Екстракт от клетъчни култури на Oenothera Biennis, надарен с действие против стареене на кожата, подобрява механичните свойства на клетките

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

Резюме:Стареенето на кожата е много добре познат процес, определящ постепенно влошаване на механичните характеристики на кожата поради спад в производството на механизма на извънклетъчната матрица и съпътстваща промяна в процеса на свиване. За да се забави тази прогресия, от решаващо значение е да се индуцира експресията на няколко протеина, способни да насърчат образуването на еластични влакна и възстановяването на тъканите. Тук водният екстракт от клетъчна култура на Oenothera bi-Ennis е изследван от химическа гледна точка и след това е тестван in vitro, в клетките и в експерименти ex vivo като адювант за противодействие на стареенето на кожата. Съответно, той е бил показва, че екстрактът от Oenothera biennis е в състояние, чрез увеличаване на експресията на MYLK ген, да насърчи свиването на матриксния колаген, полимеризацията на актин и производството на основни ECM протеини.

Ключови думи:метаболомика; молекулярни мрежи; хидрофилен екстракт от клетъчни култури на Oenothera biennis; свиване на матричен колаген; стареене на кожата

1. Въведение

Стареенето на кожата е много добре познат процес, предизвикан от ендогенни и екзогенни фактори. По време на стареенето всички кожни физиологични функции неумолимо се дегенерират и това прогресивно влошаване уврежда кожата [1]. В действителност, кожата постепенно губи своите механични характеристики, дължащи се както на спад в производството на протеини на извънклетъчната матрица, така и на съпътстващата промяна в процеса на свиване [2]. Най-важните компоненти на извънклетъчния матрикс на дермата са протеини като колаген I и IIl, ламинин, периостин, тенасцин, еластин, фибронектин и протеогликани, тъй като тяхното относително количество и състояние на сгъване играят ключова роля във взаимодействието между клетките и матрица, гарантираща правилната текстура на дермата [3]. Например, в извънклетъчното пространство, фибронектинът играе ключова роля в сглобяването на матрицата, тъй като образува мост между рецепторите на клетъчната повърхност (напр. интегрини) и колагена, протеогликаните и други фокални адхезионни молекули. Ламинините допринасят за структурата на извънклетъчния матрикс и модулират адхезията, диференциацията, миграцията, стабилността на фенотипа и устойчивостта към апоптоза. Еластинът също е важен за клетъчната адхезия и клетъчната миграция и има способността да участва в клетъчното сигнализиране. Фибрилините по подобен начин взаимодействат тясно с тропоеластин и интегрини и те са важни за сглобяването на еластините в еластични влакна. Fabulous е тясно свързан с базалните мембрани, еластичните влакна и други компоненти на извънклетъчния матрикс и участва в образуването на еластични влакна. Тенасцините са полиморфни гликопротеини на екстрацелуларния матрикс (ECM), които медиират фиброзните процеси, за да позволят ефективно възстановяване на тъканите [4] Освен това процесът на свиване на кожата също се основава на действието на фибробластите, най-разпространените клетки в дермалния матрикс; те създават правилното напрежение на кожата, подпомагайки контактите между компонентите на матрицата, които от своя страна са отговорни за компактността, плътността и устойчивостта на дермата. В основата на организацията на клетъчния им цитоскелет стои актин-миозиновият механизъм, който определя потенциалните промени във формата и структурата им. Наистина, свързването на актин и миозин предизвиква по-компактна клетъчна конформация, сближавайки влакната, гарантирайки развитието на здрава и компактна тъкан и предотвратявайки разпадането на влакната, което води до бръчки. Въпреки това, способността на фибробластите да се свиват и разтягат е частично загубена с годините, тъй като остарелите клетки вече не са в състояние да действат правилно и напълно. Поради по-ниската механична сила, фибробластите преминават към по-заоблена и изкривена морфология от удължената [5]. Някои доказателства сочат, че по време на стареенето синтезът на протеин, наречен MYLK (киназа на леката верига на миозин), намалява значително. MYLK притежава киназна активност, упражнявана от фосфорилирането на специфичен миозинов домен, наречен миозинова регулаторна лека верига, способна да индуцира актин-свързване и следователно да насърчава клетъчния контрактилитет [6].биофлавоноидиКогато беше открита ниска активност на този протеин, дължаща се например на по-слаба протеинова експресия, беше измерено съответното намаляване на свиването на матриксния колаген [7] и полимеризацията на актин [8]. Сглобяването на цитоскелета на актин е свързано не само с движението на клетките и способността им да се свиват, но и с производството на ECM матричен протеин чрез активирането на TGF-II рецептора (TGFBRII)[9]. TGFBRII принадлежи към рецепторния комплекс TGF-клетъчна повърхност, който чрез активиране на Smad транскрипционни фактори регулира експресията на много гени, кодиращи компоненти на ECM, включително колаген, ламинини, фибронектин и протеогликан [10]. Разглобяването на актиновия цитоскелет понижава TGF-Il рецептора. Тази низходяща регулация от своя страна намалява производството на колаген и други ECM протеини, което води до загуба на дермална маса и крехкост на кожата.

