Острата експозиция на кожата на ултравиолетова светлина предизвиква бъбречно възпаление, медиирано от неутрофили

Ние и други показахме, че ултравиолетовата светлина предизвиква бърза инфилтрация на неутрофили в кожата (6, 7). Въпреки че неутрофилите допринасят основно за възпалението на местата на локално нараняване, наскоро беше признато, че неутрофилите могат също да са дом на органи, отдалечени от първичното място на възпаление (8–10), където допринасят за увреждане на белодробната тъкан чрез производството на реактивен кислород видове (ROS) (11) или активират адаптивната имунна система в лимфните възли и костния мозък (9, 12). При SLE се смята, че неутрофилите играят важна роля както при локални, така и при системни заболявания. Неутрофилите присъстват в кожните лезии на пациенти със СЛЕ (13, 14) и вбъбректъкан на пациенти с LN (15, 16). Високата експресия на сигнатура на неутрофилен ген е силен предиктор за активно заболяване, включително LN и кожни обостряния (17, 18). Провъзпалителните гранулоцити с ниска плътност (LDG) се увеличават особено при пациенти с кожни заболявания (19). Въпреки че тези открития предполагат, че неутрофилите са част от локалното тъканно увреждане при SLE, дали неутрофилите осигуряват патогенната връзка между възпалението на кожата иувреждане на бъбрецитене се разбира.

За да се изясни как излагането на кожата на UV светлина влияе върхубъбреки ролята, която неутрофилите играят в тези процеси, ние оценихме променитебъбречнагенна експресия в съгласие с миграцията на неутрофилите. Установихме, че острото излагане на кожата на UV светлина стимулира възпалителните процеси вбъбрек,включително експресията на ендотелни адхезионни молекули, възпалителни медиатори, маркери за увреждане и преходна протеинурия. Трябва да се отбележи, че открихме, че неутрофилите мигрират къмбъбрекслед излагане на ултравиолетова светлина по IL-17A-зависим начин, локализирайки се в тубулоинтерстициалните (TI) области, където те показват провъзпалителни фенотипове. Блокирането на трафика на неутрофили чрез лечение с анти-G-CSF имуноглобулин (IgG) е отмененобъбречнавъзпаление и предотвратено повишаване на регулацията на маркерите за тубулно увреждане. Заедно тези констатации показват, че излагането на кожата на ултравиолетова светлина предизвиква субклинично заболяванебъбречнавъзпалителни и нараняващи процеси, медиирани от неутрофили.

Резултати

Излагането на кожата на UV светлина причинява субклинично бъбречно увреждане.Излагането на слънчева светлина е свързано с влошаване на системните симптоми и поява на обостряния на заболяването при пациенти със СЛЕ, включително нефрит (2-4). Затова първо попитахме дали острото стерилно възпаление на кожата, предизвикано от еднократно излагане на ултравиолетова B (UVB) светлина (500 mJ/cm2) при черни 6 (B6) мишки води до промени вбъбрек, включително възпаление, нараняване и протеинурия (фиг. 1А). Белият дроб е избран като контролен орган, тъй като не е докладвана връзка между фоточувствителността и клиничното белодробно заболяване при SLE. Общо 500 mJ/cm2 UVB светлина при B6 мишки е дефинирано като две минимални еритематозни дози (20), референтната доза, използвана за човешки протест (21). Анализи на генна експресия на перфузиябъбрек tissues (Fig. 1A) revealed up-regulation in the gene expression of adhesion molecules vcam- 1 and e-selectin on days 1 and 2 after UVB light exposure (Fig. 1 B and C). In contrast, vcam-1 and e-selectin expression demonstrated a downward trend in the lung (SI Appendix, Fig. S1). We also observed a >10-сгъванебъбречнаиндукция в s100A9, неутрофилен медиатор, свързан сувреждане на бъбреците(22), както и повишена експресия на s100A6, калций-свързващ протеин, свързан с тубулно увреждане (23) (фиг. 1 D и E). Докато индукцията на s100A9 беше открита в белия дроб, генната експресия на s100A6 остана непроменена в белия дроб (SI Приложение, Фиг. S1). Възпалителният отговор вбъбрексъщо беше свързано с ранно увеличаване на експресията на il-1 (дни 1 и 2 след UV), докато имаше минимална или никаква промяна в tnf или il-6 (фиг. 1F). Експресията на Il-1 не беше открита в белия дроб до 6 дни след излагане на кожата на UVB светлина (SI Приложение, Фиг. S1). Бърза индукция в експресията на cxcl12, хемокин, секретиран от гломерули и тубули и замесен вбъбречно увреждане(24), също е открит вбъбрекно не и белия дроб (фиг. 1G и приложение SI, фиг. S1). Следователно предизвиканото от UVB светлина нараняване на кожата предизвиква бързобъбречнапровъзпалителни процеси, докато в белия дроб се наблюдават по-малко промени.

В допълнение към провъзпалителния отговор, наблюдаван вбъбрек,както протеинурията, така и съотношението албумин/креатинин в урината се увеличават през първите няколко дни след излагане на кожата на UVB светлина (Фиг. 1 H и I). Този бърз ефект върхубъбречна функциябеше придружено от повишена регулация в експресията на липокалин-2 иувреждане на бъбрецитемолекула 1 (kim-1) (фиг. 1 J и K), маркери на тубуларниувреждане на бъбрецитекоито се наблюдават и при LN (25, 26). Въпреки преходния характер на протеинурията, изразът на тезиувреждане на бъбрецитемаркерите се задържаха до ден 6 (фиг. 1 J и K), вероятно отразяващи възстановяването на тъканите.

