Метформин защитава епителните клетки на лещата срещу стареене в модел на естествено остаряла мишка

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

ВЪВЕДЕНИЕ

Епителните клетки на лещата (LEC) образуват монослой от клетки, покриващи предната капсула на лещата и се простират до екваториалната дъга на лещата [1, 2]. Нормалната конструкция и функция на LEC са от съществено значение за поддържането на прозрачността и метаболитната хомеостаза на цялата леща[3]. Все повече доказателства сочат, че стареенето на LEC може да причини модификация, денатурация и агрегация на протеини на лещата, включително ензими и кристалини, като по този начин в крайна сметка води до помътняване на лещата или дори катаракта [3-5]. Свързаната с възрастта катаракта (ARC) остава водещата причина за зрителни увреждания и слепота, което сериозно засяга качеството на живот на възрастните хора [6]. Понастоящем няма ефективни стратегии за превенция на прогресията на ARC. Следователно е необходимо да се разработи фармакологична интервенция, която може да подобри прозрачността на лещата и да забави прогресията на ARC.

През последните няколко десетилетия учените постигнаха забележителен напредък в подобряването на здравето и удължаването на живота, използвайки няколко генетични, диетични и фармакологични интервенции [7]. Метформин (MET) е един от широко изследваните агенти против стареене. Съществени проучвания показват, че MET може да облекчи стареенето и да удължи здравословния живот в различни животински моделни системи. MET може не само да удължи живота на Caenorhabditis elegans, но и да подобри здравето и жизнеността му [8]. MET може да намали свързаното с възрастта и оксидативния стрес натрупване на увреждане на ДНК в стволовите клетки на средното черво на Drosophila, за да удължи техния живот [9]. Предишни проучвания също показват, че хроничното прилагане на ниски дози MET подобрява здравето и продължителността на живота на мишки [10]. Нещо повече, появяващите се доказателства показват, че когато пациенти с диабет се лекуват с MET, те проявяват ползи за оцеляване, дори в сравнение с контролите, които нямат диабет [11].

Моля, щракнете тук, за да научите повече

В допълнение към активността на МЕТ за насърчаване на продължителността на живота в различни моделни организми, МЕТ е насочен към множество клетъчни сигнални пътища за подобряване на свързаните с възрастта заболявания. Доказано е, че MET модулира аутофагията главно чрез активиране на протеин киназа (AMPK) с аденозин монофосфат (AMP) и предотвратява невродегенерацията и невровъзпалението, за да играе невропротективна роля при болестта на Паркинсон [12]. По подобен начин, MET подобрява свързаните с възрастта промени в чернодробните синусоидални ендотелни клетки чрез AMPK и ендотелните пътища на азотен оксид [13].cistanche дозировка redditОсвен това, хроничното активиране на AMPK от MET предотвратява кардиомиопатия чрез регулиране на автофагията при OVE26 мишки с диабет [14]. В допълнение, MET облекчава свързаното с възрастта сърдечно-съдово влошаване чрез засилване на автофагията и ограничаването на калориите [15]. Освен това лечението с MET може да инхибира свързаната с възрастта атеросклероза при ApoE-7-мишки и зайци, предизвикана от диета с високо съдържание на мазнини, значително предотвратявайки калцификацията на атеросклеротичните плаки, намалявайки нивата на високочувствителния С-реактивен протеин и потискайки активирането на ядрен фактор kappa B(NF-kB) път в кръвоносните съдове [16-18].

Въз основа на тези наблюдения, настоящото проучване се опита да проучи дали MET може да забави стареенето на ARC и основния молекулен механизъм. Нашите констатации са следните: (i) хроничното лечение с ниски дози MET забави стареенето на LEC в естествено остарели мишки, като по този начин инхибира непрозрачността на лещата; (i) AMPK пътят беше инактивиран и автофагичният поток беше нарушен в стареещите LEC; (i) ) хроничното лечение с ниска доза MET забави стареенето на LECs при естествено остарели мишки чрез активиране на AMPK пътя и засилване на аутофагията. Нашите констатации потвърждават предполагаемата роля на MET срещу стареенето и предоставят достатъчно доказателства, че MET може да се окаже възможна терапевтична опция за ARC.

