Част 3 Изследванията показват, че автофагията играе важна роля в регулирането на клетъчното отлагане на LD

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

АБСТРАКТ

Появяващите се доказателства показват, че неочаквано отлагане на липидни капчици (LD) и пероксидация могат да ускорят стреса на органелите и играят решаваща роля в патогенезата на невродегенеративните заболявания (NDD). В нашето предишно проучване ние потвърдихме, че кемпферол (Ka), малка естествена флавоноидна молекула, показва невропротективни ефекти върху мишки с LPS-индуцирана болест на Паркинсон (PD). В допълнение, предишни проучвания показват, че автофагията играе важна роля в регулирането на клетъчното отлагане на LD. В настоящото проучване ние показахме, че Ka защитава срещу TH плюс загуба на неврони и поведенчески дефицити в MPTP/p-индуцирани PD мишки, придружени от намален липиден оксидативен стрес в substantia nigra pars compacta (SNpc). В култивираните невронни клетки Ka показва относително безопасен диапазон на концентрация и значително потиска натрупването на LD и клетъчната апоптоза, индуцирана от MPP plus. По-нататъшно проучване показва, че защитният ефект на Ка зависи от аутофагията, по-специално липофагията. Критично, Ka насърчава аутофагията, за да медиира разграждането на LD в лизозомите, което след това облекчава отлагането на липиди и пероксидацията и произтичащото от това увреждане на митохондриите, като впоследствие намалява невронната смърт. Освен това, AAV-shAtg5-медиираният нокдаун на Atg5 премахва невропротективните ефекти на Ka срещу липидното окисление при PD мишки.Cistanche за подобряване на паметтаТази работа демонстрира, че Ka предотвратява допаминергичната невронална дегенерация при PD чрез инхибиране на митохондриално увреждане, медиирано от липидна пероксидация, чрез насърчаване на автофагия на устните и осигурява потенциална нова терапевтична стратегия за PD и свързани с него NDD.

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Въведение

Болестта на Паркинсон (PD) е често срещано невродегенеративно заболяване (NDD), което патологично се характеризира с прогресивна загуба на допаминергични (DA) неврони в substantia nigra pars compacta (SNpc)[1]. Въпреки че точната етиология и естественият ход на това заболяване все още не са напълно изяснени, множество процеси и дисфункции на системно ниво, включително митохондриални функции, допаминова хомеостаза, невровъзпаление и автофагия, са замесени в патогенезата на PD [1, 2]. Последните доклади разкриват, че липотоксичността, свързана с липидните капчици (LD), може да участва в патологията на PD [3, 4]. LD са силно динамични органели, които излизат от мембраната на ендоплазмения ретикулум (ER) и обикновено служат като вътреклетъчни места за съхранение на неутрални липиди [5]. ]. Наскоро беше показано, че LDs играят много по-широка роля от съхранението на мастни киселини (FA) и участват в много заболявания. (cistanche para que serve) Например, миелоидните клетки, включително макрофаги, левкоцити и еозинофили, образуват LD в отговор на възпаление и стрес,cistanche на китайскии LD са места за производство и съхранение на възпалителни цитокини и допълнително участват в представянето на антигена и изчистването на патогена [6]. Важно е, че при атеросклерозата е доказано, че богатите на LD пенести клетки са вредни във всички стадии на заболяването [7].

Cistanche може да подобри имунитета

Въпреки това, LDs не са широко проучени в централната нервна система (ЦНС), като малко статии съобщават за хистологично присъствие на LDs в човешката мозъчна тъкан [8,9]. Дори и така, LD могат да имат важни функции в мозъка, тъй като последните проучвания потвърждават, че агрегираните LD в глията ускоряват невродегенерацията в модел на Drosophila [10]. Наскоро беше съобщено, че при мишки масленочервени О-позитивни натоварени с липиди клетки, включително неврони, астроцити на глиален фибриларен киселинен протеин (GFAP) и йонизирана калций-свързваща адапторна молекула-1 (IBA{{7} })t микроглия присъстват в много области на мозъка и е доказано, че участват в процесите, свързани с възрастта [11]. Нашата предишна работа също демонстрира повишено натрупване на LD в мозъка в модел на PD мишка [12]. Взети заедно, тези проучвания предполагат, че LDs могат да бъдат включени в патогенезата на PD, както и други NDDs.