Всъщност много козметични съставки имат за цел да стимулират синтеза на няколко ключови фактора, отговорни за поддържането на правилната компактност на дермалната матрица и добрата контракция на кожата. При този сценарий екстрактите, получени от вида Oenothera biennis (вечерна иглика), принадлежащи към семейство Onagraceae, са от голям интерес поради съдържанието им на биоактивни съединения като мастни киселини, феноли, тритерпени и флавоноиди, които вече са били изследвани. тествани при лечението на различни кожни патологични заболявания [11]. На свой ред се съобщава, че някои от тези метаболити потискат медиаторите на възпалението като интерлевкин 1 (IL-1), интерлевкин 6 (IL-6), цитокини и фактор на туморна некроза (TNF-)[12]. ]. Освен това, екстракти от надземни части на Oenothera biennis защитават HaCaT клетките от H, O,-индуцирано увреждане на ДНК и клетъчна смърт чрез блокиране на клетъчно увреждане, дължащо се на оксидативен стрес чрез механизъм, включващ елиминиране на ROS и Nrf2/HO-1 сигнален път [ 13]. Освен това маслото от Oenothera biennis, което е богато на липиди, е предложено като добър овлажнител за пациенти с екзема, благодарение на способността му лесно да прониква в кожата [14]. За съжаление, екстрактите от култивирани растения, използвани в козметиката, могат да включват някои недостатъци: първо, те могат да бъдат замърсени с токсични или алергенни вещества като пестициди, торове или замърсители; тогава растенията са подложени на непредвидим стрес и сезонни условия или вариации в наличността на хранителни вещества, което може да предизвика синтеза на неочаквани метаболити. Освен това екстрактите могат да съдържат патогенни микроорганизми, които намаляват качеството на крайните продукти. Всички тези недостатъци, от своя страна, се сливат в риска от променливо съдържание на вторични метаболити и ниска възпроизводимост. За да се преодолеят тези слабости, използването на растителни клетъчни култури в козметиката става все по-популярно и много високо ценено, тъй като преодолява много от гореспоменатите недостатъци [15].

Моля, щракнете тук, за да научите повече

В това проучване, хидрофилен екстракт от клетъчни култури на Oenothera biennis (ObHEx) е напълно характеризиран чрез усъвършенствани масспектрометрични подходи, подпомогнати от биоинформатика и тествани в множество биохимични и биологични анализи. Сместа съдържа биоактивни съединения главно лигнани и тритерпени, като арджунолова и азиатска киселина, които преди това са били свързвани с производството на проколаген I в човешки фибробласти [16,17]. Екстрактът е изследван за способността му да повишава експресията на MYLK, да насърчава свиването на матриксния колаген, полимеризацията на актин и производството на TGF-регулирани ECM протеини, които благоприятстват свиването на дермата, като по този начин забавят стареенето на кожата.

2. Резултати

2.1. Качествен и количествен анализ на водоразтворим екстракт от клетъчна култура на Oenothera Biennis

Беше извършен UPLC-MS/MS анализ на ObHEx и бяха използвани спектрометрични данни с висока разделителна способност за химическата характеристика с помощта на Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS), уеб-базирана система за масова спектрометрия, която подпомага идентифицирането и анотирането на природни продукти (NPS)[18]. Тя има за цел да бъде база от знания с отворен достъп за организации в цялата общност и за споделяне на необработени, обработени или анотирани фрагментирани масспектрометрични данни (MS/MS). По-конкретно, бяха извършени търсения в спектрални библиотеки на GNPS и работа на базирана на характеристики молекулярна мрежа (FBMN): първият анализ ни позволи да идентифицираме естествени съединения, сравнявайки техните MS/MS спектри с тези на структурно характеризирани метаболити, вторият - с свързани с групата NPs в рамките на мрежа, тъй като подобни модели на фрагментация на MS/MS бяха показани от структурно подобни молекули [19]. Както е показано на фигура 1 и таблица 1, много NPS несъмнено са идентифицирани като принадлежащи към няколко класа вторични метаболити, главно лигнани (салвадор и лириодендрон) и тритерпени (муриатична киселина, ариунолова киселина, азиатска киселина и хедерагенин). Химическите видове, които не са идентифицирани от GNPS, са определени в съответствие с литературата.

Като пример за използване на GNPS, мрежата, получена от FBMN анализ, е докладвана на Фигура 2а, показваща, че ObHEx съдържа много други нехарактеризирани тритерпени, свързани с муриатната киселина (18, m/z 503.3389, RT 21.89 минути: идентификацията на солена киселина е е потвърдено чрез сравнение с неговия аналитичен стандарт). Например, различни преди това нехарактеризирани видове при m/z 701 и 665 бяха идентифицирани като гликозилирани форми, свързани с муриатната киселина или нейните изомери, съответно хидратирани или не с две молекули на H O

Освен това, съобщените йони при m/z 729, 703, 699,687,685, 683, получени съответно от гликозилирането плюс две молекули на Н, О от видовете при m/z531, 505,501, 489,487 и 485: тяхната еднозначна идентификация не е постигната, но Предполага се, че всички те са тритерпени, свързани с солена киселина или нейни конгенери, поради техния път на фрагментиране на MSMS. Наскоро много тритерпени с m/ 501 и 485 бяха изолирани от друг вид Oenothera, Oenothera Maritima, и тяхната структура е е изяснен на базата на спектроскопски данни, като по този начин корелира добре с нашите резултати [20].

