ACKR4a индуцира аутофагия, за да блокира NF-kB сигнализиране и апоптоза, за да улесни инфекцията с Vibrio Harveyi

РЕЗЮМЕ

Автофагията и апоптозата са два признати механизма на резистентност към бактериална инвазия. Въпреки това, бактериите също са развили способността да избягват имунитета. В това проучване ние идентифицираме ACKR4a, член на семейството на атипични хемокинови рецептори, като супресор на NF-kB пътя, който си сътрудничи с Beclin-1, за да индуцира аутофагия, за да инхибира NF-kB сигнализирането и да блокира апоптозата, улеснявайки Инфекция с Vibrio harveyi. Механично, V. harveyi-индуцираният Ap-1 активира ACKR4a транскрипцията и експресията. ACKR4a образува комплекс с Beclin-1 и MyD88, съответно, като индуцира автофагия и транспортира MyD88 в лизозомата за разграждане за потискане на възпалителното производство на цитокини. Междувременно индуцираната от ACKR4a аутофагия блокира апоптозата чрез инхибиране на каспаза8. Това проучване доказва за първи път, че V. harveyi използва както аутофагия, така и апоптоза, за да избегне вродения имунитет, което предполага, че V. harveyi е развил способността срещу имунитета на рибите. 

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

ВЪВЕДЕНИЕ

Имунната система обикновено се разделя на вроден и придобит имунитет, като повечето организми разчитат предимно на вродения имунитет за оцеляване.1 Вроденият имунитет е защитен механизъм, формиран в организмите. Той разпознава свързания с патоген молекулярен модел (PAMP) чрез рецепторите за разпознаване на образи (PRRs), дава бърз отговор на патогенна инфекция и защитава гостоприемника от инфекция.2,3 Като важен PRR, toll-like рецептори (TLRs) могат да инициират широк спектър от реакции от фагоцитоза до производство на цитокини, като по този начин допълнително засилват възпалителните и вродените имунни отговори.4 В повечето случаи TLRs сигнализират предимно чрез MyD88-зависим път, който предава сигнали чрез каскадни реакции за активиране на ядрени фактор-kappa B (NF-kB).5 NF-kB е един от ключовите фактори в инициирането на вродения имунитет и е от съществено значение за координирането на възпалителния отговор, вродения имунитет, клетъчната диференциация, пролиферацията и оцеляването и е се счита за основен инициатор на възпалителния отговор.6 Когато бактериите заразят гостоприемника, се синтезират низходящи ефектори на вродения имунен отговор като цитокини и хемокини и в крайна сметка водят до възпалителен отговор за блокиране на растежа на бактериите. Въпреки това, в съвместна еволюция с техните гостоприемници, бактериите също са разработили различни регулаторни стратегии, за да избегнат и подкопаят защитата на своя гостоприемник.

Смята се, че автофагията и апоптозата са двата важни пътя срещу бактериална инвазия.7 Автофагията е консервативен процес, който транспортира анормални протеини до лизозомите за разграждане и играе важна роля във вродения имунитет на еукариотите срещу бактериална инвазия.8,9 Въпреки това, някои бактериите избягват имунитета чрез използване на автофагия при бозайници. Обикновено клетките се стремят да премахнат нахлуващите извънклетъчни бактерии и колонизиращите бактерии в цитоплазмата чрез автофагия,10 но някои бактерии могат да „отвлекат“ автофагията, за да завършат собствения си растеж и възпроизвеждане.11–13 Например, Unc-51-като киназа 1 (ULK1), Beclin1, асоциирана с микротубули протеинова лека верига 3 (LC3) и протеини, свързани с автофагия (ATGs) си сътрудничат, за да образуват автофагозоми, които капсулират нахлуващите микроорганизми и ги транспортират до лизозоми за разграждане.14–16 Въпреки това, Mycobacterium tuberculosis намалява -регулира Beclin-1, за да предотврати образуването на автофагозоми, като в крайна сметка инхибира автофагията и насърчава инфекцията.17 За разлика от инхибирането на образуването на автофагозоми, някои бактерии използват автофагозоми, за да завършат самовъзпроизвеждащи се места, за да насърчат пролиферацията.11,18 В допълнение към аутофагия, апоптозата също е средство за защита на гостоприемника срещу нахлуващи патогени.7 Апоптозата е модел на клетъчна смърт, използван за отстраняване на увредени клетки, за да се поддържа стабилността на системната среда.19 При получаване на сигнал за бактериална инвазия, гостоприемникът индуцира апоптоза на заразените клетките да инхибират бактериалната инфекция.20 Следователно успешната бактериална колонизация зависи от способността му да предотвратява апоптоза и да защитава бактериалната репликация. Например, Edwardsiella tarda осигурява оцеляването си чрез инхибиране на апоптозата след инфекция на ZF4 клетки на рибка зебра21, Shigella постига успешна колонизация чрез инхибиране на апоптозата22 и S протеин, произведен от стрептококи от група А (GAS), се свързва с еритроцитната мембрана, за да избегне откриването на имунната система на гостоприемника система.23 Въпреки че е доказано, че много бактерии са развили способността да избягват имунитета, има няколко доклада за морски патогени. Vibrio harveyi принадлежи към семейство Vibrionaceae, което е признато за силно патогенен агент за морските риби; причинява гастроентерит, мускулна некроза и кожни язви и е една от основните причини за смъртността на морските риби.24

растение цистанче, повишаващо имунната система

С изключение на автофагия и апоптоза, някои бактерии (напр. Staphylococcus aureus) могат дори да използват хемокиновите рецептори на своя гостоприемник, за да избегнат имунитета.25 Хемокиновите рецептори са G протеин-свързани рецептори (GPCRs), намиращи се главно на повърхността на левкоцитите. Те съдържат седем трансмембранни структури, които участват в свързването на лиганда и сигнализирането и играят ключова роля в инициирането и поддържането на имунни и възпалителни реакции.26 С напредването на изследванията на хемокините бяха открити атипични хемокинови рецептори (ACKRs).27 Въпреки че ACKRs са структурно подобни на други хемокинови рецептори и могат да интернализират лиганди, те не могат да активират пътя на сигналната трансдукция поради липсата на домейна DRYLAIV, който също се нарича "тих рецептор".28 Функцията на ACKRs може да бъде отразена по следните начини: : 1. Те ​​могат да се конкурират с типичните рецептори за свързване на хемокина и по този начин да регулират сигналната трансдукция на клетъчния хемотаксис; 2. Чрез интернализиране на хемокин в клетките, концентрацията на хемокин в околната среда се намалява, за да повлияе на клетъчното набиране и да действа като чистач на хемокини. 3. Те подпомагат хемокините да завършат междуклетъчния транспорт през стромалната клетъчна бариера.29 Семейството ACKRs, включващо главно DARC,30 D6 31,32, CXCR7,33 и CCRL1,34 CCRL1 е известен също като атипичен хемокинов рецептор 4 (ACKR4). Понастоящем някои проучвания показват, че ACKR4 изглежда реализира сигнална трансдукция през независимия от G протеин път, 35-37 и има неизлишни роли в контролирането на възпалението и имунния отговор. 38 Неговата роля в адаптивния имунитет е добре известна, но функцията на вродения имунитет рядко се изучава.

