Благоприятен/неблагоприятен ефект на кверцетин върху мембраните на SK-N-SH клетките на невробластома, част 1

Моля щракнетеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

Резюме:Кверцетинът е полифенолно съединение, чиито ефекти предизвикват съмнения у учените. Резултатите от много експерименти показват, че има противоракови, противовъзпалителни и антиоксидантни свойства, докато други изследвания показват неговото прооксидативно и цитотоксично действие. Това съединение може да реагира с реактивни кислородни видове и поради своите химични свойства може да се намери в хидрофобно-хидрофилната област на клетките. Тези характеристики на кверцетина показват, че неговото действие в клетките ще бъде свързано с модификацията на мембраните и участието му в поддържането на редокс баланса. Следователно това изследване разграничава тези два механизма и определя дали те са важни за клетъчната функция. Ние проверяваме: (1) Дали избраните концентрации на кверцетин са цитотоксични и разрушителни за SK-N-SH клетъчните мембрани (MTT, LDH, MDA тестове) в ситуации със и без приложен оксидативен стрес; (2) какво е нивото на промени в структурните/механичните свойства на липидната част на мембраните на тези клетки поради наличието на полифенолни молекули; и (3) дали антиоксидантното действие на кверцетина предпазва мембраната от неговата модификация. Нашите резултати показват, че промените в твърдостта/еластичността на липидната част на мембраната представляват решаващия механизъм на действие на кверцетин, потенциално повлияващ клетъчните процеси, чиито начални етапи са свързани с мембраните (напр. приемане на сигнали от околната среда, транспорт).

Ключови думи:кверцетин; невробластомни клетки; клетъчната мембрана; Langmuir монослой;оксидативен стрес

1. Въведение

Кверцетин (3,3',4',5,7-пентахидрокси флавон) е биоактивен полифенол, който се среща в растенията [1-3] и е най-разпространеният флавоноид в човешката диета [4].

Той проявява широк спектър от свойства - сред противовъзпалителни [5] и имуномодулиращи [6]. Литературните данни показват, че може да бъде потенциален противораков фактор [7,8]. Дължи действието си на способността да променя хода на вътреклетъчните сигнални пътища [9,10] и на антиоксидантни свойства, които са демонстрирани, наред с други, върху PC12 клетки [11,12] и човешки невронни SH-SY5Y клетки [13] .

Това съединение е антипролиферативен агент, предизвикващ програмирана клетъчна смърт в редица туморни линии, например в HL-60 и NB-4 клетки от остра миелогенна левкемия [14,15] и K{{4 }}хронична миелогенна левкемия [16]. Доказано е също, че кверцетинът инхибира разпространението на различни видове рак, като например в белия дроб, черния дроб, гърдата и дебелото черво [17-20]. Vijayababu et al [21] установяват, че той индуцира апоптоза на клетките на простатен карцином (PC-3), както и инхибира инвазията, миграцията и сигналните молекули, участващи в клетъчното оцеляване и пролиферацията на този тип клетки [22] .

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Действието на кверцетина обаче не е ясно. Има и данни, показващи висока цитотоксичност на това съединение [23-25]. Изследванията показват, че кверцетинът, в зависимост от концентрацията, местоположението в клетката и източника на свободни радикали, може да прояви прооксидативен ефект. Високите дози генерират оксидативен стрес в човешките лимфоцити [26].

Такова двойствено действие на кверцетина може да е свързано с факта, че като антиоксидант той може да се превърне в продукт на окисление. Резултатът от тази реакция е образуването на aсемихинонов радикал, който се окислява до кверцетинхинон [2]. Това съединение може да реагира с тиолови групи, ставайки токсични за клетките [26].

Друга възможност за благоприятно/неблагоприятно действие върху клетките е въздействието на това съединение върху мембраните. Поради химическата си природа и наличието на ароматни пръстени в молекулата, той може да се локализира в хидрофобни клетъчни отделения, като по този начин променя своите физикохимични свойства [27,28]. Механичните и структурните свойства на липидната част на мембраните са много важни за протичането на всички процеси, свързани с мембраните, т.е. транспорт, сигнализация и провеждане на стимули. Тези процеси се извършват главно от протеини, закотвени в мембрани.ползи от полифенолитеПромените в твърдостта или гъвкавостта на мембраната могат да блокират възможността за приемане на подходяща конформация на отделните протеинови домени, което впоследствие може да наруши или инхибира процеса, извършван от даден протеин. Следователно е вероятно промяната на състава на мембраната чрез въвеждане дори на малко количество кверцетин между липидните молекули може значително да промени тяхната мобилност.

