Орален прием на пилешки костни колагенови пептиди против стареене на кожата при мишки чрез регулиране на разграждането и синтеза на колаген, инхибиране на възпалението и активиране на лизозомите част 1

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

Резюме:Ефектът от диетата върху стареенето на кожата се превърна в интересна изследователска тема. Предишни проучвания се фокусираха предимно върху полезните ефекти на колагеновите пептиди, получени от морски организми, върху стареещата кожа, когато се прилагат орално, докато рядко се съобщава за полезните ефекти на колагеновите пептиди, получени от домашни птици, върху стареещата кожа. В това проучване колагеновите пептиди са получени от пилешка кост чрез ензимна хидролиза и са изследвани ефектът и механизмът на действие на перорално приложените колагенови пептиди върху облекчаването на стареенето на кожата, предизвикано от UV, комбинирано с D-галактоза. Резултатите показват, че колагенът от пилешки кости има типични характеристики на колаген, а колагеновите пептиди от пилешки кости (CPs) са предимно малки молекулни пептиди с молекулно тегло от<3000 da.="">Cistanche удължаване на животаЕкспериментите in vivo показаха, че CP имат значителен облекчаващ ефект върху стареещата кожа, показан от промените в състава и структурата на стареещата кожа, подобряване на нивото на кожните антиоксиданти и инхибиране на възпалението; облекчаващият ефект корелира положително с дозата на СР. По-нататъшно изследване показа, че CPs първо намаляват нивото на окисление на кожата, инхибират експресията на ключовия транскрипционен фактор AP-1 (c-Jun и c-Fos), след това активират TGF-/Smad сигналния път за насърчаване на синтеза на колаген , инхибират експресията на MMP-1/3 за инхибиране на разграждането на колаген и инхибират възпалението на кожата, за да облекчат стареенето на кожата при мишки. Освен това, транскриптомът на кожата установи, че лизозомите, активирани след перорално приложение на CPs, могат да бъдат важен път за CPs при стареене на кожата и заслужава по-нататъшно изследване. Тези резултати предполагат, че CP могат да се използват като функционален хранителен компонент против стареене.

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Ключови думи:колагенови пептиди; против стареене; кожен транскриптом; синтез на колаген; лизозоми

1. Въведение

Ерата на здравето, точното спазване на здравословна диета, определянето на ролята на храненето за стареенето на кожата и вземането на решение какво да се яде, за да се поддържа млада и здрава кожа, са трудни проблеми. Кожата е най-големият орган на тялото, съставен от епидермис, дерма и подкожен слой. Той действа като бариера за защита на тялото от външни фактори и също играе роля за здравето и красотата[1]. Стареенето на кожата е сложен процес, който се разделя на хронологично стареене и фотостареене и се влияе както от вътрешни, така и от външни фактори. Основните характеристики включват натрупване на макромолекулно увреждане в клетката, намаляване на функцията на стволовите клетки (насърчаване на обновяването на тъканите) и постепенна загуба на физическата цялост на кожата [2]. Основните молекулярни механизми, които причиняват стареене на кожата, включват главно оксидативен стрес, скъсяване на теломерите, увреждане на ДНК, генетична мутация, регулиране на микро-РНК, напреднало натрупване на краен продукт на гликиране и стареене при възпаление [3]. Фотостареенето е епидермална хиперплазия на кожата, изсушаване и деградация на извънклетъчния матрикс, предизвикани от ултравиолетово лъчение.цистанче нзОсновната причина за фотостареенето са реактивните кислородни видове (ROS), генерирани от ултравиолетово лъчение, които медиират експресията на матрични металопротеинази (MMPs) и проколаген тип-I чрез сигнални пътища като сигнализирането на митоген-активирана протеин киназа (MAPK). път, като по този начин води до разграждане на извънклетъчния матрикс (ECM) в кожата и апоптоза на фибробласти [4]. През последните години поддържането на здравето на кожата и забавянето на стареенето стана популярно и намирането на естествени съставки като биоактивни пептиди и полифеноли с антиоксидантни и анти-стареещи функции се превърна в изследователска гореща точка [5].

Въпреки това, колагенът има голямо молекулно тегло и е трудно да се абсорбира и използва директно, докато колагеновите пептиди с малка молекула след хидролиза на колаген имат по-силна биологична активност и висока степен на абсорбция [6]. Междувременно широкото приложение на колагена в храните, медицината, тъканното инженерство, козметиката и други области направи колагеновите пептиди с по-ниско молекулно тегло, по-висока ефективност на абсорбция и по-силна биологична активност нов фаворит във функционалните хранителни и медицински изследвания[{{1 }}]. Колагеновите пептиди са малки, съдържащи 2-20 аминокиселинни остатъци, получени след хидролиза на колаген. Те се използват като хранителна добавка за лечение на стареенето на кожата поради техните потенциални противовъзпалителни и антиоксидантни функции и имунна регулация и ефектите на антиоксиданта и пролиферацията върху кожните фибробласти [10].