Cistanche може да спре стареенето

FBMN анализът също предостави информация за метаболитите при m/z 617.3862 (MS2 йони при m/z 453, 145 и 119), присъстващи в молекулярни мрежи, показани на Фигура 2b и не докладвани в литературата за видовете Oenothera. Тази стойност на m/z и нейната фрагментация съвпадат с 2-OEp-кумароил апостоловата киселина или нейните изомери, доказвайки най-малкото наличието на тритерпенов кумароил, а също и кафеоилови естери в екстракта. Наистина, MS-спектрите на видовете при m/z 649 (RT 25.72 и 27.19) показват наличието на йони при m/z 179, 161 и 135 поради разцепването на остатъка от кафеена киселина, докато MS2 спектрите на другите видове отчетени на Фигура 2b при m/z 633 (RT 26.88, 27.20, 28.12 и 28.43), 649 (RT 24.18, 24.65, 24.83) и 661 (RT 30.28) показват йони при m/z 145 и 119, които са характерни за кумароилова част.

After, the content of some identified lignans and triterpenes was determined. Ouantifi-cation methods were validated as reported in Table2. All calibration curves showed good linearity (R>0.9911) в рамките на тестваните диапазони. Освен това границата на откриване (LOD) и границата на количествено определяне (LOO) показват, че използваните методи се отличават с висока чувствителност. Получените резултати от количествения анализ (Таблица 3) показват, че лириодендрон и хедерагенин са основните представени съответно лигнан и тритерпен.

2.3. Анализ на MYLK генна експресия в HDF

Активността на ObHEx беше тествана в HDF върху експресията на гена MYLK, който кодира киназата, отговорна за фосфорилирането на леката верига на миозин (Фигура 3а). Резултатите показват, че лечението с екстракт и при двете концентрации повишава експресията на MYLK гена с около 50 процента, подобно на положителната контрола TGF-.

2.4. Анализ на капацитета на свиване на колагенова матрица

За да оценим активността на ObHEx върху контрактилния капацитет на колагеновите влакна, използвахме HDF, диспергиран в колагенови гел дискове [21]. Както е показано на фигура 3b, екстрактът, при по-ниска концентрация, предизвиква значително увеличаване на свиването на колагеновия диск, което предполага потенциален ефект върху твърдостта на колагена. Лечението с ML7(1-(5-йодонафтален-1-сулфонил)-1H-хексахидро-1,4-диазепин), инхибитор на MYLK, премахна това увеличение, което показва, че както екстрактът, така и TGF- действат чрез MYLK за свиване на колагеновия диск.

2.5. Измерване на нивото на полимеризация на актин

Капацитетът на ObHEx да стимулира полимеризацията на актин беше изследван чрез измерване на нивото на полимеризиран актин в клетките, третирани с екстракта и положителната контрола TGF-, самостоятелно и в присъствието на ML7. Както е показано на Фигура 3c, третирането с двете концентрации на екстрактите води до увеличаване на количеството на полимерния актин с около 50 процента, в сравнение с 33 процента от TGF-.купи цистанчеОтново, предварителната инкубация с ML7com напълно премахна този ефект, което предполага участието на MYLK в полимеризацията на актинови нишки.

2.6. Анализ на пътя на TGF RII/SMAD в HDF

За да проверим дали увеличаването на полимеризацията на актин и свиването на колагена на клетките, третирани с ObHEx, също е свързано с активиране на пътя на сигналната трансдукция, медииран от TGF RII, първо наблюдавахме експресията на гена TGF RII и след това трансфектирахме HDF със SMAD{{ 0}}луциферазен репортерен плазмид и оценява повишаването на луциферазната активност в отговор на третиране с ObHEx. Резултатите, докладвани на Фигура 3d,e, показват, че лечението с ObHEx при 0.002 процента и 0.006 процента повишава експресията на TGF RII по начин, подобен на TGF-, използван като положителна контрола и, успоредно с това, луциферазната активност, свързана със SMAD, се повишава съответно с 80 и 40 процента. Беше получено значително намаляване на сигнала, когато клетките бяха третирани с ML7, което показва също, че тази активност е свързана с MYLK.

2.7. Анализ на про-колаген I, тропоеластин и периостин

Като следствие от активирането на сигналната трансдукция на TGF RII, ние анализирахме синтеза на основните извънклетъчни матрични протеини като проколаген тип I, тропоеластин и периостин в HDF, третиран с ObHEx при 0.002 процента. Както е показано на Фигура 3f, ObHEx повишава производството на посочените протеини съответно с около 98 процента, 75 процента и 51 процента, подобно на положителната контрола TGF-. Измерванията са извършени чрез ELISA анализ, като се използват специфични антитела срещу про-колаген I, тропоеластин и периостин.

2.8. Анализ на MYLK, фосфо-миозин, колаген I и тропоеластин върху кожни експланти Ex-Vivo

Както е показано на Фигура 4a-c, ObHEx предизвиква значително увеличение в производството на MYLK и фосфорилиран миозин в човешки кожни експланти.

