Нов, атаксичен миши модел на атаксия телеангиектазия, причинена от клинично значима безсмислена мутация (част 1)

За да научите повече информация, моля свържете сеdavid.wan@wecistanche.com

Резюме

Атаксия телеангиектазия (AT) и атаксия с очна апраксия тип 1 (AOA1) са опустошителни неврологични разстройства, причинени от нулеви мутации в гените за стабилност на генома, съответно AT mutated (ATM) и Aprataxin (APTX). Нашето механично разбиране и терапевтичен репертоар за лечение на тези разстройства силно липсват, до голяма степен поради неуспеха на предишни животински модели с подобни нулеви мутации да рекапитулират характерната загуба на моторна координация (т.е. атаксия) и свързаните церебеларни дефекти. Чрез увеличаванегенотоксиченстрес чрез вмъкване на нулеви мутации както в гените Atm (глупости), така и в Aptx (нокаут) в едно и също животно, ние генерирахме нов модел на мишка, който за първи път развива прогресивно тежък атактичен фенотип, свързан с атрофия на церебеларната молекула слой. Откриваме, че биофизичните свойства на церебеларните неврони на Пуркиние са значително нарушени (напр. намален мембранен капацитет, по-ниски прагове на потенциала за действие и т.н.), докато свойствата на синаптичните входове остават до голяма степен непроменени. Тезисмущениязначително променят нервната активност на неврона Purkinie, включително прогресивно намаляване на спонтанното задействане на потенциала за действие

честотата, която корелира както с церебеларната атрофия, така и с атаксията през първата година от живота на животното. Двойно мутантните мишки също проявяват силно предразположение към развитие на рак (тимоми) и имунни аномалии (нарушено ранно развитие на тимоцити и съзряване на Т-клетки), симптоми, характерни за АТ. И накрая, чрез вмъкване на клинично релевантна нулева мутация от безсмислен тип в Atm, ние демонстрираме, че съединенията с четене на малки молекули (SMRT) могат да възстановят производството на ATM, което показва техния потенциал като бъдещо терапевтично средство за AT.

Щракнете тук, за да научите повече за Cistanche

1.0 Въведение

Атаксия Телеангиектазия (AT) е рядко (1 на ~ 100, 000) (Swift et al. 1986), автозомно рецесивно генетично заболяване, характеризиращо се с предразположеност към рак, имунен дефицит и силно проникваща прогресивна и тежка свързана атаксия до церебеларна атрофия (Rothblum-Oviatt et al. 2016; Boder and Sedgwick 1958; Levy and Lang 2018). Пациентите с AT обикновено умират през второто или третото десетилетие от живота си (Crawford et al. 2006) от лимфен рак, респираторни инфекции или усложнения на атаксия – за съжаление, преживяемостта не се е променила драстично от 1950 г. (Micol et al. 2011; Rothblum- Oviatt et al.2016). Въпреки че прогресията на заболяването и причината за смъртта варират значително при различните пациенти, се съобщава, че силно проникващият прогресивен спад в двигателната координация има най-голямо отрицателно въздействие върху качеството на живот на пациента (Jackson et al. 2016). Грижите обикновено са палиативни, насочени към намаляване, ограничаване или елиминиране на ракови заболявания или инфекции. Няма налични дългосрочни терапии за лечение на атаксията и свързаните с нея дисфункция и атрофия на малкия мозък. AT се причинява от недостатъчност или дисфункция на банкомата (AT мутирал) протеин (Savitsky et al. 1995). Кодонът за преждевременно прекратяване (PTC), причиняващ безсмислени мутации, представлява до половината от известните случаи, като мутациите с пропуски и делеция също допринасят (Concannon и Gatti 1997; Sandoval et al. 1999). ATM е киназа от семейството на серин/треонин PIKK, която играе ключова роля в реакцията на увреждане на ДНК (DDR), защитавайки клетките от десетки хиляди ДНК лезии, възникващи всеки ден (Lindahl и Barnes 2000; Kastan и Bartek 2004; Shiloh и Ziv 2013). В активната мономерна форма ATM фосфорилира няколко ключови протеина, спирайки производството на нова ДНК (арест на клетъчния цикъл) (Ando et al. 2012) и след това, в зависимост от тежестта на увреждането, инициира възстановяване на ДНК или програмирана клетка смърт (т.е. апоптоза) (Ando et al.2012; Rashi-Elkeles et al.2006). Идентифицирани са няколко цели надолу по веригата на DDR пътя на ATM, включително p53, CHK2, BRCA1, SMC1 и NBS1 (Matsuoka et al.2007). Ролята на ATM в възстановяването на ДНК също е замесена в нормалното развитие на имунната система, където се предлага да допринесе към рекомбинацията на естествения ДНК сплайсинг, който се случва по време на генно пренареждане при узряване на Т- и В-лимфоцити (Chao, Yang и Xu 2000; Matei, Guidos и Danska 2006; Vacchio et al. 2007; Schubert, Reichenbach и Zielen 2002 ). Въпреки че неговите роли все още се появяват, ATM също е замесен в хомеостазата на оксидативния стрес (Guo et al. 2010) и митофагията (Valentin-Vega и Kastan 2012; Pizzamiglio, Focchi и Antonucci 2020). Не е ясно защо дефицитът на ATM причинява атаксия, но той далеч не е единственият DDR протеин, свързан с атаксия, тъй като Aprataxin (APTX) (Aicardi et al.1988), мейотична рекомбинация 11 хомолог 1(MRE11)(Sedghi et al.2018), нибрин (NBS1)(van der Burgt et al.1996), сенатаксин (SETX) (Moreira et al.2004) и тирозил-ДНК фосфодиестераза 1 (TDP1) (Takashima et al. 2002), когато липсват или не функционират, могат да причинят атаксия, свързана с малкия мозък. Това предполага, че неврологичните характеристики на синдромите на нестабилност на генома имат обща основна причина, въпреки че това все още не е механично доказано (McKinnon 2009; Rass, Ahel и West 2007). Основен фактор, ограничаващ нашата способност да дефинираме защо загубата на DDR протеини, като ATM, селективно въздейства върху малкия мозък и причинява прогресивна атаксия, е липсата на животински модел, който рекапитулира тези неврологични симптоми (Lavin 2013). През последните няколко години бяха създадени няколко AT модела на гризачи чрез вмъкване на генни мутации, които причиняват протеинова дисфункция (липса на киназна активност) или пълен дефицит (Herzog et al. 1998; Xu and Baltimore 1996; Elson et al. 1996; Spring et al. 2001; Campbell et al.2015; Quek et al.2016; Tal et al. 2018; Lavin 2013); наскоро беше докладвано и мини прасе (Beraldi et al. 2017). Въпреки това, никой не развива явна, прогресивна атаксия с церебеларна дисфункция и атрофия, която рекапитулира човешкото заболяване, въпреки че се развиват други аспекти на разстройството като рак на щитовидната жлеза, безплодие и имунни аномалии. Остава неясно защо тези предишни животински модели не успяват да покажат прогресивния атактичен фенотип (Lavin 2013). Възможно е видово-специфичните молекулярни компенсации при мишки да осигурят съкращения или алтернативни пътища, минимизиращи ефектите от дефицита на ATM в мозъка (El-Brolosy и Stainier 2017). Възможно е също така скъсената продължителност на живота на предишни модели (Barlow et al. 1996) да е твърде кратка, за да се натрупат стохастичните механизми, водещи до дисфункция и атрофия на малкия мозък, и да повлияят на двигателното поведение. Други предизвикателства включват потенциално пропускливи генетични манипулации, които водят до ниски нива на ATM протеин или активни фрагменти с остатъчна киназна активност, като по този начин ограничават невропатологията (Li et al. 2011). Въздействието на липсата на толкова важен животински модел има

