Благоприятен/неблагоприятен ефект на кверцетин върху мембраните на SK-N-SH клетките на невробластома, част 2

Моля щракнетеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

2.2.2. Антиоксидантна активност на кверцетин

За да се тества ефективността на кверцетина в защитата на мембраните срещу оксидативен стрес, бяха проведени експерименти, при които липидните модели на мембраната бяха изложени на озон в отсъствие (Фигура 4a) и присъствие на кверцетин в концентрация от 6,25 μM (Фигура 4b).

Под въздействието на озона ходът на двете зависимости, т.е. π{{0}}f(A) и Cs-1=f(rn) се променя. Изотермите, получени за монослойно разпространение върху озоносъдържащата подфаза, се характеризират с по-малък наклон и изместване към по-ниски стойности на А. Освен това стойностите на Cs-1 намаляват под въздействието на озона. Тези промени са най-големи при концентрация на озон от около 0,4 ppm.цинтанчеПо-нататъшното увеличаване на концентрацията на озон не увеличава промените в характеристиките на монослоя (вмъкване на Фигура 4а).

Фигура 4. Изотерми на повърхностното налягане и съответния модул на свиваемост (вмъкване) на липиден модел на невробластомни слоеве, разпределени върху подфазата, съдържат посочените концентрации на озон, разтворен в буфер. Изотерми: (a) в отсъствието на антиоксиданти; (b) в присъствието на кверцетин (6,25 μM), добавен към озон-съдържащия буфер.

Когато кверцетин в концентрация от 6,25 μM беше въведен в подфазата, озонът не повлия значително хода на r(A) изотермата; въпреки това, стойностите на модула на компресия се променят в присъствието на озон, подобно на това в случай на отсъствие на кверцетин (вмъкване на фигура 4b).

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Числените стойности на параметрите, характеризиращи монослоевете, определени въз основа на получените изотерми, са представени в таблица 3.

Таблица 3. Повърхностни параметри на монослоеве Alim и Cs-I, изчислени за монослоеве на модела на невробластомна мембрана, разпространена върху подфазата, съдържаше посочените концентрации на озон, разтворен в буфера в отсъствието и в присъствието на кверцетин (6,25 uM). Данните представляват средната стойност от три експеримента ± SD. Различните букви показват значителни разлики (p По-малко или равно на 0.05).

В присъствието на озон се наблюдава леко намаляване на повърхностната площ на молекула (Alim) в плътно опакован монослой. Максималното намаление на този параметър е 3,2 процента в сравнение с контролата (монослой върху чистия буфер). Параметърът Cs-I също е намален, достигайки платови стойности при концентрации на озон над 0.6 ppm O. Максималното намаление на този параметър достига 24 процента по отношение на контролата.

Когато кверцетин в концентрация от 6,25 uM присъства в подфазата, стойностите на Alim (1-2 процента) намаляват леко, докато намалението на стойността на Cs-1 е около 27 процента.

Естеството на промените на Алим в присъствието на озон и озон в комбинация с кверцетин има различни курсове. При концентрация на озон от около 0.3 ppm, в отсъствието на кверцетин, Aim рязко намалява до около 88,3 A2. След това достига минималната стойност на платото, даваща характерна S-образна зависимост (Фигура 5а, червени точки). В присъствието на кверцетин има леко плавно монотонно намаляване на Alim, достигайки по-висока концентрация на озон, плато от около 93,5 A2 (Фигура 5а, зелени точки).

Фигура 5. Зависимостта на площта на молекула от концентрацията на озон (a) и зависимостта на модула на компресия от концентрацията на озон (b) за мембрана на невробластома на подфаза: Без кверцетин-червени точки; с кверцетин-зелени точки. Линиите не представят никакъв физически модел, бяха математически монтирани и бяха начертани за удобство при проследяване на промените на параметрите. Стойностите на максималния модул на компресия на слоя се променят по подобен начин с концентрацията на озон и за двете: В отсъствието и в присъствието на кверцетин (Фигура 5b).

