Нова стратегия за скрининг на активни компоненти в Cistanche Tubulosa въз основа на анализ на връзката спектър-ефект и мрежова фармакология Ⅱ

3. Резултати и дискусия

3.1. HPLC отпечатъци

3.1.1. Валидиране на метода

Валидирането за метода HPLC показа, че относителното стандартно отклонение (RSD) за прецизност, възпроизводимост и стабилност на метода е по-малко от 2,85 процента за относителната пикова площ (n = 11) и 0.77 процента за относителното време на задържане (n = 11). Прецизността на същия пробен разтвор се появи в диапазона от 0.05–{{10}}.77 процента за относително време и 0.28– 2,70 процента за относителната площ на общите пикове. Възпроизводимостта на експеримента беше в рамките на 0.03–0.20 процента за относителното време и 0,23–2,59 процента за относителната площ на общите пикове. Стабилността на пробата е 0,09–0,24 процента за относителното време на задържане и 0,75–2,85 процента за относителната площ на общите пикове. Тези резултати показват, че установеният пръстов отпечатък е удовлетворен. Линейните зависимости за генипозидова киселина,ехинакозид, актеозид, тубулозид А, иизоактеозидса показани в Таблица S4. Стойността на R квадрат беше 1.0000, което показва добра линейност. Резултатите от извличането на пробата показват, че средните извличания на генипозидова киселина, ехинакозид,актеозид, тубулозид А, иизоактеозидса били 100,37 процента, 103,59 процента, 98,46 процента, 100,81 процента и 101,19 процента, а RSD за възстановяване на пробите е по-малко от 2,68 процента.

Щракнете тук, за да получите повече подробности за Cistanche Active Components

3.1.2. Пикова площ (PA) и относително време на задържане (RRT)

Референтните пръстови отпечатъци и пръстови отпечатъци на HM, WE и HR от 11 партиди C. tubulosa са представени на Фигура 2. Единадесет пика, които показват добро разделяне и разделителна способност, бяха идентифицирани като общи пикове сред HM, WE и HR. Петте стандартни съединения са идентифицирани като генипозидова киселина (А2),ехинакозид(A8),актеозид (A9), тубулозидA (A10) иизоактеозид(A11). Стандартното съединение,ехинакозид, който присъства във всички хроматограми (средно време на задържане 12.86 min) с подходяща пикова площ и добра стабилност, беше избран като референтен пик и използван за изчисляване на относителното време на задържане (RRT) на другите десет общи върхове. RRT на тези различни форми са в диапазона 0.16–1.51. PA и коефициентът на дисперсия (CV проценти) на тези често срещани пикове са изброени в таблици S5–S7. От данните процентните стойности на CV за PA в различни форми са 25,78 процента –142,02 процента, 23,36 процента –150,38 процента и 28,91 процента –112,78 процента съответно за HMs, WEs и HRs. Тези резултати показват значителни разлики в концентрацията на всеки от тяхCistanche tubulosaсъединение сред различните форми. Пръстовите отпечатъци на HM, WE и HR са показани на фигура 3.

Фигура 2 HPLC пръстови отпечатъци на стандартни проби

3.1.3. Съдържание на HM, WE и HR

Пет стандартни съставки наC. tubulosaбяха измерени. Съдържанието на основните компоненти е показано в таблица 1. Сравнението между HM, WE и HR е показано в таблица 2 и фигура 4. PhG в C. tubulosa са биологично активни, но термочувствителни. Чувствителните към топлина компоненти, разтварящи се във вода, могат да бъдат ефективно извлечени с помощта на разумен метод. Обикновено Cistanche herba се екстрахира с вода и след това се изпарява в концентриран разтвор за следващия химичен анализ [26, 27, 30]. След екстракцията и концентрирането беше използвана технология за сушене чрез пулверизиране и процедурата беше модифицирана от предишната статия. Водата бързо се отстранява от течната пара и след това се получават сухи екстракти от суровини от растения. В тази стъпка добавянето на малтодекстрин се счита за общ носител за подобряване на дисперсията и удължаване на времето за съхранение. Чрез поредица от производствени процеси билковите растения след това се пресоват във формулирани гранули с добавки. Тази стъпка на добавяне на ексципиенти не беше включена в експеримента. Най-общо казано, нашият производствен процес включва екстракция, концентрация и пулверизационно сушене, както е описано в раздел 2.2, успоредно с процеса на производство на гранули с формула. За да се произведат тези полуготови продукти, трябва да се следват горните три стъпки. Процедурата за формиране на WE включва концентрация и сушене чрез разпръскване, които лесно причиняват загуба на термочувствителни компоненти, но HR се получават след екстракция и сушене на HM. Чудим се дали е възможно активните компоненти да останат в HR. Според нашите резултати, съдържанието на вербаскозид намалява значително от HMs до WEs и HRs ( и , съответно). Термичната стабилност на вербаскозид се изследва чрез проследяване на промените в площта на пика чрез HPLC по време на процеса на нагряване. След нагряване в продължение на 4 часа остават 41,6 процента вербаскозид. Това показва, че вербаскозидът е термочувствителен [31]. Изоактеозид, тубулозид А и ехинакозид в WE остават стабилни след сложни процедури на обработка. По време на дългосрочния процес на сушене, натрупването на PhGs показва значително намаление, което може да се дължи на термичното разграждане на тези термочувствителни компоненти [32]. По отношение на другите целеви компоненти, HR и WE не се различават значително с изключение на вербаскозид. Нашето разбиране за тази разлика ще ни позволи да разработим по-добри стандарти за качество на билковите утайки в бъдеще и да ги внедрим в продукти.

