Наночастици, насочени към бъбреците за увеличаване на бъбречната лимфна плътност, намаляват кръвното налягане при хипертонични мишки
Nov 10, 2023
Резюме:Хронично интерстициално възпалениеи бъбречната инфилтрация на активирани имунни клетки играят съществена роля при хипертонията. Лимфните пътища регулират възпалението чрезизчистване на имунните клеткии излишна интерстициална течност. Преди това демонстрирахмеповишаване на бъбречната лимфангиогенезапредотвратява хипертонията при мишки. Ние предположихме, че целевото доставяне на наночастици на васкуларен ендотелен растежен фактор-C (VEGF-C) до бъбрека би индуцирало бъбречна лимфангиогенеза, понижавайки кръвното налягане при хипертонични мишки. Насочена към бъбреците наночастица се зарежда с VEGF рецептор-3-специфична форма на VEGF-C и се инжектира в мишки с индуцирана от ангиотензин II хипертония или LNAME-индуцирана хипертония на всеки 3 дни. Мишки, третирани с наночастици, показват повишена плътност и ширина на бъбречните лимфни съдове в сравнение с мишки с хипертония, инжектирани само с VEGF-C. Мишки, третирани с наночастици, показват понижено систолично кръвно налягане, намаленопровъзпалителни бъбречни имунни клеткии повишена фракционна екскреция на натрий в урината. Нашите открития показват, че фармакологично разширяващите се бъбречни лимфни съдове намаляват кръвното налягане и се свързват с благоприятни промени вбъбречни имунни клеткииповишена екскреция на натрий.
Ключови думи:бъбрек; лимфни пътища;възпаление; имунитет; хипертония
ВЗЕМЕТЕ БИЛКОВА ФОРМУЛА ОТ ЦИСТАНША ЗА БЪБРЕЦИ
1. Въведение
Почти 1 от 2 възрастни в САЩ има хипертония и тя е неконтролирана при много пациенти [1]. Въпреки подобреното образование, усилията за обществено здравеопазване и предписаните лекарства, около 30-60% от пациентите с хипертония не могат да постигнат идеално кръвно налягане. Това е жалко, тъй като намаляването на систолното кръвно налягане дори с 10 mmHg значително намалява рисковете за здравето и подобрява резултатите [2]. Необходими са допълнителни възможности за лечение, за да се помогне на тази популация с хипертоници да намалят кръвното си налягане, в идеалния случай в нормотензивния диапазон.
Инфилтрацията на бъбречните имунни клетки, възпалението и задържането на натрий са силно свързани с хипертонията [3–5]. Лимфните съдове транспортират течност, електролити, клетки и протеини от интерстициалното пространство до дрениращия лимфен възел и след това обратно в кръвообращението [6,7]. Лимфангиогенеза, свързана с възпаление, се наблюдава при остро бъбречно увреждане и прихронични възпалителни заболяваниякатодиабетна нефропатияибъбречен карцином[8]. В анвъзпалително състояние, увеличаването на лимфните пътища се опитва да помогне с отстраняването на имунните клетки, протеините и течността от органа. По-рано сме докладвали, че лимфангиогенезата също се среща в бъбреците като компенсаторна реакция при различни модели на хипертония [9–11]. Въпреки това, това компенсаторно увеличение на бъбречните лимфни възли не е достатъчно за разрешаване на възпалението и хипертонията. Генетично индуцираната бъбречно-специфична лимфангиогенеза при мишки предотвратява развитието на сол-чувствителна хипертония, инхибиране на азотен оксид (L-NAME)-индуцирана хипертония (LHTN) и индуцирана от ангиотензин II хипертония (A2HTN) и това е свързано с намаляване на натрупване на бъбречни имунни клетки и повишена екскреция на натрий [9,11,12]. Освен това, генетичната индукция на бъбречно-специфична лимфангиогенеза при мишки отслабва съществуващия LHTN и това е придружено от увеличаване на екскрецията на натрий [12].