са били значителни, силно ограничаващи експерименталните проучвания от идентифицирането на клетъчните и молекулярните механизми и възпрепятствайки предклиничното разработване и тестване на така необходимите терапевтици. Тук тестваме дали увеличаването на генотоксичния стрес, чрез поставяне на нулеви мутации не само в гена Atm, но и в свързания ген Aptx, води до по-представителен модел на мишка, който показва дисфункция на малкия мозък, атрофия и развитие на прогресивна атаксия. Избрахме допълнително да нокаутираме Aptx, тъй като неговият дефицит причинява разстройство, подобно на АТ при хората, наречено атаксия с очна апраксия тип 1(AOA1), which does not feature A-T's other system defects that could increase the potential for prenatal lethality or early death (e.g., immunodeficiency and cancer predisposition)(Coutinho P 2002).Moreover, APTX is a phosphodiesterase involved in DNA reassembly after double-and single-stranded repair, and has a function downstream of—but not directly regulated by or related to—ATM (Gueven et al.2004; Schellenberg, Tumbale, and Williams 2015; Ahel et al.2006).We hypothesized that the functional expression of both proteins would have an additive effect and induce neurological dysfunction. Our results indeed demonstrate that mice deficient in ATM and APTX develop cerebellar dysfunction, atrophy, and progressive and profound ataxia, while mice deficient in either protein alone do not Additionally, double mutants displayed other characteristic symptoms of A-T, including defects in immune maturation and a high incidence of cancer (thymomas), making it the most representative model, from a phenotypic standpoint to date. Finally, we designed this new mouse model to test our recently developed Small Molecule Read-Through Compounds(SMRT)that enable translation through premature termination codons(Du et al.2013). Thus, we inserted a premature termination-causing nonsense mutation (103C>T) в гена Atm, общ за голямо семейство от пациенти с АТ от Северна Африка (Gilad, Bar-Shira, et al. 1996). Тази мутация води до преждевременен терминиращ кодон (PTC) при това, което нормално би било аминокиселина 35, и загуба на ATM транслация. Тук докладваме експерименти с доказателство за принципа, демонстриращи, че клинично значими генетични мутации, включени в AT модела на мишка, са податливи на четене на съединения и следователно са подходящи за предклинично тестване на SMRT съединения.

2.0 Резултати

2.1 Creation of a new A-T mutant mouse model expressing a clinically relevant nonsense mutation To create a more clinically relevant mouse model of A-T we used a gateway recombination cloning and site-directed mutagenesis method to recapitulate a c.103C>T(p.R35X) mutation in the ATM gene found in a large population of North African A-T patients(Fig.1A and Methods)(Gilad, Khosravi, et al. 1996). The insertion of thymine in place of cytosine at this site in exon 3 results in a premature termination codon(PTC)-causing nonsense mutation in the ATM gene. Since the c.103C>T мутацията води до различни PTCs в човешкия ген в сравнение с мишия Atmген - TGA vs. TAG, respectively—we created two different mice by exchanging the mouse Atm exon 3 with either a human or mouse exon 3 variant with the c.103C>T mutation(Fig.1B). In the human variant, a 103C>T mutation of the mouse codon, where the arginine(R) encoding codon(CGA) becomes a TGA stop codon, results in a mouse we denote as AtmR35×(officially Atm'm103cAc)rGAMag). In the mouse variant, the c.103C>T мутацията трансформира глутамин (Q)-кодиращ CAG кодон в TAG стоп кодон и се обозначава като Atm235×(официално Atmm1.103c) време). Наличието на PTC води до загуба на ATM експресия, или намалена с около половината в хетерозиготата, експресираща едно нормално мише копие на

или Atm Q35v35×) (Фиг. или Atm 835×), или изцяло в хомозигота (Atm?35×R35×Atm ген (Atm35× плюс 1C).

