Нов, атаксичен миши модел на атаксия телеангиектазия, причинена от клинично значима безсмислена мутация (част 2)

За да научите повече информация, моля свържете сеdavid.wan@wecistanche.com

3.0 Дискусия

Чрез увеличаване на генотоксичния стрес чрез добавяне на вторичен удар към пътя на DDR, ние генерирахме нов модел на мишка, който показва най-изчерпателния набор от AT симптоми от всеки модел до момента. Това включва тежка и прогресивна атаксия, свързана с церебеларна атрофия и смущения в свойствата на PN заедно с висока честота на рак и дефекти в развитието на имунните клетки. Заедно тези съпътстващи заболявания обхващат трите водещи причини за преждевременна смърт вAT—всеки допринасящдо приблизително една трета от смъртните случаи. От тях инвалидизиращият ефект на атаксията е най-проникващ и се съобщава от пациентите и лицата, които се грижат за тях, като имащ най-голямо въздействие върху качеството им на живот. Поради тази причина наличието на атаксия и церебеларна атрофия в този нов модел на мишка е от голямо значение, тъй като предоставя за първи път ресурс не само за изясняване на механизмите на неврологичната дисфункция, но и критично необходим in vivo модел за тествайте силно необходими АТ терапевтици, като съединенията за четене, които описваме тук. Открихме няколко прилики между цялостното прогресиране на атаксията в Atm3535; Aptx мишки иAT пациенти. В клиничната АТ двигателните дефицити се наблюдават до приблизително 2-годишна възраст, когато родителите и лекарите открият намалена способност за преход от прохождане към плавна, рефлексивно координирана врата - за съжаление, малко се знае за двигателните дефекти на по-ранни етапи поради заболявания. ниско разпространение и текуща липса на ранно диагностично изследване (Rothblum-Oviatt et al. 2016). Пациентите обикновено се научават да ходят без помощ и неврологичните симптоми са склонни да останат стабилни през първите 4 до 5 години от живота си (Rothblum-Oviatt et al. 2016). Открихме подобна ранна прогресия на двигателни дефицити в Atm735 × R3x; Aptx^' мишки, откриващи ранни леки двигателни дефицити при P8 (дефицит на изправящ рефлекс), последван от период на относителна стабилност, преди началото на прогресивна и тежка атаксия, развиваща се след p210, която включва промени в походката, рефлекс на стрес, тремор и локомотор дейност. Няколко важни въпроса възникват от тези констатации, включително дали ATM и/или APTX имат роля за неврологичното развитие в

малък мозък. Бъдещите проучвания, фокусирани върху ранната фаза на разстройството, ще бъдат от решаващо значение за разбирането дали малкият мозък се развива нормално преди дисфункцията или дали дефектите в развитието са първоначална причина. Също така установихме, подобно на пациентите с AT, че тежестта на късно развиващата се атаксия е променлива, като някои мишки се придвижват с тромава, високо стъпаща задна врата (видео 3), а други се движат почти изцяло чрез изкривяване на задния ствол ( Фигура 1E и видео 4) (Rothblum-Oviatt et al.2016; Levy and Lang 2018; Boder and Sedgwick 1958). Като цяло установихме, че Atm?35×xR35×; Мишките Aptx развиха визуално дълбока и измерима прогресивна загуба на двигателна координация, подобна на тази, наблюдавана при пациенти с AT, която беше спасена чрез експресия на поне едно копие на Atm или Aptx get he. Загубата на двигателна координация при AT се приписва на церебеларна дегенерация поради относително селективната невропатология в мозъка и нейната причинно-следствена роля в няколко различни форми на атаксия (Hoche et al. 2012). В съответствие сAT пациентневроизобразяващи изследвания (Wallis et al. 2007; Sahama et al. 2015; Sahama et al. 2014; Dineen et al. 2020; Tavani et al. 2003; Quarantelli et al. 2013), откриваме, че размерът на малкия мозък в Atm735×R3× ; Мишките Aptx първоначално са нормални, но прогресивно атрофират едновременно с промени в неврологичната функция. Въпреки че загубата на церебеларна тъкан се счита за основна причина за атаксия при хора, не е ясно от клиничните данни дали тежестта на атаксията е добър предиктор за степента на дегенерация на малкия мозък, открита след смъртта (Aguilar et al. 1968b: Crawford et al, 2006 : Dineen et al.2020). В банкомата?35×R35×; Aptx^ мишки, откриваме ясна атрофия, свързана с изтъняване на дендритния слой на неврона на Пуркиние, което предшества късните, тежки поведенчески дефицити. Нашите хистологични наблюдения в Atm?35xR35×; Aptx'мишките предполагат, че промените в самата церебеларна функция, а не дълбока загуба на церебеларни клетки, са достатъчни, за да причинят атактичен фенотип, в съответствие с наблюдението на поведенчески дефекти преди значителна загуба на PN в няколко SCA (Shakkottai et al. 2011: Lorenzetti и др., 2000 г.; Кларк и др., 1997 г.; Jayabal и др., 2016 г.). Причината, поради която дефицитът на ATM и APTX е необходим за генериране на атаксия при мишки, когато загубата на едно от двете е достатъчна, за да причини атаксия при хора, остава неясна. Една от възможностите е, че мозъкът на гризачите може по-гъвкаво да използва компенсаторни пътища или излишни протеини, докато реагира на 10-20k ДНК лезии, които влияят на клетките всеки ден (Lindahl and Barnes 2000). Съществуват няколко форми на поправка на ДНК, които потенциално могат да отговорят на това предизвикателство, включително поправка чрез изрязване на основа (BER), поправка по изрязване на нуклеотиди (NER),

