Стратегия за отчитане на вродени патогени, включваща убиквитиниране на бактериални повърхностни протеини, част 2

ДИСКУСИЯ

Метазоите използват убиквитиниране като универсален механизъм за поддържане на цитозолната хомеостаза, предотвратявайки натрупването на увредени протеини/органели и защитавайки срещу нахлуващи патогени (40, 41). Като се има предвид разнообразието от патогени и различни набори от увредени протеини, които се срещат, идентифицирането на общи мотиви за разпознаване на субстрат и последващо повсеместно разпространение представлява интелигентна стратегия за оптимизиране на ресурсите. Протеините в еукариотните клетки, които са предназначени за протеолиза, обикновено се идентифицират чрез тристранен дегронов мотив (24).

Имунитетът е способността на тялото да се бори с болести, включително реакции на бактерии, вируси и други вредни вещества. Ако имунната система на тялото е нарушена, тя няма да бъде достатъчно силна, за да се справи с настъплението на болестта. Проучванията показват, че недохранването оказва влияние върху функцията на имунната система, което прави тялото по-податливо на инфекции и болести. Протеинът е едно от важните вещества за поддържане на имунитета.

Протеините са изградени от аминокиселини, някои от които се наричат ​​есенциални аминокиселини, защото трябва да бъдат осигурени от храната и не могат да бъдат синтезирани от тялото. Тези основни аминокиселини включват триптофан, левцин, фенилаланин, лизин, изолевцин, метионин, валин и хистидин. Ако тялото не получава достатъчно незаменими аминокиселини, това може да доведе до нарушен протеинов метаболизъм, което може да повлияе на функцията на имунната система.

Освен това, висококачественият протеинов прием помага за поддържане на нормална имунна система и функции на тялото. Когато на тялото липсва протеин, това може да доведе до компрометирана имунна система и тялото е по-податливо на болести. Ако човешкото тяло няма протеин за дълго време, това може да причини дълготрайно увреждане на имунната система, което прави хората податливи на различни заболявания.

Следователно балансираната диета и правилните упражнения са ключът към поддържането на приема на протеини. Хората могат да задоволят нуждите на тялото си от протеини, като ядат повече храни, богати на протеини, като месо, птици, риба, боб, яйца, млечни продукти, зърнени храни, ядки и семена. В допълнение, умерените упражнения могат също да повишат търсенето на протеини и ефективността на усвояване на тялото. Балансираното и разнообразно хранене и здравословният начин на живот са ключът към поддържането на имунитета, поддържането на тялото здраво и стабилно и устояването на инвазията на болестите. От тази гледна точка трябва да подобрим имунитета си. Cistanche може значително да подобри имунитета, тъй като полизахаридите в месото могат да регулират имунния отговор на човешката имунна система, да подобрят способността за стрес на имунните клетки и да повишат имунитета на имунните клетки. Бактерициден ефект.

Кликнете върху добавката Cistanche deserticola

Това ни накара да проучим дали подобни мотиви могат да бъдат намерени на повърхности на патогени, където те биха могли да функционират като прокси за разпознаване на субстрат. Тук ние демонстрираме, че убиквитиновите лигази на гостоприемника използват подобни молекулярни подписи, за да усетят филогенетично различни патогени. Разпознаването на патогени чрез общи молекулярни модели/мотиви (PAMP) е добре характеризирана характеристика на вродения имунитет (42). Нашите резултати предполагат, че дегроноподобните последователности в бактериалните повърхностни протеини действат по начин, еквивалентен на PAMPs, за да осигурят наблюдение на вътреклетъчния патоген. Този модус операнд може да бъде допълнително използван от гостоприемника за представяне на микробни протеинови антигени върху основен комплекс за хистосъвместимост I, за да индуцира силен CD8 отговор, насочен срещу вътреклетъчни патогени.

Потенциалното значение на убиквитин-медиираното откриване на патогени за защитата на гостоприемника е допълнително подчертано от значителното остатъчно убиквитиниране, открито в мутантни SPN, които нямат както BgaA, така и PspA. Това показва, че има допълнителни, неидентифицирани субстрати на машината за убиквитин, като произтичащото излишък осигурява стабилно прихващане на патогени. Трябва да се отбележи, че някои незабавни въпроси относно дегроновия мотив и неговото значение за бактериите (освен като разпознаваема единица) предоставят интересен еволюционен ъгъл.