Индуцираното от UV светлина възпаление на кожата води до миграция на неутрофили към бъбрека.За да изследваме дали неутрофилите участват в системния възпалителен отговор към UVB светлина, ние изследвахме кинетиката на натрупването на неутрофили в кожата, облъчена с UV светлина, както и в далака,бъбрек,и бял дроб на C57BL/6 J (B6) мишки, щам, който най-добре имитира кожните промени в UVB светлината в човешката кожа (фиг. 2A) (27). След остро излагане на кожата на UVB светлина, броят на неутрофилите в кожата се увеличава седемкратно в рамките на 24 часа и остава повишен за 6 дни в сравнение с изходните нива преди UVB (D-1) ​​(Фиг. 2B). Това е придружено от намаляване на броя на неутрофилите в костния мозък и петкратно увеличение на циркулиращите неутрофили в кръвта на дни 1 до 6 (Фиг. 2 C и D). Интересното е, че в същата времева рамка неутрофилите се увеличават в далака, белия дроб ибъбрек(Фиг. 2 E–G и SI Приложение, Фиг. S2A). Точната кинетика варира между органите, достигайки пик на ден 1 в белия дроб и дни 2 до 6 вбъбреки далак (фиг. 2 E–G). Вбъбреци, неутрофилите са предимно локализирани в тубулоинтерстициалната област, включително васкулатурата, както е показано чрез оцветяване с неутрофилна еластаза (NE) в близост до или колокализирано с адхезионна молекула на тромбоцити/ендотелни клетки-1 (PECAM-1/CD31 ) (Фиг. 2Н). Представителните изображения на Фиг. 2H показват неутрофили в или около интерстициалната васкулатура (пълни бели стрелки) и в интерстициума (бели пунктирани стрелки), с редки неутрофили, открити също в гломерулите (жълти стрелки). Подобна локализация беше открита с анти-Ly6G имунофлуоресцентно (IF) оцветяване (SI Приложение, Фиг. S2B).

За да определим дали други вродени имунни клетки показват локални и системни отговори, подобни на неутрофилите, ние изследвахме разпределението на моноцитите (CD11b плюс Ly6C плюс Ly6G−) в същите времеви точки след излагане на UVB светлина. Докато моноцитите също бяха наети в кожата, само малък брой инфилтриращи моноцити бяха открити вбъбрекна ден 6 след излагане на UVB (~2-кратно спрямо ~10.5-кратно увеличение набъбрекнеутрофили) (Фиг. 2F и SI Приложение Фиг., S3). Не е открито увеличение на броя на моноцитите в белия дроб или далака (SI Приложение, Фиг. S3), което предполага, че системният отговор на UV увреждане е относително селективен за неутрофилите.

Инфилтрацията на неутрофили в кожата е придружена от хистологични промени, включително ранно възпаление на дермата и смърт на епидермалните клетки (ден 1 и 2), последвано от развитие на акантоза и хиперкератоза с образуване на сероцелуларна кора в някои случаи (ден 6) (SI Приложение, фиг. S4). Трябва да се отбележи, че не се появяват открити кожни лезии след излагане на UVB светлина, което предполага, че наблюдаваната инфилтрация на имунни клетки е настъпила при стерилни условия, въпреки че не може да се изключи принос от променен кожен микробиом (20).

Заедно тези открития показват, че излагането на кожата на единична доза UVB светлина мобилизира неутрофилите както в локалното място на възпаление, така и във вътрешните органи, включителнобъбрек,придружени от кръвна неутрофилия. Докато общите модели на миграция са сходни както при мъжките, така и при женските мишки, неутрофилната инфилтрация в кожата е по-бърза при женските в сравнение с мъжките (фиг. 2B). Обратно, увреждането на епидермиса чрез отстраняване на лентата не е довело до миграция на неутрофили къмбъбреквъпреки подобни нива на неутрофилна инфилтрация и възпалителна реакция и увреждане на тъканите, както се наблюдава при излагане на ултравиолетова светлина (SI Приложение, Фиг. S5), което показва, че системното разпространение на неутрофили не е обичайно за всички форми на стерилно кожно увреждане.

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНО/БЪБРЕЧНО ЗАБОЛЯВАНЕ

IL-17A насърчава набирането на неутрофили след излагане на кожата на UV светлина.Проучване на хемотактични и възпалителни медиатори в кожата разкри значително повишено регулиране на генната експресия на неутрофилни хемокини и възпалителни цитокини cxcl1, cxcl5/6, g-csf и il-1 1 до 2 дни след излагане на UV (фиг. 3 A–D). Бързото и постоянно нарастване на експресията на s100A9 съответства на кинетиката на неутрофилна инфилтрация в кожата (фиг. 2B и SI приложение, фиг. S6), докато цитокините il-6, tnf и il-33 бяха временно увеличени и върнати към изходната експресия до ден 6 (SI Приложение, Фиг. S6). За разлика от това, il-36a беше повишен само на ден 6 (SI Приложение, Фиг. S6), вероятно отразявайки репаративна функция. Преходното (1 до 2 d) присъствие на моноцити в кожата (SI Приложение, Фиг. S3) е успоредно с повишената регулация на моноцит-специфичните хемокини ccl4 и ccl2 (SI Приложение, Фиг. S6). Подобно на натрупването на неутрофили в кожата на женски мишки (Фиг. 2B), натрупването на моноцити в кожата също се появява по-рано при женските, отколкото при мъжките (SI Приложение, Фиг. S3).

UV skin exposure was accompanied by rapid (6 h) 12-fold induction in il-17a gene expression in the skin (Fig. 3E) as well as >1,000-кратно кожна индукция в експресията на g-csf по време на дни 1 и 2 след UV (фиг. 3C). За да определим дали индукцията на тези цитокини е от значение за мобилизирането на неутрофилите, първо определихме количествено концентрациите на цитокинов протеин в кръвта, което разкри силно и устойчиво (10- до 100-кратно) увеличение на концентрацията на плазмата IL-17A 6 до 24 часа след излагане на ултравиолетова светлина (фиг. 3F), заедно с преходно (пик на 6 часа) увеличение на IL-6 и IL-12, цитокини, които може да е след IL-17A (28) (фиг. 3 G и H). Не се наблюдава повишаване на плазмените концентрации на IFN, GM-CSF, TNF, IL-10, IL-27, IL-23 или IL1. За да определим дали IL-17A е необходим за UVB-индуцирано набиране на неутрофили, ние блокирахме ефекта на IL-17A с неутрализиращо антитяло преди излагане на UV (фиг. 3I). Анти-IL-17A IgG значително намалява неутрофилията в кръвта (Фиг. 3J) и отслабва притока на неутрофили както в откритата кожна тъкан (Фиг. 3K и SI Приложение, Фиг. S7A), така ибъбрек(Фиг. 3L и SI Приложение, Фиг. S7B). Тези констатации показват, че набирането на неутрофили в отговор на ултравиолетова светлина се медиира, поне частично, от IL-17A.