Щракнете тук, за да научите повече за Cistanche

както и хомоложни и нехомоложни краища (HEJ и NHEJ, съответно), всички от които са замесени ATM и APTX (Chou et al.2015; Caglayan et al.2017; Wakasugi et al. 2014; Tumbale et al. 2018; Chatterjee and Walker 2017) Алтернативно, това може да бъде случай, че дефицитът на ATM или APTX сам по себе си не влияе адекватно на здравето на клетките по време на сравнително краткия живот на мишката и по този начин елиминирането на двата протеина е необходимо за постигане на достатъчно натрупване на увреждане на ДНК, което да се прояви през този период от време. Тази възможност е подсилена от факта, че ATM и APTX имат различни биохимични свойства и функционални роли в реакцията на увреждане на ДНК и следователно дефицитът и на двата би бил предвиден да причини по-широк удар върху стабилността на генома (т.е. повишен генотоксичен стрес). Нашето откритие, че са необходими два протеина на пътя за стабилност на генома, за да индуцират неврологични дефекти при мишки, категорично предполага, че загубата на Oriole на ATM при възстановяване на ДНК, а не потенциалните функции в сигнализирането на оксидативен стрес, митофагията или митохондриалната функция причиняват церебеларните дефекти ( Шайло 2020 г.). Алтернативи обаче не могат да бъдат напълно изключени, тъй като APTX, подобно на ATM, е наблюдаван в митохондриите на мозъчните клетки, където се смята, че поддържа обработката на митохондриална ДНК (Meagher и Lightowlers 2014; Sykora et al. 2011). Този нов модел на мишка предоставя нов инструмент за изследване на тези възможности и механично дефиниране как загубата на ATM и APTX в крайна сметка причинява дисфункция на малкия мозък. Биофизичните смущения, наблюдавани в PN, записани от AtmR35XR35X; Aptx мишки се срещат по подобен начин в няколко други миши модела на атаксия. Това включва промени, които наблюдавахме във входното съпротивление на PN, капацитета на мембраната и прага и ширината на AP, които също са описани в миши модели на SCA като 1, 3 и 7 (Stoyas et al.2020; Shakkottai et al.2011; Dell „Orco et al.2015). Освен това, прогресивното намаляване на честотата на задействане на потенциала на действие на PN, което докладваме, положително корелира с развитието на атаксия в AtrnR35XR35X; Aptx'mice се съобщава в голям брой атаксични модели на мишки, включително SCAs 1, 2, 3,5, 6 и 13, както и няколко епизодични форми (вижте преглед (Cook, Fields и Watt 2021)). Като се има предвид значителното припокриване на смущенията на PN, наблюдавани при много различни атаксии, причинени от различни клетъчни дефекти, възстановяването на честотите на задействане на PN AP се счита за широкообхватен терапевтичен подход. Въпреки това, остава неясно дали намаленото PN изстрелване е причинен фактор за атаксия. Нещо повече, експерименталните доказателства предполагат, че промените в активността на PN могат всъщност да бъдат генерализиран отговор за поддържане на хомеостазата по време на продължаващо свързано със заболяването увреждане на физиологията на PN (Dell'Orco et al.2015). По този начин са необходими постоянни усилия във всички церебеларни атаксии, за да се свържат генетичните, молекулярни и клетъчни смущения, причинени от заболяване, със специфичните промени в церебеларната невронна сигнализация, която в крайна сметка генерира атаксия. От съществено значение в това усилие ще бъде определянето дали причиняващите болести церебеларни дефекти обикновено или диференцирано причиняват атаксия чрез загуба на мозъчна функция (напр. загуба на координиращи сигнали по време на движение) или от доминантно-отрицателен ефект (напр. разрушаване на нервната система надолу по веригата вериги с необичайни невронни изходни модели). В крайна сметка, докато обща терапевтична стратегия за справяне с церебеларните атаксии би имала най-голямо въздействие, насочен подход, който адресира отделните генетични и молекулярни причини за клетъчна дисфункция, в крайна сметка може да бъде необходим за успешното разработване на ефикасно терапевтично средство. Механистичната връзка между дефицит на ДНК стабилни протеини като ATM и APTX и PN дисфункцията далеч не е ясна. Нашите резултати предполагат, че ефектът от загубата на ATM и APTX върху PN е присъщ, тъй като не откриваме промени в пресинаптичните свойства на гранулираните клетки или доказателства за тяхната клетъчна загуба (няма промяна в дебелината на GCL). Освен това, въпреки че наблюдавахме разлики в краткосрочната пластичност на долните оливни входове в ATM- и APTX-дефицитни PNs и див тип, тези резултати вероятно сочат към нарушаване на Ca2* хомеостазата потенциално чрез намаляване на инозитол 1,4,5- експресия на трифосфатен рецептор 1 (ltpr1), подобна на наблюдаваната при SCAs 1, 2 и 3 миши модели, както и мишки с дефицит на ATM (Kim et al. 2020; Chen et al. 2008; Demirci et al. 2009; Shakkottai et ал.2011). Въпреки че това предоставя обещаващ път за бъдещи изследвания и сравнения, все още не е ясно, дори за SCAs, дали промените в Ca²* хомеостазата са причинният фактор или просто още един симптом или дори компенсаторен отговор на болни или нарушени PN (Dell „Orco et al.2015). В имунната система ATM е замесен в ремонта на прекъсвания на ДНК, които естествено възникват по време на генно пренареждане на гени на антигенни рецептори в B- и T-клетъчни прекурсори, феномен, критичен за разнообразието на антигенните рецептори (LG и TCR) на тези клетки. намирайки товаТ-клетъчнапропорциите в кръвта са значително намалени, е в съответствие с предишни проучвания при хора и AT нокаут мишки (Schubert, Reichenbach и Zielen 2002; Hathcock et al. 2013; Chao, Yang и Xu 2000; Barlow et al. 1996). Това намаляване на Т-клетките в периферията вероятно корелира с дефект както в клетъчния, така и в хуморалния имунитет. Важно е, че открихме, че експресията на едно копие на ATM гена е достатъчна, за да възстанови CD4 плюс дефицитите в кръвта, което показва, че терапиите, способни да възстановят частичната ATM експресия, биха имали терапевтична ефикасност. Въпреки че не сме оценили развитието на B-клетките в тази статия, вероятно е подобни заключения да се прилагат за този процес, като се имат предвид техните механистични прилики (Marshall et al. 2018). Както се очаква, намаляването на Т-клетките в периферната кръв е свързано с дефектното развитие на тимоцитите. В тимуса открихме два основни дефекта. Единият, индуциран предимно от дефицит на APTX, се проявява като дефект в прехода DN3 към DN4, съвпадащ с ранното пренареждане на TCR локуса. Другият дефект, главно причинен от дефицит на ATM, корелира с намалена прогресия на двойно положителни CD4*CD8 към единично положителни клетки, предимно CD4' тимоцити. Докато констатацията на APTX беше изненадваща, тъй като неговият дефицит (AOA 1) не е свързан с имунен дефицит, известно е, че APTX взаимодейства с протеини за пренареждане на TCR ген, включително XRCC4 (Clements et al. 2004). Бъдещи проучвания, насочени към определяне на ролята на APTX в механизмите за свързване на краищата по време на пренареждане на TCR ген, ще бъдат