Тук искахме да разработим потенциална транслационна терапия, която да е насочена специално към бъбреците и да насърчава лимфангиогенезата за намаляване на кръвното налягане при хипертонични състояния. Използвахме технология на наночастици за доставяне на лимфен специфичен растежен фактор въз основа на предишни доклади за насочени към бъбреците наночастици [13–15]. Съществуват и други системи за доставяне на лекарства, използващи наночастици, и всички са предназначени да подобрят ефективността, специфичността и бионаличността. Наночастиците могат да бъдат проектирани да проявяват уникални физикохимични свойства като размер (50~200 nm), форма и повърхностна химия и могат да бъдат оборудвани да носят един или повече диагностични и/или терапевтични агенти, да ги освобождават чрез външни тригери като температура , pH и ензими. Също така, капсулирането на тези терапевтични или диагностични агенти в наночастици им позволява да увеличат техния системен полуживот и по този начин те могат да бъдат значително локализирани в целевата област. Понастоящем има различни наночастици, включително мицели, липозоми, наносфери, нанотръби, нанокапсули, кубозоми и хидрогелове въз основа на техните морфологии. Тук тествахме както мицелни, така и липозомни наночастици, за да определим кое е по-ефективно.
Нашата хипотеза беше, че насочена към бъбреците наночастица, доставяща пролимфангиогенен растежен фактор, рецептор на васкуларен ендотелен растежен фактор-3 (VEGFR-3)-специфична изоформа на васкуларен ендотелен растежен фактор C (VEGF-C) , ще увеличи бъбречната лимфна плътност и ще намали кръвното налягане при мъжки и женски мишки с A2HTN или LHTN. Ние също предположихме, че понижението на кръвното налягане ще бъде свързано с намаляване на провъзпалителните бъбречни имунни клетки, увеличаване на противовъзпалителните бъбречни имунни клетки и повишена екскреция на натрий. Поради дългата продължителност за предизвикване на чувствителна към солта хипертония и ограничения брой инжекции в опашната вена при мишки, този модел не е използван в настоящото проучване
2. Материали и методи
2.1. Разработване и характеризиране на наночастици
Блок кополимерът PLGA-PEG-фолат е закупен от PolySciTech (West Lafayette, IN, САЩ), а сертификатът за анализ, показващ NMR, FTIR анализ и GPC, може да се види на фигура S1. Използвайки 50 mg PLGA-PEG-фолатен блок съполимер, 10 mg багрило кумарин 6, 10 mg FITC-овалбумин или 1 mg VEGF-C се капсулират в наночастиците, като се използва метод на диализа, за да се направи мицел наночастица 1 (NP1). По-конкретно, лекарството и полимерът се разтварят в диметилсулфоксид (DMSO) и разтворът се прехвърля в диализна мембрана (MWCO 100, 000). Диализата се провежда в продължение на 24 часа срещу DI вода. След това водният разтвор на частиците се центрофугира и обработва с ултразвук, за да се концентрират частиците. За да направим липозомната наночастица, използвахме няколко липидни компонента, включително DSPC (120 mg), холестерол (16 mg), DSPE-PEG-фолат (24 mg) и багрило кумарин 6 (10 mg) или FITC-овалбумин (10 mg) . Първо, всички от горните компоненти бяха разтворени в DCM (10 mL) и след това DCM беше отстранен чрез въздушен поток, за да се получи тънък филм върху повърхността на стъклени флакони. След това 10 mL PBS се добавят към тънкия филм, за да се получи липозомна наночастица 2 (NP2). Размерът на наночастиците се определя чрез динамично разсейване на светлината (DLS) с помощта на Zetasizer (Malvern Panalytical, Malvern, UK). Концентрацията на пробата се поддържа при 0,5 mg/mL. Количеството капсулирано багрило Кумарин 6 се получава от измерването на абсорбцията чрез разтваряне на 100 µL наночастици в 900 µL DMSO, което освобождава Кумарин 6 в разтвора на DMSO.