Таблица 1 Съдържание на 11 партиди C. tubulosa

Таблица 2 Сравнение на съдържанието на основните компоненти (n = 11).

,

Фигура 4 Определяне на съдържанието на пет компонента от различни форми (n = 11). , ns: незначително.

3.1.4. Анализ на подобието на пръстови отпечатъци

Бяха оценени приликите между трите групи C. tubulosa. Стойностите за сходство на билков материал-воден екстракт, билков материал-растителен остатък и воден екстракт-растителен остатък бяха в диапазоните 0.943–0.994, 0.847–{ {9}}.995 и 0.938–1.000, съответно (Таблица 3).

Таблица 3 Прилики на HM-WE, HM-HR и WE-HR за 11 партиди C. tubulosa.

3.2. Резултати от теста за антиоксидантна активност

Антиоксидантните активности на различните форми на C. tubulosa бяха определени с помощта на анализи на DPPH, , и капацитет за почистване, а съответните резултати са представени на Фигура 5. В таблица S8 диапазоните за DPPH и резултатите от анализа на капацитета за почистване бяха { {2}}.04–37,80, 0,98–843,90 и 0,32–27,65 mg/mL за трите различни форми сред 11-те партиди C. tubulosa. В три теста за антиоксидантна активност HMs и WEs показват близка инхибираща активност, докато HRs показват най-слабото инхибиране.

Установено е, че изсушените чрез пулверизиране WE показват значителна активност дори при ниски концентрации. Предишен доклад показва, че изсушена чрез пулверизиране Vernonia amygdalina WE е постигнала 50 процента инхибиране на почистването при 0,17 mg/mL [33]. Прилагането на дълги времена на екстракция и високи температури е нож с две остриета. От една страна, увеличаването на времето за екстракция и температурата на входа за сушене чрез пулверизиране подобрява добива и ефективността. Освен това, екстрактите постигат силна антиоксидантна активност и по-високи концентрации на биологични компоненти от тези растения [34]. От друга страна, прекалено горещият входящ въздух разгражда биоактивните съединения. Такива повишени температури на входа на въздуха доведоха до загуба на антиоксидантна активност на екстракта от Bidens pilosa и се приписват на намаляване на фенолните съединения [35]. Настоящите резултати са в съответствие с гореспоменатия доклад. Например, WE в S6 показа по-слаби радикални инхибиторни способности от HM и HR. Освен това, HR в S5 показва по-силни способности за почистване на DPPH и супероксиден анион от HM и WE. Структурата на PhGs се състои от гликозидни връзки и ацетилови групи, които лесно се хидролизират при ензимно действие или се разлагат при високи температури. Тези реакции могат да обяснят намаляването на някои основни компоненти по време на широкомащабно производство. Въпреки това, хидролизата или изомеризацията на определени компоненти може да ускори синтеза на други компоненти. Такива трансформации са често срещани при обработката на билки Cistanches [36–38]. Тъй като PhGs са водоразтворими, това означава, че повечето биологични компоненти могат да бъдат използвани чрез водна екстракция. Твърдението, че по-голямата част от активните компоненти остават в WE, продължава от десетилетия, така че изглежда разумно да се предположи, че мокрите остатъчни материали могат да бъдат изхвърлени след екстракция. Въпреки това е неправилно да се разглеждат HR на C. tubulosa като отпадъци. Изследователите посочват, че PhG са нестабилни и са податливи на ензимно или хидролитично разграждане [39]. Реакциите на хидролиза или изомеризация, които допринасят за намаляване на биологичните съставки във фитомедикаментите по време на обработката, могат в същото време да предоставят нови възможности за използване на HR. Чрез преобразуване на традиционните методи за екстракция, лекарствените остатъци могат да бъдат разработени и използвани по-ефективно. Извършена е ензимна хидролиза, за да се превърне остатъкът от Panax ginseng в монозахари. Увеличени са добивите на полизахариди и гинзенозиди, като захар, янтарна киселина, полизахариди от женшен и гинзенозиди [40]. Остатъците от Sophora flavescens се екстрахират повторно чрез ултразвукови вълни с етилацетат [41]. Актуализираните технологии за използване на билкови остатъци са обобщени от Huang et al. [42].