важно и възможността, че алтернативни механизми за свързване на краищата, като използването на микрохомологии, обясняват липсата на имунен дефицит в негово отсъствие, се нуждае от допълнително изследване (Bogue et al. 1997). Оцеляването на Atm?35×/R35×; Aptx'mice е значително по-дълъг от предишните модели AT мишки. За сравнение, първотоПРИ КОмодел на мишка, докладван от Barlow et al. умират от тимоми обикновено в рамките на 2-4 месеца след раждането (Barlow et al. 1996). Намалената преживяемост при рак в този и много други модели на нокаут AT мишка вероятно е генетична, тъй като е доказано, че фоновият щам, приютяващ мутацията, има значителни ефекти върху разпространението на рака и преживяемостта с A/J и C57BL/6

фонове със значително повишена преживяемост спрямо щамовете BALBC и 129S (Genik et al. 2014). Фактът, че нашите ATM-дефицитни мишки са създадени на фона на C57BL/6, вероятно е в основата; че Aptx*t мишките не развиват атаксия, това е техният сравнително дълъг живот. Като се има предвид, че Atm35xR35×; Малко вероятно е ранната смърт при AT KO мишки да предотврати наблюдението на атаксичен фенотип, който иначе би се развил при тези мишки. Не е известно обаче дали фонът на C57BL/6 придава устойчивост на развиваща се атаксия, както при рак. Определянето на генетичните или евентуално епигенетичните фактори, които влияят върху тежестта на заболяването, може да осигури възможности за бъдещо терапевтично развитие. Като се има предвид глобалната природа на нулевата мутация на ATM и APTX в нашия модел на мишка, не можем напълно да изключим, че екстрацеребеларните дефекти могат също да допринесат за тежкия атактичен фенотип и по този начин за бъдещо изследване извън малкия мозък в предния мозък, мозъчния ствол, гръбначния мозък , и дори мускулите ще трябва да се провеждат. В рамките на малкия мозък, докато открихме някои анатомични разлики в свойствата на PN изстрелване в различни области на малкия мозък, не открихме регионални разлики в ML ширината или PN плътността. Съществуват обаче предизвикателства при използването на регионалната анатомия като фактор за групиране в малкия мозък, тъй като физическите гънки на тъканта не корелират непременно с границите на функционалните, молекулярните експресии или домейните на физиологичните свойства, които са описани (Apps and Hawkes 2009 ; Tsutsumi et al.2015; Gao, van Beugen и De Zeeuw 2012; Zhou et al.2014). Експериментите, фокусирани върху изследване на степента на дефектите на малкия мозък в тези области, ще бъдат важни в бъдещи проучвания и в сравнение с анекдотичните доклади за анатомични разлики при пациенти с АТ (Verhagen et al. 2012; De Leon, Grover и Huff 1976; Amromin, Boder, и Teplitz 1979; Monaco et al. 1988; Terplan и Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare и Lopez 1967; Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983). Въпреки че откриваме два потенциални етапа в прогресията на атаксията в Atm735wR35x; Aptx мишки, по-късният стадий на тежка атаксия се развива в зряла възраст при мишки, в сравнение с началото на детството при хората. Това може да ограничи употребата му в някои изследвания на неврологичното развитие. Също така, тълкуването на бъдещи експерименти трябва внимателно да вземе предвид факта, че този нов модел изразява нулеви мутации в два гена за стабилност на генома едновременно, ситуация, която не е открита при пациенти с AT или AOA1. И накрая, определянето къде, кога и как дефицитът на ATM причинява церебеларна патология и атаксия е предизвикателство, тъй като предишните мишки с дефицит на ATM обикновено нямат характерните характеристики, необходими за причинно-следствена връзка на клетъчните и молекулярните дефицити с атаксичния фенотип. Дефинирани са множество обещаващи пътища за изследване, включително тези, фокусирани върху невронно ниво, където ATM е замесен в сигнализирането на оксидативния стрес (Chen et al.2003) и синаптичната функция (Li et al.2009; Vail et al.2016), като както и глиалната функция, където последните доказателства сочат, че глиалната патология може да бъде водещ фактор в церебеларната патология (Kaminsky et al. 2016; Campbell et al. 2016; Petersen, Rimkus и Wassarman 2012; Weyemi et al. 2015). Този нов животински модел предоставя нов инструмент за тестване на механистични хипотези относно това как дефицитът на ATM причинява церебеларна патология и атаксия. В допълнение, този модел може да служи най-важното като критичен предклиничен инструмент за тестване на предварително предложени терапевтични кандидати (Browne et al.2004; Chen et al.2003) и нашите собствени SMRT съединения (Du et al. 2013). Тежките ограничения на липсата на подходящ предклиничен модел за терапевтични тестове, особено за редки заболявания като AT и AOA1, не могат да бъдат надценени.

4.0 Материали и методи

4.1 Етична декларация

Това изследване е извършено в строго съответствие с препоръките в Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни на Националните здравни институти. Всички животни бяха обработени съгласно одобрените протоколи на Комитета за грижа и използване на животните (IACUC) в Института Лундквист (31374-03,31773-02) и UCLA(ARC-2007-082, ARC{{3} }). Протоколът беше одобрен от Комитета по етика на експериментите с животни на Института Лундквист (Номер на удостоверение: D16-00213). Бяха положени всички усилия за минимизиране на болката и страданието чрез предоставяне на подкрепа, когато е необходимо, и избор на етични крайни точки.