Мотивът на degron е неприложим in vivo и ако не друго, мутирането или изтриването на мотива подобрява вътреклетъчната устойчивост, което води до повишена вирулентност. Това се потвърждава от нашите резултати, че мутацията в дегроновия мотив може да бъде използвана от патогени, за да избегнат убиквитин-медиираното разпознаване, както се вижда за SPN серотип 19F. Въпреки това, запазената природа на дегроновия мотив в BgaA в повечето SPN серотипове може да подсказва за контрастратегия, възприета от бактериите, за да бъде по-малко смъртоносна за гостоприемника.

Това би могло да даде възможност на патогена да увеличи обитаемите си местообитания. Едновременно с това, убиквитинирането на бактериалната повърхност или секретираните протеини в дегроновия мотив може да ги модулира функционално, за да потисне или пренасочи реакцията на гостоприемника за евентуална полза (43). Следователно, присъствието или отсъствието на подобни на еукариоти функционални домени или мотиви (като дегрони) може да зависи от патогенна ниша и да е адаптирано да избягва или модулира имунните отговори на гостоприемника.

Подобен механизъм за отчитане на патогени, включващ гуанилат-свързващи протеини, също е замесен в бактериалния клирънс; въпреки това, за разлика от убиквитинирането, се съобщава, че тяхната роля е ограничена до Грам-отрицателни патогени (44–47). Убиквитинирането е насочено към патогена, независимо от произхода на Gram, например документирано е, че RNF213 е насочен към Listeria spp. независимо от липсата на LPS (48). Следователно ние не елиминираме възможността за неговото антимикробно действие и срещу SPN.

Патогенна повърхност може да бъде убиквитинирана с множество верижни типове чрез различни Е3 лигази с междуверижни взаимодействия (41). По-специално, в случая на Mtb, Smurf1 и Parkin е доказано, че образуват типове вериги K48 и K63, които функционират синергично за разграждане на патогена (12). Разбирането на механистичната роля на убиквитинирането на K48 и Е3 лигазите, участващи по време на сценарии на инфекция, все още е недостатъчно проучено. В случая на STm, единична E3 лигаза ARIH1 е изобразена за насочване към цитозолния STm с K48 убиквитинови вериги, което води до тяхното елиминиране от системата (15). Въз основа на нашите и на други открития, K48-Ub-белязаните патогени се разграждат най-накрая, докато се свързват с протеазомни машини.

Това изследване обаче показва K48-Ub декорация на специфични бактериални повърхностни протеини. Известно е, че някои патогени активно модифицират своите повърхностни протеини, като ги предпазват от убиквитиниране и последващо убиване, като по този начин подчертават значението на повърхностната локализация на убиквитиновия субстрат (10). В допълнение, множество задължителни вътреклетъчни патогени са развили стратегии за де-убиквитиниране или приемане на регулаторни компоненти, за да избегнат медиираното от убиквитин изчистване (5). Заедно тези констатации подчертават значението на убиквитин-медиираната алармена възбуда като основен вътреклетъчен патогенен сензорен механизъм, който е централен за защитата на гостоприемника.

Нашето проучване допълнително демонстрира централната роля на SCF E3 лигаза, особено с FBXW7, в бактериалното убиквитиниране, увеличаващо разграждането на патогена. Хетерозиготни мутации във FBXW7, по-специално вариант R505C (критичен остатък в джоба за разпознаване на субстрат), предизвикват множество карциноми и лимфоцитна левкемия при хора (49, 50). Скорошно кохортно проучване показва, че почти 43 процента от пациентите с хронична лимфоцитна левкемия (CLL) се поддават на бактериална пневмония и сепсис, последвани от гъбични инфекции (51).

Това потвърждава нашето наблюдение на отменената способност на клетките гостоприемници, носещи FBXW7 мутация, да усещат и елиминират патогени. Следователно нашите открития предоставят неочаквано молекулярно обяснение на повишения риск от инфекции при пациенти с CLL. Връзката между генетичния полиморфизъм в гените на E3 лигазите и чувствителността към бактериални инфекции също се потвърждава от пациенти с болестта на Паркинсон, които са уязвими към коремен тиф или проказа (14), което предполага забележителния принос на E3 лигазите в имунитета на гостоприемника срещу бактериални инфекции и поддържането на клетъчно стационарно състояние.