Въз основа на резултатите от PLSR и BCA, първите пет пика на различни форми бяха скринирани с помощта на DPPH, супероксиден анион и анализи за отстраняване на хидроксилни радикали, за да се идентифицират най-важните пикове. Резултатите са илюстрирани в диаграмата на Вен (Фигура 7). A2, A6, A8 и A10 са общите пикове, които се споделят от HM, WE и HR (Фигури 7(a) и 7(c)) в анализите за отстраняване на супероксидния анион и хидроксилния радикал, докато HM, WE и HR не споделя пикове на DPPH анализ. Междувременно BCA моделите показват, че A1, A2, A3 и A6 са общите пикове, споделяни от HM, WE и HR (фигури 7 (d) – 7 (f)). Трябва да се отбележи, че припокриванията в диаграмата на Venn показват, че моделът BCA изглежда по-подходящ от модела PLSR, като първият показва повече повторения. Коефициентите на BCA модела и стойностите на IC50 на антиоксидантната способност бяха анализирани чрез RDA. Както RDA, показана на фигура 8, A1, A3 и A6 от HM и HR са свързани положително с антиоксидантните индекси, с изключение на това, че A3 е свързано отрицателно с капацитета за отстраняване на хидроксилни радикали. A1 и A6 от WE имат силни корелации с DPPH и супероксидния анион. Пиковете А6, отбелязани от различните форми, показват най-силна връзка с DPPH, супероксиден анион и хидроксилни радикали. A1 и A3 също показват подобна връзка.

Фигура 7

Диаграми на Venn на PLSR и BCA модел: (a) DPPH анализ. (b) анализ за почистване. (c) анализът на прочистване беше анализиран чрез модела PLSR. (d) DPPH анализ. (д) анализ на прочистване. (f) анализът за почистване е анализиран чрез BCA модела. Припокриващият се участък беше част от общите пикове от HM, WE и HR.

3.4. Мрежов фармакологичен анализ

3.4.1. Изграждане на КТ мрежа

Общо 4359 цели, свързани с антиоксидантната активност, бяха получени от базата данни GeneCards и базата данни OMIM. В същото време активните компоненти бяха проверени от базата данни TCMSP и базата данни SwissTargetPrediction. След това бяха събрани и стандартизирани 198 цели чрез базата данни UniPort. Имаше 159 целеви гена, споделени от активни компоненти и заболявания, свързани с антиоксиданти (виж Фигура S1). CT мрежата беше конструирана, за да илюстрира корелацията между съединенията и ключовите генни цели (Фигура 9).

Фигура 9 CT мрежа. Мрежата показа корелацията между активните компоненти и ключовите генни цели.

3.4.2. Изграждане на PPI мрежа и скрининг на ключови цели

PPI беше визуализиран с помощта на базата данни STRING (Фигура 10). Мрежата включваше 159 възела и 2528 ръба. В цялата мрежа за взаимодействие, свързващите компоненти или възлите с повече целеви точки могат да бъдат ключовият компонент или целевият ген, който играе антиоксидантна роля в C. tubulosa. Резултатите бяха изтеглени и въведени в Cytoscape за визуализация. Колкото по-висока е стойността на DC, толкова по-тъмен е цветът и колкото по-голяма е комбинираната стойност на резултата, толкова по-дебел е ръбът. Ние открихме, че RAC-алфа серин/треонин-протеин киназа (AKT1), интерлукин-6 (IL6), фактор на туморна некроза (TNF) и васкуларен ендотелен растежен фактор А (VEGFA) са централно разположени (Фигура 11), което показва, че те са били ключови цели, когато активните компоненти са проявили антиоксидантен ефект. Съобщава се, че ехинакозидът намалява митохондриалната дисфункция чрез регулиране на митоген-активирани протеин кинази (MAPK) и AKT и техните фосфорилирани форми [43]. Изследователите спекулират, че антидиабетният ефект на гликозидите на C. tubulosa може да се дължи на антиоксидантната активност на PhG чрез понижаване на провъзпалителните цитокини, като IL-6 и TNF- [44]. В допълнение, ехинакозидът може да наруши растежа на раковите клетки на яйчниците чрез понижаване на експресията на VEGFA, за да инхибира ангиогенезата [45], което е тясно свързано с ROS системата, тъй като ROS индуцира експресията на VEGF сигнализация [46].

