Част 1: Понижаването на бъбречния Hsa-miR-127-3p допринася за свръхактивирането на сигналния път на интерферон тип I в бъбреците при лупусен нефрит

За повече информация. контактtina.xiang@wecistanche.com

МикроРНК участват в патогенезата на системния лупус еритематозус (SLE) и са нарушени вбъбрецина пациенти с лупусен нефрит (LN), но тяхната патогенна роля в LN е до голяма степен неизвестна. Янус киназа 1 (JAK1) медиира активирането на низходящите сигнални пътища на многовъзпалителенцитокини, включително сигналния път на интерферон тип I (IFN-I), който е критичен за развитието на SLE и LN. По този начин JAK1 е мощна терапевтична цел за тяхавтоимунни заболявания. Въпреки това, има малко проучвания, демонстриращи дисрегулацията на JAK1 при автоимунни заболявания и молекулярния механизъм зад него. В този кратък доклад ние показваме инхибиторен ефект на hsa-miR-127-3p, микроРНК, която се регулира надолу в бъбречните тъкани на пациенти с LN, върху сигнализирането на IFN-I. Ние открихме, че свръхекспресията на hsa-miR-127-3p може да инхибира индукцията на ISRE и GAS медиирана генна експресия, фосфорилирането на STAT1 и STAT2 и регулирането на IFN стимулирани гени (ISGs), стимулирани от IFN-I. Докато hsa-miR-127-3p антагонистът повишава активирането на IFN-I сигнализиране в първичните бъбречни мезангиални клетки. Впоследствие идентифицирахме JAK1 като добросъвестен целеви ген на hsa-miR-127-3p и показахме hsa-miR-127-3p, насочен към JAK1 чрез свързване към неговия 3'UTR и кодиращ регион. Последователно открихме, че регулирането надолу на hsa-miR-127-3p е свързано с повишаване на регулирането на JAK1 и ISG в бъбречните тъкани на пациенти с LN. Нашите данни показват, че бъбречната регулация на hsa-miR-127-3p допринася за свръхактивирането на IFN-I сигналния път в бъбреците на пациенти с LN чрез насърчаване на експресията на JAK1, което предполага, че hsa-miR-127-3p имитира може да се използва за инхибиране на JAK1 и IFN-I сигнален път в LN.

Ключови думи: микроРНК, hsa-miR-127-3p, интерферон тип I, Янус киназа 1, системен лупус еритематозус, лупусен нефрит
Приложена информация:

Според съществуващите данни от научни изследвания в академичните среди, може да се счита, че имунорегулаторната функция и слабителната функция на традиционната китайска медицинаЦистанчеима голямо клинично значение за повишаване на имунитета на организма и възстановяването на пациенти с COVID-19. Регулирането на имунната функция от Cistanche се осъществява главно чрез следните точки:

Повишават функционалната активност на имунните клетки на организма (макрофаги, дендритни клетки, Т клетки, В клетки, естествени клетки убийци (NK) и др.);

Подобрява обработката на антигена, фагоцитозата и убиващите функции на имунните клетки; регулират секрецията на цитокини и антитела от имунните клетки;

Някои учени са извършили изследвания върху Cistancheполизахаридикато адювант на ваксина и установи, че полизахаридите Cistanche могат да подобрят клетъчния имунен отговор на хуморалния имунен отговор на ваксината срещу грипния вирус, показвайки, че полизахаридите Cistanche могат да подобрятимунна функция; Експертите са потвърдили, че има положителен ефект и върху имунната регулация.

Кликнете, за да научите повече за корена и екстракта от цистанче

ВЪВЕДЕНИЕ

Неподходящо и прекомерно производство на определени възпалителни цитокинези, критични за развитието на системен лупус еритематозус (SLE). Блокирането на активирането на низходящите сигнални пътища на тези патогенни цитокини може да бъде обещаваща терапевтична стратегия за SLE (1). В съответствие с това схващане, антифролумаб, моноклонално антитяло към рецепторна субединица 1 на интерферон тип I (IFN-I), е доказано обещаващо при лечение на SLE чрез блокиране на активирането на IFN-I сигналния път (2) , което е критично за патогенезата на SLE и лупусния нефрит (LN) (3).