При вродения имунитет сигналната трансдукция на TLR пътя е силно запазена от безгръбначни към бозайници. Като основен протеин на TLR сигнализацията, MyD88 е широко изследван при гръбначни животни. В допълнение, поради силно запазената структура на MyD88, неговите хомолози в рибите може да имат подобни функции на тези в бозайниците.39,40 При рибките зебра, MyD88 участва в изчистването на бактериални инфекции.41 Предишни проучвания също потвърдиха, че V. harveyi избягва имунитета, като унищожава сигналната трансдукция на MyD88.42 Въпреки това, механизмите за това как V. harveyi избягва имунитета остават слабо разбрани при костестите риби. В това проучване, ACKR4a беше бързо регулиран нагоре в V. harveyi-стимулиран Miichthys muy. Регулираният нагоре ACKR4a едновременно потиска вродения имунитет чрез индуциране на аутофагия за блокиране на медиирания от MyD88- NF-kB път и индуциране на аутофагия за блокиране на апоптоза, за засилване на инфекцията с V. harveyi. Доколкото ни е известно, този доклад е първият, който изяснява, че е установено, че V. harveyi използва както автофагия, така и апоптоза, за да избегне вродения имунитет.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

РЕЗУЛТАТИ

Инфекцията с V. harveyi индуцира експресия на ACKR4a за насърчаване на саморазпространение

За да идентифицираме гени, които потенциално участват в регулирането на инфекцията с V. harveyi, третирахме miiuy croaker с V. harveyi в продължение на 48 часа, след което използвахме RNA-seq анализ, за ​​да скринираме различните експресионни гени (DEG) между третирания и нетретирания V. harveyi проби от далака. От данните за дълбоко секвениране ние идентифицирахме 145 гена с регулиране нагоре и 280 гена с регулиране надолу (Фигура 1А). На тази основа избрахме 10-те най-големи и 10-те най-малко DEG (log2 на промяната на сгъването беше 1,0) за клъстерна топлинна карта и резултатът показа, че съответните проби както в третираните, така и в нетретираните проби с V. harveyi са добре репликирани (Фигура 1B) . МРНК на ACKR4a бяха изследвани и беше установено, че е силно експресиран в M музикален мозък след инфекция с V. harveyi (Фигура S1A). Така че M. muiiy мозъчна клетъчна линия (MBrC) е използвана за последващи експерименти. Ефективността на нокдаун на ACKR4a-si1 е 46,1%, а ACKR4a-si2 е 63,7% в MBrC (Фигура S1B), така че ACKR4a-si2 (наречен ACKR4a-si) беше използван за последващи експерименти. Впоследствие се съсредоточихме върху гена ACKR4a, който може да има имунна функция, и резултатите от анализа на образуващите колонии единици (CFU) разкриха, че ACKR4a стимулира пролиферацията на V. harveyi (фигури 1C, 1D и S1C). За по-нататъшно изследване на механизма, чрез който ACKR4a насърчава пролиферацията на V. harveyi, беше анализиран моделът на експресия на ACKR4a. ACKR4a в MBrC клетки се регулира от V. harveyi. Резултатите показват зависим от времето начин с инфекция с V. harveyi както на нива на иРНК, така и на протеин (фигури 1E и 1F). В допълнение, заглушаването на ACKR4a ефективно потиска експресията на ACKR4a както на нивата на иРНК, така и на протеина (Фигури 1E и 1G). Горните резултати показват, че повишената регулация на ACKR4a може да улесни инфекцията с V. harveyi.

Фигура 1. Индуцираният от V. harveyi ACKR4a улеснява неговото саморазпространение

ACKR4a инхибира задействаното от V. harveyi NF-kB сигнализиране 

Открихме, че скоростта на клетъчна пролиферация е засегната, когато MBrC е заразен с V. harveyi, и за да проверим това откритие, направихме анализи на клетъчна пролиферация. Резултатите показват, че инфекцията с V. harveyi наистина намалява пролиферацията на MBrC (Фигура S1D). Последващите експерименти потвърдиха, че свръхекспресията на ACKR4a намалява клетъчната пролиферация, докато ACKR4a заглушава засилената клетъчна пролиферация (Фигура 2A и S1E). Няколко проучвания показват, че активирането на NF-kB насърчава клетъчната пролиферация. Установено е, че BAY 11–7082, инхибиторът на NF-kB, може също да намали пролиферацията на MBrC (Фигура 2A и S1E). Подобно на предишни доклади,43 увеличението на NF-kB-luc се свързва с инфекцията с V. harveyi по зависим от времето начин (Фигура S1F).

Фигура 2. ACKR4a инхибира задействаното от V. harveyi NF-kB сигнализиране

За по-нататъшно определяне на ефекта на ACKR4a върху NF-kB сигнализиране, предизвикано от V. harveyi, беше извършен луциферазен репортерен анализ. ACKR4a значително инхибира V. harveyi- и LPS-задействаната NF-kB луциферазна активност; Активираната от V. harveyi IL-1b и TNFa луциферазна активност също се инхибира от ACKR4a (Фигури 2B–2D). Ендогенният ACKR4a беше заглушен, за да се потвърди ролята му във вродения имунитет. След това моделите на експресия на p65 и провъзпалителни цитокини (IL-1b и TNFa) бяха допълнително открити, ACKR4a заглушава драстично увеличените p65 mRNAs, IL-1b mRNAs и TNFa mRNAs (Фигури 2E-2G ). Резултатите в MLC и MKC също показват, че ACKR4a може да инхибира NF-kB сигнализирането (фигури S1G–S1J). Резултатите от ELISA също бяха подобни; Заглушаването на ACKR4a значително повишава TNFa и свръхекспресията на ACKR4a инхибира TNFa (Фигура 2Н). За да се оцени активирането на NF-kB, е по-необходимо да се анализира транслитерираната форма, която е фосфорилиран NF-kB, и това е мярка за активността на NF-kB върху целевите гени. При стимулиране на NF-kB, p65 се фосфорилира и навлиза в ядрото, за да регулира транскрипцията на провъзпалителни цитокини. За да изследваме регулацията на фосфорилирането на p65 от ACKR4a, ние измерихме нивото на фосфорилиране на p65 след заглушаване на ACKR4a и свръхекспресия на ACKR4a чрез имуноблот. Инфекцията с V. harveyi засилва фосфорилирането на p65, което доказва, че V. harveyi ефективно активира NF-kB. На тази основа, заглушаването на ACKR4a засилва фосфорилирането на p65, докато свръхекспресията на ACKR4a намалява фосфорилирането на p65, което показва, че ACKR4a е инхибитор на NF-kB сигнализиране (Фигури 2I и 2J). При рибата зебра, нокдаунът на ACKR4a повишава фосфорилирането на p65. В допълнение, анализът на CFU показа, че BAY 11–7082 значително повишава пролиферацията на MBrC (Фигура 2K). Като цяло, тези данни предполагат, че ACKR4a функционира като отрицателен регулатор на NF-kB сигнализиране за инхибиране на вродения имунитет по време на инфекция с V. harveyi.