3. Дискусия

Механизмът на действие на кверцетина е интензивно изследван в продължение на много години, но резултатите от експериментите често са противоречиви и показват, че при някои обстоятелства това съединение е полезно, а при други неблагоприятно за клетките. Анализът на наличните изследвания показва, че ефектът на това съединение върху клетките е свързан с два аспекта, т.е. взаимодействието му с мембраните и антиоксидантната активност. Въпреки това, в клетките не е възможно да се разграничат тези два начина на действие на кверцетин и оценката на пригодността на това съединение като потенциално вещество, например, имащо антитуморна активност. Поради тази причина експериментите са планирани по такъв начин, че да се оцени по качествен и количествен начин влиянието на това съединение върху механичните свойства на мембраните, както и неговата антиоксидантна активност в моделната система, която елиминира ефектите на активността на други метаболитни пътища.

Въз основа на проведените експерименти беше потвърдено, че дори при най-ниските концентрации (6,25 uM), кверцетинът модифицира (както е посочено от увеличението на Alimvalue) моделните монослоеве, имитирайки липидната част на мембраната на клетките на невробластома. Това сочи възможността за взаимодействие на кверцетина с мембраните на тези клетки при достигане до мозъка, дори и при ниски концентрации. Това е от особено значение за нервните клетки, чиито мембрани съдържат относително големи количества липиди.

Cistanche може да подобри имунитета

Приблизителното съотношение липид-протеин за нервните клетки е 80:20 процента, а например за еритроцитната мембрана това съотношение е 50:50 процента [29]. Такова ниво на липиди в мембраната на нервните клетки е свързано с ролята на тези клетки в предаването на електрически сигнали. В същото време дори фините промени във физикохимичните свойства, като гъвкавост и твърдост на клетъчната мембрана, могат значително да нарушат тази функция.

Потенциалът на действие се прехвърля по протежение на мембраната на нервната клетка благодарение на работата на йонните канали и след това, благодарение на действието на йонните помпи, потенциалът на покой се възстановява. Правилното функциониране на тези протеини (по-специално, определено от тяхната форма) е тясно зависимо от липидната среда. Освен това промените в механичните свойства на мембраната могат да нарушат работата на канали, чийто механизъм на стробиране зависи точно от механичните свойства на мембраната.

Тези тези се потвърждават от проучвания, които показват, че ефектът на кверцетин върху клетъчната мембрана е свързан, inter alia, с транспорта на Ca2 плюс йони и/или Ca2 плюс метаболизма [30,31]. По този начин въвеждането на молекули на кверцетин в околната среда на мембраната (особено на нервните клетки) може да има значителни последствия върху тяхното функциониране.

За да се провери дали действието на кверцетин, определено в моделни системи, играе полезна или неблагоприятна роля в клетките, резултатите, получени за моделни мембрани, бяха сравнени с ефекта на това съединение върху цели невробластомни клетки. За SK-N-SH клетки е направен МТТ тест,Екстракт от цистанче против Алцхаймерпредоставяне на информация за клетъчната жизнеспособност на клетките, която от своя страна е право пропорционална на ензимите на митохондриалната дехидрогеназа.

Получените резултати показват, че присъствието на кверцетин в концентрации от 100 и 200uM увеличава броя на жизнеспособните клетки. Подобни резултати са получени от Bao et al. [32], изследващи ефекта на кверцетин върху PC-12 клетки. Изтичането на LDH в извънклетъчната среда, което дава информация за разрушаването на клетъчната мембрана, също беше изследвано при същите нива на кверцетин. Получените резултати показват, че мембраните на тестваните клетки не са увредени при такива условия. Ботуши и др. [2], изучавайки ефектите на кверцетин върху белодробните епителни клетки, наблюдава подобни резултати. Следователно може да се заключи, че в тези концентрации кверцетинът има положителен ефект върху клетките, повишавайки тяхната жизнеспособност.