В заключение, ние дешифрирахме универсален език на усещане на патогени, живеещи в цитозола, който може да бъде ефективно приложен от гостоприемника за разпознаване на микроорганизми за последващо елиминиране. Взети заедно, тези открития хвърлят светлина върху разбирането на елементарните клетъчни имунни процеси, които могат да бъдат използвани за засилване на антибактериалния имунитет.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Клетъчна култура

И двете клетъчни линии на човешки белодробен алвеоларен карцином (тип II пневмоцити) A549 [Американска колекция от типови култури (ATCC) no. CCL185)] и цервикалната аденокарциномна клетъчна линия HeLa (ATCC № CRM-CCL-2) бяха култивирани в модифицирана среда на Dulbecco Eagle (DMEM; HiMedia), допълнена с 10 процента фетален говежди серум (Gibco) при 37 градуса и 5 процент CO2.

Бактериални щамове и условия на растеж

SPN (R6, серотип 2, подарък от Tim J. Mitchell, Университет на Бирмингам, Обединеното кралство) се отглежда в бульон Todd-Hewitt, допълнен с 1,5 процента екстракт от дрожди при 37 градуса в 5 процента CO2. Следните антибиотици са използвани за отглеждане на SPN култури, когато е необходимо: канамицин (200 ug/ml), спектиномицин (100 ug/ml) и хлорамфеникол (4,5 ug/ml). Деветстотин микролитра от 0,4 OD600 (оптична плътност при 600 nm) отглеждана SPN култура се смесват с 600 ul 80 процента стерилен глицерол (32 процента крайна концентрация на глицерол) и се съхраняват в -80 градуса дълбоко фризер. Тези запаси от глицерол бяха използвани като начален инокулум за всички експерименти.

Escherichia coli DH5 и STm (ATCC 14028) култури се отглеждат в бульон Luria-Bertani (LB) при 37 градуса при условия на разклащане (200 rpm) и когато е необходимо, се използват следните антибиотици: канамицин (50 ug/ml), спектиномицин (100 ug/ml), хлорамфеникол (20 ug/ml) и ампицилин (100 ug/ml). За всички анализи на инфекция, бактериите се отглеждат до OD600 ~0,4, последвано от ресуспендиране във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) до подобна плътност преди инфектиране на клетките гостоприемници.

Скрининг на предполагаеми целеви протеини на убиквитин

Всички повърхностни протеини, присъстващи в STm и SPN протеома, бяха идентифицирани за първи път от публикувана литература. Пълните протеинови последователности на повърхностните протеини бяха получени от UniProt, които след това бяха използвани за идентифициране на наличието на дегронови мотиви. Набор от 29 предполагаеми дегронови мотива бяха подбрани от публикувана литература (24, 52, 53) и базата данни за еукариотни линейни мотиви. Модулът regex на Python беше използван за идентифициране на местоположението на всички такива курирани мотиви в повърхностните протеинови последователности. По-нататък беше извършено линейно търсене, за да се идентифицира наличието на лизинов остатък в близост (8 до 14 аминокиселинни остатъка) до всеки идентифициран дегронов мотив. Предполага се, че този лизинов остатък действа като място за свързване на убиквитиновата част. И накрая, избраните протеинови последователности бяха въведени в IUPred (54), инструмент за предсказване на протеинова структура, за да се локализира наличието на неподредена област между дегроновия мотив и проксималния лизин. Получените протеини (BgaA и PspA за SPN и RlpA за STm) бяха избрани за оценка като цели за убиквитиниране и декодиране на тяхната роля в изчистването на патогена.

Конструкция на бактериален щам

Алелен обмен чрез хомоложна рекомбинация беше извършен с помощта на генни фланкиращи области, носещи вмъкната антибиотична касета за генериране на мутантни щамове както в SPN, така и в STm (таблица S2).