Янус киназите (JAKs) са тирозин кинази, свързващи се с вътреклетъчните домени на цитокиновите рецептори и предаващи сигнала за активиране чрез трансдукция на фосфорилиращ сигнал и активатор на транскрипционни (STAT) транскрипционни фактори (TFs). JAK-STAT сигнален път се използва от много цитокини, като IFN-I, IL6 и IL10, които участват в патогенезата на автоимунни заболявания, включително SLE. Малкомолекулни JAK инхибитори със способността да инхибират едновременно множество цитокинови сигнални пътища са разработени за лечение на автоимунни заболявания (4). Трябва да се отбележи, че в сравнение с първото поколение пан-JAK инхибитори, последните проучвания показват, че високо селективните JAKI инхибитори могат също така да постигнат задоволителна терапевтична ефикасност за няколко автоимунни заболявания с по-нисък риск от причиняване на неблагоприятни ефекти (4,5), което показва съществената роля на JAK1 в развитието на автоимунни заболявания. Въпреки това, по-малко проучвания са фокусирани върху регулирането на JAK1 по време на развитието на автоимунни заболявания, като например при SLE или LN.

МикроРНК (миРНК) е вид малки некодиращи РНК. Чрез комплементарно базово сдвояване на тяхната зародишна област към 3'UTR или кодиращата област на целева иРНК, miPHK разпознават и инхибират експресията на техните целеви гени и следователно регулират различни биологични функции (6). MiRNAs са признати за критични регулатори на имунните отговори и дисрегулацията на miRNAs е включена в патогенезата на SLE (7). Нашите предишни профили на бъбречна miPHK откриха много нерегулирани miPHK в бъбречните тъкани на пациенти с LN (8). Въпреки това, функциите на тези нерегулирани miRNAs са до голяма степен неизвестни.

Тук скринирахме 9-те запазени понижено регулирани miRNAs в бъбреците на пациенти с LN за техните регулаторни роли в сигналния път на IFN-I и идентифицирахме hsa-miR-127-3p като отрицателен регулатор на сигналния път на IFN-I, и потвърди тази роля в бъбречните мезангиални клетки. Доказахме, че JAK1 е добросъвестна цел на hsa-miR-127-3p. Нашите данни предполагат, че регулирането надолу на hsa-miR-127-3p допринася за свръхактивирането на IFN-I сигналния път в бъбречните тъкани на пациенти с LN и hsa-miR-127-3p мимиките могат да служат като алтернатива на JAKl инхибитор при лечение на LN.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Реактиви

Универсален тип I интерферон е от R&D Systems (Cat. 11200-1). МиРНК имитатори, имитиращи контроли и мутант hsa-miR-127-3p (5'UgccuagCGUCUGAGCUUGGCU3') са от Gene-

Pharma.Hsa-miR-127-3p antagomir беше от ReboBio. Подробностите за плазмидите са както следва:

pISRE- и pGAS-луциферазните репортерни плазмиди са от Clontech Laboratories. psiCHECK2 и pRL-TK векторите са от Promega Biotech. и pcDNA3.1 векторите са от Invitrogen.

За конструирането на psiCHECK2-JAK1-3'UTR репортерен плазмид, фрагментът (съдържащ предвиденото hsa-miR-127-3p място на свързване) на човешки JAK1 3'UTR беше амплифицирани с помощта на стандартни PCR техники (праймерите са изброени в таблица S1) и впоследствие вмъкнати във вектор psiCHECK2.

За конструирането на psiCHECK2-JAK1-3'UTR-мутантен репортерен плазмид, предвиденото hsa-miR-127-3p място на свързване (5'GATCTGA3') на psiCHECK2-JAK 1-3'UTR репортерен плазмид е мутиран до (5'CTAGACT3') с помощта на KOD-Plus-Mutagenesis Kit (TOYOBO) (праймерите са изброени в таблица S1).

За конструирането на pcDNA3.1-JAKlt плазмид, фрагментът (съдържащ предсказаните hsa-miR-127-3p места на свързване) на човешкия JAK1 кодиращ регион беше амплифициран с помощта на стандартни PCR техники (праймерите са изброени в таблица S1) и впоследствие вмъкнат в pcDNA3.1( плюс )-5'HA вектор.

За конструирането на pcDNA3.1-JAKlt-мутантен плазмид, предвидените hsa-miR-127-3p места на свързване (5tcgAtcGgaGcctcaaga aggAtcTggt3') на pcDNA3.1-JAKlt плазмид е мутиран до (5 'tcgTtcCgaCcctcaagaaggTtcAggt3) с помощта на комплект KOD-Plus-Mutagenesis (TOYOBO) (праймерите са изброени в Таблица S1).

Всички плазмиди бяха проверени чрез секвениране.