След това се измерва абсорбцията при 444 nm. С помощта на предварително измерена калибровъчна крива на абсорбцията на кумарин 6 в съответствие с неговата титрувана концентрация беше изчислена концентрацията на капсулиран кумарин 6 (NP1: 5 ± 0.35 mg и NP2: 4 ± {{10 }}.89 mg за кумарин 6). Като се използва предварително измерена калибровъчна крива на абсорбцията на FITC-овалбумин в съответствие с неговата титрувана концентрация, се изчислява концентрацията на капсулиран FITC-овалбумин (4 ± 0,51 mg). Количеството на капсулиране на VEGF-C в NP се определя чрез ELISA и е ~500 ± 17 ug. Всички NP са покрити с фолати, които ги насочват към проксималните тубули на бъбрека, като се има предвид високата експресия на фолатните рецептори. Схема, показваща сглобката на NP, може да се види на фигура S2
Профилите на освобождаване на кумарин 6 или FITC-овалбумин са изследвани с помощта на метод за диализа с мембранна тръба. Един mL разтвор на наночастици се добавя към диализна епруветка (Cutoff MW 3500) и след това се потапя в 10 mL PBS, съдържащ 0,5% v/v разтвор на Tween 80. В дадения момент носителите са събрани и сменени. Интензитетът на флуоресценция на събраните проби беше измерен при Ex/Em=444/500 nm (кумарин 6) или Ex/Em=488/530 nm за FITC-овалбумин с помощта на четец на микроплаки. Кумулативният % на освобождаване както на кумарин 6, така и на FITC-овалбумин от фолатните наночастици може да се види на фигура S3.
За изследване с трансмисионна електронна микроскопия (TEM, JEOL JEM-2010, Япония), суспензиите на пробите бяха пуснати върху покрита с въглерод медна решетка и изсушени при условия на вакуум. След това решетката се наблюдава под трансмисионен електронен микроскоп JEOL при ускоряващо напрежение от 200 kV. За да се определи in vivo биоразпределението, 100 µL от всеки NP1 (10 mg/mL) или NP2 (10 mg/mL) се инжектират в женски C57BL/6J мишки (n=3) през опашната вена. Флуоресцентните сигнали на кумарин 6 бяха записани при Ex/Em=444/500 nm. Дванадесет часа след инжектирането, животните бяха евтаназирани и всеки орган беше събран. Събраните органи бяха сканирани под скенер In Vivo FX Pro, за да се определи количествено разпределението на NP. Всички процедури, извършени при мишки, бяха одобрени от Тексаския университет A&M IACUC в съответствие с Ръководството на NIH за грижа и използване на лабораторни животни.
2.2. мишки
Див тип C57BL/6J мишки бяха закупени от Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA). Мъжки и женски мишки на възраст 10–14 седмици бяха хирургично имплантирани под инхалаторна изофлуран (1,5–5%) анестезия с осмотични мини-помпи (Alzet, модел 1004, Купертино, Калифорния, САЩ), съдържащи ангиотензин II (490 ng/kg/min; BACHEM, Torrance, CA, USA) (A2HTN), последвано от локален лидокаин. На друга група от мъжки и женски мишки се дава L-NAME (Sigma, St. Louis, MO, USA) в тяхната вода за пиене (0,5 mg/mL) по време на продължителността на експеримента (LHTN). След 2 дни хипертонията беше потвърдена чрез кръвно налягане в маншета на опашката във всички групи. След това мишките бяха рандомизирани и инжектирани в опашната вена или с мицеларна наночастица, заредена с VEGFR-3-специфичния мутант на VEGF-C (VEGF C c156s) [16] или свободен VEGF-C протеин самостоятелно на всеки 3 дни в продължение на курс от 16 дни (4 общи инжекции в опашната вена). Този график на инжектиране е моделиран след предишна работа [17] и позволява достатъчно време за васкуларно ремоделиране да настъпи на ниво, достатъчно да повлияе на кръвното налягане. Освен това, 3-дневният период на почивка удължава живота на крехките вени на опашката на мишка, като същевременно запазва про-лимфангиогенния сигнал постоянен. Дори след периода на възстановяване, вените на опашката можеха да издържат само 5 инжекции, преди да претърпят непоправимо увреждане. Всички мишки бяха умъртвени 16 дни след първоначалната инжекция. Мишките бяха евтаназирани чрез тъканна перфузия под дълбока анестезия с изофлуран и след това цервикална дислокация преди събирането на тъкан. Всички процедури, извършени при мишки, бяха одобрени от Тексаския университет A&M IACUC в съответствие с Ръководството на NIH за грижа и използване на лабораторни животни.