4.2 Мишки

All mice were group-housed and kept under a 12-h day/night cycle with food and water available ad libitum. Animals were housed within the general mouse house population, and not in specialized pathogen-free rooms. Older animals were made available wetted food or food gel packs on the ground of the cages as ataxia developed. Atm35 and Atm935×mice were created and provided by Dr. Hicks and colleagues at the University of Manitoba. These mice were created to contain the c.103C>T мутация, открита в голяма популация от Северна АфрикаATпациенти using recombineering Gateway technology and site-directed mutagenesis. A C>T mutation at this position in the mouse Atm gene creates a TAG G stop codon. The same mutation in the human ATM gene produces a TGA G stop codon. In consideration of the use of these models for therapeutic interventions, we chose to create a mouse model for each of the two PTC codons(Fig.1A). A modified Gateway R3-R4-destination vector was used to pull out the desired region of the mouse Atm gene from a Bacterial Artificial Chromosome (BAC) and subsequently mutated to create either a TAG G stop codon at codon 35(M00001, position 103(C>T))or a TGA G stop codon (M00002, position 103 (CAG>TGA), репликиране на човешкия AT PTC). След това геномните алели бяха клонирани в модифицирана версия на NorCOMM таргетния вектор за бозайници с помощта на 3-way Gateway Reaction (Bradley et al. 2012). Получените прицелни вектори бяха електропорирани в C2 ES клетки (C57BI/6N, получени в A. Nagy lab, Торонто, Канада) и успешно насочените клонове бяха идентифицирани чрез селекция с G418 (Gertsenstein et al. 2010). Интегрирането на мутиралата таргетираща касета в Atm генния локус беше потвърдено чрез Southern blot и чрез секвениране на PCR продукти, за да се потвърди наличието на Atm PTC мутация, безпогрешно насочване в Atm локуса и безгрешни функционални компоненти на

вектор (данните не са показани). Положителните ES клонове бяха използвани за инжектиране на бластоцисти за получаване на трансгенни линии. Трансгенният алел съдържа floxed човешки бета-актин промотор-делтаTK1-Neo cassette in the intron upstream of the region containing the mutated exon. This floxed cassette was subsequently excised by crossing with a Cre driver mouse(B6.C-Tg(CMV-are)1Cgn/J) to generate Atm3x+ and AtmM1(103CTMFcc, respectively) mouse lines Atm35×+ (MGI nomenclature: AtmTM1(103CAG>TGA)MFGCc;(фиг.1A). Генотипизирането на двете Atm линии беше извършено чрез използване на следните праймери при Tm 62 градусов градус: Atm ген преден (F) праймер: 5'-CCTTTGAGGCATAAGTTGCAACTTG-3'; и обратен (R) праймер на ген Atm: 5'-GTACAGTGTATCAGGTTAGGCATGC-3', създавайки алелен продукт от див тип от 151 bp или целеви алелен продукт от 241 bp (Фигури 1A, 1B). Atmn35~ и Atm035×v бяха обратно кръстосани с C57Bl/6J мишки за 9 поколения (99,2 процента изогенни) преди криоконсервация и последваща редеривация с помощта на C57BI/6J сурогатни майки. Atm735× и Atm?35x и Atm 35×/Q35× са размножители, получени от F1 братя Atm35 и Atm835X плюс мишки. AtmR35×k35×: и двете бяха установени като плодовити. Aptx нокаут (Aptx) мишки бяха създадени и предоставени на д-р Mathews като ембриони от д-р McKinnon (Ahel et al.2006) и впоследствие повторно получени чрез C57Bl/6J сурогатни майки. Aptx' мишките са на C57Bl/6 и 129 смесен фон. Atm35k35; Aptx мишки от различни диви, хетерозиготни и хомозиготни комбинации бяха създадени от Atm35X; Aptxt размножители са генерирани чрез кръстосване на Atm?35×R35 и Aptx^ мишки. Една кохорта от двойни мутанти и съответните контролни мишки беше използвана в надлъжното поведенческо изследване за анализи на походката и SHERPA тестване (Фигури 2, 3). Множество допълнителни кохорти от съвпадащи по възраст двойни мутантни и контролни мишки бяха използвани за електрофизиологични, имунохистологични и тестови експерименти с вертикален полюс (Фигури 4, 7). Имунологични и протеинови експресионни експерименти бяха проведени с използване на мишки, развъждани от оригиналните AtmR35× и Atm35× повторно получени мишки (Фигури 5, 6 и 8). Генотипизирането беше извършено от проби от ушна тъкан на P8-11 мишки. Методите на PCR в реално време, проведени от Transnetyx Inc., бяха използвани за определяне на генотипа на всяко животно. Животните са разпознаваеми чрез татуировки на пръстите на краката, дадени едновременно с биопсия на ухото. Уникалните праймери за Atm35× и Atm35× бяха количествено определени и използвани за идентифициране на див тип, хетерозиготни и хомозиготни мишки (изброени по-горе). Праймерите Aptx' и Aptx*" бяха използвани за оценка на техните генотипове.

4.3 Здраве на животните

Животните бяха претеглени чрез цифрова везна при P8, 45, 120,210,400. Смъртта на животните е записана като деня, в който са намерени мъртви, или в деня на евтаназирането, когато животните са достигнали хуманна крайна точка (животно не може да се оправи в рамките на 60-те години, значително сплъстяване на косата, което показва липса на самоподстригване или прекомерен дистрес, както е отбелязано от ветеринарния лекар персонал). Труповете на животните са замразявани незабавно след смъртта им, а следсмъртните аутопсии са извършвани на партиди. Вероятната причина за смъртта беше определена според нашите възможности в сътрудничество с ветеринарния лекар (д-р Каталина Гуера) чрез визуална проверка на вътрешните органи. Някои мишки бяха канибализирани или случайно изхвърлени от персонала на вивариума и бяха

следователно етикетирани като "липсващи." Мишки без забележима визуална причина за смъртта бяха етикетирани като "неопределими." Мишки, които бяха открити с гръдни маси близо до мястото, където нормално би бил тимусът при млади мишки, бяха посочени като имащи "рак на тимуса." Всички други идентифицирани вероятните причини за смърт (напр. увеличен черен дроб, запушване на урината) са означени като „други“.