РЕЗУЛТАТИ

Стареенето на LECs се свързва с ARC при естествено остарели мишки

Множество потенциални механизми на ARC, включително ефекта от стареенето, са подробно изследвани.ползи от екстракт от цистанче,Въпреки това, връзката между стареенето на LEC и ARC in vivo остава неясна. Ние предположихме, че стареенето на LECs може да доведе до ARC in vivo. Затова конструирахме модел на мишка на ARC. Нашите резултати разкриват, че прозрачността на лещата при естествено остарели мишки (по-възрастни мишки) е значително намалена в сравнение с тази в контролната група (млади мишки) (Фигура 1а). Както е показано на Фигура 1b, честотата на катаракта в естествено възрастната група е 95,23 процента. Тестът за оцветяване с H&E показва, че LECs в контролната група са с кръгла форма и са подредени правилно и плътността на нормалните LECs е относително висока, докато LECs на естествено остарелите мишки са с плоска форма и са подредени неравномерно, а плътността на стареещите LECs бяха значително намалени (фиг. 1c). В допълнение, оцветяването с SA- -Gal показа, че съотношението на стареещите LECs е повишено при естествено остарели мишки (фиг. 1d). Освен това, ние анализирахме протеиновата експресия на маркери, свързани със стареенето, чрез IHC оцветяване и Western blot анализ. IHC оцветяването разкрива, че експресията на p21 и p53 е повишена в LECs на естествено остарели мишки в сравнение с млади мишки (фиг. 1e, f). По същия начин, освен това открихме, че протеиновата експресия на p21 и p53 е по-висока в капсулите на лещите на естествено остарели мишки, отколкото в капсулите на лещите на млади мишки (фиг. 1g). Тези резултати предполагат, че стареенето на LECs е свързано с ARC при естествено остарели мишки.

Cistanche може да спре стареенето

Хроничното прилагане на ниска доза MET подобрява прозрачността на лещата и облекчава стареенето на LEC Преди да тестваме ефекта на метформин върху ARC, ние определихме дали хроничното приложение на ниска доза MET е безопасно за мишки. След лечение с MET в продължение на 10 месеца, 28 мишки (18 в групата с естествена възраст и 10 в групата с MET) умират от естествена смърт. Установихме, че живите мишки и в двете групи са здрави и няма значителна разлика в телесното тегло и теглото на органите между двете групи (Таблица 1). Следователно тези резултати показват, че дозировката на метформин, използвана в изследването, е безопасна за животните и може да се използва за последващи експерименти.

Впоследствие се прилага хронична ниска доза MET, за да се оцени дали MET може да инхибира непрозрачността на лещата и да облекчи свързаното с възрастта стареене на LECs при естествено остарели мишки. Както се очакваше, прозрачността на лещата в групата MET беше значително подобрена в сравнение с прозрачността на лещата в групата с естествена възраст (фиг.2а). В допълнение, морфологичните наблюдения потвърдиха, че лещата на групата MET показва намаляване на непрозрачността. Честотата на катаракта в групата с естествена възраст е 95,23 процента, докато тази в групата с MET е 19.00 процента (Фигура 2b). Тестът за оцветяване с H&E разкрива, че плътността на LEC в групата с MET е значително по-висока отколкото при естествено остарелите мишки (фиг. 2в). Освен това, LECs на групата MET са сравнително кръгли по форма в сравнение с тези на групата с естествена възраст (фиг. 2c). Оцветяването с SA- -Gal показа, че съотношението на стареещите LEC е значително намалено в групата с MET в сравнение с тази в групата с естествена възраст (фиг. 2d). IHC анализът разкрива, че експресията на p21 и p53 е намалена повече в LECs на групата MET, отколкото в групата с естествена възраст (фиг. 2e, f). По подобен начин Western blot анализът разкрива, че протеиновата експресия на p21 и p53 е забележително намалена в капсулите на лещите на групата MET в сравнение с тези на групата с естествена възраст (фиг. 2g). Тези резултати показват, че хроничното прилагане на ниска доза MET може да подобри прозрачността на лещата и да облекчи стареенето на LEC.