Cistanche може да спре стареенето

След перорално приложение, колагеновите пептиди се абсорбират под формата на малки пептиди и бързо се транспортират до кръвта и в крайна сметка до бъбреците, кожата, ставите и други тъкани, за да бъдат съхранени и използвани. След 14 дни нивата на радиоактивност остават високи в кожата на мишки, които са били третирани с C14-белязани колагенови пептиди. Колагеновите пептиди могат да бъдат почти напълно усвоени и използвани от тялото, докато степента на усвояване и използване на колагена е само 50-60 процента [6,11-13]. През последните години се съобщава, че колагеновите хидролизати от рибена кожа, рибени люспи, кравешка кост, кравешка кожа и свинска кожа имат благоприятен ефект върху облекчаването на стареенето на кожата и са получили значително внимание от изследователите. Например, колагенови пептиди, изолирани от кожата на толстолоб, насърчават синтеза на проколаген и инхибират експресията на протеини AP-1, MMP-1 и MMP-3 чрез активиране на TGF-/Smad пътя за предотвратяване разграждане на колаген и възстановяване на фотостареещи кожни клетки [14]. Пероралното приложение на говежди колагенови пептиди може да подобри релаксацията на кожата, да повиши съдържанието на колаген и активността на антиоксидантните ензими, да възстанови колагеновите влакна и да нормализира съотношението на колаген в кожата при стареещи мишки [15]. Въпреки това, колагеновите пептиди от различни източници имат различни ефекти. Количеството и структурата на високоактивните пептиди в кръвта след перорално приложение на колагенови пептиди зависят от източника на колаген[10]. Защитният ефект на колагеновия пептид, извлечен от кожата на кокошки срещу UVA-индуцирано увреждане на фибробласти, е по-добър от този на колагеновия пептид, извлечен от кожа на прасе, крава или тилапия, и ефектът му е еквивалентен на трипептида, получен от колаген (Gly-Pro -Hyp)[16]. Религиозните вярвания и опасенията за болести (като луда крава) са накарали хората постепенно да изместят посоката на развитие на колаген и неговите продукти от сухоземни бозайници към домашни птици и морски организми [17]. Като основен страничен продукт от обработката на птиче месо, пилешката кост е обещаващ източник на колагенови продукти. Той не само намалява загубата на ресурси и замърсяването на околната среда, но също така позволява ефективното използване на страничните продукти. Ето защо в това проучване използвахме колагенови пептиди от пилешки кости като суровини, с голи мишки, третирани с D-галактоза и UV за предизвикване на стареене на кожата, като модел за оценка на ефекта от пероралното приложение на колагеновия пептид върху облекчаването на стареенето на кожата при мишки и определя съответния механизъм.

2. Материали и методи

2.1. Материали, химикали и животни

Пилешките ферми на Юнанския селскостопански университет (Кунмин, Китай) предоставиха отработените кокошки, които бяха отделени, изсушени и смачкани, за да се получи пилешкото костно брашно. Комплекти за су-пероксид дисмутаза (SOD), каталаза (CAT) и глутатион пероксидаза (GSH-PX) бяха закупени от Soleibao Biotechnology Co., Ltd. (Пекин, Китай). Хидроксипролин (HYP), интерлевкин-1 (IL-1), матрична металопротеиназа-1/3 (MMP-1/3), проколаген тип I и хиалуронова киселина ( HA) комплекти за ензимно-свързан имуноанализ (ELISA) бяха закупени от Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Китай). Здрави женски мишки BALB/C без косми (18± 2g, на възраст шест седмици) бяха закупени от Nanjing Junke Bioengineering Corporation, Ltd. (Nanjing, Китай) с номер на разрешение: SCXK(SU)2016-0010. Пепсинът и папаинът са закупени от Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. (Шанхай, Китай), а други химикали са с аналитичен клас. Всички мишки бяха обработени в съответствие с Правилника за грижа за лабораторните животни на провинция Юнан и одобрени от Комитета за грижа и използване на животните към Аграрния университет в Юнан (ID на одобрение: YAUACUC01).

2.2. Приготвяне на колаген и аминокиселинен състав

Екстракцията и аминокиселинният състав на колагена от пилешки кости следват метода, описан от Lieut al. [18] с леки модификации. Прахът от пилешки кости се разбърква и се накисва в 0.05 М NaOH, 10 процента n-хексан и 0.25 разтвор на MEDTA (pH 7,5) при съотношение 1/10 (m/o). На всяка стъпка пробата се третира в продължение на 36 часа и разтворът за накисване се сменя на всеки 6 часа, за да набъбне костният прах и да се отстранят неколагенови протеини, мазнини и минерали от костния прах. Пробата се промива с чиста вода до неутралност след всеки етап. Предварително обработеното пилешко костно брашно се смесва с 0,5 М ледена оцетна киселина, съдържаща 0,1 процента (w/v) пепсин при съотношение твърдо към течно вещество 1:10 (w/v) и се разбърква непрекъснато и се екстрахира при 4 градуса за 48 ч. След това се филтрува и филтратът се центрофугира при 15,000×g за 15 минути при 4 градуса.размер на пениса cistancheСупернатантата се регулира до 7.5-7.8 с разтвор на NaOH и се добавя NaCl до крайна концентрация от 1,5 М. След като сместа се държи непроменена в продължение на 12 часа при 4°C за изсоляване, колагеновата утайка се центрофугира при 15,000×g за 15 минути при 4 градуса, след това разтворен с 0.5 М оцетна киселина, диализиран в чиста вода, изсушен чрез замразяване и крайният продукт беше колаген от пилешка кост.