4.4 Поведение

Преди извършване на поведенчески тест, мишките се аклиматизират към поведенческия пакет за ~ 20 минути. Мишките бяха тествани в различни часове на деня, в съответствие с дневния им цикъл. Батерия от поведенчески тестове беше извършена върху наивни двойни мутантни мишки от посочените генотипове в различни моменти от време в зависимост от поведението, но в същата кохорта от мишки. Батерията от тестове включваше оценката на походката на Catwalk (P45, 120,210, 400) и подгрупа от тестовете SmithKline-Beecham Harwell Imperial-College и Royal-London-Hospital Phenotype Assessment (SHERPA) (P30 и 400). Тези тестове са проведени от поведенческото ядро ​​на UCLA. Двойно мутантните и контролните мишки бяха допълнително изследвани чрез теста с вертикален полюс. Всички поведенчески апарати бяха изтрити с етанол (70 процента) между всеки тестван субект.

Анализ на походката

Използвахме система за анализ на походката Noldus Catwalk, предназначена за полуавтоматично измерване и анализ на походката на мишки по време на нормално движение. Накратко, движението на мишки през коридор със стъклено дъно е видео, записано от централна позиция. Отпечатъците от лапи са подчертани във видеото поради светлинното осветление през стъклената платформа за ходене. Всяка стъпка на мишката в рамките на видеоклип впоследствие се открива с помощта на Catwalk XT (Noldus) по полуавтоматичен начин. Серия за всяка мишка се състои от 3 опита на последователно придвижване през наблюдаваната платформа. Приемат се само последователни опити и мишките може да отнеме до 10 опита, за да завършат 3 съвместими опита във всяка посока през коридора. Съвместимите изпитания бяха определени като такива с движение през платформата с дължина под 5 s и с не повече от 60 процента вариация на скоростта. Веднъж поставени на платформата, мишките обикновено тичаха напред-назад, без да има нужда от подсказване на експериментатора.

Вертикален стълб

Мишките се поставят на върха на 80 cm висок болт с носа им надолу и задните лапи възможно най-близо до върха. Мишките се освобождават незабавно и времето започва веднага след поставянето.

Времето спира, когато първата предна лапа докосне повърхността под стълба. Естественото предпочитание на мишките е незабавно да се спуснат по стълба и им се дават до 60 секунди, за да прекосят стълба, в противен случай им се помага да слязат от стълба. На незавършено изпитване автоматично се дава време от 30 секунди, тъй като 95 процента от мишките, които не са се спуснали в рамките на 30 секунди, все още са били на полюса на 60-те секунди. Поведенческите тестове на SHIRPA бяха проведени от поведенческото ядро ​​на Калифорнийския университет в Лос Анджелис на P30

и P400. Всички параметри се оценяват, за да се осигури количествена оценка. което дава възможност за сравнение на резултатите както във времето, така и между различни лаборатории. Всяка мишка беше последователно тествана във всички поведения в рамките на ~20-мин период от време, преди да се премине към следващата мишка. Експериментаторът беше заслепен за генотипа на животното. Скринингът беше извършен, както е описано по-рано (Rogers et al. 1997).

Наблюдение на поведението

Първичният екран предоставя профил за наблюдение на поведението и оценката на всяко животно започва с наблюдаване на необезпокоявано поведение в съд за наблюдение (10 см диаметър) в продължение на 5 минути. В допълнение към отбелязаните поведения на позиция на тялото, спонтанна активност, честота на дишане и тремор, наблюдателят регистрира всички случаи на странно или стереотипно поведение и конвулсии, компулсивно облизване, саморазрушително ухапване и ретропулсия (ходене назад) и признаци на пространствено дезориентация.

Поведение на арена

След това мишката се прехвърля на арената (30 cm х 50 cm) за тестване на възбуждането на трансфера и наблюдение на нормалното поведение. Арената е маркирана в мрежа от 10 x 10 cm² квадрати за измерване на локомоторната активност в рамките на 30 s-период. Докато мишката е активна на арената, измерванията на реакцията на стрес, походката, повдигането на таза и повдигането на опашката се записват.

Ограничаване в легнало положение

Животното е задържано в легнало положение, за да се запише автономното поведение. По време на тази оценка бяха оценени силата на захвата, тонусът на тялото, рефлексът на ушната мида, корнеалният рефлекс, прищипването на пръстите на краката, маневрата с тел и сърдечната честота.

Баланс и ориентация

Накрая бяха извършени няколко измервания на функцията на вестибуларната система. Бяха проведени изправящ рефлекс, контактен изправящ рефлекс и отрицателни тестове за геотаксис. По време на тази процедура се записват вокализация, уриниране и общ страх, раздразнителност или агресия.