Обикновено вътреклетъчните LD се разграждат в лизозомите и доставят FA на митохондриите за тяхната консумация като алтернативен източник на енергия по време на периоди на изчерпване на хранителните вещества [13]. Въпреки това, невроните имат нисък капацитет за потребление на митохондриална FA за производство на енергия [14]. Тази характеристика прави невроните особено чувствителни към натрупване и пероксидация на LD. Освен това, натрупването на LDs повишава скоростта на окисление на FA и налага постоянен натиск върху митохондриалната верига за транспортиране на електрони, което увеличава производството на реактивни кислородни видове (ROS) от комплексите I и III на транспортната верига на електрони [15] за усилване на оксидативния стрес. Липидното претоварване също води до производство на ROS от екстрамитохондриални източници като никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADPH) оксидази и други окислителни ензими. В комбинация с намалената експресия на антиоксидантни ензими и ниския капацитет за консумация на FA в невроните, натрупването на LD медиира оксидативния стрес и може допълнително да доведе до митохондриално увреждане, лизозомна дисфункция, дефектна аутофагия и активиране на възпалителни реакции [16,17]. Освен ако натрупаните LDs не могат да бъдат инхибирани или отстранени, силно активните неврони претърпяват патофизиология, което води до невродегенерация [17]. (cistanche penis) Доказателствата показват, че медиираният от лизозома катаболен процес, наречен аутофагия, играе основна роля в поддържането на клетъчната LD хомеостаза в множество тъкани [17,18]. Подробно,растеж на пениса cistancheLD могат да бъдат селективно изолирани в автофагозоми и доставени до лизозоми за разграждане от лизозомни киселинни липази, процес, специално известен като липофагия [19]. Следователно, насочването към LD и техния път на автофагично отстраняване може да представлява нов подход за управление на невродегенерацията.

Изследването на естествени продукти и диетични агенти като източници за потенциални лечения и стратегии за NDD придоби огромен интерес през последните години [20]. Кемпферол (Ka) е естествена полифенолна малка молекула, която може да се намери в редица китайски лечебни билки и хранителни източници [21]. Съобщава се, че Ka упражнява антибактериални, против стареене и имуномодулиращи ефекти, както и антиоксидантни и невропротективни дейности [20,22,23]. По-рано се съобщава, че Ka инхибира възпалението в BV2 микроглиални клетки in vitro [24] и повишава резистентността на DA невроните към невровъзпаление in vivo [25]. Въпреки това, ефектът на Kaon LDs при PD все още не е проучен.

Като се има предвид значението на LDs и интимната връзка между LDs, митохондриите и аутофагията [16], които всички участват в PD, ние предполагаме, че Ka инхибира LD пероксидацията и предотвратява DA невродегенерацията при PD. В настоящото изследване ние демонстрирахме, че Ka значително защитава срещу невродегенерация в миши PD модел чрез инхибиране на натрупването на LD. (прах от цистанче) По-нататъшно проучване разкри, че Ка предизвиква аутофагия и намалява натрупването на окислени LDs, за да облекчи митохондриалната дисфункция и производството на митохондриална ROS (mtROS), като по този начин предотвратява апоптотичната смърт на невроните.cistanche propiedadesКонстатациите, получени в това проучване, могат да помогнат за насочване на клинични решения относно употребата на естествената молекула Ka при NDDs като PD.

2. Материали и методи

2.1. Опитни животни

C57BL/6J мишки (мъжки, 4-месечни) са получени от Nanjing Medical University Animal Core (Nanjing).Cistanche tubulosa beneficiosМишките се поддържат и отглеждат в Центъра за животински ресурси на Факултета по медицина, Медицинския университет в Нанкин и в съоръжението за животни в болницата Нанкин Drum Tower. Мишките имат свободен достъп до храна и вода в стая с околна температура от 22 градуса ±2 градуса и цикъл светлина/тъмнина от 12:12 часа. Всички процедури с животни бяха извършени в строго съответствие с насоките на Ръководството на Националните здравни институти за грижа и използване на лабораторни животни.

2.2.Реактиви

MPTP(M0896),3-MA(M9281),penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC>95%) for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol (HPLC>99.0 процента,96,353) за in vitro експерименти е получен от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). BODIPY 493/503 (D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861) и DHE (D11347) са закупени от Thermo Fisher Scientific. За опити с животни Ka се разтваря в разтвор от 10 процента DMSO в 16 процента SBE- -CD в стерилен физиологичен разтвор. За клетъчни експерименти, Ka се приготвя в DMSO (Sigma-Aldrich) и PBS (крайната концентрация на DMSO е 0.01 процента), рН 7.4.