Atm35x7R35×; Aptx^(двоен мутант) мишки бяха създадени чрез първо кръстосване на единичен мутант AtmF3xR3x (вроден на C57BL/6J фон) и Aptx'(смесен C57BL/6J и 129 фон) мишки с Aptx* мишки. F1-5 littermate Atm"; Aptx* мишки след това бяха кръстосани за генериране на хетерозиготен Atm в котилата, за да се създаде достатъчен брой от желаните експериментални и контролни генотипове, за да се определи как загубата на различни количества ATM и APTX влияе върху фенотипа на животното( Фиг.1D).

Подобно на предишни ATM-дефицитни AT мишки модели, ATM или APTX дефицит сам по себе си не е довел до мишки с атаксия (Видео 1 и 2). Въпреки това, дефицитът и на двата протеина (Atm35k35x; Aptx') води до развитие на тежък и прогресивно атаксичен фенотип (Фигура 1E, Видео 3 и 4).

2.2 Мишките с дефицит на ATM имат намалена преживяемост и висока честота на тимоми

Ние оценихме общото здраве и развитие на контролни и експериментални мишки, експресиращи различни нива на ATM и APTX (фиг.2). Установихме, че Atm735xR35×; Aptx^'мишките нарастват ~55 процента по-бавно и достигат изчислени тегла на плато, които са ~35 процента по-ниски от контролните генотипове (log-rank, n=21 до 40,p<0.0001; fig.="" 2a).="" these="" differences="" in="" weight="" were="" a="" postnatal="" phenomenon,="" as="" no="" significant="" weight="" differences="" were="" detected="" just="" after="" birth="" (p8)="" across="" all="" genotypes(1-way="" anova,n="5" to="" 23,="" p~0.23).="" adolescent="" double="" mutant="" mice="" at="" postnatal="" day="" 45(p45)weighed="" on="" average="" 30%="" less="" than="" male="" mice="" [double="" mutant:14.4±1.0g="" (n="13)vs." wildtype:20.2±0.5="" g(n="16),"><0.0001] and="" 25%less="" in="" females="" [double="" mutant:12.7±0.6g="" (n="17)" vs.wildtype:17.0±0.2g(n="15)," test,=""><0.0001; fig.="" 1a].differences="" across="" the="" control="" genotypes="" were="" observed,="" but="" they="" were="" small="" and="" not="" consistent="" across="" time="" points="" or="" sex="" and="" therefore="" judged="" to="" not="" be="" physiologically="" relevant="" (fig.="" 2a).="" survivability="" of="" the="" atm735xr35×;="" aptx*="" mice="" was="" significantly="" reduced="" compared="" to="" atm*;="" aptx*="" mice,="" with="" 53%="" of="" mice="" still="" alive="" at="" 400="" days="" of="" age,="" compared="" to="" 97%="" of="" atm*;="" aptx*="" mice="" at="" the="" same="" time="" point="" (fig.2b).atm="" deficiency="" alone="" was="" sufficient="" to="" reduce="" survivability;="" as="" compared="" to="" atm*;="" aptx*="" mice,="" both="" atm35xr35×;="" aptx*="" and="" atm735x/r35x;="" aptx*="" mice="" had="" significantly="" reduced="" survivability="" [42%,log-rank,xu5="13.49,p=0.0002" and="" 52%,log-rank,xu,53)=""><0.0001,respectively]. no="" significant="" difference="" in="" survivability="" between="" atm-deficient="" mice="" with="" partial="" or="" complete="" aptx="" deficiency="" was="" detected="" [log-rank,="" x(2.85)="1.01,p=0.6]." conversely,="" mice="" harboring="">

least one functional copy of the Atm gene had normal survivability, regardless of whether they expressed APTX or not [log-rank, X(3 131)=3.08, p=0.4]. No significant difference between male and female mice was observed, and thus data were pooled [log-rank, p>0.4 за всички сравнения по двойки; Фиг.2-фиг.S1B]. Като цяло, една трета от мишките с дефицит на ATM умират от усложнения, свързани с големи ракови заболявания на тимуса (тимома), открити в гръдната кухина (фиг. 2C). Наличието или отсъствието на APTX не повлия на разпространението на рака и мишки с поне един Atm транскрипт бяха без рак поне до P400. Като цяло дефицитът на ATM, но не и на APTX, има сериозни ефекти върху здравето и оцеляването на мишките.

2.3 Дефицитът както на ATM, така и на APTX е необходим за постигане на прогресивна двигателна дисфункция