Фигура 10 PPI мрежа.

3.4.3. Анализ на обогатяването и създаване на CTP мрежа

Потенциалните антиоксидантни съединения действат върху множество биологични функции, включително BP, CC и MF. На Фигура 12(a) са показани първите 10 пътя. Предсказаните цели от PPI ​​мрежата отговарят главно на много биологични процеси, като органични циклични съединения, ксенобиотични стимули, неорганични вещества, нива на кислород и положителна регулация на движението на клетъчния компонент. Анализът на клетъчния компонент показа, че гените са свързани главно с мембранния сал, екстрацелуларния матрикс, лумена на секреторни гранули, комплекса на регулатора на транскрипцията и апикалната част на клетката. Тези мишени също участват в много молекулярни функции, включително свързване на ДНК-свързващ транскрипционен фактор, активност на хомодимеризация на протеин, специфично за протеинов домейн свързване и свързване с цитокинов рецептор.

Фигура 12 Анализ на обогатяване: (a) Анализ на обогатяване на GO. (b) Анализ на обогатяване на KEGG.

За да се изследват биологичните функции на тези основни центрове, беше проведен анализ на обогатяване на пътя. От резултатите от обогатяването на KEGG беше начертана балонна диаграма, за да покаже топ 20 пътя. Колкото по-голямо беше петното, толкова повече гени бяха включени в пътя. Както е показано на Фигура 12 (b), ключовите пътища на C. tubulosa са свързани с пътищата при рак, липиди и атеросклероза, AGE-RAGE сигнален път при диабетни усложнения, химическа канцерогенеза - активиране на рецептора и MAPK сигнален път. Изследвани са ефектите на C. tubulosa върху апоптозата и клетъчната редокс хомеостаза. Данните предполагат, че C. tubulosa може да бъде обещаващ кандидат за терапия срещу рак на дебелото черво [47]. Екстрактът от C. deserticola се среща при възрастни хора [48].

Фигура 13 илюстрира корелацията между пътищата и техните свързани цели и връзката между припокриващите се целеви гени и биологично активните компоненти на C. tubulosa. Беше генериран глобален изглед на CTP мрежата, която се състоеше от 12 съставки, 159 цели и 20 пътя. Повечето от целите бяха споделени от кандидат-активните съединения. Тези кандидат активни съставки с висока степен на взаимосвързаност са отговорни за високата взаимосвързаност на CTP мрежата, особено кверцетин (степен = 131). По-голямата част от мишените, като AKT1, IL6, TNF и VEGFA, бяха картографирани към KEGG пътища, свързани с пътища при рак.

Фигура 13 CTP мрежа.

4. Изводи

В това проучване ние изследвахме предимно сложни ситуации, когато разглеждахме връзките спектър-ефект между HM, WE и HR наC. tubulosa. HPLC пръстови отпечатъци иантиоксидантни анализибяха използвани за идентифициране на разликите между Hs, WEs и HRs наC. tubulosa. Според HPLC отпечатъците, 11 пика са често срещани сред 11-те партиди от Hs, WEs и HR. Генипозидова киселина,ехинакозид, вербаскозид, тубулозид А, иизоактеозидбяха идентифицирани сред тези върхове. Определено е съдържанието на тези пет компонента. В допълнение, антиоксидантните ефекти наC. tubulosaHs, WEs и HR варират поради промените в химическия състав, причинени от сложни производствени условия. Въз основа на разнообразни статистически модели, изследването на връзката спектър-ефект показа, че пик A6 може да бъде най-решаващият компонент сред трите форми наC. tubulosa. Проучването се основава на мрежова фармакология за изследване на потенциалните механизми наC. tubulosaНаантиоксидантначрез скрининг на съединения, прогнозиране на ключови цели, изграждане на мрежи и провеждане на анализ на обогатяване. Нашите резултати предоставят теоретична основа за рециклиране на билковите остатъци и потенциала наC. tubulosaпри лечението назаболявания, свързани с антиоксиданти.