Екзогенният азотен оксид стимулира ранното излизане на спорозоитите на Eimeria Tenella от първични пилешки бъбречни клетки in vitro

За повече информация. контактtina.xiang@wecistanche.com

Резюме-Егресът играе жизненоважна роля в жизнения цикъл на апикомплексни паразити, включително Eimeria tenella, която привлича вниманието на различни изследователски групи. Много скорошни проучвания са фокусирани върху ранното излизане, предизвикано от имунни молекули, за да се разработи нов метод за елиминиране на паразити от апикомплексан. В това проучване ние изследвахме дали азотният оксид (NO), имунна молекула, произведена от различни видове клетки в отговор на цитокинова стимулация, може да предизвика ранно излизане на американски спорозоити in vitro. Спорозоитите на Eimeria tenella бяха екстрахирани и култивирани в първични клетки от пилешки бъбрек. Броят на спорозоитите, излезли от заразените клетки, се анализира чрез поточна цитометрия след третиране с NO, освободен от натриев нитроферицианид (II) дихидрат. Резултатите показват, че екзогенният NO стимулира бързото излизане на спорозоитите на E.tenella от първичните пилешки бъбречни клетки преди репликацията на паразита. Ние също така открихме, че излизането зависи от нивата на интрапаразитни калциеви йони (Ca2) и не е настъпило увреждане на гостоприемните клетки след излизане. Вирулентността на излезлите спорозоити е значително по-ниска от тази на пресните спорозоити. Резултатите от това проучване допринасят за нова област изследване на взаимодействията между апикомплексните паразити и техните клетки гостоприемници, както и това на изчистването на вътреклетъчните патогени от гостоприемникаимунна система.

Ключови думи: Egress, спорозоити на Eimeria tenella, азотен оксид.

Cistanche tubulosaе богат наехинакозидивербаскозид, така че има добър ефект за подобряване на имунитета. Cistanche tubulosa е ценен лекарствен материал, който може да възбуди хипофизната жлеза и надбъбречната кора или да има хормоноподобен ефект, подобен на надбъбречната кора, и да регулира имунната функция на тялото. Доказано е, че полизахаридите на Cistanche tubulosa могат да подобрят имунната функция на организма; имуноукрепващият ефект наполизахаридкомпоненти могат да играят основна роля в укрепващия и тонизиращ ефект на Cistanche tubulosa. Verbasin, една от активните съставки на Cistanche tubulosa, е доказано от експерти, че също има положителен ефект върху имунната регулация. Според съществуващите данни от научни изследвания в академичните среди може да се счита, че имуномодулиращата функция и слабителната функция на традиционната китайска медицина Cistanche има голямо клинично значение за повишаване на имунитета на организма и възстановяването на пациенти с COVID-19.

Щракнете, за да научите cistanche nootropics

Въведение

Членовете на типа Apicomplexan са задължителни вътреклетъчни патогени и включват Toxoplasma Gondi, Plasmodium spp. и Cryptosporidium spp., Които заразяват много гръбначни гостоприемници, включително хора, причинявайки тежко заболяване [9,25,33]. Апикомплексните паразити претърпяват сложни процеси в своите асексуални стадии, включително инвазия, репликация и излизане [28]. Сред тези процеси излизането е жизненоважна стъпка, която позволява на паразитите да нахлуят в друга клетка гостоприемник за по-нататъшно развитие [14]. Егресията обикновено води до лизис на клетките гостоприемници, което води до вредни последици [5, 6]. Тъй като процесът е от решаващо значение както за патогените от този тип, така и за гостоприемниците, много изследвания са проведени в тази област [29, 30]. Повечето от тези доклади обаче са ограничени до Plasmodium spp. и Toxoplasma Gondi [6]. Eimeria spp. е друг важен род апикомплексни паразити, който причинява тежки отрицателни въздействия върху птицевъдната индустрия в световен мащаб, но малко се знае за процеса на излизане от този род [11].

