Нов пептид, получен от нетрин-1-, подобрява защитата срещу невронна смърт и смекчава интрацеребралния кръвоизлив при мишки, част 3

Групи за лечение на физиологичен разтвор, ТАТ или ТЕ1 (разтворен във физиологичен разтвор) се дават на мишки 2 след ICH и всеки ден в продължение на 5 дни чрез интраперитонеална инжекция при общ обем 0.1 mL на животно. Пептидите се дават по заслепен начин в дози от 12 mg/kg.

Физиологичният разтвор е често използван физиологичен буфер, широко използван в медицински и биологични експерименти. Но знаехте ли? Физиологичният разтвор също може да подобри паметта ни!

На първо място, физиологичният разтвор играе важна роля за нормалната функция на клетките. Може да поддържа нормално клетъчно осмотично налягане и да поддържа нормалната морфология и функция на клетките. В мозъка голям брой нервни клетки се нуждаят от физиологичен разтвор като основно вещество и добавката на физиологичен разтвор може да насърчи нормалната работа на мозъчните клетки, да осигури достатъчно кислород и хранителни вещества за мозъка и да направи мозъка по-здрав.

Второ, физиологичният разтвор може да насърчи предаването на сигнали между мозъчните неврони и да подобри способността за учене на мозъка. Проучванията показват, че в процеса на учене на задачите, инжектирането на физиологичен разтвор може значително да подобри учебния ефект на обучаемите и да подобри емоционалното им състояние, да намали тревожността и стреса при учене. В същото време физиологичният разтвор може също да увеличи броя на невроните и сложността на невроните в хипокампуса, което е благоприятно за формирането и поддържането на паметта.

В допълнение, физиологичният разтвор може да подобри метаболитната среда на мозъка и да намали различни вредни ефекти върху мозъка, като увреждане, лезии, исхемия и хипоксия. Това са фактори, които могат да навредят на мозъка, а инжектирането на физиологичен разтвор може да подобри способността на мозъка да се справя и да намали увреждането му, като по този начин подобрява паметта и способността за мислене на мозъка.

Като цяло физиологичният разтвор е идеално вещество за подобряване на паметта. Може да има множество положителни ефекти върху мозъка, включително увеличаване на броя и сложността на невроните, подобряване на метаболитната среда и насърчаване на предаването на сигнали между невроните. Следователно, когато трябва да подобрим паметта си, бихме могли да помислим за инжектиране на физиологичен разтвор, за да осигурим по-добра защита и подкрепа за нашия мозък. Вижда се, че трябва да подобрим паметта си и Cistanche може значително да подобри паметта ни, защото може също да регулира баланса на невротрансмитерите, като например повишаване на нивата на ацетилхолин и растежни фактори, които са много важни за паметта и ученето. В допълнение, Cistanche може също така да подобри притока на кръв и да насърчи доставянето на кислород, което може да гарантира, че мозъкът получава достатъчно храна и енергия, като по този начин подобрява жизнеността и издръжливостта на мозъка.

Щракнете върху познайте начините да подобрите паметта си

4.13. Индуциран от колагеназа миши модел на ICH

Инжектирането на колагеназа обикновено се използва за индуциране на ICH [60]. Мъжки мишки C57BL/6 (на възраст от 8 до 12 седмици) се анестезират с изофлуран (2 до 5%) и се поставят върху стереотаксична рамка.

По време на процедурата телесната температура на всяко животно се поддържа при 37 ◦C с хомеотермично одеяло. С помощта на стереотаксичен инструмент (Ruiwode Life ScienceCo., Ltd., Шенжен, Китай) и спринцовка (Hamilton Company, Рино, Невада, САЩ), 0.3 µLof колагеназа (0.{{12 }}45 IU; Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, Мисури, САЩ) се влива в десния стриатум (AP: +0.2 mm; ML: -2,3 mm; DV: -3,5 mm) при скорост на потока от 0,1 µL/мин.

Общо 0.3 µL физиологичен разтвор се влива на контролни животни. Всички хирургични процедури са проведени при асептични условия. В това проучване бяха използвани над 66 мъжки мишки и животните бяха разпределени на случаен принцип в групи преди всеки експеримент [57].

4.14. Поведенчески анализ

Неврологичният поведенчески анализ на мишки след образуване на мозъчен хематом беше открит чрез тест за отстраняване на лепяща лента [61] и тест с цилиндър [60]. Тестът за премахване на залепването се извършва чрез поставяне на залепващата лента върху зоната на засаждане на всяка предна лапа (дясна и лява) на мишките.