Хроничното прилагане на ниски дози MET отслабва стареенето на LEC в естествено остарели мишки чрез активиране на AMPK. Огромно количество данни подкрепя заключението, че активирането на AMPK е достатъчно за удължаване на продължителността на живота в моделни организми, увеличавайки неговата привлекателност като цел за дълголетие [19,20] . Като се има предвид тази теория, ние оценихме експресията на AMPK пътя в LECs на мишки. Относителното ниво на FAS mRNA беше намалено в групата с естествена възраст и се увеличи в групата MET (Фиг. 3а). Както е показано на Фиг.3b,c, експресията на фосфорилиран AMPKa (Thr172) и фосфорилиран ACC (Ser79) е намалена в LECs на естествено остарели мишки в сравнение с тези на млади мишки. Въпреки това, експресията на фосфорилиран AMPKa (Thr172) и фосфорилиран ACC (Ser79) е повишена в LECs на групата MET в сравнение с тези на групата с естествена възраст. В допълнение, Western blot анализът разкри, че протеиновата експресия на фосфорилиран AMPKa (Thr172) и фосфорилиран ACC (Ser79) е значително понижена в капсулите на лещите на естествено остарелите и нивата на протеинова експресия на фосфорилиран AMPKa (Thr172) и фосфорилиран ACC ( Ser79) са увеличени в капсулите за лещи на MET Group (фиг. 3d). Тези данни разкриват, че AMPK пътят е инактивиран в LECs на естествено остарели мишки. Освен това, хроничното прилагане на ниска доза MET отслабва стареенето на LECs в естествено остарели мишки чрез AMPK активиране.

Хроничното приложение на ниски дози MET възстановява автофагичния поток, за да облекчи стареенето на LECs при естествено остарели мишки. Предишни проучвания показват, че автофагията може да играе важна роля в борбата с неблагоприятните ефекти от стареенето [21,22]. За по-нататъшен анализ на молекулярните и клетъчни промени в лещата след третиране с MET, ние определихме експресията на LC3 и p62, тъй като те са широко приети като биомаркери на нивата на аутофагия. Както е показано на Фиг. 4а, относителното ниво на експресия на p62 mRNA се повишава значително в групата на естествена възраст в сравнение с тази на контролната група; въпреки това, относителното ниво на експресия на mRNA на p62 беше значително понижено в групата на MET в сравнение с това в групата с естествена възраст.цистанче чингис ханВ допълнение, IHC оцветяването разкрива, че нивата на асоциирания с микротубули протеин 1 лека верига 3(LC3-II/l) и p62 са повишени в LECs на естествено остарели мишки. Освен това, нашите резултати показват, че нивата на LC3-II/l и p62 са забележително намалени в LECs на групата MET (фиг. 4b, c). Протеиновите нива на LC3-ll и p62 бяха значително повишени в капсулите на лещите на групата с естествена възраст (фиг.4d). Като цяло спекулирахме, че автофагичният поток е нарушен в LECs на естествено остарели мишки и може да бъде възстановен чрез хронично прилагане на ниски дози MET, за да се облекчи стареенето на LECs при естествено остарели мишки.

ДИСКУСИЯ

Нелекуваната катаракта е водеща причина за слепота в световен мащаб, която се характеризира с помътняване на кристалната леща [23]. Епидемиологичните проучвания показват, че възрастта е доминиращият рисков фактор за катаракта, известна като ARC, и единственото лечение е хирургично отстраняване [24]. Предишни проучвания показват, че стареенето на LEC е основната причина за ARC [25]. Към днешна дата не е имало ефективни терапевтични средства за инхибиране на помътняването на лещата и за намаляване на стареенето на LECs без нежелани странични ефекти. Фокусът на настоящото изследване беше да се оцени молекулярната биологична основа за стареенето на LECs и механизмът за защита на нормалните LEC срещу стареене. Нашите резултати разкриха, че инактивирането на AMPK и увреждането на аутофагията е свързано със стареенето на LEC и ARC. Освен това открихме, че MET може да защити LEC срещу стареене и да инхибира помътняването на лещата чрез активиране на AMPK и подобряване на автофагията.

Стареенето е основен биологичен процес, придружен от общо намаляване на тъканната функция. С увеличаването на продължителността на живота свързаните с възрастта дисфункции като ARC се превръщат в сериозно здраве

въпроси [26]. Съобщава се, че стареенето на LEC участва в появата и развитието на ARC [5]. Нашите резултати разкриват, че LEC на естествено остарелите мишки са с плоска форма и са подредени неравномерно, а плътността на LEC намалява значително (фиг. 1c, d). В допълнение, експресията на свързаните със стареенето гени (p21 и p53) се регулира нагоре в LECs на естествено остарелите мишки (фиг. 1e, f, g). Нашите резултати предполагат, че стареенето на LEC е свързано с появата и развитието на ARC. Следователно, може да е необходимо точно разбиране на молекулярните механизми, лежащи в основата на стареенето на LEC, за да се даде обосновка за нови стратегии за лечение.