Фигура 3. ACKR4a взаимодейства с MyD88 и промотори на разграждането на MyD88 при аутофагия

ACKR4a взаимодейства с MyD88 и насърчава MyD88 за автофагично разграждане

След това се опитахме да определим коя цел в NF-kB сигнализирането медиира потискащата функция на ACKR4a0. Репортерният анализ на NF-kB-луцифераза разкрива, че свръхекспресията на ACKR4a причинява намаляване на луциферазната активност, което е индуцирано от MyD88 по дозозависим начин (Фигура 3А). Въпреки това, свръхекспресията на ACKR4a не показва ефект върху луциферазната активност, управлявана от TRAF6 или TAK1 (Фигури 3B и 3C). Резултатът от имуноблот е подобен на луциферазния репортерен анализ; свръхекспресията на ACKR4a инхибира MyD88 по дозозависим начин, но няма ефект върху TRAF6 и TAK1 (Фигура 3D). Тези резултати предполагат, че ACKR4a функционира на ниво MyD88.

Всички TLR на бозайници, с изключение на TLR3, зависят поне отчасти от адаптера MyD88 за предаване на сигнали, което прави директната регулация на MyD88 по-ефективна.44 След това изследвахме експресията на MyD88 в различни моменти от инфекцията с V. harveyi и открихме заглушаване на ACKR4a засилва експресията на MyD88 (Фигура 3E), а свръхекспресията на ACKR4a инхибира експресията на MyD88 по зависим от времето начин (Фигура 3F). Беше открит интересен резултат, че въпреки че заглушаването на ACKR4a засилва експресията на MyD88, предизвикана от V. harveyi, това подобрение не е налице, когато клетките са в покой (фигури 3G и 3H). За да разберем по-добре молекулярния механизъм, лежащ в основата на действието на ACKR4a в MyD88-медиираната NF-kB сигнализация, ние проведохме анализи на коимунопреципитация (Co-IP), за да определим дали ACKR4a взаимодейства с MyD88. Flag-ACKR4a може да имунопреципитира с Myc-MyD88 (Фигури 3I и S1K). В съответствие с това открихме, че Flag-MyD88 може да взаимодейства с ендогенен ACKR4a (Фигура 3J). Последващите експерименти за субклетъчна локализация показват, че ACKR4a няма значителна съвместна локализация с MyD88 (Фигура S1L). По този начин тези открития подкрепят концепцията, че ACKR4a взаимодейства физически с MyD88 и тяхното взаимодействие вероятно се случва в цитоплазмата. След това изследвахме механизма, чрез който ACKR4a потиска експресията на MyD88. Или NH4Cl, или 3-метиладенин (3-MA), инхибитори на пътя на разграждане, зависим от автофагия-лизозома, водят до значително натрупване на MyD88 в присъствието на ACKR4a, а MG132 не повлиява разграждането на MyD88 (Фигура 3K). Освен това подобни резултати показват, че 3-MA и NH4Cl значително блокират разграждането на MyD88 по дозозависим начин (фигури 3L и 3M). Тези констатации изглежда предполагат, че блокирането на аутофагията ефективно предотвратява разграждането на MyD88, насочено към ACKR4a. Автофагичният поток обозначава динамичния процес на автофагия, който е надежден индикатор за автофагична активност. Тъй като флуоресценцията на GFP се потушава в лизозомата, етапът на автофагия може да се определи от флуоресценцията на GFP и RFP.42 Наблюдението на жълтата флуоресценция в панела за сливане показва повече червена флуоресценция в присъствието на ACKR4a, което показва, че ACKR4a насърчава сливането на автофагозоми и лизозоми; докато инхибиторът на аутофагията хлорохин (CQ) предотвратява сливането на автофагозоми и лизозоми, показвайки повече жълта флуоресценция (Фигура 3N). За по-нататъшно валидиране, че ACKR4a е насочен към MyD88 за автофагично разграждане, беше извършен анализ на лизозомна локализация, MyD88 (зелено) и лизозоми (червено) бяха локализирани съвместно в MBrC клетка (Фигура 3O), което предполага, че MyD88 е транспортиран до лизозоми. Взети заедно, тези резултати предполагат, че ACKR4a взаимодейства с MyD88 и е насочен към MyD88 за автофагично разграждане.

Фигура 4. ACKR4a участва в регулирането на автофагията чрез Beclin-1

ACKR4a участва в регулирането на автофагията чрез Beclin-1

Някои бактерии използват аутофагия, за да стимулират техния растеж и инфекция, тяхната репликация ще бъде намалена, когато аутофагията отсъства.13 За да се тества дали V. harveyi участва в регулирането на аутофагията в MBrC клетките, клетките бяха заразени с V. harveyi и след това моделът на експресия на LC3 беше изследвано. В MBrC клетки експозицията на V. harveyi повишава аутофагията, както е показано от натрупването на GFP-LC3 puncta, което е придружено от зависимо от времето увеличение на инфекцията с V. harveyi (Фигура 4А). Свръхекспресията на ACKR4a засилва индуцираната от V. harveyi аутофагия, както се вижда от забележително увеличение на puncta натрупвания на RFP-LC3, за разлика от заглушаването на ACKR4a, което значително намалява индуцираната от V. harveyi аутофагия (Фигури 4B и 4C). В допълнение, заглушаването на ACKR4a доведе до намаляване на индуцираната от V. harveyi LC3-II експресия (Фигура 4D).