Всяка мишка беше поставена в нова клетка.

Времето от момента, в който лентата е била поставена, до момента, в който мишката я е премахнала успешно, е записано за всяка лапа. За всяка лапа бяха разрешени максимум 300 s. Между експериментите животните бяха настанени в домашните си клетки в свободно от патогени съоръжение.

Тестът с цилиндър се извършва чрез поставяне на мишка в прозрачен акрилен стъклен цилиндър (диаметър: 8 cm; височина: 25 cm) пред 2 огледала и камера за 5 минути. Камерата беше поставена централно пред 2-те огледала и цилиндъра, за да се получи оптимално видео.

За оценка на независимо използване на преден крайник, (1) беше оценена способността на мишките да контактуват със стената на цилиндъра с един преден крайник по време на пълно отглеждане и (2) способността на мишките да кацнат само с един преден крайник на пода след пълно отглеждане. Най-малко 20 контактни точки за всеки преден крайник бяха преброени с помощта на забавено движение.

За базов анализ преди операцията, тестът се провежда два пъти на мишка с 1 час почивка между опитите. Предният крайник се изразява като съотношението на независимото използване на предния крайник от дясната към лявата страна.

4.15. Анализ на обема на хематома

За да се определи дали лечението намалява обема на хематома, мишките се умъртвяват 5 дни след ICH; мозъците бяха отстранени и мигновено замразени в OCT. Короналните срезове се нарязват с дебелина 30 µm и се поставят директно върху предметни стъкла. За количествено определяне на обема на хематома, срезовете бяха дигитализирани на стандартизирани коронарни нива.

Сляп потребител измерва контурите и хематома в лявото и дясното полукълбо във всяка секция. Обемът на хематома и подуването се измерват и изчисляват с помощта на ImageJ (NIH).

Най-малко 5 мозъка на група бяха подложени на измервания на хематома и обемът на хематома беше измерен в целия мозък.

4.16. Fluoro-Jade C оцветяване

Невродегенерацията при мишки след индуциран от колагеназа ICH беше оценена чрез оцветяване с комплект за оцветяване Fluoro-jade C Ready-to-Dilute (TR-100-FJT, Biosensis, Thebarton, Австралия) съгласно протокола на производителя [62].

Накратко, контролни мишки и ICH мишки (±ip пептид) бяха умъртвени 5 дни след моделирането и мозъците бяха обработени в съответствие с протокола, използван за имуноцитохимичния експеримент.

Плаващите мозъчни срезове се потапят в 1% разтвор на натриев хидроксид за 5 минути, изплакват се за 2 минути в 70% етанол и след това се изплакват за 2 минути в дестилирана вода. След това плаващите секции се потапят в 0, 06% разтвор на калиев перманганат (KMnO4 в дестилирана вода) за 10 минути.

Срезовете бяха промити с ddH2O преди да бъдат потопени в 0.0001% разтвор за оцветяване с флуоро-нефрит (флуоро-нефрит С в дестилирана вода) за 20 минути с леко разклащане на тъмно.

Срезовете се промиват с ddH2O, монтират се върху предметни стъкла с покритие и се сушат при стайна температура за една нощ на тъмно. Fluoro-Jade C оцветяване в рамките на перихематомната област беше изследвано с помощта на конфокален микроскоп Zeiss LSM 880. Количественото определяне на оцветяването с флуоро-нефрит се извършва с помощта на софтуера ImageJ.

4.17. Тъканна имунофлуоресценция

Тъканното имунофлуоресцентно оцветяване се извършва с помощта на серия от срезове с дебелина 30-µm. Срезовете се инкубират със следните първични антитела: миши анти-NeuN (1:500, Millipore, MAB377, Billerica, Масачузетс, САЩ) или миши анти-GFAP (1:200, SigmaAldrich, G3893, Сейнт Луис, Мисури, САЩ) антитела при 4 ◦C през нощта. След промиване с PBS срезовете се инкубират с Alexa Fluor 488-конюгирано магарешко анти-мише (1:1000; Invitrogen, A21202, Карлсбад, Калифорния, САЩ) антитяло.

4.18. TUNEL анализ

Терминален дезоксинуклеотидил трансфераза-медииран деоксиуридин трифосфат (dUTP) анализ за крайно маркиране (TUNEL) беше използван за идентифициране на апоптотични клетки с ядрена ДНК фрагментация в мозъчната перихематомна област.

Оцветяването се извършва с помощта на търговски комплект за едноетапен TUNEL апоптозен анализ (Beyotime, C1090, Nanjing, Китай) и се извършва съгласно инструкциите на производителя. След тъканна имунофлуоресценция беше извършена реакцията TUNEL.