Индукцията на колаген I и тропоеластин също бяха анализирани в кожни експланти, предварително третирани с ObHEx и след това третирани с хидрокортизон в продължение на 8 дни, за да се симулира хронологично стареене [22]. Лечението с хидрокортизон намалява количеството на колаген I и тропоеластин с повече от 100 процента, а присъствието на 0,002 процента ObHEx възстановява количеството на тропоеластин с почти 91 процента и на колаген със 120 процента, в сравнение с аскорбат, използван като положителна контрола (Фигура 4d-f). Това предполага потенциален ефект против стареене на ObHEx, особено ефективен за увеличаване на стегнатостта на кожата чрез въздействие върху компонентите на дермалната матрица.

2.9.Атомно-силова микроскопия (АСМ) в кожни експланти

За да съберем повече информация за биомеханичните свойства на кожата, насърчавани от лечението с ObHEx, ние оценихме еластичността, присъщо механично свойство на пробите от кожата по отношение на техните модули на Young [23]. Както е описано в раздел 4, за изчисляване на модула на еластичност, както върху третирани, така и върху нетретирани кожни проби, ние събрахме криви на силата с атомно-силов микроскоп (AFM) и ги напаснахме с модела на Hertz [24,25]. Както е показано на Фигура 5, третирането на пробите от кожата с екстракт има по-ниски стойности на модула на Young в сравнение с нетретирани проби, което предполага подобрение на еластичните свойства на кожата. По-специално, нетретирани кожни проби разкриват средна стойност на модула на Йънг от 0.37±0.15 GPa, докато кожни проби, третирани с ObHEx, показват по-ниска средна стойност от 0.{{11 }}7±0,02 GPA. Стойностите на модула на Йънг на пробите от кожата са в съответствие с литературата [26-28].

3. Дискусия

Растителните клетъчни култури представляват най-обещаващия подход за устойчиво производство на растителни вторични метаболити от търговски интерес, като предлагат непрекъснато снабдяване с материал чрез широкомащабна култура и представляват устойчива и екологична система [29,30]. Екстрактите от растителни клетъчни култури са намерили обещаващи приложения в сектора на здравеопазването и козметиката, тъй като представят някои важни предимства; (i) съдържат метаболити, биосинтезирани в лабораторни условия за контролиран растеж; (i) произлизат от стандартизирани производствени процеси, гарантиращи същите качествени и количествени характеристики на получените видове; (ii) екстрактите не съдържат замърсители като микроорганизми, хербициди, пестициди и фунгициди; (iv) те са независими от географски или екологични колебания и растителните видове могат да бъдат запазени за бъдещето поколения. В това състезание воден екстракт от клетъчна култура на Oenothera biennis (ObHEx) беше изследван като обещаващ източник на биоактивни молекули, надарени с действие против стареене на кожата. Наистина, ObHEx е изследван чрез UPLC-MSMS анализи с висока разделителна способност, съчетани с биоинформатични подходи за постигане на широка структурна характеристика. Характеризирането на съединението е реализирано главно чрез използване на GNPS за ускоряване на процеса на идентификация, сравняване на MS/MS спектрите с тези на структурно характеризирани метаболити и, освен това, разкриване на нови неочаквани видове, групиране на подобни NP в мрежа. Освен това времето на задържане, точните измервания на масата и MS2 анализите също бяха сравнени с тези на стандартите и всички данни бяха съпоставени с литературата. Бяха идентифицирани биоактивни лигнани и тритерпени, като Salvador aside, liriodendron, my-anthemic acid, arjunolic acid, Asiatic acid и hederagenin. Лириодендрон [31] и солена киселина [32] показват силна антиоксидантна активност, докато хедерагенинът показва свойства против стареене на кожата поради намаляване на клетъчното окисление и активиране на протеазомната функция [33]. Арджуноловата и азиатската киселина обаче се считат за основно отговорни за някои от следните тествани дейности, тъй като те стимулират синтеза на колаген I. В действителност беше доказано, че ObHEx подобрява биомеханичните свойства на кожата, които зависят най-вече от относителното количество на различните компоненти на ЕСМ и от това как фибробластите са способни да се свиват и да осигуряват правилното напрежение на дермалните влакна.цистанчВсъщност ObHEx насърчава свиването на колагеновата матрица и полимеризацията на актина чрез увеличаване на експресията на MYLK гена, засилвайки силата на свиване на дермалните фибробласти. Сглобяването на актиновия цитоскелет повишава TGF-тип II рецептора и, в съответствие със стимулирането на TGF-/Smad сигнализацията, повишава нивата на TGF-регулирани ECM протеини. Наистина, ObHEx индуцира производството на колаген тип I, периостин и тропоеластин. Следователно всички тези свойства го правят добър обещаващ кандидат съставка за използване в козметични формули за борба със свързаната с възрастта загуба на стегнатост и еластичност на кожата. Това предположение беше подкрепено от резултатите, получени в AFM анализа, който показа, че третирането на кожни срезове с ObHEx води до подобрение на механичните свойства на кожата, установено като намаляване на модула на Young, което показва значително намаляване на твърдостта и твърдостта на кожата.