Аминокиселинният състав на колагена от пилешки кости се определя от автоматичния анализатор на аминокиселини Sykam S433D (Мюнхен, Германия). Определено количество колагенова проба за тестване се взема в запечатана епруветка, добавя се 1 0 mL6 M HCl и се хидролизира при 110 градуса за 24 часа. Хидролизатът се концентрира чрез продухване с азот и се разтваря отново в 20 mL буфер от лимонена киселина. След микрофилтруване с 0.22 μm микропореста мембрана, 20 μL хидролизат се взема за анализ на аминокиселинен спектър. Съдържанието на аминокиселина в пробата се изразява в проценти.

2.3. Приготвяне и разпределение на молекулното тегло на колагеновите пептиди (CPs)

Според резултатите от нашия предишен процес на оптимизация, CPs бяха приготвени с помощта на папаин при съотношение ензим към субстрат 1: 4 0 (масово съотношение). След регулиране на рН до 7 и ензимна хидролиза при 63 градуса за 5 часа, ензимът се инактивира във вряща водна баня за 15 минути. Ензимният хидролизат се обезсолява и лиофилизира, повторно се разтваря в 0,1 процента разтвор на мравчена киселина и се центрофугира, за да се получи супернатантата. Масов спектрометър с висока разделителна способност AQ Exactive HF Orbitrap-OE-HF (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), оборудван с електроспрей йонизация (ESI), беше използван за анализ на колагеновия хидролизат в режим на пълно сканиране на 350-1800 m/z и резултатите бяха извлечени и анализирани с помощта на Proteome Discoverer

2.1 софтуер

2.4.Тест върху животни

Женски мишки BALB/Chairless (n {{0}}) бяха държани в стая при контролирани условия на температура (24±1 градуса), влажност (60± 5 процента) и 12 h цикъл ден-нощ за една седмица. Осигурен им е ad libitum достъп до храна и вода. След една седмица адаптация, мишките бяха разделени на случаен принцип в следните пет групи (n =11 на група): (i). Нормална група (N): UV неекспонирани; перорално приложение на 0.4 ml физиологичен разтвор дневно. (ii). Моделна група (M): UV-изложена плюс D-галактоза (0.2 mL); перорално приложение на 0,4 ml физиологичен разтвор дневно. (i). Група колагенови пептиди с ниска доза (LCPs): UV-изложена плюс D-галактоза (0,2 ml); перорално

прилагане на 0.4 ml CPs (доза: 200 mg kg-1 телесно тегло) дневно. (iv). Група колагенови пептиди със средна доза (MCP): UV експонирани плюс D-галактоза; устно

прилагане на 0.4 ml CPs (доза: 500 mg:kg-1 телесно тегло) дневно.

(v). Висока доза група колагенови пептиди (HCPs): UV експонирана плюс D-галактоза; перорално приложение на 0.4 mL CPs (доза: 1000 mg·kg-1 телесно тегло) дневно.

Лечението с D-галактоза се извършва чрез подкожно инжектиране на 0.2 mL от 10 процента разтвор на D-галактоза в задната част на врата на мишката (доза: 1.0g/ kg-1телесно тегло) дневно. UV облъчването се извършва с 40 W UVA-340 ЛАМПА (O-панел, Кливланд, САЩ, пикова дължина на вълната: 340 nm), разстоянието между лампата и гърба на мишките е 30 cm (230 m J/ cm-), а облъчването продължи 30 минути всеки ден в продължение на седем седмици (49 дни). Интензитетът на радиация беше измерен с UVA365-радиометър (Xinbao Keyi Electronic Technology Co., Ltd., Xi'an, Китай). Един час след третиране с D-галактоза и UV, на мишките се прилагат 0.4 mL CPs перорално всеки ден. След последното облъчване, мишките бяха анестезирани, претеглени и от тъканите бяха взети проби за последващ анализ.

2.5. Влага на кожата, висцерален индекс и наддаване на телесно тегло

Влажността на кожата се определя по ISO 1442 и висцералният индекс се изчислява с помощта на следното уравнение: висцерален индекс (g/kg)=висцерално тегло/телесно тегло.

2.6. Оксидативен стрес, съдържание на HA и HYP в кожата

Кожните проби се хомогенизират с девет пъти количество нормален физиологичен разтвор (w/w) в ледена баня с тъканен хомогенизатор (TGrinder OSE-Y30, Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Пекин, Китай) и след това се центрофугират при 2000 ×g и 4 градуса за 10 минути. Активностите на супероксид дисмутаза (SOD), каталаза (CAT), глутатион пероксидаза (GSH-PX) и съдържанието на хиалуронова киселина (HA) и хидроксипролин (HYP) в събрания супернатант се определят съгласно метода, описан в инструкциите съответстващи на съответните комплекти.

2.7. Кожни хистологични

Пробите от кожа на мишка се фиксират в 4% разтвор на параформалдехид за 24 часа, дехидратират се, поставят се в парафин и се нарязват. Кожните срезове се оцветяват с хематоксилин и еозин (HE) и се наблюдават с преден флуоресцентен микроскоп ECLIPSE CI-E (Nikon, Япония). Дебелината на епидермиса и дермата на кожата беше оценена с помощта на софтуера Halcon 13.0.1.1 (MVTec, Мюнхен, Германия).