Неутрофилите посредничат при възпаление на бъбреците след излагане на кожата на UVСветлина.За да се определи дали неутрофилите са отговорни за възпалителните промени вбъбрек following skin UVB light exposure, we blocked neutrophil recruitment prior to UV light exposure. Since cutaneous g-csf expression was up-regulated >1,000-кратно след излагане на ултравиолетови лъчи, което предполага хемотактична роля на G-CSF в набирането на неутрофили в отговор на ултравиолетова светлина, ние инхибирахме мобилизирането на неутрофили от костния мозък чрез блокиране на G-CSF, както е посочено на Фиг. 4А. Неутрализирането на G-CSF предотвратява кръвната неутрофилия, както и набирането на неутрофили вбъбрекслед излагане на кожата на UVB светлина (фиг. 4 B и C). По-специално, както беше съобщено по-рано в различни модели (29, 30), блокирането на G-CSF не променя броя на моноцитите вбъбрек(Фиг. 4D). Намалена миграция на неутрофили къмбъбрекбеше придружено от значително намаляване набъбречнаекспресия на адхезионните молекули vcam-1 и е-селектин (Фиг. 4 E и F), както и възпалителните медиатори s100A9 и il-1 1 d след UVB експозиция (Фиг. 4 G и H). Освен това, маркерите за тъканно увреждане липокалин-2 и kim-1 вбъбрекса значително намалени при мишки, изложени на UV светлина, третирани с G-CSF блокиращо антитяло в сравнение с третирани с изотип животни, изложени на UV светлина (фиг. 4 I и J). Както съобщихме по-рано (6), острата експозиция на кожата на UVB светлина предизвиква отговор на интерферон тип I вбъбрек(Фиг. 4K). Блокирането на G-CSF значително намалява, но не отменя напълно IFN резултата (фиг. 4K). Докато наличието на неутрофили вбъбрекбеше необходима за острите възпалителни и нараняващи реакции, наблюдавани 1 ден след излагане на кожата на ултравиолетова светлина (фиг. 4), не се наблюдават разлики в протеинурията в този момент, тъй като пиковата протеинурия се наблюдава около ден 4 след излагане на ултравиолетова светлина (фиг. 1 Н и аз). Заедно тези данни показват, че неутрофилите са отговорни за възпалителния отговор и, пряко или косвено, допринасят за индукцията на интерферон тип I вбъбрекслед излагане на кожата на UV светлина. Подобно на резултатите, получени с анти-G-CSF IgG, прилагането на неутрализиращо анти-IL-17 антитяло частично потиска миграцията на неутрофилите къмбъбреки доведе до намалена генна експресия набъбреквъзпалителни (vcam-1 и s100A9) и маркери за увреждане (липокалин-2 и kim-1), въпреки че само намаляването на експресията на kim-1 е статистически значимо (SI Приложение, Фиг. , S7 C–F)

Субпопулация от бъбречни неутрофили се трансмигрира обратно, фенотип също се открива в кръвта на пациенти със СЛЕ.Въпреки че отдавна се предполага, че неутрофилите, навлизащи в местата на инфекция или стерилно възпаление, впоследствие претърпяват апоптоза и бързо се отстраняват от макрофагите, редица проучвания разкриват, че някои неутрофили се движат по двупосочен начин, т.е. след като навлязат в тъкан, те трансмигрират обратно в кръвния поток и проникване на друго място, процес, наричан обратна трансмиграция (rTEM) (8, 10, 11, 31–34). За да се изследва дали неутрофилите, които се приютяват вбъбрекслед излагане на кожата на UVB светлина, преминала през откритата кожа, ние изследвахме миграцията на неутрофили във фотоактивируем миши модел B6 (човешки убиквитин С [UBC]-фотоактивиран [PA]-зелен флуоресцентен протеин [GFP]).

Експерименталната схема е илюстрирана на Фиг. 5А; 1 ден след излагане на кожата на единична доза UVB светлина, кожата беше изложена на виолетова светлина (405 nm), така че инфилтриращите имунни клетки бяха фотоконвертирани в GFP-положителни клетки. След това фотоконвертираните неутрофили (GFP плюс Ly6G плюс) се определят количествено в перфузиранбъбрециследващият ден. Анализът на поточната цитометрия разкрива, че ~20 процента от инфилтриращите бъбреците неутрофили са GFP положителни след изваждане на фоновия сигнал (~10 процента) (Фиг. 5B). За разлика от моделите на стерилно възпаление в черния дроб или кремастерния мускул (8, 10), ние не открихме фотоконвертирани неутрофили в белия дроб, вероятно защото малко неутрофили бяха открити в белия дроб на ден 2 (фиг. 2F). За да тествате дали GFP плюс неутрофили вбъбрекекстравазирани от изложена на UV лъчи кожна тъкан или бяха PA вътресъдово, сравнихме промените в броя на GFP плюс неутрофилите, получени отбъбрецина мишки, при които същата кожа, която е била изложена на ултравиолетова светлина, е била PA с виолетова светлина ден по-късно (група I) срещу мишки, при които кожата в съседство с това излагане на UV светлина е била PA с виолетова светлина ден по-късно (група II, диаграма в Приложение SI, Фиг. S8A). Въпреки че няма разлики в процентите на циркулиращите неутрофили между групите (SI Приложение, Фиг. S8B), по-голямо увеличение на GFP плюс неутрофили се наблюдава вбъбрецина мишки, където кожата, изложена на ултравиолетови лъчи, също е PA (група I) в сравнение с липсата на увеличение на GFP плюс неутрофили при мишките, където кожата, която не е изложена на UV лъчи, е PA (група II) (SI приложение, фиг. S7B). В група II, броят на неутрофилите е подобен на фона на GFP положителността, наблюдавана на Фиг. 5B (SI Приложение, Фиг. S8B).