4. Материали и методи

4.1. Култури от растителна тъкан и приготвяне на екстракт

Растенията Oenothera biennis бяха предоставени от GEEL Floricultura ss и бяха с италиански произход (избягвайки прилагането на протокола от Нагоя). Клетъчни култури бяха получени от листа на растения Oenothera biennis чрез индуциране на пролиферация на меристематични клетки върху твърди агарови плаки до получаване на калуси. Клетките бяха прехвърлени в течната растежна среда (Gamborg B5, допълнена с 24 дихлорфеноксиоцетна киселина (1 mg/L), аденин (1 mg/L) и кинетин (0.01 mg/L)). След това , клетките се отглеждат като суспензионни култури при орбитално разклащане. След като бяха получени култури от около 150 g/L, клетките бяха събрани и лизирани във фосфатен буфер (PBS) при рН 7.4 за получаване на водоразтворим екстракт, който беше лиофилизиран. Прахът се разтваря във вода или среда за клетъчна култура в подходящите концентрации за тестване.

4.2. UPLC-MSMS анализ за химическа характеристика

ObHEx(5{{10}} mg/mL) се приготвя и се подлага на двуфазна екстракция на бутанол/вода. Бутаноловата фракция се изсушава и се разтваря в метанол (10mg/mL) преди UPLC-MS/MS анализа. Извършено е на класически масспектрометър Q-Exactive от Thermo-Scientific (Waltham, MA, USA), оборудван с Thermo ScientificTM UltiMateTM 3000 UPLC система. Всички хроматографски серии бяха извършени с помощта на Phenomenex Luna③C18 100 A （150×2.0 mm, размер на частиците 3 μm） колона при 40 градуса C и скорост на потока 0.200 mL/min. Инжекционният обем беше 5 μL. Мобилната фаза се състоеше от А (вода от ROMIL Ltd, Convent Drive, Waterbeach, Cambridge, Обединеното кралство при 0,1 процента оцетна киселина) и B (100 процента ацетонитрил от ROMIL Ltd, Convent Drive, Waterbeach, Cambridge, UK) с помощта на градиентно елуиране от 5 процента B при0-5min, 5-14 процента B при5-8 min, 14-32 процента B при 8-11 min, 32-95 процента Bat {{ 26}}min,95-98 процента Bat32-33 min,98 процента B при 33-38min,98-5 процента Bat38-39 min и 5 процента B при { {34}} мин. Всички MS и MSMS анализи бяха проведени в ESI отрицателен режим със скорост на потока на обвивния газ при 30 (произволни единици), скорост на потока на спомагателния газ при 5 (произволни единици), напрежение на пръскане при 3,2 kV и капилярна температура и температурата на спомагателния газов нагревател е 300 градуса. Данните бяха получени с режим Full MS/dd-MS2 (Top5). Пълните настройки на MS бяха: разделителна способност 70 000, AGC цел 1 × 106, максимална IT от 200 ms и може да варира от 100 до 800 m/z.dd-MS2 настройките бяха: разделителна способност 17 500, AGC цел 2 × 105, максимум IT от 65 ms, изолационен прозорец от 1,5 m/z и NCE от 35.

получените бяха ръчно проверени. mzXML данните бяха обработени с помощта на Mzmine 2.53 преди заданието за базирана на функции молекулярна мрежа (FBMN) на GNPS. Стъпката на откриване на маса беше извършена с помощта на детектор на центроидна маса, като същевременно се запази нивото на шума при 5 × 1 {{1 0}}3. Изграждането на хроматограма за автоматизиран тръбопровод за анализ на данни (ADAP) беше реализирано със следните настройки: минимален размер на групата в брой сканирания от 5, праг на интензитета на групата от 5 × 1{{20}}³, минимален най-висок интензитет от 5 × 10 плюс m/z толеранс от 0.01 m/z или 10 ppm. Деконволюцията на хроматограмата беше постигната с помощта на Wavelets (ADAP) като алгоритъм, праг S/N 3, минимална височина на характеристиката 1 × 105, праг на коефициент/площ 5, диапазон на продължителност на пика 0.{{ 18}}.00 min и диапазон на RT вълна от 0.00-0.05. Хроматограмите бяха деизотопирани с помощта на груповия алгоритъм на изотопните пикове с m/z толеранс от 0,001 m/z или 5,0 ppm и RT толеранс от 0,10 минути. Работата на FBMN беше извършена с толеранс на родителската маса от 0,02 Da и толеранс на йонен фрагмент MS4 от 0,02 Da. Ръбовете бяха филтрирани, за да има праг на резултат от 0,7 и минимум 2 съвпадащи пика. Освен това максималният брой съседни възли за всеки възел беше зададен на 10.