Eimeria spp. може да доведе до тежко чревно заболяване при пилета, причинявайки глобални загуби на птицевъдната индустрия от приблизително 3 милиарда USD годишно [16, 31]. Разбирането на връзката между Eimeria spp. и техният гостоприемник представлява голям интерес за контрола на кокцидиозата. Нашето предишно проучване разкри, че секрецията на калциеви йони (Ca2t) и микронем 2 протеин (EtMic 2) е от решаващо значение за излизането на eimerian паразити [35, 36].

Много скорошни проучвания са фокусирани върху индуцируемо излизане, стимулирано от имунни молекули, за разработване на стратегии за лечение на апикомплексни паразити [12,27,37]. Например, индуцираната от интерферон-y клетъчна смърт води до ранно излизане на T. Gondi tachyzoites, което може да наруши жизнения цикъл на клетките гостоприемници и да насърчи елиминирането на този патоген [26]. Наскоро съобщихме, че азотният оксид (NO) може да стимулира бързото излизане на T. gondii тахизоити от инфектирани макрофаги (имунни клетки) и човешки фибробластни клетки на препуциума (неимунни клетки)[19,34].

NO се произвежда от много типове клетки, като дендритни, мастни, естествени убийци и фагоцитни клетки, в отговор на цитокинова стимулация и играе важна роля в имунологично медиираната защита срещу много видове патогени in vitro и при животински модели, включително протозои[10]. ,17]. При инфекция от протозои като Plasmodium spp. и повишеното производство на NO при Toxoplasma Gondi медиира защитата на гостоприемника чрез директно убиване на паразити или ограничаване на растежа на паразитите [8]. Предишни проучвания съобщават за по-високо производство на NO по време на първична инфекция с E. tenella, така че NO действа като антикокциден ефектор [1]. Затова се опитахме да открием дали NO може да стимулира ранното излизане на спорозоитите на E. tenella от гостоприемни клетки in vitro, за да предоставим повече информация за изследването на Eimeria spp. изход и представи нови прозрения за изчистването на вътреклетъчните патогени от гостоприемниците.

Материали и методи

Паразити, пилета и клетъчна култура

Щамът E. tenella M2e, трансгенен щам, който стабилно експресира подобрен жълт флуоресцентен протеин (EYFP) [21], използван в това проучване, се поддържа чрез размножаване в свободни от кокцидии бройлери Arber Acres, които са закупени от Beijing Arbor Acres Poultry Breeding Co. , ЕООД; Пекин, Китай. Всички птици бяха настанени в изолатори, за да се избегне заразяване с други видове Eimeria spp. Изолирането, пречистването и образуването на спори на ооцисти се провеждат съгласно установените протоколи [22]. Всички опити с животни са проведени в съответствие с процедурите за етика на животните, одобрени от Комитета за етична инспекция на лабораторията за хуманно отношение към животните към Китайския селскостопански университет (одобрение №20160921-2). Пречистването на спорозоити се провежда, както е описано по-горе [35]. Прясно пречистени спорозоити се суспендират с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) и броят на паразитите се преброява с помощта на плоча за броене на кръвни клетки. Първичните клетки от пилешки бъбрек (PCKs) се приготвят, както е описано по-горе [12] и се посяват в 24-плаки за култура с ямки, допълнени с модифицирана среда на Dulbecco Eagle (DMEM), съдържаща фетален говежди серум (10 процента, v/v), пеницилин ( 200 U/mL) и стрептомицин (100 ug/mL). Клетъчната плътност се регулира до 1 × 10 градуса клетки/ямка.

Измерване на концентрацията на NO

Концентрацията на NO, освободен от SNP, се оценява чрез измерване на NO,/NO; съотношение чрез реакция на Griess с помощта на комплект за анализ на NO (Applygen Tech Inc., Пекин, Китай), съгласно инструкциите на производителя.

Тест за индуцирано изтичане на NO

PCKs се култивират при 41 градуса и 5 процента CO, за една нощ, последвано от три промивания с PBS за отстраняване на неприлепналите клетки. След 2 дни PCK се инкубират с EtM2e спорозоити при множество инфекции (MOIof 2.0(съотношение паразит/клетка 2:1) при 37 градуса за 12 часа. Неинвазивните спорозоити се отстраняват чрез промиване След това клетките се инкубират с различни концентрации (10, 20 и 40 mM) на натриев нитрофер-рицианид (I) дихидрат (SNP; Sigma) или DMEM носител самостоятелно за различни времена на третиране (10, 20 и 30). min). След третиране, излезлите паразити се суспендират в 500 μL DMEM и 10 uL суспензии се анализират чрез поточна цитометрия (C6, Accuri Cytometers, Inc. Ann Arbor, MI, Съединени щати).