Вторият важен аспект от механизма на действие на кверцетина е свързан с неговите антиоксидантни свойства. За да се оцени свързаният ефект на изследвания полифенол, бяха проведени експерименти, при които беше проверено дали кверцетинът играе защитна роля в клетките, изложени на оксидативен стрес. Оксидативният стрес се генерира чрез въвеждане на Н, О2 в клетъчната среда.Cistanche за подобряване на паметтаКакто е показано в това проучване, водородният пероксид причинява значителна клетъчна смъртност, изразена като увреждане на митохондриите.

Когато SK-N-SH клетките се култивират в продължение на 3 часа в среда, съдържаща 3 и 5 mM H2O2, клетъчната жизнеспособност намалява до приблизително 44 процента от тази на нетретираните клетки (MTT анализ). Проучванията показват, че 24-часовата предварителна обработка на клетките с кверцетин води до увеличаване на броя на живите клетки в сравнение с клетките, третирани с H2O2. Суемацу и др. [13] съобщават за подобни ефекти.

Измерихме и нивото на MDA, който е биомаркер на оксидативния стрес като краен продукт на липидната пероксидация[33]. Предварителната обработка на клетките с високи концентрации на кверцетин, последвана от добавяне на водороден пероксид, води до леко повишаване на съдържанието на MDA в сравнение с клетките, изложени само на H O . Това може да се дължи на факта, че кверцетинът (при по-високи концентрации) може също да претърпи оксидно-редуктивно активиране и да бъде обект на редокс цикъл, генерирайки вътреклетъчни реактивни кислородни видове [34].

Няма значителни промени в разрушаването на мембраната (както е посочено от непромененото ниво на LDH) на клетките, третирани с кверцетин и H2O2 в сравнение със случая, когато клетките са били изложени само на оксидативен стрес. Следователно може да се заключи, че въпреки повишаването на липидната пероксидация (при високи концентрации на кверцетин), това не е достатъчно значително, за да разруши мембраните и да наруши тяхната непрекъснатост.

Наблюденията, получени за естествената система, бяха сравнени с тези, получени за моделна система, където е възможно да се контролира точно както концентрацията на кверцетин, така и нивото на стрес. Проверено е доколко липидната част на мембраната на невробластома е устойчива на оксидативен стрес. Условията на стрес са създадени чрез въвеждане на озон в буфера, при което озонът във водната среда претърпява реакции на разлагане, образувайки окислителни радикали, наред с други хидроксилни радикали и супероксидни анионни радикали [35]. Получената смес от реактивни кислородни видове съответства на тези, които се срещат естествено в клетките, поради дисбаланса на нарушения на редокс статуса [36-38].

Под въздействието на стрес формата на изотермите се променя, което показва значително намаляване на площта на една молекула в плътно опакования монослой. Такива промени се случват поради окисляването на ненаситените връзки във веригите на мастните киселини. Този ефект се увеличава с увеличаването на концентрацията на озон до около {{0}}.3 ppm, а след това този параметър на изотермата остава на същото ниво въпреки увеличението на ROS. Това означава, че при концентрация на озон от около 0,3 ppm, всички ненаситени мастни киселини, присъстващи в монослоя, са били окислени (в модела на невробластома, общото количество ненаситени мастни киселини е 52 процента)

Оксидираните монослоеве имат значителна твърдост,cistanche на китайскикакто е представено от стойността Cs-1 (колкото по-висока е стойността на този параметър, толкова по-голяма е твърдостта на слоя). В присъствието на кверцетин, дори при ниска концентрация （6,25 μM）, модификациите на мембраната, изложена на озон, както се визуализира от промените в стойността на Alim, бяха значително намалени (Фигура 5а), което доказва антиоксидантната активност на това съединение . Струва си да се отбележи обаче, че въпреки че кверцетинът почисти радикалите, предпазвайки ненаситените мастни киселини от окисляване, той не обърна промените в твърдостта на мембраната (Фигура 5b).

По този начин е показано, че кверцетинът проявява антиоксидантно действие, но самото му присъствие между липидните молекули влияе (определя) параметрите на умивалника, т.е. въпреки защитата на веригите на мастните киселини срещу окисление, твърдостта на мембраната намалява значително (Cs- Оценявам около 25 процента по-ниско в сравнение с контролата).