ULK1, Beclin-1 и ATG5 бяха ключовите регулаторни протеини на автофагията. Резултатите от qPCR показват, че ACKR4a значително повишава експресията на Beclin-1, но не и ULK1 и ATG5 (Фигура 4E). Анализът на луциферазния репортер на ULK1, ATG5 и Beclin-1 разкри, че свръхекспресията на ACKR4a причинява само повишаване на Beclin-1луциферазната активност (Фигура 4F). След това открихме, че свръхекспресията на ACKR4a засилва експресията на Beclin-1, но не и ULK1 и ATG5 (Фигура 4G). Освен това индуцираната от ACKR4a автофагия беше инхибирана от Beclin-1-si, докато ATG5-si имаше само частично инхибиране (Фигура 4H). Горните резултати показват, че ACKR4a е насочен към Beclin-1. Поради това бяха изследвани функцията и механизмът на Beclin-1 при ACKR4a-медиирано автофагично разграждане на MyD88. При риба зебра, заразена с V. harveyi, нокдаунът на ACKR4a не доведе до значителни промени в ULK1, като същевременно значително намали Beclin-1 и ATG5 (фигури S2B–S2D). Beclin-1 допълнително засили индуцирания от ACKR4a автофагичен поток с третирани Baf1A и CQ (Фигура 4I), а Beclin-1 засили разграждането на MyD88 от ACKR4a (Фигура 4J). След това проведохме Co-IP анализи, за да определим дали ACKR4a взаимодейства с Beclin-1, и открихме, че ACKR4a взаимодейства с Beclin-1, а инфекцията с V. harveyi засили взаимодействието между ACKR4a и Beclin{{51 }} (Фигура 4K). Анализ на лизозомна локализация показва, че ACKR4a усилва сливането на автофагозомата с лизозомата (Фигура 4L). Впоследствие ACKR4a увеличава ендогенната експресия на Beclin-1 (Фигура 4M) и заглушаването на ACKR4a отслабва индуцираната от V. harveyi експресия на Beclin-1 (Фигура 4N). В допълнение, заглушаването на Beclin-1 засилва фосфорилирането на p65, предизвикано от V. harveyi, което допълнително предполага, че V. harveyi индуцира автофагия за отрицателно регулиране на NF-kB сигнализиране (Фигура 4O). След това се опитахме да определим биологичното значение на Beclin-1 при инфекция с V. harveyi, особено при контролиране на пролиферацията на V. harveyi. Извършен е CFU анализ и е установено, че заглушаването на Beclin-1 и блокираната от CQ аутофагия намаляват пролиферацията на V. harveyi, което доказва, че V. harveyi използва аутофагия за насърчаване на своята пролиферация (Фигура 4P). Горните резултати заедно разкриват, че ACKR4a индуцира и образува комплекси с Beclin-1 за насърчаване на автофагията и след това улеснява инфекцията с V. harveyi.

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

ACKR4a индуцира аутофагия до блокирана апоптоза

Автофагичната клетъчна смърт се счита за разумна алтернатива на апоптозата, а апоптозата също е признат антибактериален механизъм; успешните бактериални инфекции завършват самовъзпроизвеждане чрез инхибиране на апоптоза.22 За да се определи връзката между индуцираната от V. harveyi аутофагия и апоптоза, беше определена апоптозата на MBrC клетки с различни лечения преди и след инфекция с V. harveyi и заглушаването на ACKR4a увеличи V. индуцирана от harveyi апоптоза (Фигури 5A и 5B, левият панел). Тъй като каспаза3 и каспаза7 са важни за инициирането на апоптоза, те са широко приети като надеждни индикатори за апоптоза. Анализ на каспаза Glo 3/7 показа, че свръхекспресията на ACKR4a инхибира индуцираната от V. harveyi активност на каспаза 3/7, докато заглушаването на ACKR4a засилва индуцираната от V. harveyi активност на каспаза 3/7 (Фигура 5B, десен панел). V. harveyi и екзогенно добавена рекомбинантна активна каспаза8 индуцирана от каспаза3/7 активност се инхибира от ACKR4a (Фигура 5C), което предполага, че ACKR4a е способен ефективно да блокира апоптозното сигнализиране. Въпреки че е демонстрирана индуцирана от ACKR4a аутофагия, необходими са допълнителни проучвания за изследване на ролята на аутофагията при блокиране на апоптозата. Както е показано на Фигура 5D, заглушаването на ACKR4a значително повишава ефекторните каспази (каспаза7) и инициаторните каспази (каспаза8). В допълнение, свръхекспресията на ACKR4a инхибира мРНК на каспаза7 и каспаза8 (Фигура 5E) и нокдаунът на ACKR4a значително повишава каспаза7 и каспаза8 в рибата зебра (фигури S2E и S2F). Предишни проучвания показват, че Beclin-1 е молекулярен превключвател, който медиира процесите на апоптоза и автофагия, 45 така че е проучено участието на Beclin-1 в регулирането на апоптозата. В нашето изследване, свръхекспресията на Beclin-1 регулира надолу каспаза8, индуцирана от V. harveyi, докато Beclin-1 заглушава високорегулираната каспаза8, индуцирана от V. harveyi (Фигура 5F). Беше открит интересен резултат, че каспаза8 беше значително повишена на 3 часа от инфекцията с V. harveyi; отново се инхибира с увеличаване на продължителността на инфекцията и LC3-II корелира отрицателно с каспаза8 (Фигура 5G). Съгласно горните резултати, ACKR4a индуцира аутофагия, за да блокира апоптотичното сигнализиране и да улесни инфекцията с V. harveyi, а Beclin-1 може да бъде потенциална цел в каскадата от аутофагия и апоптоза.