Клетъчна култура

Hela клетки, HepG2 клетки и K562 клетки бяха от Cell Bank, Шанхайски институти за биологични науки, Шанхай, Китай. U4A клетки с мутирал JAK1 (9) бяха подарък от Y.Eugene Chin от университета Soochow. Прилепналите клетки (Hela, HepG2 и U4A) се култивират в DMEM (Gibco), допълнен с 10 процента FBS (Gibco) и 100 ug/ml пеницилин-стрептомицин (Gibco). Суспензионните клетки (K562) се култивират в RPMI 1640（Gibco） с 10 процента FBS（Gibco） и 100 ug/ml пеницилин-стрептомицин (Gibco). Първични човешки бъбречни мезангиални клетки (HRMCs) (Cat. 4200, ScienCellTM Research Laboratories) се култивират в мезангиална клетъчна среда (Cat.4201, ScienCellTM Research Laboratories) съгласно инструкциите на производителя. Всички клетки се поддържат при 37 градуса в 5 процента CO2.

Трансфекция и стимулация

За анализ на луциферазен репортер, Hela клетки или HRMCs бяха посяти в 96-плака с ямки и трансфектирани с ISRE- или GAS-луциферазен репортер (100 ng/ямка), pRL-TK плазмид (10 ng/ямка) заедно с посочени миРНК мимики (100 nM) или антагомири (500 nM), като се използва Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 12 часа по-късно, трансфектираните клетки бяха стимулирани с универсален тип I интерферон (1000 U/ml) за 8 часа преди измерването.

За проверка на таргетните места на hsa-miR-127-3p в 3'UTR на JAK1 иРНК, Hela клетките бяха посяти в 96-ямкова плака и трансфектирани с psiCHECK2-JAK1-3 'UTR(или psiCHECK2-JAK1-3'UTR-мутант или psiCHECK2) плазмиди (20 ng/ямка) заедно с посочени миРНК мимики (100 nM), използвайки

Липофектамин 2000 (Invitrogen). Трансфектираните клетки се култивират в продължение на 24 часа преди измерването.

Луциферазната активност се измерва с Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega Biotech) съгласно инструкцията.

За проверка на таргетните места на hsa-miR-127-3p в кодиращия регион на JAK1 иРНК, U4A клетки бяха посяти в 6-плака с ямки и трансфектирани с pcDNA3.1-JAKlt (или pcDNA3. 1-JAK1t-мутант) плазмиди (луг/ямка) заедно с посочени миРНК мимики (100 nM), използвайки Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

За други цели, Hela клетки или HRMCs бяха трансфектирани с миРНК мимики (100 nM) или антагомири (500 nM), използвайки Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen). 24 часа по-късно, трансфектираните клетки бяха стимулирани с универсален интерферон тип I (1000U/ml) за 6 часа (за количествено определяне на иРНК или микрочипове) или за 10 минути или 15 минути (за Western blot).

Количествено определяне на генната експресия

Общата РНК се екстрахира с TRIzol реагент (Invitrogen). cDNA се синтезира с помощта на комплект реагент PrimeScript RT (Takara). Генната експресия се определя количествено с помощта на комплекта SYBR Premix ExTaq (Takara). RPL13a се използва като референтен ген за количествено определяне на иРНК. Експресията на hsa-miR-127-3p се определя количествено с помощта на комплекта TaqMan MicroRNA Assay (Applied Biosystems). RNU48 беше използван като референтен ген за количествено определяне на miRNA. Амплификацията беше извършена на ABI vii7 PCR система в реално време (Applied Biosystems). Относителният израз беше изчислен с помощта на 2-метод. Индукционната гънка се изчислява чрез разделяне на относителната експресия на ген от проба в експериментални групи (миРНК имитиращи или групи с антагомирна трансфекция с IFN-I стимулация) на относителната експресия на същия ген на нестимулирана контролна проба (без трансфекция, без IFN-I стимулация). Праймерите са изброени в Таблица S2.

Western Blot

Използвани са цели клетъчни лизати. Протеините бяха разделени с 10 процента SDS-PAGE, електрически прехвърлени към PVDF мембрани (EMD Millipore) и изследвани с посочените антитела. Лентите се визуализират с Pierce ECL Western Blotting субстрат (Thermo ScientificTM). Информацията за антителата беше в таблица S3.