2.8. Секвениране на кожен транскриптом

2.8.1. Екстракция на РНК, конструиране на библиотека и секвениране на транскриптоми

Общата РНК се екстрахира от кожата на мишки с помощта на RNeasy Mini Kit (Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Пекин, Китай) съгласно инструкциите на производителя. Чистотата и концентрацията на РНК се проверяват с помощта на спектрофотометър kaiaoK5500 (Kaiao, Пекин, Китай); Целостта на РНК беше оценена с помощта на RNA Nano 6000 Assay Kit и системата Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ). Анализът на транскрипционното секвениране на всяка проба беше извършен от Biolinker Technology Company Limited (Kunming, Китай).цистанче на прахНакратко, клъстерирането на индексно кодирани проби беше извършено на cBot система за генериране на клъстери, използвайки HiSeq PE Cluster Kit v4-cBot-HS (Illumina) съгласно инструкциите на производителя. След генериране на клъстер, библиотеките бяха секвенирани на платформа Illumina и бяха генерирани четения от 150 bp сдвоен край.

2.8.2. Биоинформатични анализи на данни за секвениране на РНК

Генната онтология (GO) и Киото Енциклопедия на гените и геномите (KEGG) анализ на обогатяване на диференциално експресирани гени (DEG) беше извършен с помощта на пакета R езиков клъстерен анализатор. Когато p-стойността е по-малка от 0.05, елементите и пътищата, обогатени с GO и KEGG, се считат за значими.

2.8.3. Верижна реакция на обратна транскриптаза-полимераза (qRT-PCR)

QRT-PCR се извършва, както е описано по-горе [19].

2.9.Wester1 Блот

Съгласно метода, описан от Park et al. [20], беше извършен Western blot (WB) анализ за количествено определяне на експресията на протеини, свързани със стареенето на кожата при мишки. Протеинова концентрация на кожен лизат във всяка третирана група се определя количествено с помощта на комплекта BCA, разделя се чрез SDS-PAGE (10 процента акриламиден гел), прехвърля се върху PVDF мембрана, блокира се с 5 процента обезмаслено мляко и се инкубира с подходящо количество първичен антитела (TGF-b1, c-Fos, c-Jun, Samd2/3 и -актин) при 4 градуса за една нощ. След промиване с TBST, пробите се смесват с вторични антитела и се инкубират при стайна температура в продължение на 1 час. ChemiDoc XRS плюс хемилуминесцентен гел образ (BioRAD, Hercules, Калифорния, САЩ) беше използван за откриване на специфични протеини. Софтуерът Image] беше използван за количествено определяне на експресията на целевия протеин във всяка третирана група и резултатите бяха представени чрез стойностите на плътност, нормализирани към -актин протеин.

2.10.ELISA

Нивата на експресия на MMP-1, MMP-3, проколаген тип I и IL-1 в течността за лизис на кожата бяха определени чрез ензимно-свързан имуноанализ. Анализът беше проведен съгласно инструкциите, предоставени с комплекта.

2.11. Статистически анализи

Всички резултати бяха анализирани с помощта на софтуера SPSS 21 (IBM Inc., Армонк, Ню Йорк, САЩ) чрез еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA) и многообхватен тест на Дънкан, като нивото на значимост беше зададено на p<0.05. originpro="" 2017="" (originlab,="" northampton,="" ma,="" usa)was="" used="" to="" plot="" the="" data.="" all="" data="" were="" expressed="" as="" the="" mean="" ±standard="" deviation="">

3. Резултати и дискусия

3.1. Аминокиселинен състав на колагена

Аминокиселинният състав на колагена от пилешки кости е показан в таблица 1. Gly е основната аминокиселина в пробите, представляваща почти една трета (27.86 процента) от общите аминокиселини, а Hyp е основната специална аминокиселина в колагена, представляваща 9,83 процента. Основните характеристики на колагеновите молекули са повтарящите се Gly-XY последователности и уникалната тройна спирална структура, съставена от три c вериги. Gly представлява около една трета от общите аминокиселини, X и Y често са пролин и хидроксипролин или могат да бъдат всякакви остатъци [21]. Аминокиселинният състав на пробата е подобен на този на колагена от пилешки кости, докладван в предишни проучвания и има типичните характеристики на колаген [22].

3.2. Разпределение на молекулното тегло на CPs

Molecular weight distribution reflects the degree of collagen hydrolysis. The molecular weight of the CPs was mainly below 3000 Da(Figure 1), accounting for about 87.61%of all collagen hydrolysates, indicating that almost all of the CPs were small peptides. Many studies claim that collagen peptides with a lower molecular weight have better biological activity [23]. For example, Song et al. [24]. reported that lower molecular weight (200-1000 Da,65%)silver carp skin collagen peptides repaired UV-induced aging skin in mice more effectively than similar peptides with a higher molecular weight(>1000 Da, 72 процента). Въпреки това, германската компания Gelita показа чрез няколко клинични проучвания, че ефектът на колагеновите пептиди се определя главно от степента на съответствие със свойствата на колагеновите пептиди след разграждането на човешкия колаген, а не от молекулното тегло на колагеновите пептиди. Те установиха, че продуктът VERISOL⑧ със средно молекулно тегло 2000 Da има най-стимулиращ ефект върху кожните фибробласти, докато продуктът FortigelTM със средно молекулно тегло 3000 Da има специален ефект върху възстановяването на хрущяла [25-27].