Фигура 5. ACKR4a индуцира аутофагия, за да блокира апоптозата

Ap-1 засилва индуцираната от ACKR4a автофагия при инфекция с V. harveyi

Впоследствие беше изследван механизмът на експресия на ACKR4a, индуцирана от V. harveyi. Четири различни ACKR4a промоторни плазмиди бяха конструирани първо според последователностите за предсказване на промотора (Фигура 6А). Луциферазният анализ показа, че активността на ACKR4a-p-3 е най-висока (Фигура 6B). За идентифициране на възходящия активатор на експресия на ACKR4a по време на инфекция с V. harveyi, промоторната област на ACKR4a беше анализирана и беше установено, че ACKR4a има потенциални места на свързване на Sp-1 и Ap-1 (Фигура 6C). Анализът на ACKR4a-luc показа, че Sp-1 не може да повиши луциферазната активност, а Ap-1 повиши луциферазната активност (фигури 6D и 6E), което повиши възможността ACKR4a да бъде директна мишена на Ap -1. За да се изследва това, бяха конструирани два луциферазни вектора, състоящи се от мутант ACKR4a (Фигура 6F). Анализът на луциферазата показа, че мутанти без Ap-1 свързващи места инхибират луциферазната активност за разлика от дивия тип (Фигура 6G). За да потвърдим, че Ap-1 насърчава експресията на ACKR4a, ние заглушихме или засилихме експресията на Ap-1 чрез свръхекспресия или нокдаун и експресията на ACKR4a беше оценена в трансфектирани MBrC клетки. Заглушаването на Ap-1 значително намалява индуцираната от V. harveyi експресия на ACKR4a (Фигура 6H), докато свръхекспресията на Ap-1 значително повишава експресията на ACKR4a (Фигура 6I). Резултатите от имуноблот са в съответствие с резултатите от qPCR, свръхекспресията на Ap-1 повишава експресията на ACKR4a, докато заглушаването на Ap-1 намалява експресията на ACKR4a (Фигура 6J). ChIP анализът показа, че Ap-1 се свързва с ACKR4a промотора в MBrC клетки при нормални физиологични условия и V. harveyi стимулация засилва свързването на Ap-1 с ACKR4a промотора (Фигура 6K). Горните резултати потвърдиха, че ACKR4a е потенциална транскрипционна цел на Ap-1. След това беше изследвана функцията на Ap-1 в автофагията; Заглушаването на Ap-1 ефективно намалява индуцираното от инфекцията V. harveyi натрупване на GFP-LC3 (Фигура 6L) и също така отслабва индуцираната от инфекция V. harveyi повишена регулация на LC3-II (Фигура 6M ). Анализът на CFU беше извършен, за да се изследва ролята на Ap-1 при инфекция с V. harveyi и се установи, че AP-1 улеснява пролиферацията на V. harveyi (Фигура 6N). Взети заедно, горните резултати показват, че Ap-1 активира транскрипцията и експресията на ACKR4a и допринася за инфекцията с V. harveyi.

Фигура 6. Ap-1 усилена индуцирана от ACKR4a аутофагия при инфекция с V. harveyi

Фигура 7. Работен модел за това как ACKR4a улеснява инфекцията с V. harveyi

ДИСКУСИЯ

Показано е, че ACKR участват в няколко биологични процеса като регулиране на хемокинова система, интернализация на хемокинов лиганд, вътреклетъчно разграждане и възпалителен отговор, 4, 26, което е важно не само за адаптивния имунитет, но и като важен компонент на вродената имунна система .33,34 Въпреки това, ролята на ACKRs във възпалителния отговор на бактериална инфекция при риби не е изследвана. Това проучване демонстрира за първи път, че ACKR4a, член на семейството на ACKR, насърчава инфекцията на V. harveyi на риба телеост чрез автофагия и апоптоза. Механично, транскрипцията на ACKR4a се регулира нагоре от транскрипционния фактор AP-1. След това повишено регулираният ACKR4a беше синергизиран с Beclin-1, за да индуцира автофагия и транспортира MyD88 до лизозомите за разграждане. Междувременно ACKR4a индуцира аутофагия, за да блокира апоптозата и след това улеснява инфекцията с V. harveyi (Фигура 7). Вроденият имунитет играе решаваща роля в защитата на еукариотите от ендогенна и екзогенна патогенна инвазия.46 В резултат на дълготрайно излагане на микроорганизми, рибите са развили по-оптимизиран вроден имунитет, за да ги предпазва от инфекция.47 TLR разпознават PAMP, когато възникне бактериална инфекция, и инициира вроден имунен отговор чрез MyD88-зависими и независими пътища, които индуцират производството на провъзпалителни цитокини за елиминиране на бактериална инфекция. MyD88 е основен адаптер в TLR сигнализирането, с изключение на TLR3, всички TLR на бозайници използват MyD88, за да активират NF-kB сигнализирането. Следователно може да е най-ефективно да се регулира директно MyD88. Например S-1-ацетилцистеинът инхибира производството на IL-6 чрез индуциране на разграждането на MyD88. По подобен начин при риби се съобщава, че IRF3 и eIF3k инхибират сигнализирането на NF-kB чрез насочване към MyD88.42,49 Натрупаните доказателства също предполагат, че MyD88 е важен за елиминирането на бактериални инфекции. Например мишки с дефицит на MyD88-не можеха да разпознаят бактериалните компоненти и бяха силно податливи на S. aureus. 50 Освен това е доказано, че MyD88 участва в елиминирането на бактериални инфекции при рибките зебра.41 Активирането на вродената имунна система насърчава изчистването на бактериите, което представлява голям селективен натиск, като ги насърчава да развият способността си да потискат вродения имунитет .51,52 Доказано е, че салмонелата може да регулира имунните реакции и да манипулира възпалителните реакции след инфектиране на клетки гостоприемници. Вирулентността на салмонелата SpvC необратимо дефосфорилира ERK, p38 и MAPK, като по този начин инхибира транскрипцията на провъзпалителни цитокини.53 В това проучване повишеният ACKR4a в инфектиран с V. harveyi M. miiuy се комбинира с MyD88 за инхибиране на фосфорилирането на p65 и блокира NF-kB сигнализиране. Това предполага, че бактериите могат също да потиснат вродения имунитет на рибите, като се намесват в стабилността на адаптерите в TLR сигнализирането с цел избягване на имунитета.

Автофагията и апоптозата са два признати механизма на резистентност към бактериална инвазия, като антимикробната аутофагия е бариера срещу нахлуващи микроорганизми. PRR могат да индуцират аутофагия на различни етапи от контакта гостоприемник-бактерия и да инхибират вътреклетъчния растеж на бактериите.54 Обратно, бактериите също са развили ефективни механизми за предотвратяване, борба или управление на автофагия. Тези механизми често включват насочване към Beclin-1 за блокиране на аутофагията,55 предотвратяване на съзряването на автофагозомите56 и дори активиране на аутофагията в някои случаи, за да се осигури хранене за бактериален растеж.57 За разлика от това, открихме, че V. harveyi индуцира Beclin{{6} }активирана аутофагия чрез ACKR4a, която е насочена към MyD88 за автофагично разграждане, като по този начин блокира NF-kB сигнализирането и насърчава самовъзпроизвеждането. Друга защитна стратегия е програмираната клетъчна смърт (апоптоза), която се активира, когато патогените използват клетки гостоприемници за оцеляване и репликация. Например, микобактериалната инфекция на макрофагите причинява апоптоза, която допринася за елиминирането на бактериите от клетките.58 В допълнение, TNF-a-медиираната макрофагова апоптоза разрушава вътреклетъчната среда за репликации на микобактерии и намалява скоростта на растеж на заразените микобактерии.59 За борба с налягането на оцеляване на апоптозата, много успешни патогени кодират гени, чиито продукти инхибират апоптозата в клетките гостоприемници, като по този начин поддържат жизнеспособността за репликация на патогени.60 Въпреки че тези механизми са добре проучени при бозайници, малко се знае за бактериалното инхибиране на апоптозата при рибите. В нашето изследване индуцираната от V. harveyi автофагия играе роля в апоптотичните етапи и блокира апоптотичната сигнализация. Апоптозата и аутофагията се насърчават и антагонизират взаимно. В предапоптозните етапи клетките блокират апоптотичния път и намаляват нивото на апоптоза чрез автофагия, като по този начин запазват предимството. Автофагията не предизвиква клетъчна смърт в ранните етапи на апоптозата, но също така насърчава клетъчното оцеляване.61 Автофагията по време на късния етап на апоптозата може да насърчи апоптозата, а след това повишената апоптоза инхибира появата на аутофагия чрез миграцията на p53 и BH3 пътища.62 Биологичният процес е строго регулиран, включително взаимодействието на автофагия и апоптоза. Множество регулаторни гени участват в механизма на интерактивен отговор на апоптозата и аутофагията, Beclin-1 е един от тях.63 В допълнение към регулацията на инициирането на автофагия, Beclin-1 също участва в регулирането на апоптозата.45 ,64 Проучванията показват, че Beclin-1 губи способността си да устои на апоптоза, след като бъде разцепен от активирани каспази.65 Това предполага, че Beclin-1 играе важна роля като „молекулен превключвател“ в регулацията на автофагия и апоптоза.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