Докато ниските нива на GFP плюсбъбрекнеутрофилите в група II предполагат, че виолетовата светлина не циркулира PA в клетките, които не са изложени на ултравиолетови лъчи, остава възможно излагането на ултравиолетова светлина да промени взаимодействията на неутрофилите с кръвоносните съдове в кожата, което позволява по-голямо фотопреобразуване и последващобъбрекдостъп. За да определим относителните пропорции на TEM неутрофили, ние количествено определихме експресията на повърхностни маркери, използвани за характеризиране на неутрофили, които са претърпели rTEM: CXCR4hi (8) и ICAM1hiCXCR1lo (11, 35). Наистина, GFP плюсбъбрекнеутрофилите експресират по-високи нива на CXCR4 в сравнение с GFP плюс неутрофили в кожата или GFP− неутрофили вбъбрек(Фиг. 5C). На

интерес,бъбречнаекспресията на CXCR4 лиганда, cxcl12, 1 до 2 дни след излагане на кожата на UVB светлина е съпътствана от присъствието на CXCR4hi неутрофили вбъбрек(Фиг. 1G), вероятно осигурявайки хемотаксичния стимул за набиране на тези неутрофили в бъбрека. Интересно е, че открихме CXCR4hi и ICAM1- hiCXCR1lo неутрофили в костния мозък късно след излагане на ултравиолетови лъчи (ден 6, SI Приложение, Фиг. S9 B и C), което предполага, че някои от тези неутрофили също се връщат обратно в костен мозък, подобно на това, което се съобщава за rTEM след чернодробно увреждане или вирусна инфекция на кожата (12, 36). В съответствие с тези наблюдения, ние открихме по-висока експресия на CXCR4 върху кръвните неутрофили на ден 2 след излагане на ултравиолетови лъчи, вероятно улавяйки клетки по пътя къмбъбреки костен мозък (SI Приложение, Фиг. S9D). По подобен начин, значително по-голям процент от ICAM1hiCXCR1lo клетки беше открит сред GFP плюс неутрофили вбъбрекв сравнение с GFP плюс неутрофили в кожата и GFP− неутрофили вбъбрек(Фиг. 5D). Фенотипът ICAM1hiCXCR1lo се открива при ~20 до 35 процента от GFP плюс неутрофили вбъбрек(фиг. 5D), което предполага, че подгрупа от неутрофили, които мигрират къмбъбрекчрез изложена на ултравиолетови лъчи кожа го правят чрез обратна трансмиграция, докато останалата част отбъбрекнеутрофилите вероятно се активират, докато циркулират през възпалена кожа, изложена на UV лъчи. Неутрофилната субпопулация ICAM1- hiCXCR1lo също беше открита вбъбрецина нормални B6 мишки, изложени на UV светлина, които не са получили PA (SI Приложение, Фиг. S9A).

Въпреки че както CXCR4hi, така и ICAM1hiCXCR1lo неутрофилните фенотипове са свързани с възпалителни функции и увреждане на тъканите при различни миши модели (11, 31, 37), са проведени малко проучвания върху тези клетъчни популации при човешко заболяване. Като се има предвид нововъзникващата роля на неутрофилите в SLE (13, 17, 18) и тяхната очевидна хетерогенност (19), ние изследвахме дали полиморфонуклеарни клетки с нормална плътност (PMN) или LDG от пациенти със SLE

демонстрира обратните мигриращи фенотипове: CXCR4hi (37, 38) и ICAM1hiCXCR1lo. Профилирането на проточна цитометрия на PMNs и LDGs разкрива по-висока експресия на CXCR4 на повърхността на тези клетки при пациенти със SLE в сравнение със здрави контроли (фиг. 6 A и C). Нещо повече, открихме малък, но значително по-висок процент на ICAM1hiCXCR1lo PMNs в SLE кръв (средно, 3,5 процента) в сравнение със здрави контроли (средно, 1,4 процента) (Фиг. 6B). Интересно е, че LDG неутрофилната популация (CD15 плюс CD14loCD10 плюс в мононуклеарни клетки на периферната кръв [PBMCs]) съдържа по-голям процент ICAM1hiCXCR1lo клетки, отколкото PMNs както в здрава (средно, 7,1 процента), така и в SLE кръв (средно, 29,4 процента) (фиг. 6 B и D). Популацията, подобна на rTEM, е значително по-силно представена в LDG от пациенти със SLE в сравнение със здрави контроли (фиг. 6D). Тези данни идентифицират наличието на rTEM-подобни неутрофилни фенотипове в PMNs и по-специално LDGs при пациенти със SLE.

Дискусия

Системните ефекти от излагането на кожата на UV светлина са слабо разбрани. Идентифицирането на тези пътища при нормални изходни условия може да информира механизмите на системно тъканно засягане след излагане на слънце, което се случва при заболявания като SLE (2-4). Тук докладваме няколко открития за това как излагането на слънчева светлина влияе на бъбреците. Първо, ние демонстрирахме, че острото излагане на кожата на UVB светлина предизвиква възпалителни и нараняващи реакции вбъбрек,включително субклинична протеинурия. Интригуващо, тезибъбречнапромените са придружени от инфилтрация на неутрофили в бъбрека след възпаление на кожата, медиирано от UVB светлина. Неутрофилният отговор зависи от IL-17A и G-CSF. Неутрофилите в бъбреците имат провъзпалителни фенотипове, както се вижда от екстрацелуларната локализация на NE, по-висок дял от rTEM (CXCR4hi), известен също като "остарели" и ICAM1hiCXCR1lo клетки. Неутрофилите са пряко замесени в субклиничнитеувреждане на бъбреците,тъй като изчерпването на неутрофилите води до значително намаляване на експресията на адхезионни молекули, възпалителни цитокини, IFN-I сигнатура и маркери за увреждане на бъбреците след излагане на кожата на UV лъчи.

Съобщава се, че други видове наранявания на кожата, като отстраняване на лента и локално приложение на агонист на TLR7, подобряватувреждане на бъбрецитепри някои модели на лупус, въпреки че се смяташе, че усилването на заболяването се медиира от макрофаги и дендритни клетки, а не от неутрофили (39, 40). След като демонстрира, че премахването на лентата не е довело до набиране на неутрофили вбъбрек, ние предлагаме, че излагането на ултравиолетова светлина е различно от другите видове възпаление на стерилна кожа. Това може да се обясни с генерирането на фотопродукти или уникални възпалителни медиатори след UV нараняване, които подготвят бъбрека за възпаление, с разлики в отстраняването на неутрофилите след UV в сравнение със стриппинга или с други фактори. Наблюдавахме, че ултравиолетовата светлина задейства бърза и силна индукция на il{0}}a информационна РНК (mRNA) в кожата заедно с високи нива на циркулиращия IL-17A протеин (~100-кратно увеличение) , което беше необходимо за набиране на неутрофили след излагане на UV светлина. Едновременната 100- до 1,000-кратна индукция в кожната g-csf експресия предполага, че IL-17A/G-CSF оста е вероятният механизъм, отговорен за неутрофилията и насочването на неутрофилната тъкан в отговор на UV светлина. Ролята на IL-17A в регулирането на гранулопоезата и набирането на неутрофили чрез индукция на G-CSF е добре позната при хомеостатични условия и няколко проучвания идентифицират IL-17A като важен за набирането на неутрофили в местата на стерилно възпаление (41, 42). При лупус повишената експресия на IL-17A се открива в кожните лезии (43), а повишените нива на циркулиращия IL-17A се свързват с по-лоши прояви на заболяването (44), въпреки че специфичната връзка с неутрофилите, патогенна популация при това заболяване (13, 17, 18), остава неизследвана. Освен преките си ефекти върху медиираната от G-CSF мобилизация на неутрофили от костния мозък, IL- 17A може също да допринесе за насочването на неутрофилите къмбъбрекчрез стимулиране на експресията на адхезионни молекули (напр. VCAM-1 и E-Selectin) върхубъбречнаендотел (45, 46).