Мозъчните срезове се инкубират с реакционна смес TUNEL (1 час при 37 °C) и след това срезовете се промиват с PBS и се оцветяват обратно с DAPI. Ко-локализацията на оцветяването с NeuN-TUNEL беше изследвана с помощта на конфокален микроскоп Zeiss LSM 880.

TUNEL-позитивните неврони (NeuN положителни) в перихематомната област вътре в стриатума бяха количествено определени с помощта на софтуер ImageJ на три различни снимки на мишка, направени под 20X обектив. Колокализацията на GFAP-TUNEL оцветяване е подобна на тази на NeuN-TUNEL оцветяване.

4.19. In Vivo анализ на пропускливостта на кръвно-мозъчната бариера

In Vivo, анализите на пропускливостта на кръвно-мозъчната бариера бяха извършени, както е описано по-рано [63–65]. Накратко, контролни мишки и ICH мишки (±ip пептид) бяха интраперитонеално инжектирани с FITC-маркиран 4 kDa декстран (100 µL от 2 mM изходен разтвор в PBS, Sigma Aldrich, 46944-100 MG-F, St Louis, MO, USA) след моделиране 5 дни, последвано от анестезия 5 минути по-късно.

След време на циркулация от 10 минути за маркера, животните бяха подготвени за транскардиална перфузия и ~ 300 ul кръв беше събрана от гръдната кухина точно след атриална пункция, последвано от перфузия за 3 минути с PBS. Хемимозък (без обонятелни лобове, малък мозък и заден мозък) и един бъбрек бяха събрани и незабавно замразени в течен азот и съхранени при -80 ◦C.

За измерване на флуоресценция пробите се размразяват в лед, претеглят се и се хомогенизират в PBS (400 µL за хемицеребрум и 600 µL за бъбрек), последвано от центрофугиране за 20 минути при 4 ◦C и 15, 000 × g.

Супернатантите (100 µL), както и равни обеми серум (1/5 разреждане в PBS), се зареждат в 96-черна плака с ямка и се измерва флуоресценцията при съответното възбуждане (490 nm)/емисия (520 nm) ) в четец на плочи (Tecan, Männedorf, Швейцария). Използвани са фалшиви животни (без инжектиране на тракер) за изваждане на стойностите на автофлуоресценция. Индексът на пропускливост (mL/g) се изчислява като съотношението на тъканните RFUs/g тъканно тегло към серумните RFUs/mL серум.

4.20. Флуоресцентно оцветяване с лектин

За визуализиране на мозъчни микросъдове, ние използвахме конюгиран с флуоресцеин Lycopersicon esculentum lectin (1: 200, Vector Laboratories, FL-1171, Burlingame, CA, USA) за потапяне на плаващи секции за 1 час.

Секциите бяха изобразени на Zeiss LSM 880 конфокален микроскоп под 20 × обектив и изображенията бяха обработени с 1,3 гама настройка. Бяха взети три изображения от 3 предварително определени области в перихематомната област на коронарния мозък на животното. Точките на разклоняване на съдовете бяха количествено определени във всеки мозък от заслепен изследовател. Точката на разклонение се дефинира като единичен белязан с флуоресцеин съд, забележимо разделящ се на 2 различни и отделни следи на съд [66].

4.21. Статистически анализ

Всички експериментални процедури бяха проведени на сляпо и извършени 3 пъти независимо, както е описано по-горе [67]. Данните са представени като средна стойност ± SEM. Статистическият анализ е извършен чрез еднопосочна ANOVA, двупосочна ANOVA и Student'st-тест, според случая, с помощта на GraphPad Prism v7 (GraphPad Software Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ ) и софтуер SPSS версия 20.0 (SPSS, Inc., Чикаго, Илинойс, САЩ).

Статистическите параметри могат да бъдат намерени в съответните легенди на фигурите. Статистическата значимост беше зададена на *p < {{0}}.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0,0001.]

5. Изводи

EGF3 домейнът на Netrin-1 е от решаващо значение за взаимодействието на Netrin-1 с DCC и може да активира различни сигнални пътища. Скъсеният пептид E1 на Netrin-1 (остатъци 407–422) взаимодейства с DCC, за да защити невроните от индуцирана от хемин токсичност.

Прилагането на пептид Е1 подобрява функционалното възстановяване в експериментален модел на ICH. Освен това, пептид Е1 може да защити невроните от дегенерация и апоптоза след ICH.