3.3. Ефект на пероралните CP върху облекчаване на стареенето на кожата

3.3.1. Телесно тегло и органен индекс

Индексът на телесното тегло и индексът на органите са важни и отразяват здравословното състояние на мишките. Теглото на мишките във всяка група се увеличава нормално по време на тестовия период (Таблица 2). Средното наддаване на тегло на групата M е по-ниско от това на групата N, а това на групите на лечение с CP е по-високо от това на групата M, което предполага, че CP нямат странични ефекти върху мишки. В предишни доклади дозата на мишките, третирани с колагенов пептид, беше предимно между 100-1000 mg/kg.bw·d, а безопасната доза на колагенови пептиди от тилапия достигаше 4,07 g/kg.bw·d [{{6} }].екстракт от цистанче салса Similarly, the growth of skin-aged mice after gavage with tilapia scale collagen peptides (dose: 500 and 1000 mg/kg.bw·d)was also similar to our results [29]. The spleen plays an important role in humoral and cellular immunity, thus, the spleen index is often used to evaluate immune system function. The liver index was used to evaluate the toxicity of the tested sample. In these tests, the liver and spleen indices in the M group were lower than those in the N group, and both recovered after treatment with CPs, but there was no significant difference across the treatment groups(p>0.05). Резултатите са подобни на тези от предишни проучвания [30], което показва, че CPs са безопасни и могат леко да подобрят имунитета на мишки.

3.3.2. Състав на кожата

Лечението с UV и D-галактоза (М група) значително намалява съдържанието на влага, НА и Hyp в кожата, в сравнение с тези на групата, съответно с 13,36 процента, 24,08 процента и 15,83 процента (p<0.05)(table 2).the="" contents="" of="" moisture,="" ha,="" and="" hyp="" in="" the="" skin="" were="" significantly="" higher="" in="" mice="" after="" the="" oral="" administration="" of="" cps="" compared="" to="" the="" contents="" of="" those="" in="" the="" mice="" of="" the="" m="" group=""><0.05). among="" the="" dose="" groups,="" the="" contents="" of="" the="" three="" skin="" components="" were="" significantly="" different="" between="" the="" lcp="" and="" hcp="" groups="" and="" were="" dependent="" on="" the="" dose="" of="" intake="" of="" cps.="" the="" hcp="" group="" had="" even="" higher="" contents="" than="" the="" n="" group,="" and="" ha="" and="" hyp="" were="" significantly="" different="" between="" the="" two="" groups="" (p=""><>

Промените в съдържанието на влага в кожата причиняват бръчки и увисване на кожата и се влияят от компоненти на матрицата като кожен колаген и НА[31]. Хидроксипролинът е стабилна, богата и специална аминокиселина в колагена и нейното съдържание може индиректно да отразява съдържанието на колаген в кожата, както и стареенето на кожата. Освен това НА, която е силно експресирана в ECM на кожата, играе важна роля в контролирането на водния баланс на кожата, осмотичното налягане, задържането на влага и еластичността като система за съхранение на вода и структурен компонент на кожата [32]. В това проучване съдържанието на влага, HYP и HA в кожата се повишава значително след приема на CP, което може да е свързано с насърчаването на синтеза на колаген и HA от CP. Освен това, увеличаването на HYP и HA повишава съдържанието на влага.

3.3.3. Кожни хистологични промени

Хистологичните промени в кожата на гърба на мишки след седем седмици непрекъснато лечение са показани на фигура 2. Застаряващата кожа от група М показва характеристиките на груба повърхност, удебелен епидермис, изтънена дерма и оскъдни клетки в сравнение с кожата от групата N. Въпреки това, състоянието на старееща кожа при мишки се подобрява след перорално приложение на CPs, поддържайки гладка, подредена и пълна структура, подобна на тази при мишките от N групата. Така дермата на кожата беше значително по-тънка, а епидермисът беше значително по-дебел в групата M, отколкото в групата N (p<0.05). the="" change="" in="" skin="" dermis="" and="" epidermal="" thickness="" was="" significantly="" better="" after="" treatment="" with=""><0.05), and="" the="" effect="" was="" more="" obvious="" with="" the="" increase="" in="" the="" dose="" of="" cps="" (figure="" 2).="" the="" effect="" of="" oral="" cps="" on="" the="" histological="" structure="" of="" aging="" skin="" was="" similar="" to="" that="" reported="" previously[4,28,31].="" the="" increase="" in="" the="" thickness="" of="" the="" epidermis="" might="" be="" an="" adaptive="" change="" to="" protect="" the="" skin="" from="" external="" stimuli,="" loss="" of="" skin="" moisture,="" and="" uv="" damage,="" possibly="" due="" to="" the="" increase="" in="" uv-activated="" epidermal="" growth="" factor="" receptor="" (egfr)="" that="" induces="" keratinocyte="" proliferation="" and="" epidermal="" hyperplasia[4].="" however,="" the="" mechanism="" by="" which="" oral="" cps="" alleviate="" the="" increase="" in="" epidermal="" thickness="" remains="" unclear.="" the="" dermis="" imparts="" elasticity="" and="" strength="" to="" the="" skin,="" and="" the="" degradation="" of="" ecm="" and="" the="" reduction="" in="" the="" ability="" to="" repair="" fibroblasts="" are="" the="" main="" causes="" of="" dermal="" thinning="" in="" aging="" skin.="" dermal="" thickness="" increased="" after="" the="" treatment="" with="" cps,="" which="" might="" be="" due="" to="" the="" removal="" of="" ros="" from="" the="" skin="" and="" inhibition="" of="" the="" increase="" of="" mmps="" by="" cps.="" this,="" in="" turn,="" inhibited="" the="" degradation="" of="" skin="" collagen="" and="" elastin="" (figure="" 3),="" the="" entry="" of="" cps="" into="" the="" skin,="" and="" their="" participation="" in="" the="" synthesis="" of="" collagen="" and="" ha="" [6],="" which="" was="" confirmed="" by="" the="" increase="" in="" the="" content="" of="" hyp="" and="" ha="" in="" the="" skin="" (table="">