Видео микроскопия

PCK бяха третирани с 4 0 mM SNP след 12 часа инкубиране с EtM2e спорозоити при MOI от 2,0. Прогресията на изхода се записва с помощта на светлинен микроскоп (Carl Zeiss, Olympus).

Откриване на ефект върху етапа на развитие на паразити

Преди третиране с 40 mM SNP за 30 минути, спорозоитите бяха оставени да се развият в PCKs за 24 или 36 часа, което е трофозоитният стадий на този паразит. След третиране, излезлите паразити се суспендират в 500 uL DMEM и 10 μL суспензии се анализират чрез поточна цитометрия.

Определяне на жизнеспособността на клетката гостоприемник

PCKs бяха промити след NO-индуцирано излизане, спорозоитна инвазия, SNP лечение и съответно в нетретираната група и клетъчната жизнеспособност беше измерена с помощта на пропидиев йодид (PI; eBioscience). Накратко, PCKs във всяка група бяха промити с PBS и внимателно трипсинизирани след третиране, а единичните клетки бяха оцветени с PI, съгласно инструкциите на производителя. Процентът на жизнеспособни клетки се анализира чрез поточна цитометрия.

Тест за инхибиране

За анализи на инхибиране, вътрешният Ca2 плюс хелатор BAPTA-AM (Sigma, St. Louis, MO, Съединени щати) и фосфоинозитид специфичен фосфолипаза C инхибитор U-73122(Sigma) бяха използвани за оценка на ефекта на Ca2 plus върху спорозоита изход. В друг експеримент цитохалазин D (CyoD; MerckDarmstadt. Германия) е използван за блокиране на паразитната подвижност. Инфектираните PCK бяха предварително третирани с 10 μM BAPTA-AM. U-73122.или CytoD, приготвени в диметилсулфоксид (Sigma) за 30 минути. След това клетъчните култури се инкубират с 40 тМ SNP за 30 минути. и броят на излезлите спорозоити се оценява, както е описано по-горе.

Вирулентност на излезлите паразити

PCKs се инкубират със спорозоити в продължение на 12 часа, последвано от третиране с 40 mM SNP в продължение на 30 минути. Среда за клетъчна култура, съдържаща свободни паразити след третиране с SNP, се събира и промива три пъти с PBS. и жизнеспособността на паразита беше тествана чрез използване на 4 процента трипаново синьо изключване на багрилото. Излезлите паразити се преброяват с помощта на плочи за броене на кръвни клетки. За откриване на вирулентност бяха тествани повторната инвазия и репродуктивните способности на излезлите паразити след третиране с 40 mM NO за 30 минути. PCK бяха инкубирани с излезли паразити при

Вирулентност на излезлите паразити

PCKs се инкубират със спорозоити в продължение на 12 часа, последвано от третиране с 40 mM SNP в продължение на 30 минути. Среда за клетъчна култура, съдържаща свободни паразити след третиране с SNP, се събира и промива три пъти с PBS. и жизнеспособността на паразита беше тествана чрез използване на 4 процента трипаново синьо изключване на багрилото. Излезлите паразити се преброяват с помощта на плочи за броене на кръвни клетки. За откриване на вирулентност бяха тествани повторната инвазия и репродуктивните способности на излезлите паразити след третиране с 40 mM NO за 30 минути. PCKs се инкубират с излезли паразити на са използвани като контрола. За да се оцени репродуктивната способност на гостоприемника, 2 × 10" прясно приготвени спорозоити и равно количество излезли паразити бяха инокулирани в 3-седмични пилета бройлери АА през клоакалния път и всички птици бяха настанени в изолатори [13 Общото количество ооцисти на птица беше измерено с помощта на камера за броене на яйца McMaster на 6-9 дни след заразяването [15].