MET е най-широко предписваното перорално хипогликемично лекарство за диабет тип 2 в световен мащаб. Появяващите се доказателства показват, че MET има благоприятни ефекти върху здравето извън тези, свързани с подобряване на гликемията [27]. Потвърдено е, че механизмите на MET са важни за насочване към фундаментални пътища в биологичното стареене, като активиране на AMPK, увеличаване на автофагията, инхибиране на възпалението и упражняване на антиоксидантни ефекти [28]. При хора MET се използва в клиничната практика повече от 60 години; той има висок профил на безопасност и е уникално позициониран да се намеси в няколко ключови пътя, отговорни за стареенето и свързаните с възрастта заболявания. Ефектите от MET върху ARC и регулаторният механизъм на тези ефекти обаче никога не са докладвани. Следователно, в нашето проучване, хроничното прилагане на ниска доза MET при естествено остарели мишки подобрява прозрачността на лещата (Фиг. 2а) и отслабва стареенето на LEC in vivo (Фиг. 2).

Широко признато е, че MET активира AMPK пътя, който е потенциалният механизъм на MET за упражняване на ефект против стареене [29]. AMPK, клетъчен енергиен сензор, играе решаваща роля в регулирането на клетъчния енергиен баланс [30]. Няколко проучвания показват, че AMPK служи като интегратор и медиатор на няколко пътища и процеси, свързващи енергетиката с дълголетието. В нашето проучване открихме, че инактивирането на AMPK е характеристика на стареещите LECs при естествено остарели мишки (фиг.3). Впоследствие беше показано, че MET стимулира AMPK пътя, за да предотврати стареенето на LECs (фиг.3). Като утвърден активатор на AMPK, ролята на MET в превенцията на стареенето обикновено се приписва на неговите ефекти върху модулирането на сигналните пътища надолу по веригата, като възстановяване на автофагията, активиране на Sirt1 и Foxo1 и потискане на mTOR [31,32]. Нашето проучване предостави нова линия от доказателства, подчертаващи важността на AMPK функцията, активирана от MET, за предотвратяване на появата на ARC.

Както бе споменато по-горе, AMPK комуникира с множество пътища и протеини, за да упражни ефект против стареене, включително увеличаване на автофагията. Автофагията, възникваща като основен процес за осигуряване на дълголетие, привлече широк интерес като потенциална терапевтична цел за заболявания, свързани с възрастта. Автофагията е течен, многоетапен сложен биологичен процес. Пълният процес на автофагия се нарича автофагичен поток, който се използва широко за отразяване на нивото на автофагия. Като индикатор за автофагия, LC3-Il е здраво свързан с автофагозомната мембрана, която се разгражда от лизозомни ензими.Cistanche удължаване на животаПо подобен начин p62, специфичен за аутофагията субстрат, обикновено се разгражда в автофаголизозома и неговата експресия индиректно отразява нивото на аутофагия. В настоящото проучване нашите открития предполагат, че нивото на аутофагия отчетливо е намаляло в стареещите LEC (фиг. 4), докато MET обръща свързаното с възрастта увреждане на аутофагията (фиг. 4). Молекулярният механизъм против стареене на MET се приписва на основната функция на AMPK в клетките, тъй като той като цяло засилва автофагията чрез активиране на AMPK [33]. Освен това е показано, че MET увеличава директно аутофагията, като по този начин допринася за предотвратяването на стареенето [34]. Необходими са обаче по-подробни проучвания за изясняване на основните механизми, доказващи, че MET увеличава аутофагията чрез независим или зависим AMPK път.