За SPN, 500-bp области нагоре и надолу по веригата на bgaA, pspA и неговите гени бяха амплифицирани от генома с подходящи праймери (таблица S3) и сглобени в pBKS вектора. След клонирането на тези фрагменти, антибиотична резистентна касета (спектиномицин за bag, както и pspA и хлорамфеникол за hysA) беше вмъкната в този конструкт. След това линеаризираните рекомбинантни плазмиди се трансформират в WT SPN, като се използва пептид 1, стимулиращ компетентността (GenPro Biotech), рекомбинантите се избират, използвайки съответните антибиотици, и заместването на гена се потвърждава чрез полимеразна верижна реакция (PCR) и секвениране на съответните генни локуси. За STm, методът на λ-червената рекомбиназа беше използван за генериране на мутанти с генна делеция (55).

Накратко, последователности, хомоложни на краищата на гена на въжето, бяха добавени в последователностите на праймера, които се използват за амплификация на касетата с резистентност към канамицин. След това касетата беше електропорирана в WT STm щама и нокаутите, генерирани от хомоложна рекомбинация, бяха избрани на базата на резистентност към канамицин. Генната делеция се потвърждава с помощта на PCR и секвениране на генния локус. Пълна дължина pspA, hysA и съкратен bgaA-T (1 до 3168 bp) бяха клонирани под Р23 промотора в совалковия вектор pIB166 (56) и използвани за допълване.

These recombinant plasmids were also used for site-directed mutagenesis to generate different variants of bgaA-T (bgaA-TK96R, bgaA-TK97R, bgaA-TK96R, K97R, and bgaATΔDegron), pspA (pspAK314R, pspAK315R, pspAK314R, K315R, and pspAΔDegron ), и неговия (hysADegron-BgaA и hysADegron-PspA), използвайки подходящи комплекти праймери (таблица S3) и трансформирани в ΔbgaA и ΔpspA мутанти. Всички клонове бяха проверени чрез ДНК секвениране. Експресията на различни варианти на BgaA, PspA и HysA се потвърждава чрез Western blot, като се използват подходящи антитела.

Антитела и реагенти

Анти-енолаза и анти-PspA серум (S. Hammerschmidt, Университет на Грайфсвалд, Германия); анти-BgaA серум (S. King, Държавен университет в Охайо, САЩ); и антитела, специфични за His6 (Invitrogen, MA1-21315), K48-Ub връзка (Millipore, 05-1307), K63-Ub връзка (Millipore, 14-6077-80 ), Ply (Santa Cruz Biotechnology, sc-80500), FBXW7 (Bethyl Laboratories, A301-721A), SKP1 (Invitrogen, MA5-15928), Cullin1 (Invitrogen, {{15} }), глицералдехид фосфат дехидрогеназа (Millipore, MAB374), GSK3 [Технология за клетъчно сигнализиране (CST), D5C5Z], фосфотреонин (CST, 9381S), IgA, Kappa от миши миелом, клонинг TEPC-15 (Sigma-Aldrich, M1421) и PSMB7 (Invitrogen, PA5-111404) бяха осигурени. Бяха използвани следните вторични антитела: маркирани с пероксидаза от хрян (HRP) анти-заешки (BioLegend, 406401), маркирани с HRP анти-миши (BioLegend 405306), анти-заешки Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A27206), анти-заешки Alexa Fluor 555 (Invitrogen, A31572), биотин-конюгиран анти-миши имуноглобулин А (Life Technologies, M31115), анти-миши Alexa Fluor (Invitrogen, A31570), анти-миши Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A21202), анти-кози Alexa Fluor 633 (Invitrogen, A21082) и FM4-64 (Thermo Fisher Scientific, T13320).

Експресия и пречистване на протеини

BgaA-T и неговите варианти бяха клонирани в pET28, използвайки Xba I/Not I рестрикционни сайтове. Рекомбинантни плазмиди, кодиращи BgaA-T с N-краен His-tag, се трансформират в Е. coli BL21 (DE3) клетки за протеинова експресия. Прясно трансформираните колонии се отглеждат в LB, съдържащ канамицин (50 ug/ml) при 37 градуса в шейкър инкубатор за 12 часа. Един процент от първичната култура се добавя към 1 литър LB бульон и се инкубира при 37 градуса в шейкър инкубатор, докато OD600nm достигне между 0,6 и 0,8. Експресията на протеин се индуцира чрез добавяне на 100 μM изопропил- -D-тиогалактопиранозид (IPTG) и допълнително отглеждане на културата при 37 градуса за 5 до 6 часа с разбъркване при 150 rpm.