Тези резултати показват, че промяната на мембраната е основният фактор за клетъчните ефекти в резултат на присъствието на кверцетин. Последствията от тази промяна обаче (модификация на сигнализацията, транспорт) варират в зависимост от броя на полифенолните молекули, първоначалния състав на мембраната и функцията на клетката. Това обяснява защо при различни обстоятелства и в различни изследвания кверцетинът показва защитен ефект, докато при други точно обратното.

В ситуация на висок оксидативен стрес, антиоксидантният ефект помага на клетката, като предпазва нейните компоненти от увреждане. Въпреки това, ако мембраните са значително модифицирани чрез локализиране на това съединение в тяхната среда, което води до разпределение на сигналните или транспортните пътища чрез променена твърдост на мембраната, това може да доведе до неблагоприятни ефекти. Трябва също да се помни, че много процеси в клетката протичат едновременно, както тези, свързани с мембраните, така и тези, които генерират оксидативен стрес. Ефектът, който може да се наблюдава и измери чрез определяне нивото на конкретни показатели, винаги е общ. Следователно има ситуации, в които ефектът на кверцетина се възприема като благоприятен и неблагоприятен.

4. Материали и методи

4.1.Материали

Съставът на модела на липидната част на мембраната на клетките на невробластома е установен въз основа на работата на авторите на [39-41]. Фосфолипиди: 1-олеоил-2-палмитоил-sn-глицерол-3-фосфохолин;1-хексакозаноил-d4-2-хидрокси-sn-глицерол-3-фосфохолин; 1,2-диолеоил-sn-глицерол-3-фосфохолин; L- -фосфатидилетаноламин (мозък); сфингомиелин (мозък)-(Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL, USA). Холестеролът е закупен (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Германия). Съотношението фосфолипиди към холестерол е 79 процента към 21 процента. Съотношението на наситени към ненаситени мастни киселини е 48% към 52%.

Разтворителите (хлороформ, етанол) с химическа чистота - Poch (Gliwice, Полша); прясно дейонизирана вода, произведена от HLP 5 Hydrolab (Straszyn, Полша). Културалната среда, серумът и антибиотиците са закупени от CytoGen GmbH. Химическите реагенти, използвани в експериментите, са получени от Sigma Aldrich.

4.2.Клетъчна култура

Човешка невробластомна клетъчна линия SK-N-SH (Европейската колекция от автентифицирани клетъчни култури (ECACC) се култивира в 10 процента фетален говежди серум (FBS) в Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), допълнен с 0,01 процента пеницилин -стрептомицин при 37 градуса във влажна атмосфера, съдържаща 5 процента CO2.

4.3. Измерване на клетъчната жизнеспособност (MTT анализ)

Клетките се посяват в {{0}}плака с ямки при плътност от 1 × 104 клетки на ямка в обем от 0,1 mL. Клетките бяха третирани в продължение на 24 часа с различни концентрации на кверцетин (3.75-200 μM）. След това време бяха добавени 3 mM и 5 mM водороден пероксид за 3 часа. Поради липсата на разлики между ефектите на HO2 при 3 и 5 μM концентрации, за статистически изследвания, те бяха третирани като същите лечения и описани като 3-5 uM H2O2 лечение.

След това 50μL MTT（3-【4,5-диметилтиазол-2-ил】-2,5 дифенил тетразолиев бромид）разтвор (стерилен основен разтвор от 5 mg/mL) се добавя към клетките и се инкубира в продължение на 2 часа при 37 градуса в овлажнена 5 процента CO, атмосфера. След това към всяка ямка се добавят 0,4 mL диметилсулфоксид (DMSO) и се оставят за 10 минути. След центрофугиране, оптичната плътност на супернатантата се измерва при 570 nm с помощта на четец на микролитрови плаки (BioTek Instruments, VT, USA).