2.3. Индуциране и лечение на метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрахидропиридин (МРТР)-индуциран миши модел на PD

За да се оценят ефектите на Ka в PD модела на MPTP/p-токсичност, мишки (мъжки, на възраст 4-5 месеца) бяха разделени на случаен принцип в група, третирана с физиологичен разтвор, група, третирана с MPTP, група, третирана с MPTP плюс Ka , и Ka самостоятелно третирана група. В групата, третирана с MPTP, мишките получават хронично приложение на MPTP с протокол, подобен на описания по-рано [26]: MPTP се разтваря във физиологичен разтвор и се инжектира подкожно при 25 mg/kg, последвано от 250 mg/kg пробенецид (разтворен в диметилсулфоксид) интраперитонеално (ip) инжектиране на интервали от 1 час на всеки 3,5 дни за период от 5 седмици. (корен от цистанхе) Контролните мишки получават инжекция с физиологичен разтвор и пробенецид. В групата, лекувана с MPTP плюс Ka, мишките получават Ka (50 mg/kg, единична инжекция/ден по време на експерименти, Jingzhu Biotechnology, Nanjing, Китай) интраперитонеално (ip) дневно 3 дни преди лечението с MPTP и над 5 MPTP инжекционни седмици. Една седмица след последната MPTP инжекция, мишките бяха подложени на поведенчески тестове, заслепени за групи. След това всички мишки бяха анестезирани с 40 mg/kg натриев пентобарбитал и умъртвени за откриване на мозъчни протеини и имунохистохимия или qPCR анализ.

2.4. In vivo стереотаксична хирургия и експериментални лечения

Стереотаксичната хирургия под анестезия с натриев пентобарбитал (40 mg/kg, ip) се извършва, както е описано [25]. Миши Atg5 и контролна shRNA бяха трансфектирани с опаковъчни вектори (AAV-U6-CMV-she-NA-EGFP), за да се генерира AAV. За микроинжектиране, анестезирани мишки се поставят в стереотаксичен апарат. Те бяха инжектирани с 1 μL AV чрез стъклен електрод, насочен към DG (AP:-0.3mm; ML: ±0.13mm; DV:-0.45 mm） със скорост от 0,25 μL/мин. След това иглата беше задържана за допълнителни 2- минути 2 седмици след микроинжектирането на вируса, мишките бяха подложени на МРТР-индуцирано PD моделно провеждане и (или) Ka лечение.

Atg5 shRNA беше получена от Hanbio Biotechnology (Shanghai, China) Co., Ltd. За мълчанието на Atg5, праймерите бяха показани в допълнителна таблица 1.

2.5. Поведенчески анализ

Една седмица след последното инжектиране на MPTP или физиологичен разтвор, тестът с въртяща се пръчка и полюсният тест бяха извършени, както е описано по-горе [27]. За теста с ротарод, мишките бяха аклиматизирани към ротарод в два опита (6 минути с ускорена скорост от 12-20 rpm) на ден в продължение на 2 последователни дни преди началото на експеримента. След това мишките бяха тествани при 20 rpm за 300 s за други 3 последователни дни. Закъснението до падане беше регистрирано с помощта на Rotarod Analysis System (Jiliang, Шанхай, Китай). За теста с стълб, мишките бяха поставени с главата нагоре върху върха на вертикален дървен стълб (с груба повърхност, височина 50 cm, диаметър 1 cm). Всички мишки бяха свикнали с апарата 2 дни преди тестването и след това бяха тествани три пъти на третия ден. Бяха записани общото време (T-общо, докато мишката достигне пода с четирите си лапи) и времето за завъртане (T-завъртане, за да се обърне напълно главата надолу на мишката). Експериментът беше заслепен за групи мишки за всеки поведенчески тест и тестът беше извършен три пъти.

2.6. Събиране на мозъчни проби

След крайните поведенчески тестове, мишките бяха анестезирани с натриев пентобарбитал (40 mg/kg, ip). За qPCR, Western blotting и анализ с високоефективна течна хроматография (HPLC), целите мозъци бяха бързо извлечени от животни, след което тъканите на средния мозък и стриатума бяха бързо дисектирани, предварително замразени с течен азот. Всички проби се съхраняват при -80 градуса до анализа.