Използвайки същия модел на остро излагане на ултравиолетови лъчи, наскоро съобщихме, че единична доза ултравиолетова светлина предизвиква локален и системен IFN-I отговор, който е необходим за ефективно набиране на неутрофили в кожата (6). Тъй като е доказано, че IFN-I индуцира производството на IL-17A (47), е правдоподобно тези пътища независимо или съвместно да водят до медиирано от ултравиолетова светлина набиране и миграция на неутрофили, които докладваме тук. Въпреки че нашите открития предполагат възпалителна роля на IL- 17A, потискащите ефекти на UVB светлината върху сигнализирането на IL-17A са докладвани преди това при псориазис, където излагането на псориазис на кожа на UVB светлина елиминира патогенните Т клетки и миелоидни възпалителни дендритни клетки (48, 49). Тъй като псориазисната, за разлика от здравата, кожа е богата на IL-17-продуциращи и реагиращи Т-клетки, разликата в клетъчния състав вероятно ще определи отговора на UVB светлината, включително степента на медиираното от UVB светлина потискане на IL -17Рецепторна експресия (50). Дозировката на ултравиолетовите лъчи може също така да определи дали възниква възпалителен или терапевтичен ефект: ниските дози са свързани с противовъзпалителни и имуносупресивни последици (51), вероятно чрез инхибиране на CD8 Т клетъчните отговори (52).

Неутрофилите играят множество роли по време на тъканно възпаление. Когато се активират от свързани с патогени молекулярни модели и свързани с увреждане молекулярни модели (DAMPS) или чрез ангажиране на рецептори, неутрофилите директно допринасят за увреждане на тъканите чрез освобождаване на протеази, ROS и екструзия на неутрофилни извънклетъчни капани (NET) (53, 54). Неутрофилите могат също така да насърчат възстановяването на тъканите чрез фагоцитоза на клетъчни остатъци и като позволят тъканна реваскуларизация (8). При SLE сигнатурата на неутрофилния ген е силен предиктор за активно заболяване, включително LN и кожен лупус (17, 18). Неутрофили се откриват в кожни лезии (13, 14), както ибъбрекпроби от биопсия (15, 16) на пациенти със СЛЕ и техните възпалителни свойства се приписват отчасти на образуването на NET (16). Този процес включва повишено производство на ROS (55), освобождаване на митохондриална ДНК (55) и освобождаване и индуциране на възпалителни протеини, като s100A9 (56), IL-1b (57) и интерферони тип I (55). , 58). Нашите констатации, че инхибирането на миграцията на неутрофилите към бъбрека отменя s100A9 и значително намалява експресията на IL-1b ибъбрекIFN резултатът предполага, че подобни възпалителни функции могат да бъдат включени. От значение за бъбречното заболяване при SLE, неутрофилите са локализирани главно в TI ендотела, мястото на повишена експресия наувреждане на бъбрецитемаркери kim-1 и липокалин-2 в LN бъбречни тъкани (59,60). Протеинурията може да възникне поради прекомерна пропускливост на гломерулната бариера за протеини поради нарушена реабсорбция на протеин от тубулите или комбинация от тези механизми (61). Увреждането на TI при пациенти със SLE е честа патологична находка в LN бъбреците, включително тези с леко гломерулно увреждане (61, 62). Доказано е, че увреждането на TI предсказва тежестта на LN (63, 64), но механизмите, които го задействат, са неизвестни. Тъй като повишените kim-1 и липокалин-2 са признати маркери за увреждане на TI при SLE (26, 65) и блокират миграцията на неутрофилите къмбъбрекинхибира тяхната експресия, ние предполагаме, че преходната протеинурия, наблюдавана след излагане на ултравиолетови лъчи, е следствие от медиирано от неутрофили субклинично TI възпаление (65). Повишената бъбречна vcam-1 експресия, друг маркер за увреждане на TI при SLE (66), допълнително подкрепя този модел.

В допълнение към разпространението на възпаление в локалните места на стерилно или инфекциозно увреждане, неутрофилите са показали, че се намират в отдалечени органи (8-10), където, в зависимост от контекста, те допринасят за увреждане на тъканите чрез производство на ROS (11) или активират адаптивната имунна система в лимфните възли и костния мозък (9, 12). Възпалителният характер на тези неутрофили се дължи на тяхната способност да излизат от първичното място на нараняване и да мигрират към вторични места, тоест да се подлагат на rTEM (9–11, 31–34). Нашите констатации, че PA на GFP-съдържащи клетки в кожата след излагане на ултравиолетови лъчи доведе до откриване на GFP плюс неутрофили вбъбрекс фенотипа на rTEM предполагат, че субпопулация отбъбречнанеутрофилите обратно мигрират от изложена на UV лъчи кожа (GFP плюс неутрофилите съставляват ~20 процента отбъбрекнеутрофили и от тях 20 до 35 процента са rTEM; следователно rTEM съставлява 4 до 7 процента от общия бройбъбрекнеутрофили). Тази пропорция на rTEM е сравнима с пропорцията, докладвана след стерилно чернодробно увреждане (~9 процента) (36) и исхемично-реперфузионно увреждане (~8 процента) (11). При други обстоятелства е доказано, че rTEM са провъзпалителни (10, 11) и имат нарушена апоптоза (35), което води до възможността те да играят роля в UV-индуциранияувреждане на бъбреците.Повишената експресия на CXCR4 върху тези неутрофили е особено уместна като съвпадениебъбречнасе наблюдава експресия на cxcl12, CXCR4 лиганд, експресиран от подоцити и тубули (24), което вероятно осигурява хемотактичен сигнал за тази неутрофилна популация. Повишена експресия на CXCR4 върху имунните клетки, съчетана с високи нива набъбречнаCXCL12 са идентифицирани при пациенти със СЛЕ с LN (67) и този път е замесен в лупус, както и исхемия-реперфузияувреждане на бъбрецитепри мишки (24, 68). Освен че е маркер за rTEM, повишената експресия на CXCR4 също е индикатор за "остарели" неутрофили, които могат да медиират увреждащи тъканите възпалителни реакции (38). Точната роля на CXCR4 в набирането на неутрофили вбъбрекмогат да бъдат изследвани чрез антагонизъм на CXCR4, както беше направено преди това в други модели на стерилно увреждане (38).