4.4. Тест за увреждане на мембраната (тест за LDH)

Анализът на лактат дехидрогеназата (LDH) се използва като маркер за цялост на клетъчната мембрана.

Клетки в количество от 1 × 1{{10}}* клетки на ямка се посяват в 96-плака с ямки и се инкубират в присъствието на кверцетин （3.75-200 μM） за 24 часа; След това се добавят 3 mM и 5 mM H2O за 3 часа. Към епруветките, съдържащи 0.5 mL от 0,75 mM натриев пируват и 10 uL NADH（140 µM））(нагрети при 37°C за 10 минути), се добавят 150 μL супернатанта и се инкубират за 30 минути при 37 градуса. След това към пробата се добавят 0,5 mL 2,4-динитрофенилхидразин и след 1 час абсорбцията се измерва при 450 nm.

4.5. Определяне на липидна пероксидация (концентрация на MDA)

Мембранната липидна пероксидация се оценява чрез реакция на тиобарбитурова киселина (TBA) с малондиалдехид (MDA). Клетките се посяват в {{0}}плаки с ямки, съдържащи кверцетин и Н, О2 (в концентрации и времена, описани по-горе) в количество от 1×104 клетки на ямка в обем от { {10}}.25 мл. След третиране, пробите бяха събрани и центрофугирани (1000×&,5 минути). Към пелетите бяха добавени 0.5 mL от 0,5 процента TCA, разбъркани на вортекс за 1 минута и лизирани чрез обработка с ултразвук за 5 минути. След центрофугиране при 10 000 × g за 10 минути, 0,4 mL от супернатанта се добавя към 1,25 mL 20 процента TCA с 0,5 процента TBA и се нагрява в сух термоблок (100 градуса) за 30 минути. След охлаждане абсорбцията се измерва при 532 nm, като се използва коефициентът на моларна екстинкция на MDA, равен на 155 M-1 cm-1.

4.6.Моделни мембрани

Буферно озониране. Фосфатният буфер (0.01 М, рН 7,4) беше наситен с озон, произведен от озонов генератор FM 500 (Grekos, Полша). Концентрацията на озон в буфер се определя съгласно Bader и Hoigne [42].

Изотерми на повърхностното налягане.растеж на пениса cistancheКорито Langmuir (KSV, Финландия) беше използвано за регистриране на изотерма на повърхностното налягане при постоянна степен на компресия, съответстваща на бариерна скорост от 5 mm/min. Липиден монослой се образува чрез разпръскване на определено количество разтвор на липиден хлороформ при концентрация от 1 mg/mL върху субфазата, съставена от воден 0.01 М фосфатен буфер, рН 7,4 с или без кверцетин и със или без озон. Повърхностното напрежение се измерва с Pt-Wilhelmy плоча. Експериментите бяха проведени при 25 градуса ±1 градус.

4.7. Статистически анализ

Три до шест независими анализа бяха извършени за всеки тестван вариант и осреднени (±SD). Значителните разлики в сравнение с контролите бяха оценени чрез използване на процедурата SAS ANOVA. Статистическият анализ беше извършен чрез многообхватния тест на Дънкан, като се взе p<0.05. statistical="" tests="" were="" carried="" out="" using="" statistica="" 13.3(cracow,="">

Авторски принос: Концептуализация, BK, BD и ER-S.methodology, BKBD; софтуер, BK, BDвалидация, BK, BD, ER-S., ABwriting—изготвяне на оригинална чернова BK, BD, ER-S., писане—преглед и редакция, BK, BD, ER-S., ABвизуализация, BK, BDsupervision, BK, BD, ER-S., AB Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа.

Финансиране:Това изследване не получи външно финансиране.

Изявление на институционалния съвет за преглед: Не е приложимо.

Декларация за информирано съгласие: Не е приложимо.

Декларация за наличност на данни: Данните се съдържат в статията. Конфликти на интереси: Авторите декларират липса на конфликт на интереси.

Тази статия е извлечена от Molecules 2021, 26, 4945. https://doi.org/10.3390/molecules26164945 https://www.mdpi.com/journal/molecules