4.4. Количествен анализ на лигнани и тритерпени

Същите условия на UPLC, докладвани за качествения анализ, бяха използвани за количествен анализ на лигнани, докато за този на тритерпени те бяха оптимизирани, за да се разделят две двойки изомери, арджунолова и азиатска киселина. Анализът беше извършен на Q-Exactive Classic масспектрометър, както е описано по-горе. Разделянето беше извършено с Phenomenex Kinetex⑧EVO C18 300 A（150×2,1 mm, размер на частиците 5 μm）. Подвижната фаза се състои от A (5 mM воден разтвор на амониев ацетат, рН 9.00 коригирано с амониев хидроксид) и B(100 процента ацетонитрил) с помощта на градиентно елуиране на 17-28 процент B при 0-18 min, 28-65 процент B при 18-22 min, 65-75 процент B при 22-26min, 75-95 процент при {{17 }}, 5 минути, 95 процента на 26,5-30 мин, 95-17 процента на 30-30,1 мин, 17 процента на 30,1-42 мин. Скоростта на потока беше 0.450 mL/min и инжекционният обем беше 5 uL. Както за лигнаните, така и за тритерпените, данните бяха получени с пълен MS-SIM и PRM режим. Пълните настройки на MS-SIM бяха: разделителна способност от 70.000, AGC цел от 3 × 106, максимална IT от 200 ms и може да варира от 200 до 800 m/z за лигнани и от 400 до 850 m/z за тритерпени. Настройките на PRM бяха: разделителна способност от 70.000, AGC цел от 2×10 градуса, максимална IT от 100 ms, прозорец на изолация от 1,0 m/z и NCE от 35 в случай на лигнани и 50 в този на тритерпени.cistanche АвстралияКупихме Salvador настрана (#{{0}}XS172930) от Biosynth Carbosynth (Staad, St. Gallen, Швейцария), лириодендрон (#SMB00181) и арджунолова киселина (#SMB00119) от Sigma -Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ), азиатска киселина (#0027) от Extrasynthese (Genay, Lyon, Франция) и хедерагенин (#89706) от PhytoLab GmbH & Co.KG (Vestenbergsgreuth, Bayern-Mittelfranken, Германия). Мириантовата киселина беше подарък от проф. Мария Валерия Д'Аурия, Университет на Неапол. Кривите на калибриране бяха получени чрез инжектиране на стандартни разтвори в концентрационен диапазон от 0.25-25 μM за лигнани и 0.1-25 uM за тритерпени. Както чистият Салвадор, така и лириодендронът показаха два пика LC-MSMS, вероятно поради установеното химическо равновесие в разтвора. Границата на откриване (LOD) и границата на количествено определяне (LOO) за стандартите бяха определени на базата на съотношението сигнал/шум (S/N).

4.5. Кожни клетъчни култури и експланти

Човешки дермални фибробласти (HDF) се поддържат в Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), допълнена с 10 процента фетален говежди серум (FBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA )в 95 процента въздух, 5 процента CO, и овлажнена атмосфера при 37 градуса. Кожни експланти, получени от кожата на здрави жени донори (на възраст 44-47) в хирургичния център Villa Cinzia (Неапол, Италия), бяха култивирани в 24-трансуелни плаки в DMEM/FBS плюс антибиотици във въздушно- течни условия при 37 градуса в 5 процента CO2 овлажнен въздух. Всички донори са дали своето писмено информирано съгласие за използването на кожните тъкани, съгласно Декларацията от Хелзинки.

4.6. Тест за цитотоксичност

Тестовете за цитотоксичност се основават на използването на MTT съединението [{{0}}(45-диметил тиазолил)-2,5-дифенилтетразолиум-бромид][34]. Клетките се отглеждат в 96-ямкови плаки в DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) културална среда, допълнена с 10 процента фетален говежди серум, за приблизително 8 часа. След третиране с ObHEx между 0.05 процента и 0,0004 процента (500 ug/mL и 4 ug/mL) в продължение на 48 часа, клетките се промиват в PBS и се инкубират със 100 μL/ямка от "реакционен буфер", съдържащ ∶ 10 mMof Hepes, 1,3 mM CaCl2, 1 mM MgSO, 5 mM глюкоза и 0,5 mg/mL MTT колориметричен субстрат в буфер PBS при pH 7,4. След 3 часа инкубиране при 37 градуса С в 5 процента CO, 100 μL разтвори за разтваряне, съдържащи 10 процента от Triton-X100, 0,1 N HCl в абсолютен изопропанол, бяха добавени към всяка ямка. След 16 часа инкубация, колориметричната реакция се измерва при 595 nm с четеца на плаки Victor3 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