V. harveyi е морска грам-отрицателна бактерия, която представлява сериозна заплаха за здравето на морските аквакултури. Инфекцията с V. harveyi причинява менингит и енцефалит при рибите,66 а инфекцията с V. harveyi причинява церебрална конгестия при групера.67 В отговор на бактериална инфекция, вродените имунни и възпалителни реакции са основните защитни системи на рибите. Въпреки това, бактериите също са развили способността да избягват имунитета в симбиоза с техните гостоприемници. В обобщение, нашите резултати разкриват механизъм на имунно избягване на V. harveyi при риби. ACKR4a индуцира аутофагия, за да инхибира сигнализирането на NF-kB и да блокира апоптозата, което от своя страна улеснява инфекцията с V. harveyi при риби телеост. Това е и първият път, когато е установено, че грам-отрицателните бактерии избягват имунитета чрез едновременно регулиране на вродения имунитет и апоптозата чрез автофагия. Това проучване предоставя представа за разбирането на ефектите от аутофагията върху взаимодействието гостоприемник-бактерия при телестните риби и предоставя перспектива за резистентността на бозайниците към бактериална инфекция.

ПРЕПРАТКИ

1. Динарело, Калифорния (2018). Преглед на семейството IL-1 при вродено възпаление и придобит имунитет. Immunol. Откр. 281, 8–27.

2. Gaidt, MM, Ebert, TS, Chauhan, D., Ramshorn, K., Pinci, F., Zuber, S., O'Duill, F., Schmid-Burgk, JL, Hoss, F., Buhmann, R., et al. (2017). ДНК инфламазомата в човешки миелоидни клетки се инициира от STING-клетъчна програма за смърт преди NLRP3. Клетка 171, 1110–1124.e18.

3. Xiao, TS (2017). Вроден имунитет и възпаление. клетка. Mol. Immunol. 14, 1–3.

4. Коропатник, Т.А., Енгъл, Дж.Т., Апичела, Масачузетс, Стаб, Е.В., Голдман, У.Е., и МакфолНгай, MJ (2004). Развитие, медиирано от микробен фактор, при взаимовръзка гостоприемник-бактерия. Наука 306, 1186–1188.

5. Джейнуей, Калифорния (1989). Приближаване до асимптотата? Еволюция и революция в имунологията. Cold Spring Harb. Symp. Количество Biol. 54, 1–13.

6. Vallabhapurapu, S. и Karin, M. (2009). Регулиране и функция на NF-kB транскрипционни фактори в имунната система. Annu. Rev. Immunol. 27, 693–733.

7. Кракауер, Т. (2019). Инфламазоми, автофагия и клетъчна смърт: триединството на вродената защита на гостоприемника срещу вътреклетъчни бактерии. Медиатори на възпаление. 2019, 2471215.

8. Хърли, JH и Young, LN (2017). Механизми на иницииране на автофагия. Annu. Rev. Biochem. 86, 225–244.

9. Хе, X., Жу, Y., Джан, Y., Geng, Y., Gong, J., Geng, J., Zhang, P., Zhang, X., Liu, N., Peng, Y ., и др. (2019 г.). RNF34 функционира в имунитета и селективната митофагия чрез насочване към MAVS за автофагично разграждане. EMBO J. 38, 1009788–e101018.

10. Yin, L., Lv, M., Qiu, X., Wang, X., Zhang, A., Yang, K. и Zhou, H. (2021). IFN-G манипулира NOD1-медиираното взаимодействие на аутофагията и Edwardsiella piscicida, за да увеличи вътреклетъчния клирънс при рибите. J. Immunol. 207, 1087–1098.

11. Mansilla-Pareja, ME, Bongiovanni, A., Lafont, F. и Colombo, MI (2017). Промени в целостта на репликативната вакуолна мембрана на Coxiella burnetii и взаимодействие с пътя на автофагията. Преден. клетка. заразявам. Microbiol. 7, 112.

12. Браво-Сантано, Н., Елис, Дж.К., Матеос, Л.М., Кале, Й., Кеун, Х.К., Берендс, В. и Летек, М. (2018). Вътреклетъчният Staphylococcus aureus модулира централния въглероден метаболизъм на гостоприемника, за да активира автофагията. mSphere 3, 003744– 003818.

13. Winchell, CG, Dragan, AL, Brann, KR, Onyilagha, FI, Kurten, RC, и Voth, DE (2018). Coxiella burnetii подкопава p62/секвестозома 1 и активира Nrf2 сигнализиране в човешки макрофаги. заразявам. имунна. 86, e00608–e00617.

14. Lee, HK, Lund, JM, Ramanathan, B., Mizushima, N., and Iwasaki, A. (2007). Зависимо от автофагия вирусно разпознаване от плазмоцитоидни дендритни клетки. Наука 315, 1398–1401.

15. Джоунай, Н., Такешита, Ф., Кобияма, К., Савано, А., Мияваки, А., Син, КК, Ишии, К. Дж., Кавай, Т., Акира, С., Сузуки, К., и Okuda, K. (2007). Конюгатът Atg5 Atg12 е свързан с вродени антивирусни имунни отговори. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ. 104, 14050–14055.

16. Шааф, MBE, Keulers, TG, Vooijs, MA, и Rouschop, KMA (2016). Семейни протеини LC3/GABARAP: автофагия-(несвързани) функции. FASEB J 30, 3961–3978.