Тъканно-специфичната миграция на неутрофили и механизмите, отговорни за диференциалната експресия на адхезионни молекули в различни органи, не са добре разбрани (69). По-високи нива на експресия на хемокина cxcl12 вбъбрекно не и белия дроб може да обясни преференциалното присъствие на CXCR4hi неутрофили в бъбрека. В допълнение, индукцията на експресия на vcam-1 и е-селектин в бъбрека, в сравнение с липсата на промяна в експресията в белия дроб, вероятно допринася за преференциално набиране и задържане на неутрофили в бъбрека. 5- до 6-кратно увеличение на експресията на s100A9 в белия дроб в сравнение с 30- до 60-кратно увеличение в бъбреците, както и 6-кратно увеличение в експресията на il-1b в белия дроб в сравнение с 16-кратното увеличение в бъбреците допълнително показва тъканни разлики във възпалителния отговор. Намаляването на неутрофилната инфилтрация на бъбрека след неутрализацията на G-CSF може да се дължи както на намаляването на броя на циркулиращите и активирането на неутрофилите, така и на намаляването на локалната експресия на vcam-1 и е-селектин. Не можем обаче да сме сигурни дали първоначалната регулация нагоре на тези адхезионни молекули след излагане на кожата на ултравиолетови лъчи се дължи на произхождащи от кожата цитокини/DAMPS или дали неутрофилите чрез освобождаване на серинови протеази допринасят директно за тяхната експресия, както е показано в други контексти (70). Независимо от механизмите и отбелязвайки, че не сме извършили цялостен анализ на всички тъкани, нашите проучвания предоставят доказателства за известна органна селективност при системни ефекти, медиирани от UV светлина. Бъдещите проучвания ще се занимават с тъканно-специфичните функционални последици от системното разпространение на неутрофили чрез, например, изтичане на съдов албумин и образуване на оток в белия дроб (11, 36).

При пациенти със SLE е трудно недвусмислено да се свърже излагането на ултравиолетова светлина на кожата с екзацербации на системно заболяване, тъй като има значителни вариации (1 до 3 седмици) във видимите реакции на фоточувствителност при различните индивиди (21). В допълнение, субклиничниувреждане на бъбрецитеможе лесно да се пропусне, докато последователното излагане на UV светлина не усложни ефектите. Въпреки че открихме, че неутрофилите медииратвъзпаление на бъбрецитев отговор на UV светлина не причинява клинично заболяване при здрави мишки, такъв механизъм може да допринесе за изблици на LN при фоточувствителни пациенти с лупус по много начини. Ангажирането на Fc рецептора от имунните комплекси може да подобри набирането на неутрофили, което води до освобождаване на ROS и протеаза (71); повишеният капацитет на лупусните неутрофили и LDGs да произвеждат NETs, ​​които при пациенти със SLE не се изчистват ефективно (72), може да доведе до освобождаване на тъканно-увреждащи протеази (73), разпространение на IFN-I отговора (58) , или директно увреждане набъбрекендотел чрез създаване на съдово увреждане и изтичане (16). Нещо повече, основните разлики в лупусната кожа, като засилено IFN-I сигнализиране (5, 74) и дефекти в защитната клетъчна популация на Лангерханс (75), биха могли да информират степента и естеството на неутрофилно-медиираните системни отговори. Проследяването на миграцията на неутрофили, съчетано с разпитване на автоантитела, натрупване на апоптотични клетки и ниски нива на комплемент, може да бъде адресирано с помощта на нови модели на лупус, като генетично дефинирани тройни мутанти (Sle1.Mfge8−/− C1q−/− и Sle1.Mfge8− /−C3−/−) (76) или други щамове на лупус след излагане на UV светлина.

Точните механизми, свързващи неутрофилите с възпалението при SLE, могат освен това да бъдат повлияни от фенотипа на неутрофилите/LDG, тъй като хетерогенността в тези популации е станала по-очевидна (77). Нашите констатации за повишени CXCR4 и ICAM1hiCXCR1lo (rTEM) циркулиращи популации, особено при SLE LDGs, допълнително добавят към тази хетерогенност и предполагат, че някои от по-провъзпалителните гранулоцити в кръвта може да имат предишен "тъканен опит", тоест пребиваване в засегнати органни тъкани, като кожата, преди системно разпространение. Фенотипите rTEM са докладвани преди това в синовиалната течност и циркулиращите неутрофили на пациенти с ревматоиден артрит (35, 78) и при свързано с остър панкреатит белодробно увреждане (79). Тяхната роля в SLE изисква по-нататъшно разследване.

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА БОЛКА

Материали и методи

мишки.Всички експерименти с животни бяха одобрени от Комитета за институционална грижа и използване на животните към Университета на Вашингтон, Сиатъл. Първоначалните експерименти бяха проведени с използване на мъжки и женски мишки C57BL/6J (Jackson Laboratory, на възраст от 3 до 4 месеца, Фигури 1 и 2). За всички следващи експерименти са използвани женски мишки. Бяха проведени изследвания на PA върху B6. Cg-Ptprc Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J женски мишки (Jackson Laboratory, на възраст от 3 до 4 месеца). Тези мишки са генерирани чрез инжектиране на трансгенен вектор, носещ PAGFP (T203H вариант) под транскрипционния контрол на човешкия убиквитин С промотор в C57BL/6 ембриони. Животните се настаняват в условия без патогени и се поддържат в цикли светло-тъмно от 12 часа с ad libitum достъп до храна и вода. Експериментите върху всички животни са проведени по едно и също време на деня, за да се избегне влиянието на циркадния ритъм върху миграцията на неутрофили (38).