Клетките бяха събрани чрез центрофугиране при 6000 rpm за 10 минути при 4 градуса. Клетъчната пелета се ресуспендира в буфер А [25 mM tris (рН 8.0) и 300 mM NaCl] и се лизира чрез ултразвук. Клетъчните остатъци се отделят чрез центрофугиране (14,000 rpm, 50 минути, 4 градуса) и супернатантата се нанася върху Ni-NTA колона, уравновесена с буфер А. Колоната се промива с 10 колонни обема буфер A и His-белязаните протеини се елуират с имидазол (250 тМ) в буфер А. Всички варианти на BgaA-T се експресират и пречистват, като се използва същата процедура. FBXW7 беше субклониран във вектора pGEX-4 T-1, имащ маркер на N-терминална глутатион S-трансфераза (GST) от вектора pCMV6-Entry-FBXW7, използвайки рестрикционния ензим Eco RI.

GST-маркиран FBXW7 се експресира в клетки на Е. coli BL21 (DE3) след индуциране на протеинова експресия с 0.1 mM IPTG и растеж при 30 градуса за 4 часа. GST-FBXW7 от суров екстракт от Е. coli се пречиства с помощта на колонна хроматография с глутатион-сефароза (GE HealthCare). Фракциите, съдържащи пречистени протеини, бяха обединени и концентрирани до 0,5 mg/ml с помощта на 10-kDa филтър за прекъсване на молекулното тегло (Amicon) чрез центрофугиране при 4700 rpm при 4 градуса. Чистотата на протеините се проверява чрез SDS-полиакриламидна гел електрофореза (SDS-PAGE), последвана от оцветяване с Coomassie blue.

Трансфекции на клетка гостоприемник

BgaA-T беше клониран в доксициклин-индуцируем вектор pAK_Tol2_TRE_Blast (Addgene no. 130261) с помощта на комплект за клониране чрез инфузия (Takara). Положителен клонинг беше потвърден чрез секвениране на Sanger. Мутацията на FBXW7R505C беше извършена чрез сайт-насочена мутагенеза, използвайки pMRX-GFP-FBXW7 като шаблон и потвърдена чрез секвениране на Sanger. Всички трансфекции се извършват с помощта на реагент Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) и селекциите се извършват в присъствието на бластицидин хидрохлорид (2 ug/ml; HiMedia).

siRNA-насочен ген нокдаун

За медиирано от РНК интерференция нокдаун на специфични гени бяха използвани следните siPHK: siFBW7 (Dharmacon ON-TARGET SMARTpool L-004246-00-0005), siCullin1 (Qiagen, 1027423), siSKP1 (Qiagen, SI00301819) и siGSK3 (Dharmacon ONTARGET SMARTpool L-003010-00-0005). Накратко, A549 клетки, отгледани в 24-плака с ямки, бяха временно трансфектирани с генно-специфични siPHKs или scramble (siControl) (150 pmol), използвайки Lipofectamine 3000 съгласно инструкциите на производителя. Тридесет и шест часа след трансфекцията клетките бяха обработени за Western blotting и имунофлуоресценция или тестове за защита на пеницилин-гентамицин.

Прогнозиране и моделиране на структурата

Всички структури бяха предвидени от AlphaFold (Protein Homology/analogy Recognition Engine V 2.0) (57) и визуализирани с помощта на PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, версия 2.0 Schrödinger, LLC). Структурите бяха цветно кодирани в PyMol въз основа на IUPred (54) резултати, вариращи от подредени (сини) до неподредени (червени) до бели.

Западно попиване

SPN култури, отгледани до {{0}}.4 OD600nm, бяха лизирани чрез обработка с ултразвук и суровите екстракти бяха събрани след центрофугиране (15,000 rpm, 30 минути, 4 градуса). За A549s, монослоевете се промиват няколко пъти с PBS и се лизират в ледено студен буфер за радиоимунопреципитационен анализ (RIPA) [50 mM tris-Cl (рН 7,89), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% натрий деоксихолат и 1 процент SDS], съдържащ протеазен инхибиторен коктейл (Promega), натриев флуорид (10 mM) и EDTA (5 mM). Клетъчната суспензия се обработва за кратко с ултразвук и се центрофугира за събиране на клетъчни лизати. Протеините, присъстващи в бактериални или А549 клетъчни лизати (10 или 20 ug) се разделят на 12 процента SDS-PAGE гелове и се прехвърлят към активирана поливинилиден дифлуоридна мембрана. След блокиране в 5 процента обезмаслено мляко, мембраните се изследват с подходящи първични и HRP-маркирани вторични антитела. Накрая блотовете бяха разработени с помощта на подобрен хемилуминесцентен субстрат (Bio-Rad).
Тест за защита на пеницилин-гентамицин