4.7. Анализ на експресията на MYLK и TGF6RII гена в HDF

На ямка, 1×10 степен на HDF се отглеждат в 6-плаки с ямки в DMEM при 2 процента FBS, след 24 часа FBS се разрежда допълнително до 0.5 процента, и клетките бяха третирани с 0.002 процента и 0.006 процента концентрации на ObHEx и TGF- 2.5 ng/mL, последвано от инкубиране от 2 часа за MYLK и 48 за TGFRII. За екстракция на РНК беше използван комплектът "GenEluteM Total RNA Purification", закупен от компанията Merck (Дармщат, Германия). След посочените третирания клетките се промиват с PBS, събират се в лизисен буфер и се подлагат на процедурата на екстракция, както е докладвано. Пробите бяха третирани с DNase I (Ambion, Austin, TX, USA) при 37 градуса за 30 минути, за да се отстрани замърсителя на геномната ДНК. От всяка проба, 2 μL се зареждат върху 1% агарозен гел в присъствието на денатуриращо зареждащо багрило с цел квантуване на количеството РНК по отношение на специфичен маркер за РНК (ThermoScientific, Waltham, MA, USA). GeneTools (PerkinElmer, Waltham, MA, САЩ) е използван като софтуер за квантуване. След това 300 ng от общата РНК се транскрибират ретро с помощта на ензима обратна транскриптаза (ThermoScientific, Waltham, MA, USA). Полуколичествената RT-PCR беше проведена с използване като вътрешни стандарти на двойката универсални праймери 18S праймер/конкурент (Ambion, Austin, TX, USA). PCR продуктите бяха разделени на 1, 5 процента агарозен гел, прегледани с помощта на инструмента Reliance (PerkinElmer, Waltham, MA, САЩ) и анализирани чрез денситометрия с помощта на софтуера Genetools. Последователностите на праймерите, използвани за амплификация, са следните: MYLK FW: ATCAAACTGTCAAGTTCAG, MYLK Rv: AGGCACTGCGTGCAGTCCA, TGFBR2 FW: GTCACTGACAACAACGGT, TGFBR2 RV: ATGTCAGAGCGGTCATCT.

4.8. Анализ на капацитета на свиване на колагенова матрица

Що се отнася до HDF клетките, 20× 10 градуса бяха ресуспендирани в 5x DMEM растежна среда (Gibco, Waltham, MA, USA) в 24-ямкова плака и 2 mg/ mL разтвор на колаген от говежда кожа (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) се добавя към всяка ямка. рН на разтвора се коригира до 7.2. Плаката се инкубира при 37 градуса С за 45 минути, за да се позволи втвърдяване на колагеновия гел. DMEM, допълнен с 10 процента FBS и/или ML7 25 uM, като MYLKпротеинов инхибитор, беше добавен по-късно. След 16 часа ML7 се изчиства и се добавя ObHExat с концентрация от 0,002 процента в DMEM с 2 процента FBS. Като положителна контрола се използва TGF- 2.5 ng/mL. Образуваният диск от колаген веднага се отделя от ямката с помощта на стерилна микро шпатула, за да се насърчи свиването му. Площите на диска на всяко третиране бяха измерени на време 0 и 5 часа и анализирани с помощта на софтуер за изображения.

4.9. Анализ на степента на полимеризация на актина

След това 1,5×10 степен HDF клетки на ямка се отглеждат в 24-ямкова плака и на следващия ден средата се добавя с 2 процента FBS и цитохалазин В, който е инхибитор на актин полимеризация, при 2 μM за 3{{1{{20}}}} min. След 30 минути към клетките се добавя ObHEx（0,002 процента и 0,006 процента) заедно с TGF- 2.5 ng/mL, използван като положителна контрола, и ML7 25μM, като отрицателна контрола на MYLKenzyme. След 30 минути третиране клетките се фиксират с 4 процента параформалдехид (PFA) в буферен фосфат за 30 минути върху лед. Клетките се промиват с PBS и се пермеабилизират с разтвор на фосфатен буфер и Triton-X100 при 0.2 процента за 30 минути. Впоследствие клетките се инкубират с разтвор от 0, 4 μM фалоидин, конюгиран с родамин (Santa-Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) в продължение на 1 час на тъмно.Cistanche ползиВъв време 0 и след 18 часа флуоресценцията беше измерена при 540/570 nm с помощта на четеца на плаки Victor3 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). 4.10. Анализ на пътя на SMAD2

HDF клетките се посяват при плътност 3 × 103 в 96-плаки с ямки и след 16 часа се трансфектират с помощта на реагент за трансфекция на X-tremeGeneTM HP ДНК (Roche Diagnostics, Базел, Швейцария) с репортерен вектор Smad2 съгласно инструкциите на производителя. След 24 часа клетките бяха третирани с ObHEx или TGF- 2.5 ng/mL, самостоятелно или в комбинация с ML7 25 μM за 24 часа. В края на инкубацията клетките се промиват с PBS и активността на луциферазата се определя чрез използване на системата за анализ SteadyGlo Luciferase (Promega Corporation, Madison, WI, USA) в Multiwell Plate Reader Victor Nivo (PerkinElmer, Waltham, MA , САЩ).

4.11. Анализ на синтеза на про-колаген I, тропоеластин и периостин

На ямка, 8 × 103 HDF се отглеждат в 96-плаки с ямки и се третират с 0.002 процента от ObHEx или TGF 2,5 ng/mL. След 24 часа клетките бяха обработени за ELISA с използване на моноклонално първично антитяло анти-проколаген тип I (sc-166572, Santa-Cruz Biotechnology, Далас, Тексас, САЩ), последвано от инкубиране с вторично анти-мише антитяло, белязано с пероксидаза (170-6516, Biorad, Hercules, Калифорния, САЩ). Супернатантите на клетките бяха покрити върху друга плака за откриване на тропоеластин и периостин, използвайки анти-тропоеластин заешко антитяло (ab21600, Abcam, Cambridge, U или анти-периостиново мише антитяло (sc-398631, Santa-Cruz Biotechnology) , Dallas, TX, USA), последвано от инкубиране с вторично антитяло анти-заек, белязано с пероксидаза (170-6515, Biorad, Hercules, CA, USA）. Колориметричната реакция се развива чрез добавяне на 100 μL воден разтвор на OPD (О-фенилендиамин), 0,35 mg/mL в 50 mM цитратен буфер и 0,012 процента водороден прекис (H2O2) След 30 минути абсорбцията беше измерена при 490 nm с помощта на многократния четец Victor Nivo (PerkinElmer, Waltham, MA, САЩ).