3.3.4.Кожни антиоксидантни и възпалителни нива

Определянето на активността на антиоксидантните ензими е най-често използваният метод за оценка на нивото на антиоксиданти в организма [28]. Както е показано на фигура 3, активностите на съдържанието на CAT, SOD, GSH-Px и MDA в M групата са значително по-ниски от тези в N групата (p<0.05). administering="" cps="" effectively="" inhibited="" the="" decrease="" of="" cat,="" sod,="" gsh-px="" activities,="" and="" the="" mda="" content="" in="" the="" skin="" of="" mice,="" compared="" to="" those="" in="" the="" mice="" skin="" of="" the="" m="" group,and="" was="" positively="" correlated="" with="" the="" dose="" of="" cps;="" there="" were="" significant="" differences="" among="" the="" different="" dose="" groups=""><0.05). when="" ros,="" accumulated="" by="" skin="" oxidative="" stress,="" exceed="" the="" antioxidant="" defense="" ability="" of="" the="" body,="" they="" destroy="" the="" ecm,="" which="" is="" the="" key="" cause="" of="" skin="" aging.="" ros="" can="" cause="" the="" oxidation="" of="" lipids="" and="" proteins="" in="" the="" skin,="" resulting="" in="" fibroblast="" degeneration="" and="" changes="" in="" the="" skin.="" ros="" activates="" the="" mapk="" signaling="" pathway="" and="" the="" ap-1="" protein="" to="" upregulate="" the="" expression="" of="" mmps="" and="" promote="" the="" degradation="" of="" matrix="" collagen="" [21].="" although="" the="" antioxidant="" enzymes="" and="" antioxidants="" in="" the="" body="" can="" remove="" ros="" to="" protect="" the="" skin="" from="" damage,="" when="" the="" content="" of="" rosexceeds="" the="" defense="" (antioxidant)="" ability="" of="" the="" body="" or="" the="" body's="" defense="" ability="" declines,="" it="" causes="" oxidative="" stress="" and="" skin="">

Освен това клетъчната възпалителна реакция, причинена от ROS, също допринася за стареенето на кожата. След третиране с UV и D-галактоза (М група), съдържанието на IL-1 в кожата на мишките значително се повишава в сравнение с това в N групата (Фигура 3D), което показва, че кожата показва значителен възпалителен отговор (стр<0.05). the="" cps="" significantly="" reduced="" the="" content="" of="" il-1α="" in="" the="" skin="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" compared="" to="" that="" in="" the="" skin="" of="" mice="" in="" the="" m="" group.="" there="" was="" a="" significant="" difference="" between="" hcps="" and="" lcps=""><0.05), indicating="" that="" cps="" alleviated="" skin="" inflammation.="" the="" o2="" produced="" by="" ultraviolet="" irradiation="" stimulated="" the="" expression="" of="" mmp-1="" in="" dermal="" fibroblasts="" through="" the="" secretion="" of="" il-1α="" and="" il-6,="" thereby="" disrupting="" the="" ecm="" [33].="" therefore,="" this="" study="" suggested="" that="" cps="" significantly="" increased="" the="" activity="" of="" skin="" antioxidant="" enzymes="" and="" inhibited="" inflammatory="" responses,="" which="" might="" be="" important="" in="" delaying="" skin="" aging="" in="">

3.4. Механизъм на действие на диетичните CP за облекчаване на стареенето на кожата

3.4.1. Анализ и валидиране на RNA-Seq данни

Analysis techniques, such as PCA, HCA, gene GO enrichment, and KEGG pathway enrichment were used to analyze the transcriptome data. Based on the PCA analysis (Figure 4A)and hierarchical clustering analysis (heat map)of 4303 differential genes with average channel strength greater than 100, the relative expression levels of total DEGs between the two treatment groups are shown to provide an overview of the changes in gene expression(Figure 4B).The M group and the HCP group were significantly separated, and the expression patterns of most DEGs in the M and HCP groups were opposite, indicating that there were significant differences between the mouse skin after HCP treatment and the M group(Figure 4A,B).Pairwise comparisons showed that after feeding HCPs, 4303 genes were significantly expressed in the mice's skin, including 1790 upregulated genes and 2513 downregulated genes(Foldchange>2,p<0.05)(figure 4c).among="" the="" six="" genes="" associated="" with="" skin="" aging="" quantified="" by="" qrt-pcr,="" five="" genes(including="" fos,="" jun,="" cxcl1,="" and="" egr1)were="" downregulated,="" and="" one="" gene="" was="" upregulated(figure="" 4d),="" which="" was="" consistent="" with="" the="" overall="" trend="" of="" transcriptomic="" data.="" the="" rna="" expression="" levels="" of="" fos,="" jun,="" and="" cxcll="" were="" significantly="" upregulated="" in="" damaged="" skin="" compared="" to="" that="" in="" intact="" skin="" [34],="" and="" inhibition="" of="" egr1="" expression="" alleviated="" skin="" inflammation="" [35].="" these="" results="" reflected="" the="" reliability="" of="" transcriptome="" sequencing="" data,="" and="" oral="" cps="" effectively="" alleviated="" skin="">