Авторски принос: Концептуализация, LL, Z.-XH и X.-JZ; методология, LL, K.-JL andJ.-BC; валидиране H.-LY и X.-XH; разследване, X.-JZ; обработка на данни, JY; ресурси LL и Z.-XH; писане LL, Z.-XH и X.-JZ; надзор, Z.-XH, X.-JZ; придобиване на финансиране, Z.-XH и X.-JZ Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа.

Финансиране: Това изследване е финансирано от Националната природонаучна фондация на Китай (31671065 и 32071018), План за развитие на науката и технологиите на провинция Дзилин (202520YY01017404).

Изявление на институционалния съвет за преглед: Всички процедури са одобрени от институционалния комитет за грижа и използване на животните към Североизточния нормален университет (NENU/IACUC, AP2016200299). Националните стандарти на Китайската народна република (GB/T 35892–2018), Насоки за лабораторни животни за етичен преглед на хуманното отношение към животните, бяха ръководството за нашите грижи за животните и протоколи.

Изявление за информирано съгласие: Не е приложимо.

Благодарности: Тази работа беше подкрепена от Националната природонаучна фондация на Китай (31671065 и 32071018) и Плана за развитие на науката и технологиите на провинция Дзилин (202520YY01017404).

Конфликти на интереси: Авторите декларират липса на конфликт на интереси. Финансиращите нямат никаква роля в дизайна на проучването; при събирането, анализите или тълкуването на данни; в написването на ръкописа или в решението за публикуване на резултатите.

Референции

1. Kirshner, HS Медицинско лечение на интрацеребрален кръвоизлив: Обратно към основите. Вътр. J. Clin. Практ. 2008, 62, 521–522 [CrossRef] [PubMed]

2. Андерсън, CS; Heeley, E.; Huang, Y.; Wang, J.; Stapf, C.; Delcourt, C.; Линдли, Р.; Робинсън, Т.; Lavados, P.; Neal, B.; et al. Бързо понижаване на кръвното налягане при пациенти с остър интрацеребрален кръвоизлив. Н. англ. J. Med. 2013, 368, 2355–2365. [CrossRef][PubMed]

3. Куреши, AI; Mendelow, AD; Hanley, DF Интрацеребрален кръвоизлив. Lancet (Lond. Engl.) 2009, 373, 1632–1644. [CrossRef]

4. Запазете, RF; Hua, Y.; Xi, G. Интрацеребрален кръвоизлив: Механизми на нараняване и терапевтични цели. Lancet Neurol. 2012, 11,720–731. [CrossRef]

5. Шраг, М.; Kirshner, H. Управление на интрацеребрален кръвоизлив: JACC Focus Seminar. J. Am. Coll. Кардиол. 2020, 75, 1819–1831 [CrossRef] [PubMed]

6. Кандасами, Р.; Идрис, З.; Abdullah, JM Хирургия на интрацеребрален кръвоизлив. В невроваскуларната хирургия Хирургични подходи за невроваскуларни заболявания; Юли, J., Wahjoepramono, EJ, Eds.; Springer: Сингапур, 2019 г.; стр. 201–210.7. Бротън,

7. Бротън, BR; Reutens, DC; Sobey, CG Апоптотични механизми след церебрална исхемия. Удар 2009, 40, e331–e339. [CrossRef][PubMed]

8. Кристиансен, М.; Graversen, JH; Jacobsen, C.; Соне, О.; Hoffman, HJ; Закон, SK; Moestrup, SK Идентифициране на рецептора за пречистване на хемоглобина. Nature 2001, 409, 198–201. [CrossRef]

9. Мадангарли, Н.; Bonsack, F.; Дасари, Р.; Sukumari-Ramesh, S. Интрацеребрален кръвоизлив: кръвни компоненти и невротоксичност. Brain Sci. 2019, 9, 316. [CrossRef]

10. Дейнер, MS; Кенеди, TE; Фазели, А.; Серафини, Т.; Tessier-Lavigne, M.; Sretavan, DW Netrin-1 и DCC медиират насочването на аксона локално в оптичния диск: Загубата на функция води до хипоплазия на зрителния нерв. Neuron 1997, 19, 575–589. [CrossRef]

11. Кенеди, TE; Серафини, Т.; де ла Торе, JR; Tessier-Lavigne, M. Netrins са дифузионни хемотропни фактори за комиссурални аксони в ембрионалния гръбначен мозък. Cell 1994, 78, 425–435. [CrossRef]

12. Flores, C. Роля на нетрин -1 в организацията и функцията на мезокортиколимбичната допаминова система. J. Psychiatry Neurosci. Jpn.2011, 36, 296–310. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com