SPN щамове, отгледани до OD600nm 0.4 в Todd-Hewitt бульон, допълнен с 0.2 процента екстракт от дрожди (THY), бяха пелетирани, ресуспендирани в PBS ( рН 7,4) и се разрежда в среда за анализ за инфекция на монослоеве А549 с множественост на инфекцията (MOI) 10. След 1 час от заразяването, монослоевете се промиват с DMEM и се инкубират с среда за анализ, съдържаща пеницилин (10 ug/ml ) и гентамицин (400 ug/ml) в продължение на 2 часа за унищожаване на извънклетъчния SPN. След това клетките се лизират с 0,025 процента Triton X-100 и лизатът се поставя върху агарови плочи с мозъчно-сърдечна инфузия, за да се изброят жизнеспособните SPN. Процентът на инвазия се изчислява като [образуващи колонии единици (CFU) в лизата/CFU, използвани за инфекция] × 100. За да се оцени вътреклетъчното оцеляване, 9 часа след инфекцията (от началото на лечението с пеницилин-гентамицин), клетъчните лизати се приготвят като споменати по-горе, и бяха изброени разпръснати плочки и оцелели бактерии. Ефективността на оцеляване (процент) беше представена като кратна промяна в процента на оцеляване спрямо контролата в посочената времева точка (нормализирана до 0 часа).

Имунофлуоресценция

За имунофлуоресцентен анализ, A549 или HeLa клетки се отглеждат върху стъклени покривни стъкла и се заразяват със SPN или STm щамове при MOI ~25 за 1 час, последвано от антибиотично лечение за 2 часа. В желаните времеви точки след инфекцията (9 часа за SPN инфекция в A549s и 3 часа за инфекция със STm в HeLa), клетките се промиват с DMEM и се фиксират с ледено охладен метанол при -20 градуса за 10 минути. Освен това, покривните стъкла се блокират с 3 процента говежди серумен албумин (BSA) в PBS за 2 часа при стайна температура (RT). След това клетките се третират с подходящо първично антитяло в 1% BSA в PBS за една нощ при 4 градуса, промиват се с PBS и се инкубират с подходящо вторично антитяло в 1% BSA в PBS за 1 час при RT. Накрая, покривните стъкла се промиват с PBS и се монтират върху предметни стъкла заедно с VECTASHIELD със или без 4',6-диамидино-2-фенилиндол (Vector Laboratories) за визуализация с помощта на лазерно сканиращ конфокален микроскоп (LSM 780, Carl Zeiss ) под 40× или 63× маслени обективи. Изображенията бяха получени след оптично разделяне и след това обработени с помощта на софтуер ZEN lite (версия 5.0). Микроскопията със свръхразделителна способност беше извършена по подобен начин с помощта на Elyra 7 (Carl Zeiss) в режим SIM. За анализ на колокализация, бактериите се оценяват чрез визуално преброяване на n > 100 бактерии на реплика.

Трансмисионна електронна микроскопия

След заразяване със SPN и STm, клетките се промиват с {{0}}.1 М натриев какодилатен буфер, фиксиран с 2,5 процента глутаралдехид (Sigma-Aldrich) в 0.1 М натриев какодилатен буфер ( Sigma-Aldrich) за 3 часа при 4 градуса. След фиксиране клетките се събират през клетъчен скрепер и се пелетират при 2000 rpm за 10 минути. След това клетките се промиват с 0.1 М натриев какодилатен буфер и се фиксират с 1 процент осмиев тетроксид в 0.1 М натриев какодилатен буфер за 20 минути при 4 градуса. След последващи промивания с какодилатен буфер и дестилирана вода, клетките бяха дехидратирани в нарастващи концентрации на етанол (50, 70, 95 и 100 процента) и пропилей оксид за 30 минути и накрая вградени в епоксидна смола (Electron Microscopy Sciences, 14300) от полимеризация при 75 градуса за 45 минути. След това капсулите се прехвърлят в пещ при 95 градуса за 45 минути. Ултратънките срезове (70 nm) се изрязват с помощта на диамантен нож на Leica EM UC7 Ultramicrotome и се оцветяват с 2 процента уранил ацетат и 1 процента оловен цитрат и се разглеждат с помощта на трансмисионен електронен микроскоп (Talos L120 C, Thermo Fisher Scientific) при 120 KV.