За имунохистохимичен анализ мишките се перфузират транскардиално с 4% параформалдехид (PFA). Мозъците бяха екстрахирани, постфиксирани, дехидратирани, вградени в OCT (Tissue-Tek) и серийни срезове на мозъците бяха криосекционирани （30 μm на срез） през всеки цял стратум и среден мозък с помощта на замразяващ микротом (Leica CM1950, Nussloch, Германия ). Всички срезове бяха събрани в шест отделни серии и срезовете на мозъка бяха съхранени в 50 процента глицерин и замразени при -20 степен до анализа.

За ТЕМ мишките се перфузират с 2,5 процента глутаралдехид и 2 процента параформалдехид, както е описано 【12】. Малка порция (<1 mm³）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4="" ℃.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">

2.6. Имунохистохимичен анализ

Мозъчните срезове се промиват в PBS, последвано от 3 процента H2O2 за 10 min, след което се инкубират с 0.3 процента Triton X-100 в PBS, допълнен с 5 процента BSA за 1 час. След това слайдовете се инкубират с първичните антитела при 4 градуса за една нощ в PBS, съдържащ 5 процента BSA при 4 градуса за една нощ, след това се промиват и инкубират във вторични антитела за 1 час при стайна температура, последвано от инкубиране с диаминобензидин (DAB) или монтиране в DAPI (Life Technologies, Cat P36931) като имунофлуоресцентно оцветяване за 5 min. За оцветяване с Nissl предметните стъкла се смесват в разтвор на крезил виолет (CV) (0,1 g крезил виолет, 99 ml Н20 и 1% оцетна киселина 1 ml) за 30 минути при стайна температура, след което се дехидратират с алкохол и ксилен. Изображенията бяха наблюдавани и снимките бяха заснети под микроскоп Olympus BX52 (Olympus America Inc., Melville, NY, Съединени щати). Общият брой на TH-позитивните и Nissl-позитивните неврони в SNpc беше получен серологично чрез използване на метода на оптичния фракционатор със софтуер MicroBrightField Stereo-Investigator (MicroBrightField, Williston, VT, USA).

2.7. Анализ чрез високоефективна течна хроматография (HPLC).

Стритални проби от мишки се хомогенизират с {{0}}.1 М перхлорна киселина （1 mg тъкани в 100μL перхлорна киселина） и 0,1 mM EDTA, третирани с ултразвук и центрофугирани при 20,000 rpm за 30 минути, както е докладвано [27]. След това супернатантните течности бяха събрани за измерване. Подвижната фаза е смесен разтвор, състоящ се от 90 mM моноосновен натриев фосфат, 1,7 mM 1-октансулфонова киселина, 50 mM цитрат, 50 uM EDTA, 10 процента ацетонитрил със скорост на потока 0,2 ml/min. Успоредно с това, за изчисляване на количествена стандартна крива, изходен стандартен разтвор за допамин и дихидрокси-фенил оцетна киселина (DOPAC) (Sigma-Aldrich, САЩ) се приготвя в 0,1 М HClO4. Количество от 10 ul от приготвения супернатант или стандартен разтвор се инжектира в мобилната фаза и тествани с електрохимичен детектор ESA Coulochem III (Coulochem III, Thermo Fisher Scientific). Пробите бяха измерени и пиковете бяха количествено определени. Концентрациите на моноамини бяха количествено определени чрез сравняване със стандарта с помощта на софтуер ClarityChrom (Knauer, Германия) и след това съдържанието в стратума беше преобразувано според съотношението на разреждане Стандартната крива на DA и DOPAC беше показана на допълнителна фигура 1а и b.

2.8. Клетъчни култури и лечение

Мезенцефалните първични невронни култури бяха проведени, както е описано по-рано [12]. Накратко, мезенцефалните тъкани на C57BL/6 мишки на ембрионален ден 14/15 (E14/15) бяха внимателно отстранени, механично дисоциирани за отстраняване на мембраните и големите кръвоносни съдове, и след това разчленен. След това те се усвояват с трипсин-EDTA (Amresco, Solon, OH, USA) и след това се филтруват през 100-um филтър, за да се получи едноклетъчна суспензия. Впоследствие клетките се посяват върху предварително покрити с поли-L-лизин 12-/24-ямкови плаки при 2,5 ×10 градуса клетки/ml, съдържащи невробазална среда (Cat 21103049, GibcoTM , Thermo Fisher Scientific, Рокфорд, САЩ), допълнен с B27 (2 процента v:v, Cat 1750404, GibcoTM) и пеницилин/стрептомицин (0,5 процента v:v). Културите се поддържат във влажна камера (37 градуса, 5 процента CO2 инкубатор). Културалната среда се сменя на всеки 3 дни и клетките могат да се използват на 7-10 дни.