Прогресивното развитие на тежка атаксия е отличителна черта на AT, която е обобщена в Atm? 35/R35x; Aptx' мишки, но нито един от другите контролни генотипове, които тествахме. Като цяло откриваме, че дефицитът на моторна координация се появява между 210 и 400 дни след раждането в Atm735Xk3x; Aptx мишки и не намират доказателства за атаксия при мишки с поне едно копие на гена Atm или Aptx (Фиг. 3A, B). За теста с вертикален полюс, Atm735xR3x×; На Aptx мишките отне два пъти повече време, за да се спуснат при P400 в сравнение с Atm*;Aptx*,Atm*; Aptx',Atm735xR35×; Aptx* или Atm35×*; Aptx' мишки [Мъжки: 29,1±0,9s(n=3) срещу 7,5±0,4s(n=12),12,5±2,5s(n=9),9,2±0,9s (n=10),8,6±0,9s(n=11),1-way ANOVA,F4.40=19.9,p<0.001;female:19.0±4.0s(n=4)was.7.5±0.4s(n=12),7.8±0.4s(n=10),10.5±1.2s(n=6), 8.2±0.5="" s(n="8),1-way" anova,="" f4,="" 35="13.9,"><0.0001]. an="" examination="" of="" gait="" indicated="" thatatm?35×r35×;="" aptx^="" mice="" at="" p400,="" but="" not="" p210="" need="" additional="" stabilization="" during="" ambulation,="" as="" they="" spend="" twice="" as="" much="" time="" with="" 3="" paws,="" rather="" than="" the="" normal="" 2,="" in="" contact="" with="" the="" ground="" as="" they="" walk="" across="" the="" gait="" analysis="" platform="" [male:="" 56.2="" vs.="" 26.4="" to="" 32.2="" %,1-way="" anova,="" f4.54)="14.3,"><0.0001; female:="" 58.4="" vs.18.9="" to="" 28.8="" %,1-way="" anova,="" f3.178)="95.5,"><0.0001; fig.3b].="" atm35xr35×;="" aptx'="" also="" display="" a="" slower="" cadence="" and="" average="" speed="" across="" the="" platform="" compared="" to="" all="" other="" genotypes="" at="" p400="" [cadence,="" male:9.5="" vs.="" 13.3="" to="" 15.9="" steps/s,="" 1-way="" anova,="" f3.204)=""><0.0001;female: 9.1="" vs.14.2="" to="" 15.9="" steps/s,1-way="" anova,f,204)="39.7,"><0.0001;speed, male:8.8="" vs.22="" to="" 26="" cm/s,1-way="" anova,="" f4.50)=""><0.0001;female: 58.4vs.18.9="" to="" 28.8="" cm/s,1-way="" anova,="" f3.178)="39.7,"><0.0001;fig.3b; fig.3-fig.="" s1].="" this="" difference="" in="" speed="" and="" cadence="" is="" unlikely="" to="" be="" caused="" by="" the="" animal="" size,="" as="" there="" are="" no="" significant="" differences="" in="" these="" parameters="" at="" earlier="" time="" points="" when="" the="" difference="" in="" size="" is="" significant(fig.2a).="" these="" observations="" across="" the="" two="" behavioral="" tests="" were="" found="" in="" both="" male="" and="" female="" mice="" at="" each="" of="" their="" respective="" time="" points,="" consistent="" with="" the="" lack="" of="" sex="" differences="" observed="" in="" a-t="" patients.="" we="" further="" examined="" behavioral="" differences="" between="" the="" atm735xr35x;="" aptx'="" and="" atm*;="" aptx*="" mice="" using="" a="" standardized="" set="" of="" experimental="" procedures="" used="" to="" phenotype="" genetically="" modified="" mice="" (i.e.,="" sherpa;="" fig.3c;="" fig.3-fig.s1)(rogers="" et="" al.1997).="" we="" first="" detected="" differences="" in="" motor="" function="" at="" p8,="" where="" atm35xr35×;aptx'="" mice="" took="" 3-4="" times="" longer="" on="" average="" to="" right="" themselves="" compared="" to="" atm*;aptx*mice="" [male:="" 6.4±1.1="" s(n="24)vs.1.5±0.1" s(n=""><0.0002;female: 11.1±1.9s(n="21)was.2.4±0.3s" (n=""><0.0002;fig.3c bottom].at="" 30="" days="" of="" age,="" we="" detected="" x;="" aptx*="" and="" atm*+;="" aptx**="" mice="" in="" behavioral="" tests="" that="" significant="" differences="" between="" atm735×r35×;="" qualitatively="" measured="" body="" position="" and="" spontaneous="" activity(fig.3c).="" striking="" differences="" in="" atm35×r35×;="" aptx^'="" compared="" to="" atm*;="" aptx*"="" mice="" were="" observed="" at="" p400,="" especially="" for="" behaviors="" related="" to="" movement,="" including="" locomotor="" activity,="" body="" position,="" and="" gait(fig.3c).="" the="" results="" from="" this="" battery="" of="" tests="" demonstrate="" that="" atm35×r35x;="" aptx*mice="" develop="" a="" severe="" change="" in="" behavior="" by="" p400,="" consistent="" with="" purely="" visual="" observations="" of="" significant="" motor="" coordination="" deficits="" in="" the="" mice="" up="" to="" this="" time="" point.="" importantly,="" we="" do="" not="" find="" any="" significant="" differences="" between="" the="" other="" control="" genotypes,="" including="" atm35×;="" aptx*="" mice="" that="" express="" at="" least="" some="" atm="" but="" no="" aptx="" protein="" (fig.="">

2.4 Мембранните и синаптичните свойства са нарушени в ATM- и APTX-дефицитните неврони на Purkinje

Невроните на Purkinje (PN) са ключов невронален подтип, разположен в кората на малкия мозък. Те показват значителна присъща възбудимост, изстрелвайки спонтанно потенциали за действие със скорост, значително по-висока от повечето други неврони в мозъка (50 до 100 Hz повече в много случаи). Тяхната активност оформя церебеларния изход чрез тонично инхибиране на неврони на малкомозъчните ядра, които се проектират към центровете за моторна координация в предния мозък, мозъчния ствол и гръбначния мозък. Церебеларната PN дисфункция е свързана с няколко форми на атаксия и е замесена в AT (Hoxha et al.2018: Cook. Fields. and Watt 2021: Shiloh Aptx*-X/R35X.2020). Следователно ние проверихме дали електрофизиологичните свойства на PN в малкия мозък на Atm са необичайни. Тъй като основната активност на PN и чувствителността към въвеждане се медиират от базов набор от пасивни и активни свойства на мембраната (фиг. 4), ние директно записахме и сравнихме мембранните свойства на PN в остри церебеларни участъци, събрани от Atm35XR35 ×; Aptx* и Atm*; Aptx* мишки (P350 до 400). PN, записани от Atm35xR35×; Aptx мишки имаха значително "по-стегнати" мембрани, показващи по-високи мембранни входни съпротивления (Rm) от тези от Atm; Aptx* мишки [47,7±5,6 (n=15) спрямо.