Ex vivo убиквитиниране

A549-експресиращ BgaA-T и неговите варианти бяха третирани с MG132 (5 μM) и протеиновите експресии бяха индуцирани с доксициклин (100 ug/ml) за 24 часа. След това клетките се лизират в RIPA буфер и пробите се подлагат на електрофореза чрез SDS-PAGE (8 процента). Потвърждението на протеиновата експресия и убиквитинирането на BgaA-T и неговите варианти бяха доказани чрез Western blot след сондиране съответно с анти-BgaA и анти-K48-Ub антитела.

Ин витро убиквитиниране

За in vitro анализи на убиквитиниране, рекомбинантните протеини се пречистват, както е описано по-рано (58). SCFFBW7 E3 лигазният комплекс се инкубира с рекомбинантен 0.1 mM E1 (UBE1; Boston Biochem), 0.25 mM E2 (cdc34; Boston Biochem) и убиквитин (2.5 ug/ml; Boston Biochem) в присъствието на пречистен BgaA-T и неговите варианти. Реакциите на убиквитилиране се провеждат в буфер за анализ [50 mM tris (pH 8), 5 mM MgCl2, 5 mM аденозин трифосфат (ATP), 1 mM -меркаптоетанол и 0,1 процента Tween 20] за 2 часа при 25 градуса . Реакциите бяха спрени с 5 × Laemmli буфер, разтворени върху SDS-PAGE гелове и анализирани чрез имуноблотинг, използвайки анти-BgaA антитяло.

In vitro киназен анализ

За извършване на in vitro киназен анализ се използва GSK3 киназна ензимна система (Promega) съгласно протокола на производителя със следните модификации. Накратко, 3 ug рекомбинантен BgaA-T се добавя към 0.5 ug активен GSK3 с 400 μM ATP в реакционен буфер, съставен от 40 mM tris, (рН 7,5), 20 mM MgCl2 , BSA (0,1 mg/ml) и 50 μM дитиотреитол. Реакцията се инкубира в продължение на 2 часа при 30 градуса и се спира чрез добавяне на 1 × Laemmli буфер. След това пробите бяха сварени и подложени на електрофореза за Western blotting, както беше споменато по-горе. Фосфорилиран BgaA-T се открива с анти-фосфотреониново антитяло.

In vivo модел

All animal experiments were performed at the University of Liverpool in strict accordance with U.K. Home Office guidelines, under project license PP2072053, following approval from local animal welfare and ethics committees. For infection studies, 7- to 8-week female CD1 mice were purchased from Charles River Laboratories, United Kingdom, and allowed to acclimatize for 7 days before use. Briefly, mice were placed into a restraint tube, and S. pneumoniae was administered by intravenous injection into the tail vein (1 × 106 CFU in 100 μl of PBS). Mice were periodically scored for clinical signs of disease and culled when they showed signs of advanced pneumococcal disease or else at predetermined times after infection. Severity endpoints were defined as one or more of the following: substantially elevated or reduced respiratory rate, substantial reduction in natural behavior or moderate reduction in provoked behavior, loss of >20 процента начално телесно тегло и изразен назален или очен секрет. Кръвни проби бяха получени чрез сърдечна пункция при терминална анестезия и далаците бяха изрязани след смъртта за изброяване на бактерии. Тъканните проби бяха обработени с ръчен тъканен хомогенизатор и хомогенатите бяха серийно разредени в PBS преди нанасяне върху плочки с кръвен агар. Плаките се инкубират една нощ при 37 градуса, 5 процента CO2 и броят на бактериалните колонии се оценява на следващия ден.