Използвано оборудване

1. Арена от прозрачен плексиглас (приблизителни вътрешни размери 55x33 x18 cm). На пода на арената има лист от плексиглас, маркиран с 15 квадрата (11 см). Твърд хоризонтален тел (диаметър 3 mm) е закрепен през задния десен ъгъл, така че животните да не могат да докосват страните по време на маневрата на телта. Решетка (40x 20 cm) с 12 mm отвори (приблизително) е закрепена по цялата ширина на кутията за измерване на окачването на опашката и поведението на силата на захващане. 2. Прозрачен плексигласов цилиндър (15 x 11 cm) беше използван като буркан за гледане. 3. Един решетъчен под (40x 20 cm) с отвори 12 mm, върху който стоят буркани за гледане.4. Четири цилиндрични опори от неръждаема стомана (3 cm дължина x 2,5 cm диаметър) за повдигане на решетките от пейката. 5. Една квадратна (13 см) плоча от неръждаема стомана за пренасяне на животни на арената. 6. Отрязани дължини от 3/0 Mersilk, държани в форцепса за тестове за рефлекс на роговицата и ушната мида. 7. Пластмасов дюбел беше заточен до върха на молив, за да се тества слюноотделянето и захапването.8. Чифт щипки за дисекционно оборудване, извити с фини върхове (125 mm щипки, Philip Harris Scientific, кат. № D46-174), за прищипване на пръстите на краката. 9.Хронометър.10. IHR Click box се използва за тестване на реакциите на стрес. Click Box генерира кратък 20 kHz тон при 90dB SPL, когато се държи на 30 cm над мишката. Свържете се с проф. KP Steel, MRC Institute of Hearing Research, University Park, Nottingham NG7 2RD. 11. Линийка. 12. 30 cm прозрачна плексигласова тръба с вътрешен диаметър 2,5 cm за рефлекса за изправяне на контакта. 4.5 Електрофизиология Приготвяне на остър церебеларен срез Сладки парасагитални срезове с дебелина 300 μm бяха приготвени от малкия мозък на експериментални и контролни мишки от едно котило чрез следване на публикувани методи (Hansen et al., 2013). Накратко, церебелата беше бързо отстранена и потопена в леденостуден извънклетъчен разтвор със състав (mM): 119 NaCl, 26 NaHCOg, 11 глюкоза, 2,5 KCl, 2,5 CaCla, 1,3 MgCla и 1 NaHzPOa, рН 7,4, когато газиран с 5 процента CO-/95 процента O2. Церебелата се нарязва парасагитално с помощта на вибратом (Leica VT-100, Leica Biosystems, Nussloch, Германия) и първоначално се инкубира при 35 градуса за -30 минути, след което се уравновесява и съхранява при стайна температура до употреба. Извънклетъчна електрофизиология Извънклетъчни и вътреклетъчни записи бяха получени от неврони на Пуркиние (PNs) в срезове, постоянно перфузирани с извънклетъчен разтвор с карбогенни мехурчета и поддържани при 37 градуса C (извънклетъчен) или 32 градуса (вътреклетъчен) ± 1 градус (виж по-горе). Клетките се визуализират с DIC оптика и обектив с потапяне във вода 40 × (NA 0.75), като се използва микроскоп Zeiss Examiner. Стъклени пипети с резистентност ~3 MQ (Модел P-1000, Sutter Instruments, Novato, CA) бяха напълнени с екстрацелуларен разтвор и поставени близо до хълмчета на PN аксон, за да се измерят свързаните с потенциала на действие капацитивни токови преходни процеси в режим на напрежение с потенциал на пипетата, поддържан при 0 mV. За записи на пач-кламп на цели клетки, пипетите бяха напълнени с вътреклетъчен разтвор (mM): 140 месеца (CH3KO3S), 10 NaCl, 2 MgCl2, 0,2 CaClz, 10 HEPES, 14 фосфокреатин (трис сол), 1 EGTA, 4 Mg -ATP,0.4 Na-GTP.100 μM пикротоксин (Sigma) беше добавен за блокиране на инхибиторни GABAegeric синаптични входове. Данните са получени с помощта на

усилвател MultiClamp 700B при 20 или 100 kHz в режим на напрежение или ток, Digidata 1440 с pClamp10 (Molecular Devices, Сънивейл, Калифорния) и филтриран при 2 до 4 kHz. Серийното съпротивление обикновено беше между 10 и 15 MQ. Серийното съпротивление беше компенсирано на 80 процента само за краткосрочни експерименти за пластичност. За извънклетъчни записи бяха записани общо 20 до 45 PN за всяко животно във всички генотипове, полове и възрастови групи. Записите бяха разпределени както по медиално-латералната, така и по рострокаудалната ос на малкия мозък. Бяха изследвани само клетки със "здрав" вид (нисък контраст на клетъчните граници) и редовна, непрекъсната скорост на изстрелване. По време на анализа беше установено, че няколко клетки имат пропуски в изстрелването, по-големи от 2 секунди, и тези клетки бяха елиминирани от анализа, тъй като този тип изпичане се свързва с това, че е „нездравословен“. Двойната мутантна тъкан не се различава качествено в външен вид при DIC микроскопия преди записите, нито броят на "нездравите" клетки е по-голям от този на други генотипове (7 процента срещу 4 до 11 процента от всички клетки в контролните генотипове при P400). Пространственото сравнение на невронната активност беше получено чрез записване от серийни срезове във флокулуса, странични (2"d или 3'), междинни (6" или 7-ми) и медиални (11" или 12t) срезове. Използвани са срезове с по-малък брой по-младите възрастови групи (P45 и 110), за да съответстват приблизително на относителното позициониране на записите между възрастовите групи. 0-3 записи бяха направени от всяка лобула във всеки срез в зависимост от качеството и здравето на тъканта. Всеки запис продължи {{29} } минута 3 до 5 мишки бяха използвани за всяка възрастова група и експериментаторът беше заслепен за генотипа, възрастта и пола.

Вътреклетъчни записи бяха получени от PNs в лобула IIl или VIl на медиалния малък мозък (т.е. вермис); не са наблюдавани статистически разлики в свойствата между лобулите.