Cistanche може да подобри имунитета

С оглед на съществуващата неяснота в литературата относно ефектите на кверцетин върху клетките, това изследване оценява анти- или про-оксидативното действие на кверцетина и проверява влиянието на това съединение върху функционирането на клетъчните мембрани, включително определянето на структурната модификация на липидна част от тези мембрани.физиологичен разтвор на цистанчеТази цел беше постигната чрез изследване на ефекта на различни концентрации на кверцетин върху оцеляването на SK-N-SH клетките и нивото на увреждане на техните мембрани. Потенциалната антиоксидантна активност на това съединение беше проверена чрез иницииране на оксидативен стрес в клетките след предварителна инкубация с кверцетин.стандартизирана цистанчеДействието на мембранно ниво беше тествано в моделни системи, даващи недвусмислена информация за: (1) структурната модификация на липидния монослой на състава, отразяващ клетъчната мембрана (SK-N-SH), причинена от наличието на различни количества кверцетин, и (2) защитните способности на тествания флавоноид срещу пероксидация на ненаситени мастни киселини в липидите, които изграждат клетъчната мембрана (SK-N-SH).

2. Резултати

2.1.Национални клетъчни мембрани

Ефектът на кверцетин върху човешки SK-N-SH клетки е изследван с помощта на МТТ анализ, който определя митохондриалната активност.

SK-N-SH бяха изложени в продължение на 24 часа на различни концентрации на кверцетин (3.1, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 и 200 uM). Клетъчното третиране с по-ниски концентрации на кверцетин не показва значителен ефект. Обратно, добавянето на кверцетин в концентрация от 200 uM причинява леко увеличение на броя на жизнеспособните клетки (11 процента в сравнение с контролата) (Фигура la).

Проучването също така изследва ефекта от различни концентрации на водороден пероксид (1-5 mM) върху клетките след 3 часа контакт. Беше наблюдавано, че най-ниската тествана концентрация причинява леко намаляване на клетъчната жизнеспособност (с около 10 процента в сравнение с контролата), докато по-високите концентрации са токсични за SK-N-SH клетките. В присъствието на H2O2 при концентрации 3 и 5 mM в културалната среда се забелязва значително (от приблизително 54 процента) намаление на клетъчната жизнеспособност в сравнение с клетките, които не са третирани с H2O2 (Фигура 1b).

За да се определи защитният ефект на кверцетин срещу H2O, токсичност, клетките бяха третирани с различни концентрации на кверцетин в продължение на 24 часа, последвано от 3 часа контакт на пробата с водороден пероксид от 3 и 5 mM. Беше наблюдавано, че кверцетин от 3.1-50 uM концентрации причинява леко,от къде мога да купя цистанчеоколо 9 процента, увеличаване на броя на жизнеспособните клетки, в сравнение с клетките, третирани само с Н, О. За разлика от това, за SK-N-SH клетки, предварително инкубирани в среда, съдържаща по-високи концентрации на кверцетин (100 и 200 uM) и след това в контакт с H2O2, клетъчната жизнеспособност се повишава с приблизително 18 и 33 процента (Фигура 1с).

Следващият етап от работата беше да се провери до каква степен кверцетинът и Н, О влияят върху мембраните на тестваните клетки. За тази цел тестът за лактат дехидрогеназа (LDH) беше използван за оценка на нивото на увреждане на клетъчната мембрана и нивото на малондиалдехид (MDA) беше измерено за оценка на степента на липидна пероксидация. Клетките SK-N-SH бяха третирани в продължение на 24 часа с избрани концентрации на кверцетин (6.25; 25; 100; 200 μM) и след това беше добавен водороден пероксид (3-5 mM) за още 3 часа.

Фигура 1. Клетъчната жизнеспособност се определя чрез МТТ анализ. SK-N-SH клетки бяха изложени в продължение на 24 часа на различни концентрации на кверцетин (3.1-200 uM). Процентът на клетъчна жизнеспособност се отнася за нетретираните контролни клетки (а); клетки, контактуващи в продължение на 3 часа с различни концентрации на H2O2 (mM) (b), SK-N-SH клетки, предварително инкубирани в продължение на 24 часа с различни концентрации на кверцетин и след това в контакт за 3 часа с Н, О2. Процентът на клетъчна жизнеспособност е свързан с клетки, третирани само с H,O2 (c). Стойностите представляват средната стойност ± SD от три до шест независими експеримента. Различните букви показват значителни разлики (p По-малко или равно на 0.05).