Клетъчни линии: Клетъчните линии SH-SY5Y се култивират в 10 процента FBS и 1 процент пеницилин/стрептомицин в овлажнен инкубатор при 37 градуса и 5 процента CO2. В експериментите клетките SH-SY5Y бяха третирани с MPP плюс （200 μM） или различни дози Ka (0,3,30,60,100,300,600uM) за 24 часа. Ka(3,10, 30,60 μM, 3h）primed-SH- SY5Y клетки бяха стимулирани с MPPt (400 μM) за 24 ч. Ka (30 μM, 3 h) с (или без) 3-MA (3 mM, 1 h) или -токоферол (50 μM, 1 h, Sigma-Aldrich, 47783 ）праймирани-SH-SH5Y клетки бяха стимулирани с MPPT（200 μM） за 24 часа.

2.9. Клетъчна жизнеспособност CCK8 анализ

Променената клетъчна жизнеспособност при третиране с Ka беше открита чрез комплект за броене на клетки-8 (CCK-8 комплект, Selleck, Хюстън, Тексас, САЩ). Накратко, клетките SHSY5Y бяха посяти в 96- ямкова плака и след това се третира с различни концентрации на Ка（3,30,60,100,300,600,600 uM） за 24 часа. След това 10 ul CCK-8 реагент се добавят към всяка ямка за 4 часа. Накрая, абсорбцията беше открита от Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) при 450 nm.

2.10. ATP анализ

Клетъчните нива на АТФ се откриват чрез комплект за анализ на биолуминесценция на АТФ (Beyotime Biotechnology Co., Китай) съгласно инструкциите на производителя. След третиране клетките бяха лизирани и центрофугирани при 12,000 rpm за 5 минути при 4 градуса и супернатантите бяха събрани. Работен разтвор （100 μL） се добавя към 20 μL проба в 96-ямковата плака и луминесценцията се измерва незабавно на автоматизиран четец на микроплаки. Измерванията от всички проби бяха нормализирани до концентрацията на протеин.

2.11. Анализ на Na плюс -K плюс -ATPase

За измерване на Nat-K плюс -ATPase (A070-2-2, Jiancheng, Nanjing, Китай), клетките се обработват с ултразвук и се центрофугират при 600 rpm за 10 минути, за да се получи супернатант. Реакционните разтвори за откриване на Nat-Kt-ATPase бяха добавени и инкубирани съгласно инструкциите на производителя. След това беше открита абсорбцията при 660 nm. Измерванията на всички проби се нормализират до концентрацията на протеин.

2.12. Western blotting анализ

Клетки или мозъчни тъкани се лизират в RIPA буфер (50 mM Tris (рН 7,4),цистанче คือ150 mM NaCl, 1 процент NP-40 (FNN0021, Thermo), 0,5 процента натриев деоксихолат (D6750, Sigma), 0,1 процента SDS (74255, Sigma), допълнен с протеаза и фосфатазни инхибитори (Roche, Шанхай, Китай). Концентрациите на протеин се определят с комплекта Micro BCA (Beyotime, Шанхай, Китай). 30-ug протеин от всяка проба се разделя чрез SDS-PAGE с помощта на полиакриламидни TGX гелове (Bio-Rad, Hercules, Калифорния, САЩ) и след това се прехвърля към мембрани от поливинилиден дифлуорид (PVDF) (Millipore, Bedford, MA). След блокиране, PVDF мембраните се инкубират с различни специфични първични антитела в TBST при 4 градуса за една нощ, след което се промиват и инкубират в съответните вторични антитела, конюгирани с пероксидаза от хрян (HRP), за 1 час при стайна температура. Имунореактивните ленти бяха визуализирани и открити чрез подобрена хемилуминесценция (ECL) плюс реагент за откриване (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) и анализирани с помощта на ImageQuantTM LAS 4000 система за изображения (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA).

2.13.Количествена (Q) и обратна транскрипция (RT)-PCR в реално време

Общата РНК се екстрахира от мозъчни тъкани и култивирани клетки с помощта на Trizol реагент (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, САЩ). Обратната транскрипция се извършва с помощта на комплект реагент TAKARA PrimeScript RT (TaKaRa, Япония). qPCR в реално време се провежда с помощта на SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) в инструмент StepOnePlus (Applied Bio-systems). Праймерите са закупени и валидирани от General (Шанхай, Китай). Праймерите, използвани за qPCR, са показани в допълнителна таблица 2.

Тази статия е извлечена от Redox Biology 41 (2021) 101911