Анализи

Интерстимулните интервали на спонтанен потенциал за действие бяха открити и анализирани с помощта на стандартни и персонализирани процедури в ClampFit (Molecular Device), GoPro (Wavemetrics) и Excel (Microsoft). По-конкретно, потенциалите за действие бяха открити с прагове и статистическите данни за пиковете (т.е. честота и дължина на интервала) бяха определени с помощта на адаптирани пророутини (TaroTools;https://sites.google.com/site/tarotoolsregister/). Коефициентът на вариация на средния интервал между пикове (CV) и средният интервал между пикове (CV2=2 ISIn плюс 1-ISInl/(ISIn плюс 1 плюс ISIn)) бяха изчислени в Excel с помощта на потребителски макроси. Свойствата на стандартната мембрана бяха анализирани с помощта на lgorPro. RM се определя чрез осредняване на 3 отговора на следите на напрежението към -5 mV стъпков импулс от -80 mV потенциал за задържане и измерване на полученото отклонение на тока между 900 и 1000 ms след началото. Времевата константа на мембраната се измерва чрез монтиране на единична експоненциална фаза към началната фаза на разпадане от 90 процента до 10 процента от пика. CM се изчислява чрез разделяне на мембранната времеконстанта на RM. sEPSC събитията се записват за 1-минутна епоха и се откриват и измерват с помощта на Neuroexpress (v21.1.13). Паралелни и катерещи се влакнести аксони бяха стимулирани с помощта на тета-стъклени електроди (WPI) и TTL-контролиран изолатор на стимул (ISO-Flex, AMPI). Предизвиканите EPSC амплитуди и времеконстантите на затихване (1 експ. за паралелни и 2 експ. за катерещи влакна) бяха анализирани с помощта на персонализирани процедури в lgorPro. Потенциалите на действие бяха изследвани като част от набор от 1 s токови инжекции между -500 и 2250 pA (стъпки от 250 pA) със задържащ ток, регулиран за поддържане на ~70 mV потенциал. Формите на вълните на потенциала за действие бяха измерени с помощта на потребителски

рутинни процедури в lgorPro. Прагът на потенциала на действие се определя като първото напрежение на мембраната, при което първото производно надвишава 30 mV/ms (Zhu et al.2006).

4.6 Изследване на церебеларна атрофия

Размер на малкия мозък Веднага след отстраняването на мозъка от черепа беше получено дорзално цялостно изображение. След това изображенията бяха обработени с помощта на Фиджи (NIH). Размерите на предния мозък и малкия мозък бяха оценени чрез очертаване на 2-измерното им пространство и след това изчисляване на площта. Ние нормализирахме възможните разлики в общия размер на мозъка, като разделихме резултатите от малкия мозък на размера на предния мозък, за да получим относително съотношение между малкия мозък и предния мозък. Експериментаторите са били слепи за генотипа на животното. Имунохистохимия При съответните крайни точки на изследването (P45, 120,210,4{{7{{104}}}}0), мъжки и женски мишки от всички генотипове представен в това проучване е анестезиран с изофлуран и е подложен на транскардиална перфузия с фосфатно буфериран физиологичен разтвор, последван от 4 процента (w/v) буфериран параформалдехид (PFA) и след това дисектиран за екстракция на мозъка. Снимки на целия мозък са взети веднага след отстраняването на мозъка от черепа и след това мозъците са потопени в 4% PFA за 24 часа и след това криопротектирани в Tris-буфериран физиологичен разтвор (TBS) с 0,05% азид и 30% захароза за 72 часа. часа и се съхранява при 4 градуса до следваща употреба. Малкият мозък беше отделен от предния мозък и парасагитален срез с помощта на плъзгащ се микротом （Microm HM 430, Thermo Scientific）, настроен на срез с дебелина 40 μm. Срезове от малкия мозък се събират в серия от шест и се съхраняват в TBS-AF (TBS с 30 процента захароза, 0,05 процента натриев азид и 30 процента етилен гликол) при 4 градуса или -20 градуса до следваща употреба. За имунофлуоресцентна визуализация на неврони на Пуркиние, участъци от малкия мозък на двата Atm*; Aptx*t и Atm?35×R35×; Aptx^(n=5 за генотип) се промиват в продължение на 5 минути в TBS три пъти и след това се блокират в 15 процента нормален кози серум при стайна температура в продължение на 30 минути, последвано от свободно плаваща инкубация в заешки или миши анти-калбиндин D -28k (1:1000) за 1 час при стайна температура върху орбитален шейкър. След това срезовете се промиват в продължение на 5 минути с TBS три пъти, последвано от свободно плаваща инкубация в кози анти-заешки или миши Alexa Fluor 488 (1:1000) в продължение на 1 час на тъмно при стайна температура върху орбитален шейкър. След вторична инкубация на антитела, срезовете се промиват в продължение на 5 минути в TBS три пъти, след това се монтират и покриват с Fluoromount-G с DAPI. За някои участъци, анти-разцепените Caspase-3(1:200) и анти-CD68(1:400) антитела бяха допълнително изследвани успоредно с Calbindin с помощта на Alexa Fluor 647 (1:500) вторично антитяло. Слайдовете бяха сканирани с помощта на Stereo Investigator (MBF Bioscience, версия 2020) на микроскоп Zeiss, оборудван с ApoTome 2 (Carl Zeiss Microscopy, Axio Imager.M2), използвайки 2,5, 10, 20, 40 или 63x обектив и изображения заснети с Hamamatsu CMOS камера (Hamamatsu Photonics, ORCA Flash 4.0 LT plus). За да определим количествено броя на реактивните на калбиндин клетки във всяка лобула в получените изображения, използвахме Stereo Investigator, за да начертаем произволно 2 линии с дължина между 300 до 500 μm в всяка лобула и ръчно преброи общия брой PNs по дължината в рамките на 40 um дебелина на тъканния срез при 40x увеличение. 2D плътност (# PNs/(линейна дължина*40 um дебелина)) на двете проби на лобула след това бяха осреднено за по-нататъшно сравнение между лобули и животни. Ширините на положителните за калбиндин PN дендрити бяха измерени на предварително определено място в лобула VI от всяко животно в тъканни срезове с дебелина 25 или 40 um при 20x увеличение. Дендритните ширини на първичния и вторичния клон се измерват по средната линия между телата на PN клетката и ръба на молекулярния слой. Измерени са между 7 и 13 дендрита на срез, по един срез на животно. За соматични измервания на PN, Stereo Investigator беше използван за произволен избор на PN, разпределени в цялата медиална секция под 20x увеличение. Средната PN ширина на животно се определя чрез осредняване на резултатите в 3 серийни секции (16 до 37 PN на секция). PN ширините се измерват перпендикулярно на PN слоя или на излизащия дендрит, ако е наклонен с повече от няколко градуса. Ширините на молекулярния слой и гранулирания клетъчен слой (визуализирани съответно с оцветяване на Calbindin и DAPI) бяха оценени в Stereo Investigator чрез осредняване на две измервания на ширината на предварително определени места за всяка лобула, приблизително по средата заедно с дългата дължина на всяка лобула при 2,5x увеличение. CD68 положителността в церебеларните секции се определя количествено чрез измерване на общата процентна площ на CD68 плюс положително оцветяване в цялата медиална церебеларна секция. 10x зашити изображения бяха прагово оценени към отрицателната контрола и количествено определени с помощта на ImageJ, един раздел на животно. За да определим количествено процента на калбиндин-позитивните PN, които са били положителни за разцепена каспаза-3, ние преброихме PN в целия малък мозък с помощта на Stereo Investigator. Бяха изследвани три зашити изображения с 20x увеличение на животно и резултатите бяха осреднени. Прагът за положителност на Caspase-3 беше установен от контролни срезове, оцветени само с вторичните антитела. За нефлуоресцентен хистологичен анализ, 25-um-дебели, свободно плаващи тъканни срезове върху положително заредени слайдове и изсушени на въздух за една нощ. Тъканта се промива с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) два пъти за 5 минути, след което се оцветява последователно с 0,1 процента хематоксилин в 95 процента етанол за ~25 секунди и 0,5 процента еозин в 95 процента етанол за ~3 секунди и се промива в двойно дестилирана вода след това. всяко петно. След това тъканта се дехидратира за 1 минута в 95 процента етанол, 100 процента етанол и 100 процента ксилен промивки, след което се покрива с покривно стъкло с Permount. Слайдовете бяха изобразени с помощта на цветна камера (Q Imaging, MBF Biosciences) на същия микроскоп Zeiss и MBF софтуер за придобиване. Експериментаторите бяха заслепени за генотипа на мишката, в който бяха изследвани срезовете, и редът на изследване беше подреден за всички хистологични измервания.