Доказано е, че разпространението на ARC не е свързано със пола в популациите с азиатски произход [35, 36]. Следователно, ние не считаме пола за фактор, който може да повлияе на ARC. Нашето проучване трябва да се тълкува, като се вземат предвид горепосочените ограничения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В обобщение, ние доказахме, че инактивирането на AMPK пътя и свързаното с възрастта увреждане на аутофагията може да допринесе за стареенето на LECs и появата на ARC. В допълнение, данните от нашите експерименти разкриват, че MET ефективно забавя стареенето на LEC и образуването на ARC чрез активиране на AMPK пътя и увеличаване на аутофагията. Нашите открития са основна линия за по-нататъшно изследване на молекулярните механизми, които са полезни в ролята на MET по време на процеса на стареене на ARC и ще бъдат информативни за по-интензивни проучвания за разработването на нови стратегии срещу появата и развитието на ARC.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ Реактиви

MET е закупен от Bristol-Myers Squibb Company (Китай). Антитела срещу p21 (ab188224), p53 (ab131442), фосфорилиран AMPKa(p-AMPK)(Thr172)(ab133448), AMPKa1(ab32047), -актин (ab8226) и SQSTM1/p62 (3340-1) са получени от Abcam (MA, САЩ). Антитела срещу LC3 (12741) и фосфо-ацетил CoA карбоксилаза (p-ACC) (Ser79) (3661) са закупени от Cell Signaling Technology ( Масачузетс, САЩ).

Животни и лечение

Мъжки C57BL6J мишки, които са на възраст 3 и 8 месеца, са закупени от Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd. (Пекин, Китай). Мишките бяха настанени в условия с контролирана температура (температура, 20-25 градуса и относителна влажност, 55±15 процента) с 12-часов цикъл светлина/тъмнина, със свободен достъп до храна и вода. Всички процедури и протоколи, проведени върху животни, бяха одобрени от комисията по етика на медицинския университет в Харбин.

Мишките бяха разделени на следните три групи: (i) контролна група с млади мишки (на 3 месеца, телесно тегло=29.72± 1,66 g, n =40), получавали стандартна пречистена диета за мишки и вода ad libitum; Когато мишките бяха на възраст 10 месеца, 120 мишки бяха разделени на случаен принцип в две групи: група на естествена възраст и MET група. (i) естествено остаряла група (по-възрастни мишки, на възраст 20 месеца, телесно тегло=32.98±1,93 g, n=60) получиха стандартна пречистена диета за мишки и вода ad libitum; (ii) MET група ( 20 месеца, телесно тегло=31.21±2.81 g,n=60) се поддържа на стандартна пречистена диета за мишки и вода, докато мишките достигнат 10-месечна възраст; след което са започнати леченията. Мишките в групата MET бяха хранени с диета, допълнена с 0,1 процента MET (Bristol Myers Squibb, Китай) и вода свободно в продължение на 10 месеца.

изолиране на лещи и капсули за лещи

Мишките бяха евтаназирани чрез цервикална дислокация. Цялото око се изрязва веднага от всички експериментални животни и се поставя в стерилен физиологичен разтвор. Оптичният нерв се поставя нагоре и се фиксира с пинсети. След това се прави разрез на оптичния нерв, който влиза в окото, и склерата се изтегля назад, за да се разкрие лещата.цистанче нзВпоследствие използвахме пинсети, за да отстраним внимателно фрагментите от цилиарното тяло, прикрепени към екваториалната равнина на лещата. Веднага бяха направени снимки на новата леща и лещата бързо беше фиксирана с 4 процента параформалдехид при стайна температура. Целите капсули на лещата бяха бързо обелени от останалата леща, моментално замразени в течен азот и съхранени при 80 градуса C за последващи експерименти.

Хематоксилин и еозин (H&E)

Свежата леща веднага се фиксира с 4% параформалдехид при стайна температура и се поставя в парафин. За хистологично изследване тъканите се нарязват на 4-µm резени. След депарафинизация и рехидратация, приготвените парафинови срезове се оцветяват с разтвор на хематоксилин (Н) за 8 минути, последвано от 5 потапяния в 1% киселинен етанол (1% HCI в 70% етанол)

и изплакване с дестилирана вода. Впоследствие срезовете се оцветяват с разтвор на еозин (Е) в продължение на 3 минути, последвано от дехидратиране с градуиран алкохол и избистряне с ксилен. Морфологичните промени се наблюдават под микроскоп (Nikon, Eclipse, Япония).

Анализ на свързаната със стареенето -галактозидаза (SA- -Gal) Активността на свързаната със стареенето -галактозидаза (SA- -Gal) беше измерена чрез използване на комплект за оцветяване SA- -Gal (Sigma, CS{ {12}}030). Съгласно инструкциите на производителя, тъканните срезове, след серия от третирания, се промиват с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) в продължение на 5 минути (три пъти) и след това се инкубират в разтвор за оцветяване SA- -gal (рН 6,0) при 37 градуса без CO2 за 24 часа. Изображенията са заснети под светлинен микроскоп (Nikon, Eclipse, Япония). Процентът SA- -gal-позитивни клетки се оценява като среден брой положителни клетки/среден брой общи клетки.