30.2±1.47(n=23)MQ, t-тест,p-0.008; Фиг.4B] и показва по-бърза мембранна времеконстанта() [3,6±0,4(n=15) спрямо 5,1±0,3(n=23)ms, t-тест, p=0 .009; Фиг.4B]. Тези резултати показват, че общият мембранен капацитет (Cm=t/Rm) на Atm35x/35x;Aptx^PNs е значително намален [98,25±19,23(n=15) спрямо 175,6± 12,67(n =23)pF,t-test,p=0.0025;Фиг.4B]. На клетъчно ниво това предполага, че PN с дефицит на ATM и APTX имат по-малко (т.е. намалена площ) или по-тънки мембрани

отколкото този на див тип PNs, резултат, предполагащ дефицит на развитие или невродегенеративен процес; Aptx/-и (DellOrco et al.2015). След това оценихме присъщата възбудимост на PN в AtmR35xR3x;

Atm*;Aptx* мишки чрез изследване на генерирането и динамиката на PN потенциал за действие (AP). Значителни дефицити в способността на PN да се задействат непрекъснато в отговор на инжектиране на ток се наблюдават при мишки Atm?35×3x;Aptx^ (Фигура 4C). Тези дефицити са свързани със значителни смущения в амплитудата, прага и областта на евокираните потенциали за действие [амплитуда: 66,2± 0.7 (n=14) vs. 72,1±1,4 (n=13)AmV,t-тест,p=0.003;праг:-55.2±1,5vs.-48. 61±1,9 mV, t-тест, p=0.0196; площ:17.96±0.6v.

20.63± 1.0 mV*ms, t-тест, p=0.048; Фиг.4C]. Заедно тези експерименти демонстрират значителни смущения на физиологичните свойства на PN, които вероятно нарушават способността им да функционират нормално в малкия мозък на At/mR35×R35×; Aptx мишки.

След това тествахме дали външните и/или синаптичните PN свойства също са засегнати в AtmR35xR3sx. Aptx* мишки. Първо изследвахме спонтанни възбудителни постсинаптични токове (iPSC), генерирани от синапси от гранулирана клетка към PN (т.е. паралелни влакна). Не беше открита разлика в размера на UPSC, което показва, че функцията на краищата на аксона на гранулирани клетки (т.е. успоредни влакна) е относително нормална в AtmR35KR35X; Aptx'cerebellum [18,92±1,3(n{{10}}) е. 23,4±3,3(n=11)pA,t-тест,p=0.477;Фиг.4D](Ямасаки, Хашимото и Кано 20{{5{{58} }}}6). Установено е обаче, че честотата на sEPSC е значително повишена, феномен, който може да се отдаде или на увеличаване на общия брой синапси, увеличаване на размера на лесно отделящия се пул от синаптични везикули или увеличаване на вероятността от невротрансмитер освобождаване в PN на fAtmR35XR35X; Aptx'мишки [18,75±2,8Hz(n=11) срещу 11,4±1.0Hz(n=11), t-тест,p=0.{{ 69}}47; Фиг.4D]. След това изследвахме предизвикано синаптично освобождаване и краткосрочна пластичност чрез едновременно записване от PNs и електрическо стимулиране на аксони на гранулирани клетки (т.е. успоредни влакна) или долни оливиарни (т.е. катерещи влакна) с изблик на сдвоен импулс (2- импулси, 50 ms един от друг). Установено е, че синаптичните свойства на паралелните влакна са нормални, като не показват значителни разлики в очакваното краткосрочно улеснение (Atluri и Regehr 1996) или полуширина и времева константа на затихване на предизвикания EPSC [PPR: 1,3±0. 03 (n=10) срещу 1,4±{{90}}.{{1{{1{{106}}5}}1 }}5(n=13),t-тест,p=0.162;полуширина:3,9±0.6 спрямо 4,9±0.4 ms,t -тест,p=0.175;времева константа: 3,5±0.5 спрямо 4,7±0,4 ms,t-тест,p=0.054;Фиг. 4E]. За сравнение открихме изкачващи се синаптични реакции от влакна към PN, които обикновено показват депресия на двойка импулси (Hansel and Linden 2000), t депресия при значително по-големи величини при Atm/3338/R35X;Aptx'мишки [PPR:0,6±0,03 (n=6) спрямо 0,7±0,02(n=9), t-тест, p=0.03; Фиг.4F]. Общата ширина и времевата константа на затихване на евокирането токовете също бяха по-малки [полуширина: 2,3±0,6(n =6).3,0±0,2(n=9)ms,t-тест,p=0.004;времева константа (бързо) :1,1±0,14 спрямо 2,9±0,4ms, t-тест, p=0.001]. Въпреки че тези резултати могат да бъдат причинени от пресинаптичен дефицит, като намалени запаси от везикули в терминала на аксона на катерещите влакна, незасегнатата начална величина на EPSC [2,4±0,4(n=6)vs. 1,9 ±0,2 nA (n=9), t-тест, p=0.3] сочи към по-присъщ дефицит, като намален приток на Ca2* от ендоплазмения ретикулум, което може значително да повлияе дълго -терминна синаптична пластичност, критична за функцията на малкия мозък (Hoxha et al. 2018; Kano and Watanabe 2017). Като цяло, смущенията в пасивните и активните PN свойства, които наблюдаваме тук, вероятно водят до значителна церебеларна дисфункция в AtmR35X/R35X; Aptx'мишки.