2.3. Кръвно налягане
Отчитанията на систолното кръвно налягане (SBP) бяха взети в различни времеви точки чрез маншета на опашката. За всички измервания беше използвана неинвазивната система за придобиване на кръвно налягане IITC Life Science за мишки (IITC Inc., Woodland Hills, Калифорния, САЩ). Кръвното налягане беше измерено след 30-минутен период на аклиматизация в определена тиха зона. През това време затоплящата камера и ограничителните камери бяха оставени да се нагреят до 34 ◦C. Мишките бяха внимателно заредени в камери за задържане с подходящ размер и оставени да се аклиматизират в затоплящата камера за 5 минути преди измерванията на SBP. Измерванията на SBP са получени от проследяването на налягането от двама независими, заслепени изследователи.
2.4. Събиране и измерване на серум и урина
Събиране и измерване на серум и урина: Мишките се поставят в метаболитни клетки (Hatteras, Cary, NC, USA) и се оставят да се аклиматизират за една нощ. След аклиматизация, урината се събира в продължение на 24 часа, завършвайки с евтаназия. Измерена е събраната урина. Кръвта беше събрана при евтаназията през лявата камера и серумът беше изолиран за по-късни мерки. Серумът и урината бяха анализирани чрез капилярна електрофореза за натрий с помощта на DxC 700 AU Chemistry Analyzer (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) и чрез директна потенциометрия за креатинин с помощта на система за капилярна електрофореза P/ACE MDQ Plus (Sciex, Redwood City, CA , САЩ). Тези мерки бяха използвани за изчисляване на екскрецията в урината, фракционната екскреция на натрий (FENa) и креатининовия клирънс.
2.5. Имунофлуоресценция
При евтаназирането бъбреците се събират, нарязват се сагитално на половинки и се фиксират в 10% буфериран разтвор на формалин (Sigma, St. Louis, MO, USA) за 48 часа. След фиксиране, половинките на бъбреците се промиват в 100% етанол и се поставят в парафин. Половинките на бъбреците бяха нарязани на 5–7 µm срезове, които бяха депарафинизирани, рехидратирани и пермеабилизирани с 0, 1% разтвор на Triton (BioRad, Hercules, СА, САЩ). Тъканта беше блокирана с 10% разтвор на AquaBlock (EastCoastBio, North Berwick, ME, USA), преди да бъде имуномаркирана с маркерите на лимфните ендотелни клетки LYVE-1 или подопланин (коза поликлонална; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) за една нощ инкубиране при 4 ◦C. Alexafluor 488 или 594 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) вторични антитела бяха използвани за визуализиране на лимфни съдове. Пробите се инкубират с подходящо конюгирани вторични антитела за един час при стайна температура. Отрицателните контроли се инкубират само с вторично антитяло. Всички маркирани слайдове бяха монтирани с ProLong Gold анти-избледняващ реагент, съдържащ DAPI (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, САЩ). За изображения е използвана система за флуоресцентна микроскопия Olympus BX51 с камера Olympus Q5. Изображенията бяха заснети при 40 × увеличение с помощта на софтуер за изображения Olympus CellSens (Olympus, Shinjuku, Токио, Япония). Същите методи бяха използвани за изобразяване на лимфните съдове в сърцето, черния дроб, белите дробове и кожата (10 × или 20 × увеличение).