Статистически анализ

GraphPad Prism версия 5 беше използвана за статистически анализ. Статистическите тестове, предприети за отделни експерименти, са споменати в съответните легенди на фигурите. P < 0.05 се счита за статистически значимо. Данните бяха тествани за нормалност и за определяне на дисперсията на всяка тествана група. Всички многопараметрични анализи включват корекции за множество сравнения и данните са представени като средни стойности ± SD, освен ако не е посочено друго.

ЛИТЕРАТУРА И БЕЛЕЖКИ

ME Bianchi, DAMPs, PAMPs и alarmins: Всичко, което трябва да знаем за опасността. J. Leukoc. Biol. 81, 1–5 (2007).

2. TH Mogensen, Разпознаване на патогени и възпалително сигнализиране при вродена имунна защита. Clin. Microbiol. Rev. 22, 240–273 (2009).

3. K. Ray, B. Marteyn, PJ Sansonetti, CM Tang, Животът отвътре: Вътреклетъчният начин на живот на цитозолните бактерии. Нац. Rev. Microbiol. 7, 333–340 (2009).

4. X. Jiang, ZJ Chen, Ролята на убиквитилацията в имунната защита и избягването на патогени. Нац. Rev. Immunol. 12, 35–48 (2011).

5. V. Vozandychova, P. Stojkova, K. Hercik, P. Rehulka, J. Stulik, Системата за убиквитиниране в рамките на бактериалните взаимодействия гостоприемник-патоген. Микроорганизми 9, 638 (2021).

6. E. Fiskin, T. Bionda, I. Dikic, C. Behrends, Глобален анализ на гостоприемник и бактериален убиквитином в отговор на инфекция със Salmonella typhimurium. Mol. Клетка 62, 967–981 (2016).

7. Q. Chai, X. Wang, L. Qiang, Y. Zhang, P. Ge, Z. Lu, Y. Zhong, B. Li, J. Wang, L. Zhang, D. Zhou, W. Li, W. Dong, Y. Pang, GF Gao, CH Liu, Повърхностният протеин на mycobacterium tuberculosis набира убиквитин, за да предизвика ксенофагия на гостоприемника. Нац. Общ. 10, 1973 (2019).

8. EG Otten, E. Werner, A. Crespillo-Casado, KB Boyle, V. Dharamdasani, C. Pathe, B. Santhanam, F. Randow, Убиквитилация на липополизахарид от RNF213 по време на бактериална инфекция. Nature 594, 111–116 (2021).

9. A. Yamada, M. Hikichi, T. Nozawa, I. Nakagawa, FBXO2/SCF убиквитин лигазен комплекс насочва ксенофагията чрез разпознаване на бактериален повърхностен гликан. EMBO Rep. 22, e52584 (2021).

10. P. Engstrom, TP Burke, CJ Tran, AT Iavarone, MD Welch, Метилирането на лизин предпазва вътреклетъчния патоген от убиквитилация и автофагия. Sci. адв. 7, eabg2517 (2021).

11. J. Celli, LRSAM1, Е3 убиквитин лигаза със сензор за бактерии. Микроб клетъчен гостоприемник 12, 735–736 (2012).

12. LH Franco, VR Nair, CR Scharn, RJ Xavier, JR Torrealba, MU Shiloh, B. Levine, Убиквитиновата лигаза Smurf1 функционира при селективна аутофагия на mycobacterium tuberculosis и противотуберкулозна защита на гостоприемника. Клетъчен гостоприемник микроб 21, 59–72 (2017).

13. J. Noad, A. von der Malsburg, C. Pathe, MA Michel, D. Komander, F. Randow, Синтезираните от LUBAC линейни убиквитинови вериги ограничават цитозол-инвазиращите бактерии чрез активиране на автофагия и NF-κB. Нац. Microbiol. 2, 17063 (2017).

14. PS Manzanillo, JS Ayres, RO Watson, AC Collins, G. Souza, CS Rae, DS Schneider, K. Nakamura, MU Shiloh, JS Cox, Убиквитин лигаза паркин медиира резистентност към вътреклетъчни патогени. Nature 501, 512–516 (2013).

15. M. Polajnar, MS Dietz, M. Heilemann, C. Behrends, Разширяване на машината за убиквитилация на клетката гостоприемник, насочена към цитозолна Salmonella. EMBO Rep. 18, 1572–1585 (2017).

For more information:1950477648nn@gmail.com