4.12. Ex Vivo тестове

Имунохистофлуоресценцията (IHF) на MYLK и фосфорилирания миозин беше оценена в кожни експланти на {{0}}-годишни донори. Експлантите на човешка кожа бяха изрязани с кюрети за биопсия от 8 mm и култивирани в 24-ямкови плаки в DMEM с 10 процента FBS и антибиотици. Получените удари бяха третирани с 0.002 процента и 0,006 процента ObHEx за 24 часа. Те бяха инкубирани в 15 процента захароза, след това в 30 процента захароза и накрая замразени. След това бяха получени 10 μm секции с помощта на криостат CM1520 (Leica Microsystems, Wetzlar, Германия). Предметни стъкла с криоразрези се хидратират за 30 минути в PBS и се поставят в "блокиращ" разтвор (6 процента BSA, 5 процента серум, 20 mM MgCl2, 0,2 процента Tween) за 1 час. Криосекциите се инкубират с първичното анти-MYLK заешко антитяло (1: 100, GeneTex, Irvine, Калифорния, САЩ) и първичното антитяло анти-фосфо-миозин (1:100, LifeTechnologies, Карлсбад, Калифорния, САЩ) в продължение на 16 часа при 4 степен. Слайдовете се промиват с PBS за 30 минути и след това се инкубират с вторичното анти-заешко Alexa-Fluor 546 антитяло (1: 1000; A11035 ThermoFisher, Waltham, MA, USA) за 1 час. Ядрата се оцветяват с DAPI(4',6-5 диамидино-2-фенилиндол)1 ug/mL в PBS за 10 минути. Изображенията бяха получени с флуоресцентен микроскоп и анализирани със софтуера ImageJ. За IHF на тропоеластин и колаген I бяха използвани кожни експланти на 36--годишни жени донори. Кожни биопсии бяха получени, както е описано по-горе, и предварително обработени с 0,002 процента и 0,006 процента ObHEx за 24 часа. Беше добавен стрес с хидрокортизон при 10 ug/mL за 8 дни в присъствието на ObHEx. След това биопсиите бяха замразени, както е описано по-горе, и срезовете бяха инкубирани с първично антитяло анти-тропоеластин заек (1:1000 ab21600, Abcam, Cambridge, UK) и анти-колаген I (1:100 C2456 Merck, Darmstadt, Германия) за 16 часа при 4 градуса. Слайдовете бяха анализирани, както е описано по-горе, и изображенията бяха получени и анализирани със софтуера ImageJ.

4.13. Атомно-силова микроскопия (АСМ) в кожни експланти

Еластичността на нетретирани и третирани с ObHEx кожни проби беше оценена, като се гарантират техните модули на Young чрез метод в нанометричен мащаб, базиран на атомно-силова микроскопия (AFM), разработен не само за биологични проби, но и за неорганични. Тези подходи се основават на предположенията на моделите на Hertz и разглеждат пробата и конзолата като две пружини в серия в настройка на AFM експеримент. Накратко, екземпляр от кожа, третиран с 0.006 процента от ObHEx и нетретирани проби от кожа бяха нарязани от криостат на резени с дебелина 10 um. Пробите се съхраняват при 12 градуса, след това се промиват с PBS и се изследват при фиксирана температура и относителна влажност съответно 22 градуса и 55 процента. Всяка проба беше изследвана от NanoScope IIA AFM в единичен режим на силова спектроскопия, използвайки пирамидален връх (RESP-20) с константа на пружината от 0,9 N/m. За да се изчисли модулът на Юнг, бяха получени десет криви на силата в десет различни точки от една и съща повърхност на пробата. Всяка крива на силата е крива на отклонение (волт) спрямо изместване (nm) и може да бъде преобразувана в криви на сила (N) спрямо разделяне (nm). Всъщност всяка крива на силата отчита кривите на товарене и разтоварване. Те представляват тенденцията на върха по отношение на пробата: когато върхът е далеч от пробата, когато влязат в контакт и върхът започва да се отклонява, и когато се отдалечава отново. Само първата част от тези криви може да бъде изследвана. Всяка от тези части на кривите беше съгласувана със стандартен херцов модел, по-специално типичното уравнение на Херц за върха на пирамида, за да се извлече модулът на еластичност, известен като модул на Юнг в GPa.

4.14. Статистически анализ

Всички докладвани стойности са средните от три независими експеримента, всеки от които е извършен в три екземпляра. Звездичките показват статистическа значимост, изчислена в съответствие с t-теста: *означава стойност По-малка или равна на 0.05;** p стойност По-малка или равна на 0. 01;***p стойност По-малко или равно на 0,001.

Тази статия е извлечена от Metabolites 2021, 11, 527. https://doi.org/10.3390/metabo11080527 https://www.mdpi.com/journal/metabolites