2.5 Дефицитът на ATM и APTX причинява прогресивно смущение на невронната активност на PN, което е свързано с дендритнисвиване и цялостна церебеларна атрофия Decreased rates of spontaneous PN action potential firing, which can be indicative of PN dysfunction, have been observed in several mouse models of ataxia, including spinocerebellar ataxias (SCA)2,3,5,6,13,27, several models of episodic ataxia (e.g., leaner, ducky, and tottering), and autosomal- recessive spastic ataxia of the Charlevoix-Saguenay (Hourez et al.2011; Hansen et al. 2013; Dell'Orco, Pulst, and Shakkottai 2017; Kasumu and Bezprozvanny 2012; Liu et al.2009; Perkins et al.2010; Shakkottai et al. 2011; Jayabal et al.2016; Stoyas et al.2020; Hurlock, McMahon, and Joho 2008; Shakkottai et al.2009; Bosch et al.2015; Walter et al.2006; Alvina and Khodakhah 2010; Ady et al.2018; Lariviere et al.2019; Cook, Fields, and Watt 2021). We, therefore, used this biomarker to characterize the progression of PN perturbation in Atm35XR35; Aptx'mice and assess whether deficits were restricted to ATM- and APTX-deficient mice, consistent with the behavioral results(Fig.2,3). We additionally examined whether decreased PN activity differed across the cerebellum, as anecdotal clinical pathology reports suggest degeneration may occur asymmetrically across the cerebellum, with the anterior and posterior vermis and middle cerebellar hemispheres affected the most, although no systematic analysis has been performed, and the consistency of results across patients is highly variable (Verhagen et al.2012; De Leon, Grover, and Huff 1976; Amromin, Boder, and Teplitz 1979; Monaco et al.1988; Terplan and Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare and Lopez 1967; Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983). Using extracellular recording methods in the acute slice, we recorded spontaneous action potentials Aptx^ and 3 others from 3,300 PNs(Fig. 4G) across 188 animals, encompassing Atm35×R35×; genotypes at four different time points (P45, 120,210, and 400). We visually selected "healthy cells (see Methods) located deeper in the slice, that consistently fired during the extent of the 60-second recording period. Qualitatively, tissue and cell quality did not visually differ across genotypes under DIC microscopy. Cells were sampled in a distributed fashion across the lateral, intermediate, and medial (vermis)cerebellum of each mouse to assess whether changes in PN firing activity were ubiquitous or anatomically restricted. Regions were segregated based on gross anatomical domains in the mouse defined by natural anatomical boundaries (e.g., foliation) and their general connectivity with different regions of the nervous system (e.g., forebrain, brainstem, etc.)(Voogd and Glickstein 1998). We found that a complete deficiency of both ATM and APTX, consistent with the behavioral results, was necessary to produce a significantly reduced spontaneous PN firing frequency (Fig. 4G, H). Although the trend of slower PN firing rates were observed across most regions of the cerebellum, some subregions appeared to be less or minimally impacted, including several areas of the lateral cerebellum, including the paraflocculus, paramedian, and crus I and Ⅱ (Fig. 4-fig. S2). Significant age-dependent changes in firing frequency were also commonly observed in AtmR35XR35X; Aptx'mice(Fig. 4H), with the most significant decline occurring betweenP120 and 210 [medial: 50.3±2.4Hz(n=61)vs. 36.9±2.2Hz(n=31),t-test,p=0.0006].No significant difference in PN firing frequency was detected between male and female mice within each genotype, thus the data were pooled (2-way ANOVA, p>0.3 във всички сравнения по двойки; Фиг. 4-фиг. S3). Предишни проучвания върху няколко модела на наследствена атаксия при мишки, включително епизодична атаксия и няколко варианта на спиноцеребеларна атаксия, установяват, че физиологичното прекъсване на PN изстрелването не само променя честотата, но и редовността (Kasumu and Bezprozvanny 2012; Jayabal et al. 2016; Stoyas и др., 2020; Кук, Фийлдс и Уат, 2021). Сравнихме както коефициента на вариация (CV), така и променливостта в съседни интервали (CV2) между AtmR35X/R35X; Aptx/ и контролни мишки (фиг. 4-фиг. S4, S5). Не е открита разлика в тези параметри по пол, възраст или генотип. В съответствие с поведенческите резултати, церебеларна дисфункция е открита само в AtmR35XR35X; Aptx'мишки, които са развили атаксия, а не при мишки с частична или пълна експресия на ATM или APTX.