4.7 Измервания с поточна цитометрия

Анализът на поточната цитометрия на кръвта и клетките на тимуса се извършва чрез оцветяване със специфични анти-миши антитела∶CD4, CD8, CD3, CD44 и CD25. Накратко, проби от цяла кръв (50 μ） бяха оцветени с помощта на флуоресцентно белязани антитела, след това червените кръвни клетки бяха лизирани с помощта на BD лизиращ разтвор, докато живите бели кръвни клетки бяха оцветени с помощта на оцветяване за жизнеспособност. Тимусите са механично дисоциирани. 1 до 2 милиона тимусни клетки бяха оцветени по подобен начин с помощта на специфични антитела за CD4, CD8, CD44 и CD25. Анализът на имунооцветени бели кръвни клетки или проби от тимус беше извършен с помощта на FACS ARIA 1 и данните бяха анализирани с помощта на софтуер FlowJo, както беше докладвано по-рано (Sanghez et al. 2017).

4.8 Западни BIots

Протеиновите екстракти (клетки/тъкани) се хомогенизират в лизисен буфер за радиоимунопреципитационен анализ (RIPA) (150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40 [NP-40],0 .5 процента деоксихолат, 0.1 процента SDS, 50 mM Tris, pH 8,0) с протеазни инхибитори (10 ug/ml AEBSF, 10 ug/ml леупептин, 5 ug/ml пепстатин, 5 ug/ml химотрипсин, 10 ug/ml апротинин). Протеиновите екстракти се обработват с ултразвук и след това се пелетират чрез центрофугиране при 13,000 rpm за 15 минути при 4°C. BCA протеинов анализ беше използван за количествено определяне на протеиновите концентрации. Проби, съдържащи равни количества протеин от 50 до 100 ug на лента, се разделят с помощта на 4 до 12 процента градиент TGX готови гелове BioRad, след което се прехвърлят чрез TransBlot Semi-Dry BioRad система, използвайки нитроцелулозен трансферен пакет. Трансферираните петна се оцветяват с оцветяване на Ponceau S за еднакво протеиново натоварване, след което се промиват и блокират с 5 процента обезмаслено сухо мляко в TBST за 60 минути при стайна температура. Първичните антитела се инкубират с разклащане за една нощ при 4 градуса. Блотове бяха изследвани за следните антитела: ATM (D2E2) заешко mAb клетъчно сигнализиране, при разреждане 1:1000, -актин (D6A8) заешко mAb клетъчно сигнализиране, GAPDH (D16H11) заешко mAb клетъчно сигнализиране, последвано от подходящ конюгиран с пероксидаза от хрян ( HRP) вторичен анти-заешки, анти-миши за 2 часа при стайна температура. След множество промивания с TBST, протеиновата експресия беше открита от Radiance Plus хемилуминесцентен субстрат, използвайки Azure c400 и BioRad ChemiDoc системи за изображения. Денситометричният анализ на банкомата беше извършен с помощта на ImageJ. Експериментите бяха проведени с 2 технически и 2-3 биологични реплики, както е посочено.

4.9 Статистическа оценка

Броят животни, избрани за всяка група, се основава на априорни анализи на мощността с помощта на GPower v3.1 въз основа на размер 0.5, мощност 0.8 и размери на ефекта, изчислени от предварителни данни или предишни проучвания. Използвахме както параметрични (1-, така и 2-way ANOVA) за нормално разпределени и непараметрични (Kruskal Wallace) статистически методи за интервални данни, за да тестваме разликите между групите, последвани от тестове за множество сравнения по двойки, както е посочено в Текстът. Извънредности за имунни данни на фиг. 6 и 7 бяха изключени чрез метода ROUT (Q=2 процента). Конкретните анализи, използвани за всеки набор от данни, са отбелязани в легендата на всяка фигура. За всички фигури: ns не е значимо,*p По-малко или равно на 0.05,** p<0.01,***><0.001,****><0.0001. data="" are="" reported="" as="" mean="" ±="" sem="" and="" box="" and="" whisker="" plots="" indicate="" the="" minimum,="" first="" quartile,="" median,="" third="" quartile,="" and="" maximum="" data="" values.="" all="" figures="" and="" statistical="" analyses="" were="" completed="" using="" excel="" (microsoft="" 360)="" or="" prism="" v8="" and="" 9="">