Количествена полимеразна верижна реакция в реално време (gRT-PCR) Тоталната РНК от капсулите на лещите на мишки се екстрахира с помощта на реагента TRlzol. Обратната транскрипция беше извършена с ExScript RT Reagent Kit (Invitrogen). Количествен анализ на обратна транскрипция-полимеразна верижна реакция (qRT-PCR) беше извършен с помощта на SYBR Green Supermix

комплект (Takara, Токио, Япония), с -актин като ендогенна контрола. Транскрипциите бяха изследвани за няколко целеви гена, включително FAS (напред, 5'-TTGCTGGCACTACAGAATGC-3'и обратен, 5'-AACAGCC TCAGAGCGACAAT-3'), p62 (напред, 5'-GGCGCACTACCGCGATGAGGA{{ 10}} и обратно, 5'-TGTTCCCGCCGGCACTCCTT-3') и -актин (напред, 5 '-TCGTGGGCCGCCCTAGGCAC-3'и обратно, 5'-TGGCCTTAGGGTTC AGGGGGG-3'. Относителният нивата на всяка генна експресия бяха

метод. нормализиран до -актин и изчислен с помощта на 2-△△ct r Имунохистохимично (IHC) оцветяване. Общо 5 представителни секции от всяка от 10 избрани лещи на група бяха използвани за имунохистохимичен (IHC) анализ за оценка на експресията на p21, p53, p-AMPK, p-ACC, LC3 и p62. След като подготвените проби бяха инкубирани при 6 0 градуса за 2 часа, те бяха прекарани през ксилен и класифицирани алкохолни серии за депарафинизация. Впоследствие пробите се варят в 0.1 М лимонена киселина (рН 6.1) в продължение на 30 минути и се охлаждат до стайна температура. След промиване три пъти с PBS, пробите се накисват с 0, 3% H20, за да се инхибира ендогенната пероксидазна активност. Впоследствие се добавят първични антитела и се охлаждат при 4 градуса С за една нощ. Съответните вторични антитела се инкубират в продължение на 1 час при 37 градуса С. След промиване с PBS, пробите се инкубират в диаминобензидин (DAB), докато се развие желаният интензитет на оцветяване. Изображенията на имунооцветените клетки бяха заснети с помощта на микроскоп Nikon Eclipse (Nikon, Eclipse, Япония).

Western blot анализ

Общият протеин от капсулите на лещите на мишки се екстрахира с помощта на радиоимунопреципитационен анализ (RIPA) буфер с коктейл от протеазен инхибитор (Pierce, САЩ) и комплект с бицинхонинова киселина (BCA) (Thermo Fisher Scientific, САЩ) се използва за количествено определяне на концентрацията на протеин . Общият протеин (40 ug) се анализира с помощта на електрофореза с натриев додецилсулфат-полиакриламиден гел (SDS-PAGE) и се прехвърля електрофоретично върху мембрани с поливинилиден дифлуориден филтър (PVDF) (Millipore, Германия). Мембраните се инкубират за една нощ с първично антитяло при 4 градуса С. На следващия ден мембраните се инкубират със съответните вторични антитела за 1 час при 37 градуса С. Имунореактивните ленти се визуализират с помощта на метода на хемилуминесцентния субстрат със Super Signal West Pico комплект (Pierce Biotechnology, САЩ). Проведени са три независими експеримента.

Статистически анализ

Данните бяха изразени като средно ± стандартно отклонение (SD). Статистическите анализи бяха проведени с помощта на софтуера GraphPad Prism 7.0 и Microsoft Excel. Протеинът се определя количествено с помощта на софтуера Image J. t-тестът на Student и дисперсионният анализ (ANOVA) бяха използвани за изчисляване на статистическата значимост на експерименталните данни. Разлики с P-стойност<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" experiments="" were="" repeated="" independently="" at="" least="" three="">

НАЛИЧНОСТ НА ДАННИ

Наборите от данни, използвани и анализирани по време на настоящото проучване, са включени в тази публикувана статия.

Тази статия е извлечена от www.nature.com/cddiscovery