Дефицитът на 2.5 ATM и APTX предизвиква церебеларна атрофия

In A-T patients, ataxia is usually detected between1 two 2-years of age and is associated with little to no cerebellar atrophy (Tavani et al. 2003; Taylor et all. 2015). Significant structural changes and atrophy are usually first detected via neuroimaging between 5 and to 10-years of age (Demaerel, Kendall, and Kingsley 1992; Tavani et al. 2003). Postmortemclinical histopathology in A-T patients points to significant changes in PN morphology and density, however, these reports primarily detail patients at late stages of the disorder, and the relationship between the severity of PN pathology and ataxia is not clear (Verhagen et al. 2012; De Leon, Grover, and Huff 1976; Amromin, Boder, and Teplitz 1979; Monaco et al. 1988; Terplan and Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare and Lopez 1967:Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983; Gatti and Vinters 1985). In the Atm735X7k3×; Aptx^ mice, we found the gross size of the cerebellum to be normal early in life, but significant atrophy developed as the severity of ataxia increased (Fig.5A). At early stages(P45-P210), the size of the cerebellum in Atm3xR35×; Aptx^ mice did not differ from mice with at least one copy of the Atm gene(2-way ANOVA, Fa.s52)=1.0, p-0.4). However, by P210, the overall size of the cerebellum in Atm735XR35×; Aptx* mice was significantly reduced(1-way ANOVA, F(3,37= 1.4,p=0.3), with the degenerative process continuing to at least the last time point investigated (P460). To rule out the possibility that reduced cerebellar size was related to the smaller stature of Atm735xR35×; Aptx" mice, we examined, animal weight and cerebellar size and found no correlation [Pearson's correlation, p>0.3 за всичките 4 генотипа при P460, n=10 до 20]. Освен това открихме, че размерът на малкия мозък не се различава между мъжките и средно 22 процента по-малки женски мишки за различните генотипове на тази възраст [2-way ANOVA, F(2. 153)=1.9, p =0.2]. Следователно, церебеларна невродегенерация в Atm35XR35 ×; Aptx*мишки, който започва след P120, е свързан с дефицит на ATM и APTX. Установихме, че церебеларната атрофия е свързана със селективно намаляване на ширината на молекулярния слой, където се намират PN дендритите (фиг. 5B). В съответствие с временните промени в брутния размер на малкия мозък, честотата на PN изстрелване и поведението, ширината на ML в Atm35 × R35X; Aptx* мишки е нормален при по-млади мишки, но прогресивно намалява по ширина, тъй като тежестта на атаксията се увеличава 【P400∶120,2±2,1 μm （n=5）срещу 140,2±4,8 μm（n=5）,{ {31}}way ANOVA, Fu42=45.04, p<0.0001;fig.5b, fig.5-figs.s1a】.in="" contrast,="" no="" difference="" in="" the="" width="" of="" the="" granular="" cell="" layer(gcl)across="" age="" was="" observed="" in="" the="" atm35xr3x;="" aptx*mice="" 【p400∶135.5±2.4="" μm（n="6）v.127.5±4.3" μm（n="5）,2-way" anova,fu="" 42="3.3,p=0.08;Fig.5B," fig.5-figs.s1a].="" cerebellar="" atrophy,="" however,="" was="" not="" due="" to="" pn="" cell="" death,="" as="" pn="" density="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" atm735×r35x;="" aptx'="" and="" atm*;="" aptx*="" mice="" [p400:4.5="" ±0.3（n="9）vs.4.5±0.2（n=7）PNs/4000" μm²,welch's="" t-test,="" p="0.9;Fig.5C," d="" fig.5-figs.s1b】.moreover,="" we="" found="" no="" evidence="" from="" immunohistological="" experiments="" for="" increased="" levels="" of="" aptx"-="" mice="" (fig.5-figs.s2).="" at="" the="" programmed="" cell="" death="" or="" microglial="" activation="" in="" the="" atm?35x/r35x="" anatomical="" level,="" we="" found="" pathological="" changes="" in="" pn="" morphology,="" as="" the="" somatic="" size="" was="" reduced(15.3±0.3（n="5）vs.17.8±0.1（n=5）μm," welch's="" t-test,="" p="0.0004;" fig.5e）and="" the="" primary="" and="" secondary="" dendrites="" were="" abnormally="" large="" in="" caliber="" in="" the="" atm35xxr35x;="" aptx'mice="" (3.1±0.2(n="6)vs.2.8±0.1" （n="6）μm," welch's="" t-test,="" p-0.003;="" fig.5f,="" fig.5-figs.s2c）.="" overall,="" we="" found="" a="" good="" correlation="" between="" the="" abnormal="" structural="" and="" electrophysiological="" properties="" of="" the="" cerebellum="" and="" the="" progression="" of="" motor="" deficits.="" 2.6="" differential="" disruption="" of="" thymocyte="" development="" in="" atm-deficient="" vs.="" aptx-deficient="">