статистически анализи

Софтуерът SPSS 20.0 (SPSS Inc.) беше използван за анализиране на разликите между третираните и контролните групи. Всички други статистически анализи бяха извършени с помощта на софтуер GraphPad Prisma 5.01 (Graphpad Software). Данните са изразени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). Експерименталните групи бяха сравнени с помощта на еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA).

Статистическата значимост беше оценена на нива p < 0.05 (значително) и p<0.01 (highly="">

Резултати

Екзогенен NO стимулира излизането на спорозоити от E. tenella

Преди провеждането на изходни анализи, ние проверихме дали концентрацията на NO, освободен от SNP, може да се поддържа стабилна, когато се разтвори в DMEM в рамките на 30 минути чрез реакция на Griess (фиг. 1A). След това инкубирахме заразени със спорозоити клетъчни култури с различни концентрации на SNP за различна продължителност, както е описано по-горе. Броят на свободните спорозоити се увеличава, когато заразените PCKs се инкубират с SNP (фиг. 1B). Ние също наблюдавахме процеса на излизане на паразита чрез видеозапис (фиг. 1C).

Ефект на етапа на паразитно развитие върху NO-стимулираното излизане

Интересувахме се дали изходът, предизвикан от NO, може да бъде повлиян от етапите на развитие на този паразит в PCKs. Преди третиране с 40 mM SNP за 30 минути, ние позволихме на спорозоитите да се развият в клетките гостоприемници съответно за 24 или 36 часа, което е трофозоитният стадий на този паразитен сайт. Изненадващо открихме, че броят на излезлите паразити е значително намален с удължаването на времето за развитие на паразита (фиг. 2), което показва, че етапът на развитие на паразита е важен елемент от NO-индуцираното излизане.

Излизането на паразити зависи от паразитния Ca2 плюс и мобилността

Предишно проучване показа, че интрапаразитният Ca2 играе жизненоважна роля по време на излизането на спорозоитите на E. tenella [12, 34]. Проведохме експерименти, за да определим значението на Ca2t в NO-индуцираното излизане на паразита. Както е показано на фигури 3A и 3B, индуцираното от NO излизане е блокирано чрез предварително третиране както с BAPTA-AM, така и с U-73122, което показва жизненоважната роля на интрапаразитния Ca2 plus и че източникът на Ca2 plus в

ендоплазмен ретикулум (ER). Освен това, предварителното третиране с Cyto-D за блокиране на мобилността на паразита показа подобни резултати (Фигури 4A и 4B), което показва, че мобилността на паразита е друг важен фактор за излизане на спорозоити.

Излизането на паразити не е свързано с увреждане на клетката гостоприемник

За да се изследва възможността, че NO-индуцираното излизане е токсично за клетките гостоприемници, клетъчната жизнеспособност се измерва чрез PI оцветяване. Резултатите показват, че процентът на PI клетки се увеличава след третиране със SNP и няма разлика между неинфектираните и инфектираните групи, което показва, че инкубацията на SNP е довела до увреждане на клетките, но не и до излизане на паразити (Фигури 5A и 5B).

Вирулентността на паразита намалява след NO-индуцирано излизане

Egressed parasites were collected and shown to remain viable by trypan blue exclusion (>85 процента жизнеспособност). След това добавихме излезлите паразити към PCK или ги инокулирахме в 3-седмични пилета бройлери АА поотделно по клоакалния път. И двете инвазивни ефикасности (стр<0.01)(fig.6a)and productivity="" in="" chickens=""><0.01)(fig.6b)of the="" parasites="" after="" no-induced="" egress="" decreased="" dramatically="" compared="" to="" that="" of="" freshly="" prepared="">

Дискусия

В това проучване открихме, че екзогенният NO стимулира ранното излизане на спорозоити от E. tenella от заразени PCK в процес, зависим от Ca2-. Излизането на паразити не доведе до увреждане на клетките гостоприемници и реинвазивната способност и вирулентността на излезлите паразити намаляха значително. Заедно тези резултати предполагат нов модел за изучаване на механизма на излизане на eimerian паразит и осигуряват нов метод, медииран от NO, за намаляване на вътреклетъчните патогени в клетките гостоприемници.