Излагане на UVB светлина и отстраняване на лента.Гръбният аспект на мъжки и женски мишки C57BL/6 се обръсва най-малко 24 часа преди облъчване с UVB светлина и в експериментите се използват само мишки с непигментирана кожа. Мишките се анестезират с изофлуран и се излагат на една доза UVB светлина (500 mJ/cm2), използвайки FS40T12/UVB крушки (National Biological Corporation), с пикова емисия между 300 и 315 nm. Енергията на UVB светлината на дорзалната повърхност беше измерена с радиометър Photo light IL1400A, оборудван с детектор SEL240/UVB (International Light Technologies). Мишките бяха евтаназирани 1, 2 или 6 дни след излагане на UVB светлина и необлъчени мишки бяха използвани като контроли (D -1) (Фигура 2А). Отстраняването на епидермалната лента се извършва, както е описано по-горе (7), и кожата ибъбрекбяха оценени 24 часа след нараняването

Инхибиране на IL-17A и G-CSF.Мишките бяха третирани интравенозно със 100 ug пречистен плъши анти-миши IL-17A IgG (BioLegend) или изотипна контрола 3 часа преди излагане на UV светлина (1 × 500 mJ/cm2) (Фиг. 3I). Наличие на неутрофили в кръвта, кожата и перфузията с физиологичен разтворбъбректъкан се оценява чрез поточна цитометрия 24 часа след излагане на ултравиолетови лъчи, както е описано по-долу. Миграцията на неутрофили в отговор на UV светлина се инхибира чрез третиране на мишки интраперитонеално с 50 ug анти-мише G-CSF моноклонално антитяло или миши IgG изотип контрол (R&D Systems) 24 часа и 3 часа преди излагане на кожата на UVB светлина (1 × 500 mJ /cm2) (фиг. 4A). След сърдечна перфузия, броя на неутрофилите и моноцитите вбъбрекбяха оценени чрез поточна цитометрия и генна експресия чрез qPCR, както е описано по-долу. Като допълнителна контролна група се използват мишки, които не са изложени на UVB светлина.

Изолиране на клетки от различни органи.След евтаназия с вдишване на CO2, парче дорзална кожа беше отстранено и държано в разтвор на RPMI (Roswell Park Memorial Institute) върху лед до обработка. Кръвта се събира чрез сърдечна пункция в спринцовки, покрити с етилендиаминтетраоцетна киселина. Впоследствие беше извършена сърдечна перфузия с помощта на буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS) (~60 mL) през лявата камера след отрязване на дясното предсърдие. Успешната перфузия се определя чрез наблюдение на пълнатабъбреки бледност на белите дробове. Белите дробове, бъбреците, далака и двете бедрени кости се отстраняват внимателно и се поставят в RPMI разтвор върху лед до обработка на пробата. Клетките се изолират от еквивалентни участъци от кожна тъкан (~30 mm2) чрез смилане и смилане на тъканта с 0.28 единици/mL Liberase TM (Roche) и 0,1 mg/mL дезоксирибонуклеаза I ( Worthington) в PBS с Са плюс 2 и Mg плюс 2 за 60 минути при 37 градуса с разклащане. Клетките бяха изолирани от еднабъбрекна животно;бъбректъканите бяха смлени и смлени в 2 mg/mL колагеназа тип I (Worthington) за 30 минути при 37 градуса съгласно публикуван протокол. Белодробните клетки се събират чрез смилане на тъкан в PBS (Ca плюс 2 и Mg плюс 2) с 1 mg/mL колагеназа тип 1 и 60 U дезоксирибонуклеаза I. Цели далаци се натрошават върху 40 μm клетъчна цедка и се промиват с RPMI разтвор. Цялата кръв и клетките от далака, костния мозък, бъбреците и белите дробове бяха третирани с 1X лизисен буфер за червени кръвни клетки (RBC) (BD Biosciences). След изолиране/смилане клетките от всички тъкани се филтруват (40 μm), промиват се с PBS и се суспендират отново в RPMI разтвор преди преброяване.

Оцветяване и анализ с поточна цитометрия.Клетките бяха третирани с Fc Block TruStain FcX (Biolegend) и оцветени с багрило Zombie Aqua Viability (Biolegend) според препоръките на доставчика. Клетките се промиват и повърхностното оцветяване се извършва с помощта на миши специфични флуоресцентни антитела, закупени от Biolegend. Различни миелоидни клетъчни популации бяха анализирани в портата на живите имунни клетки (Zombie Aqua-CD45 plus). Процентът и броят на неутрофилите (Ly6CintLy6Ghi) и моноцитите (Ly6C плюс Ly6G−) бяха количествено определени. Представителна стробация на поточна цитометрия е представена в Приложение SI, Фиг. S10. Процентната експресия и средният интензитет на флуоресценция на повърхностните маркери в PA модела (CXCR4, ICAM1 и CXCR1) бяха определени с помощта на контроли за оцветяване с флуоресценция минус едно (FMO) в неутрофилната врата (Ly6Ghi). Всички проби бяха обработени с помощта на поточен цитометър CytoFLEX (Beckman Coulter) и данните бяха анализирани със софтуер FlowJo версия 10 (Tree Star).

Изследвания за фотоактивиране (PA).UBC-PA-GFP мишки бяха обръснати и част от гърба беше облъчена с една доза UVB светлина (500 mJ/cm2), както по-горе. Само областта на кожата, която ще бъде фотоконвертирана, беше изложена на UVB светлина, докато останалата кожа беше покрита с алуминиево фолио. След 24 часа след индуцирано от UVB стерилно нараняване, цялата област на кожата, облъчена с UVB, беше подложена на виолетова светлина (405 nm) с помощта на 50 W светодиодна лампа с 0,37 цифрова апертура (NA) влакно (Mightex) при мощност от 100 mW (15 минути експозиция на площ). Този метод е оптимизиран въз основа на публикуван протокол за специфично за кожата фотопреобразуване (80).Бъбреции белите дробове бяха събрани и обработени за анализ на поточна цитометрия 24 часа след PA, както е описано по-горе. Подходът и времевата линия са очертани в диаграмата на Фиг. 5A. Процентът GFP плюс неутрофили вбъбрекбеше сравнен с този, открит при мишки при три контролни условия: 1) без UV и без PA, 2) UV, но без PA, и 3) без UV, но PA. Нива на експресия на CXCR4 и фенотип ICAM1hiCXCR1lo в GFP плюс и GFP− неутрофили в кожата ибъбрекбяха оценени чрез поточна цитометрия, използвайки миши специфични флуоресцентно белязани антитела, закупени от Biolegend. За да се определи дали GFP плюс неутрофили вбъбрекпроизлизащи от кожата, а не от кръвта, кожата в една група мишки беше изложена на UV светлина и PA, както е описано по-горе (група I), докато в друга група кожата беше изложена на UV светлина, но PA беше извършена върху съседната кожна област не са изложени на ултравиолетова светлина (група II) (диаграма в приложение SI, фиг. S7A).Бъбрецибяха събрани и обработени за анализ с поточна цитометрия, както е описано по-горе.