Както е показано в таблица 1, присъствието на кверцетин в средата, използвана за 24-часово третиране на SK-N-SH клетки, не предизвиква значителна промяна в освобождаването на LDH.

Предварителното третиране с концентрация на кверцетин от 6,25 uM не повлиява съдържанието на MDA, докато по-високите дози на кверцетин （25; 100 и 200 μM） предизвикват повишаване на липидната пероксидация с около 12 процента (Фигура 2а).

Третирането на клетките както с кверцетин, така и с водороден пероксид не повлиява освобождаването на LDH в сравнение с клетките, третирани само с водороден пероксид (Фигура 2b).

Фигура 2. Ефектът на кверцетин върху SK-N-SH клетки, изложени на H2O, се измерва чрез степента на липидна пероксидация (концентрация на MDA) (a) и освобождаване на LDH (b). Клетките бяха предварително третирани в продължение на 24 часа с избрани концентрации на кверцетин (6,25; 25; 100; 200 uM), последвани от 3 часа контакт с H2O2 (3-5 mM).Цистанче против стареенеПроцентът на изтичане на LDH се отнася само за стойности, получени за клетки, третирани с H2O, (b). Стойностите представляват средната стойност± от три до шест независими експеримента. Различните букви показват значителни разлики (p По-малко или равно на 0.05).

2.2. Моделни мембрани

2.2.1. Влиянието на кверцетина върху механичните свойства на мембраните

За да се тества ефекта на кверцетин върху мембраните на клетките на невробластома, бяха образувани липидни монолавери (със състав, отразяващ липидната част на мембраните на клетъчната линия SK-N-SH). Монослоевете бяха направени върху чист буфер с рН 7.4 (контрола) и върху буфер, съдържащ кверцетин при концентрации от 6.25, 12.5, 25 и 50 μM. За такива монослоеве бяха измерени зависимостите на повърхностното налягане （元） от площта на единична молекула в монослоя (А) (Фигура 3).

Ходът на (π-A) изотермите, получени за състава, имитиращ липидната смес, характерен за мембраната на невробластома, се характеризира с монотонен ход, без забележими фазови преходи. Наличието на кверцетин ясно променя тази връзка, причинявайки изместване на кривите към по-високи стойности на A. Тази тенденция е правопропорционална на концентрацията на кверцетин в буферния разтвор. Зависимостта на статичния Cs-I модул на компресия от rt беше изчислена въз основа на изотермите (вмъкване на фигура 3).

Въз основа на получените изотерми са определени стойностите на физикохимичните параметри, характеризиращи изследваните монослоеве (Таблица 2).

Фигура 3. Изотерми на повърхностното налягане и съответния модул на свиваемост (вмъкване) на липидния модел на невробластомни слоеве, разпръснати върху субфазата, съдържат посочените концентрации на кверцетин, разтворен в буфер.

Таблица 2. Повърхностни параметри на монослоеве (Alim-ограничаващата площ за една молекула; πcoll-налягане на свиване; Cs-1-максимални стойности на модула на компресия) бяха изчислени за монослоеве на модела на мембрана на невробластома. Данните представляват средната стойност от три експеримента ±SD. Различните букви показват значителни разлики (p По-малко или равно на 0.05).

С увеличаване на количеството на кверцетин, Alim (минималната площ на молекула в плътно опакования слой) се увеличава пропорционално на неговата концентрация. За най-високото ниво на кверцетин това увеличение е било до 17,5 процента в сравнение с контролата. Останалите параметри, т.е. πcoll и Cs-I (повърхностно налягане в точката на свиване на слоя и статичен модул на компресия) са по-малко чувствителни към съдържанието на кверцетин в подфазата. Промените в Scroll варират от 3-5 процента, а за Cs- от 0.2 до 8,8 процента в сравнение с контролата.

Тази статия е извлечена от Molecules 2021, 26, 4945. https://doi.org/10.3390/molecules26164945 https://www.mdpi.com/journal/molecules