Хроничните синопулмонални инфекции, свързани с имунодефицит, са една от водещите причини за смърт при пациенти с АТ (Morrell, Cromartie и Swift 1986; Bhatt и Bush 2014). Имунодефицитът е свързан с дефицити в генерирането на В- и Т-лимфоцити, които са свързани с дефекти в процесите на пренареждане на гена на антигенния рецептор по време на генерирането на тези клетки съответно в костния мозък и тимуса (Staples et al. 2008). Получените дефекти в броя на зрелите лимфоцити включват намаляване на CD4t хелперните Т-клетки и убийците CD8*T-клетки (Schubert, Reichenbach и Zielen 2002). Следователно ние изследвахме процентите на Т-клетките в периферната кръв и на различни субпопулации в тимуса на Atm35xR35 ×; Aptx*'мишки, използващи Т-клетъчен антигенен рецептор (TCR) и CD4/CD8 ко-рецепторна експресия. В периферната кръв наблюдаваме значително намаляване на общата фракция на CD3*T-клетки при мишки с намалена или липсваща ATM експресия в сравнение с мишки от див тип (Фигура 6). Това намаление беше допълнително усложнено от съпътстващия дефицит на APTX. Дефицитите на ATM и APTX намаляват Т-клетките в периферната кръв с над 65 процента в сравнение с контролите от див тип. Ефектът от дефицита на APTX е адитивен към този на дефицита на ATM, което предполага различен механизъм на действие за всеки от тези два протеина върху генерирането на Т-клетки. Намаляването на процента на Т-клетките в периферната кръв се свързва най-вече с намаляване на популацията на CD4 плюс хелперни Т-клетки (Фигура 6В). Интересно е, че делът на CD8 плюс Т-клетките е увеличен само в AtmR35X/R35×; Aptx* мишки (Фигура 6В). Отново наблюдавахме различен ефект на ATM и APTX дефицити, както се вижда за ефектите на тези мутации върху общата Т-клетъчна фракция. Като се има предвид намаляването на Т-клетъчните популации в кръвта, ние след това оценихме развитието на Т-клетки в тимуса. В този орган Т-клетъчните прогенитори, получени от костен мозък, претърпяват пренареждане на TCR ген, последвано от положителна селекция за рестрикция на МНС и отрицателна селекция на автореактивни клонове. Фазите на развитие на тимоцитите могат да бъдат проследени чрез проследяване на експресията на CD4 и CD8 експресия в тимоцитите. Прогресията на тази програма за развитие преминава от двойно отрицателни (CD4CD8) тимоцити към двойно положителни (CD4*CD8) тимоцити и след това към единично положителни (CD4*или CD8*) тимоцити. В допълнение, в рамките на двойно отрицателния стадий могат да бъдат идентифицирани четири различни субпопулации въз основа на експресията на CD25 и CD44, известни като DN1(CD44*CD25),DN2 (CD44*CD25*), DN3 (CD44 CD25*) и DN4 (CD44 степен CD25) (Germain 2002). Пренареждането на гена по време на развитието на тимоцитите се случва два пъти - веднъж в етапа на двойно отрицателни тимоцити в етапа на CD25*CD44 (Krangel 2009) и след това отново в етапа на двойно положителни тимоцити, преди да прогресира в отделни CD4* и CD8t единични положителни популации (Livak et al 1999). Дефицитът на ATM е свързан с дефекти в двата цикъла на пренареждане при мишки (Vachio 2007, Hathcock 2013). Следователно, ние сравнихме дела на клетките в тимуса, експресиращи тези различни маркери на клетъчната повърхност на развитието в нашите ATM-дефицитни и контролни мишки (Фигура 7). AtmR35xR35×; Aptx и Atm35×; Aptx^ но не AtmR35XR35; Aptx* мишките имат значително повишени пропорции на CD44*CD25, CD44*CD25t и CD44CD25* клетки в сравнение с дивия тип (Фигура 7A). Тези увеличени пропорции изглежда се дължат отчасти на пречка на CD44CD25t клетките да узреят в CD44CD25 двойно отрицателни клетки, като част от CD44CD25 клетки от Atm735xR35×; Aptx'и Atm35× плюс; Aptx'мишки е значително по-нисък от дивия тип (Фигура 7A). Интересно е, че дефицитът на APTX сам по себе си има най-голям ефект върху загубата на DN4 клетки, което предполага, че дефицитът на APTX, а не ATM дефицитът, е отговорен за този ефект. Доколкото ни е известно, това откритие включва за първи път APTX в генно пренареждане по време на процеса на TCR рекомбинация. След това разгледахме пропорциите на CD4*CD8t тимоцити в сравнение с CD4tCD8 и CD4CD8 плюс единични положителни тимоцити в тези четири различни щама. В съответствие с нашите резултати в кръвта и предишни проучвания, ние открихме, че ATM-дефицитни мишки, но не и контролни мишки, показват намалена експресия на CD4*CD8 и CD4CD8* единични положителни тимоцити (Фигура 7B). Тези резултати подкрепят ролята на ATM в TCR a/δгенното пренареждане по време на развитието на тимоцитите (Bredemeyer et al. 2006), роля, която е независима от ролята на APTX в ранното узряване на тимоцитите.

2.7 Молекулите за четене преодоляват PTC, за да възстановят експресията на ATM

Нашата основна обосновка за вмъкване на клинично значима безсмислена мутация в Atm гена беше да генерираме мишка, податлива на критично предклинично тестване на нов набор от SMRT съединения. По-рано демонстрирахме, че SMRT съединенията възстановяват производството на ATM протеин в AT лимфобластоидни клетъчни линии, получени от пациенти, чрез преодоляване на преждевременни терминиращи кодони (PTC), причинени от безсмислени мутации (Du et al. 2013). За да демонстрираме пригодността на този нов AT животински модел за тестване на SMRT съединения, ние избрахме да изследваме директно способността им да възстановяват експресията на ATM, използвайки подход на експлант, който заобикаля предизвикателствата, свързани с in vivo доставка (напр. бионаличност, път на доставка и т.н.). Експресията на ATM се измерва в проби от далака, където ATM обикновено се експресира на високи нива, и малкия мозък, ключова целева тъкан за разстройството. Изложихме ли тези експлантирани тъкани, събрани от хомозиготни Atm?35× и Atm? 35 мишки с кандидат SMRT съединение (GJ103) или аминогликозид, за който преди е било известно, че има свойства на четене (G418) и след това измерва ATM експресията чрез имуноблот за оценка на възстановяването. И при двата типа ATM-дефицитни мишки, ATM експресията беше последователно възстановена в далака и малкия мозък от G418 и GJ103 (фиг. 8). Тези резултати показват, че нашите SMRT съединения могат да дадат възможност за четене на поне 2 от 3-те възможни безсмислени мутации, причиняващи PTC, и предоставят обосновката за in vivo тестване на ефикасността в последващи n проучвания.