Генна експресия и протеомни анализи.кожа,бъбрек,и белодробните проби се съхраняват в разтвор на RNAlater (QIAGEN). РНК беше извлечена от RNeasy Kit от QIAGEN и комплементарна ДНК (cDNA) беше синтезирана с помощта на High Capacity cDNA Synthesis Kit (Applied Biosystems). Транскриптите на възпалителни хемокини, цитокини и адхезионни молекули бяха количествено определени чрез qPCR в реално време, като се използваха праймерите, изброени в Приложение SI, Таблица S1 и нормализирани до средните нива на 18S транскрипт. Използваната доза UVB светлина не повлиява експресията на 18S в нито един от органите. Относителната експресия на mRNA мишени се определя с помощта на стандартната формула 2^(-Ct) × коефициент. Резултатите за IFN са получени от експресията на 10 представителни интерферон-стимулирани гени (ISG; Mx1, Irf7, Isg15, Isg20, Ifi44, ifit1, ifit3, oasl1, usp18 и ifi27l2a), както е описано по-горе (6). Средната стойност и SD на относителната експресия на всеки ISG бяха определени вбъбрецина мишки, които не са изложени на ултравиолетова светлина (meannoUV и SDnoUV). След това те бяха използвани за стандартизиране на нивата на експресия на всеки ISG в бъбреците на третираните мишки (IgG изотип плюс UVB или a-GCSF плюс UVB). След това стандартизираните нива на експресия се сумират за всяка мишка, за да се получи IFN експресионен резултат; i=израз на всеки ISG; Генно лечение=относително ниво на генна експресия след лечение; и Gene inoUV=ниво на относителна генна експресия при мишки, които не са изложени на UVB светлина. ∑ 10 i=1=Geneitreatment−meanGeneinoUV SD(GeneinoUV ) . Протеиновите нива в протеиновите екстракти от плазма и кожна тъкан бяха измерени с помощта на дефинирани аналитични панели LEGENDplex Панел за възпаление при мишка и Панел за възпалителни хемокини (Biolegend).

IF оцветяване на замразени бъбречни тъкани.Перфузиран с физиологичен разтворбъбрецибяха фиксирани в 4 процента параформалдехид за 1 час при стайна температура и след потапяне в 3 0 процента захароза, замразени в оптимална среда за рязане (Sakura Finetek). 5-µm тъканни срезове бяха рехидратирани в PBS преди IF оцветяване. Тъканите бяха пермеабилизирани с 0.1 процента Triton X-100 в PBS и впоследствие блокирани в PBS плюс 0,1 процента Triton X-100/5 процента BSA (говежди серумен албумин)/5 процента заешки серум . NE и ендотелните клетки бяха открити чрез оцветяване с анти-миши NE Cy5 (1:100, Bioss) и анти-миши PECAM-1/CD31 Al488 (1:100, Biolegend), съответно, при 4 градуса за една нощ. Наличието на неутрофили вбъбрексе потвърждава чрез оцветяване с анти-миши Ly6G Al647 (1:100, Biolegend). Тъканите бяха монтирани с помощта на ProLong Gold с 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) среда за монтиране (Invitrogen) и изобразени с флуоресцентен микроскоп Nikon Eclipse 90i (Histology and Imaging Core, University of Washington).

Кожна хистологична оценка.Фиксирани с формалин, вградени в парафин кожни тъканни срезове (4 до 5 μm) бяха оцветени с хематоксилин и еозин в Университета на Вашингтон за хистология и изображения преди UV, ден 1, ден 2 и ден 6 след UVB облъчване (n {{ 7}} женски). Кожата се оценява по заслепен начин за следните параметри: възпаление на дермата/подкожието, епидермална клетъчна смърт, акантоза, хиперкератоза, образуване на сероклетъчна кора и ерозия/язва. Тези параметри се оценяват по скала от 0 до 4 в зависимост от тежестта и степента с изключение на ерозия/язва, която се оценява като налична (1) или липсваща (0). Представителните изображения бяха направени с помощта на NIS-Elements BR 3.2 64bit и поставени в Adobe Photoshop с корекции на осветлението, приложени към цялото изображение. Посочено е оригиналното увеличение.

Измервания на урина.Нивата на протеин в урината бяха оценени чрез анализ на протеин на Брадфорд (Thermo Fisher Scientific). Пробите от урина бяха тествани при разреждане 1:40 в PBS и концентрацията на протеин в урината беше определена на базата на серийни разреждания на известни концентрации на BSA. Съотношението албумин/креатинин в урината беше оценено чрез използване на анализ на албумин на Albuwell и придружаващ комплект за креатинин (Exocell) съгласно инструкциите на производителя.

Вземане на човешки проби и анализ с поточна цитометрия.Това проучване е одобрено от Съвета за преглед на институциите на Университета на Вашингтон (STUDY00001145). Цялата кръв беше събрана в хепаринизирани епруветки от здрави доброволци и пациенти със SLE след информирано съгласие. Неутрофили (PMNs) и PBMCs бяха изолирани чрез прекъснато градиентно разделяне на Ficoll-Paque (GE Healthcare). PMNs се пречистват от еритроцитната пелета чрез утаяване с 5 процента декстран. След лизис на червените кръвни клетки, клетките бяха оцветени с флуоресцентно белязани антитела, закупени от Biolegend, и CXCR4 експресията и процентът ICAM1hiCXCR1lo клетки бяха оценени в PMNs (CD66b плюс) и LDGs (CD15 плюс, CD14lo и CD10 плюс в PBMCs (19)). Стратегията за стробиране за LDG и ICAM1hiCXCR1lo оцветяване на базата на FMO е показана в SI Приложение, Фиг. S11. Пробите бяха обработени с помощта на CytoFLEX поточен цитометър (Beckman Coulter) и данните бяха анализирани с FlowJo софтуер версия 10 (Tree Star).

Статистически анализи.Данните бяха анализирани с помощта на софтуер GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc.) и представени като средна стойност ± SEM. Статистическата разлика между двете групи данни беше определена спрямо необлъчени контроли (D-1) с помощта на теста на Student. Еднопосочен ANOVA с множество сравнения и Tukey post hoc беше използван за определяне на статистическата значимост между трите групи.