анализът на обогатяване и анализът на обогатяването на базата данни KEGG предоставиха подкрепа за по-нататъшно изследване на биологичните функции на DEG. GO анализът показа, че DEGs са значително обогатени в биологични процеси като репликация на ДНК, регулиране на хемопоезата, регулиране на хидролазна активност и производство на цитокини; в клетъчните компоненти, които включват литична вакуола и лизозома, съдържащите колаген и други свързани гени са значително обогатени; по отношение на молекулярната функция, рецепторно-лигандната активност, цитокиновата активност и други свързани гени са значително обогатени (Фигура 5). Анализът на обогатяване на KEGG на първите 20 сигнални пътя, значително променени от DEG, е показан на Фигура 5. Взаимодействие цитокин-рецептор, лизозома, взаимодействие невроактивен лиганд-рецептор, клетъчен цикъл, системен лупус еритематозус и TGF-път (p<0.05)were closely="" related="" to="" aging,="" especially="" cytokine-receptor="" interactions,="" lysosomes,="" and="" tgf-βsignaling.="" an="" important="" feature="" of="" cellular="" senescence="" is="" the="" accumulation="" of="" damaged="" organelles="" and="" protein="" aggregates.="" lysosomes="" play="" an="" important="" role="" in="" degrading="" damaged="" organelles="" and="" protein="" aggregates="" in="" senescent="" cells="" [36].="" cytokine-receptor="" interaction="" is="" the="" main="" pathway="" of="" enrichment="" in="" the="" skin="" after="" being="" affected="" by="" various="" factors="" such="" as="" inflammation="" [37],="" sulfur="" mustard="" exposure="" [38],="" and="" terahertz="" pulse="" [39].="" cytokines,="" as="" small="" molecular="" proteins="" synthesized="" and="" secreted="" by="" various="" tissue="" cells,="" maintain="" skin="" homeostasis="" by="" controlling="" the="" balance="" between="" keratinocyte="" proliferation,="" differentiation,="" and="" apoptosis="" through="" complex="" interactions="" with="" growth="" factors="" [40].="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" is="" also="" important="" for="" regulating="" skin="" aging="" [14].="" gene="" functional="" enrichment="" analysis="" showed="" that="" tgf-β="" was="" highly="" expressed="" during="" cytokine-receptor="" interaction="" and="" in="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway.="" tgf-β="" is="" a="" major="" pro-fibrotic="" cytokine="" that="" regulates="" cell="" differentiation="" and="" proliferation="" while="" inducing="" extracellular="" matrix="" protein="" synthesis="" [41.="" therefore,="" we="" verified="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" and="" some="">

3.4.2. Проверка на механизма на действие на CPs за облекчаване на стареенето на кожата

За да се провери ролята на TGF-сигналния път и взаимодействието цитокин-рецептор за облекчаване на стареенето на кожата чрез перорални CPs, беше извършен WB анализ, за ​​да се провери TGF- и транскрипционния фактор Smad2/3 в TGF-сигналния път, както и ключът транскрипционен фактор AP-1(c-Fos и c-Jun), който регулира цитокините. Съдържанието на MMP-1, MMP-3, тип I проколаген и I-1 се определя чрез ELISA. Резултатите от WB анализа показват, че експресията на TGF-, Smad2 и Smad3 в група M е значително по-ниска от тази в група N(p<0.05). the="" expression="" levels="" of="" tgf-β="" and="" smad3="" were="" significantly="" higher="" in="" mice="" after="" the="" oral="" administration="" of="" cps="" compared="" to="" their="" levels="" in="" group="" m="" mice;="" additionally,="" smad2="" also="" increased="" significantly=""><0.05), except="" for="" in="" the="" lcps="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (figure="" 6).="" on="" the="" contrary,="" the="" expression="" of="" c-fos="" and="" c-jun="" in="" the="" m="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" n="" group.="" the="" expression="" of="" c-fos="" and="" c-jun="" in="" the="" cp="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" in="" the="" m="" group,="" except="" for="" the="" expression="" of="" c-jun="" in="" the="" lcp=""><0.05), and="" the="" change="" was="" dose-dependent.="" these="" results="" indicated="" that="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" was="" activated="" and="" ap-1="" was="" inhibited="" after="" feeding="">

Протеинът AP-1 е димерен комплекс от протеини от семейство Jun и Fos и е важен регулатор на възпалението на кожата и експресията на цитокини. Като цяло, комплексът, съставен от c-Jun и c-Fos, показва най-висока транскрипционна активност в кожата [41, A42]. ROS, произведени в стареещите кожни клетки, първо активират AP-1 протеина и след това регулират цитокините надолу по веригата (като IL-1), MMPs и TGF-сигналния път чрез транскрипция и транслация, като по този начин улесняват стареенето на кожата [43]. ,44]. TGF-/Smad сигнализиращата реакция е класически път на синтез на колаген и Smad транскрипционният фактор е в основата на този път на сигнална трансдукция. TGF- задейства фосфорилирането и активирането на Smad2 и Smad3 надолу по веригата чрез свързване към рецептора, като по този начин увеличава синтеза на COLI [14].