Микрочипове

Общата РНК се екстрахира с реагент TRIzol (Invitrogen) от пробите, посочени в раздела РЕЗУЛТАТИ, и се подлага на анализ с микрочипове. Всички експерименти с микрочипове бяха проведени с помощта на масив Affymetrix U133 плюс 2.0 от Shanghai Biotechnology Corporation. Накратко, общата РНК беше проверена за RIN номер, за да се провери целостта на РНК от Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ). Квалифицираната тотална РНК беше допълнително пречистена с RNeasy micro kit (Cat#74004, QIAGEN, GmBH, Германия) и RNase-Free DNase Set (Cat#79254, QIAGEN, GmBH, Германия). След това РНК пробите бяха амплифицирани, белязани и пречистени с GeneChip 3'IVT Express Kit (Cat #901229, Affymetrix, Санта Клара, Калифорния, САЩ), следвайки инструкциите на производителя за получаване на белязана с биотин cRNA. Хибридизацията и промиването на масива бяха извършени с помощта на GeneChip①Hybridization, Wash and Stain Kit (Cat#900720, Affymetrix, Santa Clara, CA, US) в Hybridization

Пещ 645 (Cat#00-0331-220V, Affymetrix, Санта Клара, Калифорния, САЩ) и Fluidics Station 450(Cat#00-0079, Affymetrix, Санта Клара, Калифорния, САЩ) последваха инструкциите на производителя. Слайдовете бяха сканирани от GeneChipScanner 3000(Cat#00-00212, Affymetrix, Санта Клара, Калифорния, САЩ) и софтуер за командна конзола 3.1 (Affymetrix, Санта Клара, Калифорния, САЩ) с настройки по подразбиране. Суровите данни бяха нормализирани от алгоритъма MAS5.0 и импортирани в софтуера Gene Spring 11.0 (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ). Анализът на несдвоен тест с корекция на Benjamini-Hochberg беше използван за получаване на диференциално експресирани гени с коригирана P-стойност от<0.05. overlapping="" differentially="" expressed="" genes="" in="" ifn-α="" treated="" hela="" cells(upregulated="" or="" downregulated="" by="" 1.5-fold)="" between="" different="" comparison="" pairs="" (hsa-mir-127-3p="" mimics="" vs="" mock,="" hsa-mir-127-3p="" mimics="" vs="" negative="" control="" mimics,="" and="" hsa-mir-127-3p="" mimics="" vs="" hsa-mir-127-3p="" mutant="" mimics)="" were="" calculated.="" all="" the="" hsa-mir-127-3p="" inhibited="" genes="" were="" retrieved="" and="" subjected="" to="" the="" enrichment="" analysis="" of="" the="" cis-regulatory="" motifs="" at="" the="" upstream="" of="" these="" genes="" using="" the="" iregulon="" plugin="" on="" the="" cytoscape="" platform(10).="" the="" effect="" of="" hsa-mir-127-3p="" on="" the="" induction="" of="" the="" interferon-stimulated="" genes="" (isgs)from="" a21-gene="" ifnsignature="" (8)by="" ifn-α="" in="" hela="" cells="" was="" also="">

Ago2 свързваща РНК имунопреципитация Hela клетки се посяват в 10 cm паничка и се трансфектират с hsa-miR-127-3p или hsa-miR-127-3p мутант при концентрация от 100nM. Трансфектираните клетки се култивират за една нощ. След това клетките се промиват в студен PBS и се изстъргват. Имунопреципитацията се обработва с помощта на EZ-Magna RIPRNA-Binding Protein Immunoprecipitation kit (Cat.17-701, Millipore) и RIPAb плюс Ago2 (Cat. 03-110, Millipore). 10 процента от общия лизат се използва като вход и останалите 90 процента от общия лизат се използват за имунопреципитация. РНК проби от всяка група бяха използвани за синтезиране на комплементарна ДНК с комплекта реагенти PrimeScript RT (Takara). Експресията на JAK1 се определя количествено с помощта на комплекта SYBR Premix ExTag (Takara). Експресията на hsa-miR-127-3p беше количествено определена с помощта на комплекта TaqMan MicroRNA Assay (Applied Biosystems). Амплификацията беше извършена на ABI vii7 PCR система в реално време (Applied Biosystems). Праймерните последователности са в Таблица S2.

Бъбречни проби

Бъбречни биопсии (n=14) са получени от биобанката на шанхайската болница Ren Ji. От всички пациенти е получено писмено информирано съгласие. Проучването е одобрено от Съвета по етика на научните изследвания на Шанхайската болница Ren Ji. Всички пациенти с LN (клас IV-V) отговарят на критериите на Американския колеж по ревматология за LN (11). Пробите в нормалната контролна група (n=11) са от нормални паракарциномни бъбречни тъкани на пациенти с рак на бъбреците (стадий I-II), които не са имали история на автоимунни заболявания. Клиничната информация за всички субекти е описана в нашата предишна статия (8).

Статистика

Данните бяха анализирани и нанесени с GraphPad Prism (версия 6.02). Mann-Whitney U-тест и еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA) бяха използвани за сравнение на две или повече независими групи. Корелационният тест на Spearman беше използван за корелационни изследвания. P стойности под 0,05 се считат за статистически значими.