17. Chen, Z., Wang, T., Liu, Z., Zhang, G., Wang, J., Feng, S. и Liang, J. (2015). Инхибиране на аутофагията от MiR-30A, индуцирана от Mycobacteria tuberculosis, като възможен механизъм за имунно бягство в човешките макрофаги. Jpn. J. Инфектирайте. дис. 68, 420–424.

18. Kubori, T., Bui, XT, Hubber, A. и Nagai, H. (2017). Legionella RavZ играе роля в предотвратяването на набирането на убиквитин във вакуоли, съдържащи бактерии. Преден. клетка. заразявам. Microbiol. 7, 384.

19. Danial, NN и Korsmeyer, SJ (2004). Клетъчна смърт: критични контролни точки. Клетка 116, 205–219.

20. Salvesen, GS и Ashkenazi, A. (2011). Моментна снимка: каспази. Клетка 147, 476–476.e1.

21. Zhou, ZJ и Sun, L. (2016). Индуцирано от Edwardsiella tarda инхибиране на апоптоза: стратегия за вътреклетъчно оцеляване. Преден. клетка. заразявам. Microbiol. 6, 76.

22. Gu¨nther, SD, Fritsch, M., Seeger, JM, Schiffmann, LM, Snipas, SJ, Coutelle, M., Kufer, TA, Higgins, PG, Hornung, V., Bernardini, ML, et al. (2020 г.). Цитозолните грам-отрицателни бактерии предотвратяват апоптозата чрез инхибиране на ефекторни каспази чрез липополизахарид. Нац. Microbiol. 5, 354–367.

23. Wierzbicki, IH, Campeau, A., Dehaini, D., Holay, M., Wei, X., Greene, T., Ying, M., Sands, JS, Lamsa, A., Zuniga, E., et al. (2019 г.). Стрептококовият S протеин от група А използва червените кръвни клетки като имунен камуфлаж и е критичен фактор за избягване на имунитета. Cell Rep. 29, 2979–2989.e15.

24. Chen, J., Lu, Y., Ye, X., Emam, M., Zhang, H., and Wang, H. (2000). Текущ напредък в отчитането на кворума на Vibrio harveyi като цели за откриване на лекарства. Евро. J. Med. Chem. 207, 112741.

25. Kimura, T., Jain, A., Choi, SW, Mandell, MA, Schroder, K., Johansen, T. и Deretic, V. (2015). TRIM-медиирана прецизна аутофагия е насочена към цитоплазмените регулатори на вродения имунитет. J. Cell Biol. 210, 973–989.

26. Злотник, А. и Йоши, О. (2012). Преглед на суперсемейството на хемокините. Имунитет 36, 705–716.

27. Ulvmar, MH, Hub, E. и Rot, A. (2011). Атипични хемокинови рецептори. Exp. Cell Res. 317, 556–568.

28. Bonecchi, R., Savino, B., Borroni, EM, Mantovani, A. и Locati, M. (2010). Хемокинови рецептори за примамка: структурна функция и биологични свойства. Curr. Връх. Microbiol. Immunol. 341, 15–36.

29. Comerford, I., Litchfield, W., Harata-Lee, Y., Nibbs, RJB и McColl, SR (2007). Регулиране на хемотаксичните мрежи от "атипични" рецептори. Биоесета 29, 237–247.

30. Horuk, R., Chitnis, CE, Darbonne, WC, Colby, TJ, Rybicki, A., Hadley, TJ и Miller, LH (1993). Рецептор за маларийния паразит Plasmodium vivax: еритроцитният хемокинов рецептор. Наука 261, 1182–1184.

31. Bonini, JA, Martin, SK, Dralyuk, F., Roe, MW, Philipson, LH и Steiner, DF (1997). Клониране, експресия и хромозомно картографиране на нов човешки CC-хемокинов рецептор (CCR10), който показва свързване с висок афинитет за MCP-1 и MCP-3. DNA Cell Biol. 16, 1249–1256.

32. Nibbs, RJ, Wylie, SM, Yang, J., Landau, NR и Graham, GJ (1997). Клониране и характеризиране на нов безразборен човешки бета-хемокинов рецептор D6. J. Biol. Chem. 272, 32078–32083.

33. Бърнс, JM, Summers, BC, Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, MET, Sunshine, MJ, Littman, DR, Kuo, CJ и др. (2006). Нов хемокинов рецептор за SDF-1 и I-TAC участва в клетъчното оцеляване, клетъчната адхезия и развитието на тумора. J. Exp. Med. 203, 2201–2213.

34. Gosling, J., Dairaghi, DJ, Wang, Y., Hanley, M., Talbot, D., Miao, Z. и Schall, TJ (2000). Най-модерно: идентифициране на нов хемокинов рецептор, който свързва дендритни клетки и Т-клетъчно активни хемокини, включително ELC, SLC и TECK. J. Immunol. 164, 2851–2856.

35. Hall, RA, Premont, RT и Lefkowitz, RJ (1999). Сигнализация на хептахеличен рецептор: отвъд парадигмата на G протеина. J. Cell Biol. 145, 927–932.

36. Brzostowski, JA и Kimmel, AR (2001). Сигнализиране при нула G: независими от G-протеин функции за 7-TM рецептори. Trends Biochem. Sci. 26, 291–297.

37. Sun, Y., Huang, J., Xiang, Y., Bastepe, M., Ju¨ppner, H., Kobilka, BK, Zhang, JJ и Huang, XY (2007). Зависещо от дозата преминаване от G протеин-свързано към G протеин-независимо сигнализиране чрез GPCR. EMBO J. 26, 53–64.

38. Nibbs, RJB и Graham, GJ (2013). Имунна регулация от атипични хемокинови рецептори. Нац. Rev. Immunol. 13, 815–829.

39. Луис, BP, Бърдж, CB, и Бартел, DP (2005). Запазеното сдвояване на семена, често оградено от аденозини, показва, че хиляди човешки гени са микроРНК мишени. Клетка 120, 15–20.

40. Friedman, RC, Farh, KKH, Burge, CB и Bartel, DP (2009). Повечето тРНК на бозайници са запазени мишени на микроРНК. Genome Res. 19, 92–105.

41. Denli, AM, Tops, BBJ, Plasterk, RHA, Ketting, RF и Hannon, GJ (2004). Обработка на първични микроРНК от микропроцесорния комплекс. Nature 432, 231–235.

42. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W., Sun, Y. и Xu, T. (2022). eIF3k инхибира сигнализирането на NF-kB чрез насочване към MyD88 за ATG5-медиирано автофагично разграждане в костни риби. J. Biol. Chem. 298, 101730.