2.6. Бъбречна имунофлуоресценция
Количествено определяне От всеки бъбречен участък бяха събрани 5–7 изображения при 20 × от предварително определени области, като обикновено се избягват тъканни дефекти, незначителна чашка и голям брой гломерули. ImageJ беше използван за събиране на стойности на площта, измерващи общия брой подопланин+ пиксели, след като прагът беше зададен за положителен ендотел.
2.7. Количествено определяне на максималната ширина на бъбречните лимфни съдове
От всеки бъбречен участък бяха събрани изображения на всички свързани с артерията лимфни съдове в кората при 20 ×. Лимфните съдове се идентифицират чрез наличието на оцветяване с подопланин. ImageJ беше използван за събиране на дължината в пиксели на най-широката точка на всички лимфни съдове, съдържащи лумен.
2.8. Поточна цитометрия
При евтаназията бяха събрани бъбреците и капсулите бяха отстранени. Тъканта беше старателно смляна и усвоена в буфер, съдържащ Collagenase D (2, 5 mg / mL, Roche Sigma, St. Louis, MO, USA) и Dispase II (1 mg / mL, Sigma) при 37 ◦ C за 1 час. Усвоените проби бяха филтрирани и изплакнати през 100 и 40 µm филтри. Потокът беше центрофугиран за изолиране на клетъчните компоненти и червените кръвни клетки бяха лизирани в NH4Cl/EDTA. Спленоцитите се изолират по подобен начин за използване като контроли на антитела и за стробиране на разсейване в посока напред срещу страничен размер и форма на имунните клетки. Бъбречните клетки се ресуспендират в 0.1% FBS разтвор. За да се предотврати неспецифичното Fc свързване, пробите се инкубират с анти-мише CD16/CD32 антитяло (BD Pharmingen, Сан Хосе, Калифорния, САЩ) за 10 минути върху лед. След това клетките се инкубират с флуоресцентно-конюгирани антитела срещу CD45, F4/80, CD11c и CD3e и се филтруват през друг стерилен 40 цт филтър. Всички антитела са закупени от BD Biosciences. Вижте онлайн таблица S1 за описателния панел. BD LSR Fortessa X-20 поточен цитометър със софтуер FACS DIVA (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния, САЩ) беше използван за получаване. Популации от до 500 000 клетки бяха анализирани с помощта на FlowJo v10.6.2.1 (FlowJo, LLC, Ashland, OR, USA). CD3e+ популациите бяха количествено определени в рамките на портата CD45+. CD3e PacBlue+ популациите са отрицателни за флуорофори PE и PerCP-Cy5.5. F4/80+ и CD11c+ популациите бяха количествено определени в CD45+/CD3e-gate (Фигура S4). Тези популации са отрицателни за PacBlue, APC и APC-Cy7 флуорофори. Резултатите се изразяват като процент от общите CD45+ клетки на бъбрек. Стратегията за стробиране може да бъде намерена на фигура S4. Информация за антителата се намира в Таблица S1.
2.9. Статистика
Резултатите са представени като точкови графики и средни стойности или средна стойност ± SEM. Разликите между 2 групи бяха оценени чрез 2-опашен несдвоен t-тест на Student и между 3 или повече групи с еднопосочен ANOVA, последван от post hoc теста на Student–Newman–Keuls. Нивото на значимост беше зададено на 0.05 за всички сравнения. Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на софтуера SigmaPlot 10 (Systat, Сан Хосе, Калифорния, САЩ).
Поддържаща услуга на Wecistanche-най-големият износител на cistanche в Китай:
Имейл:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/телефон:+86 15292862950
Пазарувайте за повече подробности за спецификациите:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