Освен това резултатите от ELISA показват, че съдържанието на MMP-1, MMP-3 и IL-1 в кожата на M групата е значително по-високо от това в N групата и съдържанието на Тип I проколагенът беше значително по-нисък (стр<0.05). however,="" the="" contents="" of="" mmp-1,="" mmp-3,="" and="" il-1α(figure="" 3d)in="" the="" skin="" after="" oral="" administration="" of="" cps="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" in="" the="" m="" group="" (p=""><0.05); type="" i="" pro-collagen="" increased="" significantly,="" and="" all="" the="" changes="" were="" dose-dependent="" with="" cps="" (figure="" 7).="" mmps="" are="" involved="" in="" the="" decomposition="" of="" skin="" collagen,="" il-1α="" shows="" the="" level="" of="" inflammation="" of="" the="" skin,="" and="" type="" i="" pro-collagen="" reflects="" the="" synthesis="" of="" skin="" collagen.="" accumulating="" evidence="" suggests="" that="" the="" role="" of="" the="" jun/ap-1="" protein="" pathway="" has="" also="" been="" proposed="" to="" regulate="" skin="" inflammation="" [40].="" the="" elisa="" results="" showed="" that="" the="" combined="" treatment="" of="" uv="" and="" d-galactose="" caused="" skin="" collagen="" degradation,="" decreased="" collagen="" synthesis,="" and="" caused="" skin="" inflammation,="" leading="" to="" skin="" aging.="" however,="" these="" changes="" were="" reversed="" after="" the="" oral="" administration="" of="">

В допълнение към горните пътища, в това проучване, регулираните нагоре гени след лечение с CP са значително обогатени в лизозомния път, което показва, че лечението с CP активира лизозомата в кожата (Фигура 5). Предишни проучвания показват, че активираните лизозоми изчистват агрегатите и повишават активирането на стареещите невронни стволови клетки по време на стареенето [45]. В допълнение към тях, повишената функция на лизозомите може да намали концентрацията на вътреклетъчните ROS, за да предотврати латентността на клетките. По същия начин, всяко намаляване на функцията на лизозомата може да повиши вътреклетъчната ROS концентрация, която в крайна сметка насърчава клетъчния латентност [46]. Въпреки че не сме го проверили систематично в тази статия, тези резултати и предишни доклади предполагат, че активирането на лизозомната функция може да бъде основният начин за CPs да облекчат стареенето на кожата и ние ще продължим да се стремим да го проверяваме.

Следователно, това проучване показа, че диетичните CP могат да облекчат стареенето на кожата, предизвикано от UV и D-галактоза, по дозозависим начин. CP облекчават стареенето на кожата чрез понижаване на нивата на окисление на кожата, инхибиране на експресията на ключови транскрипционни фактори AP-1(c-Jun и c-Fos), активиране на TGF-/Smad сигналния път за насърчаване на синтеза на колаген, инхибиране на експресията на MMP-1 и MMP-3(които инхибират разграждането на колаген) и инхибират възпалението на кожата за облекчаване на стареенето на кожата (Фигура 8). Освен това нашите открития в течение

4. Изводи

В обобщение, това проучване потвърди, че хранителните добавки с колагенови пептиди от пилешки кости могат значително да облекчат стареенето на кожата, предизвикано от ултравиолетова радиация и D-галактоза чрез множество пътища, които включват насърчаване на синтеза на проколаген, инхибиране на разграждането на колаген, подобряване на нивото на антиоксиданти в кожата и инхибиране на възпаление; облекчаването е зависимо от дозата с СР. Подробно изследване показа, че CPs първо намаляват нивото на окисляване на кожата, инхибират експресията на ключовия транскрипционен фактор AP-1(c-Jun и c-Fos) и след това активират TGF-/Smad сигналния път за насърчаване синтеза на колаген, инхибират експресията на MMP-1 и MMP-3 за инхибиране на разграждането на колагена и инхибират възпалението на кожата за облекчаване на стареенето на кожата при мишки. В допълнение, активирането на лизозомите може също да бъде основният път за CPs за облекчаване на стареенето на кожата, което е достойно за последващи изследвания и проверка. Тези резултати предоставят теоретична основа за прилагане на колагенови пептиди за облекчаване на стареенето на кожата и разширяване на обхвата за цялостно използване на странични животински продукти във функционални храни.

Авторски принос: CC проектира, измери и написа ръкописа; ZX и HT проектираха и преработиха ръкописа; YL предоставя методически насоки; CG и YW прегледаха ръкописа. Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа.

Тази статия е извлечена от Nutrients 2022, 14, 1622. https://doi.org/10.3390/nu14081622 https://www.mdpi.com/journal/nutrients