43. Chu, Q., Sun, Y., Cui, J. и Xu, T. (2017). Индуцируемата микроРНК -214 допринася за потискането на NF-kB-медииран възпалителен отговор чрез насочване към гена myd88 при риба. J. Biol. Chem. 292, 5282–5290.

44. Gay, NJ, Symmons, MF, Gangloff, M. и Bryant, CE (2014). Сглобяване и локализиране на Toll-подобни рецепторни сигнални комплекси. Нац. Rev. Immunol. 14, 546–558.

45. McKnight, NC и Zhenyu, Y. (2013). Beclin 1 е основен компонент и главен регулатор на PI3K-III при здраве и болести. Curr. Pathobiol. Rep. 1, 231–238.

46. ​​Mutwiri, G., Gerdts, V., Lopez, M. и Babiuk, LA (2007). Вроден имунитет и нови адюванти. Rev. Sci. техн. 26, 147–156.

47. Бухман, К. (2014). Еволюция на вродения имунитет: улики от безгръбначни през риби до бозайници. Преден. Immunol. 5, 459.

48. Chu, Q., Sun, Y., Cui, J. и Xu, T. (2017b). МикроРНК-3570 модулира пътя на NF-kB в риба телеост чрез насочване към MyD88. J. Immunol. 198, 3274–3282.

49. Ян, X., Zhao, X., Huo, R. и Xu, T. (2020). IRF3 и IRF8 регулират сигнализирането на NF-kB чрез насочване към MyD88 в костови риби. Преден. Immunol. 11, 606.

50. Такеучи, О., Хошино, К. и Акира, С. (2000). Най-нови: Мишките с дефицит на TLR2-и MyD88-дефицит са силно податливи на инфекция със Staphylococcus aureus. J. Immunol. 165, 5392–5396.

51. Keszei, AFA, Tang, X., McCormick, C., Zeqiraj, E., Rohde, JR, Tyers, M., и Sicheri, F. (2014). Структурата на SspH1-PKN1 комплекс разкрива основата за разпознаване на субстрата на гостоприемника и механизма на активиране за бактериална Е3 убиквитин лигаза. Mol. Cell Biol. 34, 362–373.

52. Gu¨ nster, RA, Matthews, SA, Holden, DW и Thurston, TLM (2017). Ефекторите на SseK1 и SseK3 тип III секреционна система инхибират NFkB сигнализирането и некроптотичната клетъчна смърт в инфектираните със салмонела макрофаги. заразявам. имунна. 85, e00010–e00017.

53. Mazurkiewicz, P., Thomas, J., Thompson, JA, Liu, M., Arbibe, L., Sansonetti, P., and Holden, DW (2008). SpvC е ефектор на Salmonella с фосфотреонин лиазна активност върху протеин кинази, активирани с митоген. Mol. Microbiol. 67, 1371–1383.

54. Saitoh, T. и Akira, S. (2010). Регулиране на вродените имунни отговори чрез протеини, свързани с автофагия. J. Cell Biol. 189, 925–935.

55. Orvedahl, A., Alexander, D., Tallo´ czy, Z., Sun, Q., Wei, Y., Zhang, W., Burns, D., Leib, DA и Levine, B. (2007 г. ). HSV-1 ICP34.5 придава невровирулентност чрез насочване към автофагичния протеин Beclin 1. Микроб клетъчен гостоприемник 1, 23–35.

56. Kyei, GB, Dinkins, C., Davis, AS, Roberts, E., Singh, SB, Dong, C., Wu, L., Kominami, E., Ueno, T., Yamamoto, A. и др. ал. (2009). Пътят на автофагията се пресича с биосинтезата на ХИВ-1 и регулира вирусните добиви в макрофагите. J. Cell Biol. 186, 255–268.

57. Niu, H., Xiong, Q., Yamamoto, A., Hayashi Nishino, M., и Rikihisa, Y. (2012). Автофагозомите, индуцирани от бактериален Beclin 1 свързващ протеин, улесняват задължителната вътреклетъчна инфекция. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ. 109, 20800–20807.

58. Hussain, MA, Datta, D., Singh, R., Kumar, M., Kumar, J. и Mazumder, S. (2019). TLR-2 медииран цитозолен-Ca2+ скок активира ER стрес-супероксид-NO сигналозома, увеличавайки производството на TNF-a, което води до апоптоза на инфектирани с Mycobacterium smegmatis рибни макрофаги. Sci. Представление 9, 12330.

59. Лий, Дж., Хартман, М. и Корнфелд, Х. (2009). Апоптоза на макрофагите при туберкулоза. Yonsei Med. Й. 50, 1–11.

60. McCormick, AL (2008). Контрол на апоптозата от човешки цитомегаловирус. Curr. Връх. Microbiol. Immunol. 325, 281–295.

61. Кума, А., Хатано, М., Мацуи, М., Ямамото, А., Накая, Х., Йошимори, Т., Осуми, Й., Токухиса, Т. и Мизушима, Н. (2004) . Ролята на автофагията по време на ранния период на неонатален глад. Nature 432, 1032–1036.

62. Marin˜o, G., Niso-Santano, M., Baehrecke, EH, and Kroemer, G. (2014). Самоконсумация: взаимодействието на автофагията и апоптозата. Нац. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 81–94.

63. Фуруя, Д., Цуджи, Н., Ягихаши, А. и Ватанабе, Н. (2005). Beclin-1 усилва индуцираната от цис диаминдихлороплатина апоптоза чрез засилване на активността на каспаза 9. Exp. Cell Res. 307, 26–40.

64. Pattingre, S., Tassa, A., Qu, X., Garuti, R., Liang, XH, Mizushima, N., Packer, M., Schneider, MD, и Levine, B. (2005). Bcl-2 антиапоптотичните протеини инхибират Beclin 1-зависимата автофагия. Клетка 122, 927–939.

65. Djavaheri-Mergny, M., Maiuri, MC и Kroemer, G. (2010). Кръстосан разговор между апоптоза и аутофагия чрез медиирано от каспаза разцепване на Beclin 1. Онкоген 29, 1717–1719.

66. Grimes, DJ, Gruber, SH и May, EB (1985). Експериментална инфекция на лимонови акули, Negaprion brevirostris (Poey), с видове Vibrio. Дж. Риба. дис. 8, 173–180.

67. Mohamad, N., Mohd Roseli, FA, Azmai, MNA, Saad, MZ, Md Yasin, IS, Zulkiply, NA, и Nasruddin, NS (2019). Естествена едновременна инфекция на Vibrio harveyi и V. alginolyticus в култивирани хибридни групери в Малайзия. J. Aquat. Anim. Здраве 31, 88–96.