Егресията е важен процес, който позволява на eimerian паразитните сайтове да излязат от клетките гостоприемници и да нахлуят в съседните клетки, за да започнат нов вътреклетъчен жизнен цикъл; по този начин изходът играе решаваща роля в патогенезата в гостоприемника. Нашите предишни доклади се фокусираха върху предварителните механистични изследвания на изхода на eimerian паразит [35,36]. В това проучване е включен NO. Ние открихме, че NO може да индуцира изхода на паразитите малко след завършване на инвазията и много преди появата на изход на зрял мерозоит, който наруши жизнения цикъл на този патоген. В настоящото проучване, заразените PCKs не са претърпели увреждане по време на излизане, което се различава от съобщенията за некроза на клетка гостоприемник в подобни проучвания на излизане на тахизоит на T. Gondi [19, 20]. Едно правдоподобно обяснение за тази разлика е, че спорозоитите не са се репликирали преди провеждането на изходния анализ. Следователно не повече от два паразита обитават клетките гостоприемници, стойност много по-ниска от тази на тахизоитите, докладвани в предишни проучвания [19, 32]. Друго възможно обяснение е, че за разлика от T.gondi tachyzoites или eimerian merozoites, на паразита липсва специфичен протеин, който да унищожи клетките гостоприемници за естествено излизане в спорозоитния стадий. Въпреки това не открихме преки доказателства в подкрепа на тези хипотези. Нашите резултати показват значително намаляване на вирулентността на излезлите спорозоити, за разлика от тахизоитите на T. Gondi, които поддържат нормална вирулентност след излизане [27, 37]. Предполагаме, че паразитът се е развивал от спорозоити до шизонти, когато е извършен анализът за изход и че генната експресия, регулираща специфичните за стадия протеини в паразита, може да се е променила. За разлика от спорозоитите на eimerian, тахизоитите на T. Gondi претърпяват бинарно делене в клетките гостоприемници, като по този начин поддържат нормална вирулентност. Затова смятахме, че ако има определени стимулатори, които биха могли да предизвикат излизане на Eimeria spp. след инвазия тогава излезлите паразити не могат да запазят нормалната си вирулентност in vivo, както при in vitro експериментите. Това имуномедиирано излизане може да наруши жизнения цикъл на паразитите и в крайна сметка да насърчи изчистването на паразита от имунните клетки.

Последните проучвания разкриха решаващата роля на Са2 при излизането на апикомплексни патогени [7,18]. Вторичният инозитол 1,4,5-трифосфат (IP3) стимулира освобождаването на Ca2 от ER в цитоплазмата чрез свързване с IP3 рецептор [3]. Доказано е, че IP3 индуцира освобождаването на Ca2 от вътреклетъчните басейни както в T.gondi [24], така и в Plasmodium falciparum [2]; обаче малко се знае за геномното присъствие на IP3 рецептори в апикомплексни паразити [4,23]. В настоящото проучване вътреклетъчните Ca² и IP3 пътища бяха блокирани с помощта на BAPTA-AM и U-73122, за да се провери дали NO-индуцираното излизане на спорозоити е Ca плюс -зависимо и да се определи източникът на Ca2t. Нашите резултати показаха, че излизането е задържано както от BAPTA-AM, така и от U-73122, което показва, че вътреклетъчният Caps играе жизненоважна роля в излизането на спорозоити на E. tenella. Въпреки че демонстрирахме, че вътреклетъчният Ca2 plus е жизненоважен за изхода на паразита, пътят и функцията на свързаните протеини изискват по-нататъшно проучване с помощта на по-напреднали и прецизни методи.

В обобщение, резултатите от това проучване показват, че NO може да стимулира ранното излизане на спорозоити на E. tenella от заразени PCKs и предоставя предварителна информация за механизма на това излизане. В бъдещи проучвания ще се стремим да идентифицираме допълнителни имунни молекули, които индуцират ранно излизане на спорозоити от E. tenella и ще изследваме дали NO може да индуцира ранно излизане на eimerian паразити от пилешки чревни епителни клетки in vitro и in vivo.