Анастатинови производни облекчават миокардна исхемия-реперфузионно увреждане чрез антиоксидантни свойства

За допълнителна информация, свържете се сtina.xiang@wecistanche.com

Резюме:(±)-Анастатини А и В са флавоноиди, изолирани от Anastatica hierochuntica. В предишно проучване са проектирани двадесет и четири ди- и три-заместени нови производни на анастатини и са оценени техните предварителни антиоксидантни активности. В настоящото проучване защитният ефект на миокардна исхемия-реперфузия (I/R) и системният антиоксидантен капацитет на 24 производни бяха допълнително проучени. Съединение 13 беше най-мощното сред всички изследвани съединения, което увеличи преживяемостта на клетките H9c2 до 80,82 процента. Антиоксидантната способност на съединение 13 беше оценена при антиоксидантна сила на редуциране на желязо, 2,2'-азино-бис (3-етилбензотиазолин-6-сулфонова киселина) радикално отстраняване и 2,2-дифенил{ {20}}пикрилхидразил анализи. Беше наблюдавано, че съединение 13 значително намалява инфарктните области и подобрява хистопатологичните и електрокардиограмните промени при плъхове с миокардно I/R увреждане. Нещо повече, съединение 13 намалява степента на изтичане на серумна лактат дехидрогеназа, креатин киназа и малонил диалдехид от миокардни тъкани на плъхове и повишава нивото на активността на глутатион и супероксид дисмутаза след товамиокардно I/R уврежданепри плъхове. Взети заедно, ние стигнахме до заключението, че съединение 13 има мощни кардиопротективни ефекти срещу миокардно I/R увреждане както in vitro, така и in vivo, поради обширните си антиоксидантни активности.

Ключови думи: производни на флавоноиди; H9c2 клетки; хипоксия/реоксигенация; кардиопротективни ефекти

Щракнете тук, за да получите повече информация за продукта

1. Въведение

Исхемичната болест на сърцето (ИБС) е водеща причина за смърт в световен мащаб [1]. Навременното възстановяване на кръвния поток може ефективно да подобри клиничния резултат от заболяването; въпреки това реперфузията не е без риск поради степента на клетъчно увреждане, причинено от самата реперфузия. Следователно е изключително важно да се разработят ефективни терапевтични стратегии срещу миокардно исхемично-реперфузионно (I/R) увреждане [2]. Механизмът на миокардно I/R увреждане е много сложен; включва апоптоза, оксидативен стрес [3], претоварване с калций [4] и възпаление [5].Оксидативен стресможе да доведе до апоптоза чрез различни пътища на сигнална трансдукция, включително сигнално-регулирана киназа (ERK), c-Jun амино-терминална киназа (JNK), активиране на p53 (туморен протеин p53) и p66shc вариант. Освен това, прекомерното производство на реактивни кислородни видове (ROS) може да причини необратимо увреждане на клетъчните мембрани и клетъчните молекули, като ДНК, нуклеинови киселини, протеини, липиди и да започне верижни реакции, като допълнително уврежда миокардната тъкан. Оксидативният стрес [6], който се причинява от дисбаланс между образуването на свободни радикали и поглъщането на ROS, играе важна роля в патогенезата на I/R увреждане I. Следователно, стратегиите, които предпазват миокарда от оксидативен стрес, са силно обмислени при управлението на миокардно I/R увреждане. Поради това, поради техните потенциални способности за поглъщане на свободни радикали, базираните на антиоксиданти стратегии са полезни при управлението на I/R наранявания.

В клинични проучвания антиоксидантите, използвани за намаляванемиокардно I/R уврежданесе разделят главно на два вида: ензими и неензими. Ензими като каталаза и глутатион пероксидаза намаляват концентрацията на водороден пероксид, за да предотвратят увреждане на клетките; неензимни антиоксиданти като витамин Е, витамин С, -каротин и др., Отслабват реакцията на оксидативния стрес на тъканта, за да намалят увреждането на тъканите и да насърчат функционалното възстановяване. Въпреки това, приложението и на двете в момента има определени ограничения. Голямата молекулна маса на ензимните препарати не благоприятства абсорбцията [8]. Съществуват и определени проблеми със стабилността на неензимите, което води до лоша стабилност на лекарствата, поради което те лесно се окисляват [9].Флавоноиди, като вид неензимни антиоксиданти, се съобщава, че притежават различни мощни свойства, включително антиоксидантна, противоракова, антиапоптотична и сърдечно-съдова защита [10]. Те предотвратяват образуването на силно реактивни оксиди и инхибират окислителните реакции чрез отстраняване на ROS, като водородни радикали и пероксинитрит. Анастатини А и В [11] са флавоноиди с хепатопротективна активност. Anastasius A и B са активни компоненти в Anastatica hierochuntica (подтип Anastatica, семейство Brassicaceae). Понастоящем има много малко доклади за химичния синтез и структурните модификации на анастатини А и В. През 2003 г. бяха изолирани активни съединения от Anastatica hierochuntica и беше разкрито, че имат хепатопротективни ефекти срещу индуцирана от D-галактозамин цитотоксичност в първично култивирани миши хепатоцити. Nakashima и Eman също са показали, че съединенията упражняват in vitro антиоксидантни и противоракови действия. Въпреки това, фармакологичните ефекти на анастатини А и В и техните производни, както и процедурите за техния синтез, остават неясни. Ето защо, ние имахме за цел да синтезираме анастатини А и В и някои от техните производни и да ги оценим за антиоксидантни активности при хипоксия/реоксигенация(H/R) модел, който е ефективен за изследване на миокардно I/R увреждане [12].

В предишно проучване ние синтезирахме анастатини А и В и техните аналози и оценихме техните антиоксидантни способности, използвайки модел на клетъчна култура на H2O2 (водороден пероксид)-индуцирано окислително увреждане13. Предишните ни резултати показаха, че анастатините А и В имат мощни хепатопротективни действия, които изглежда са свързани с техните антиоксидантни способности.

В настоящото изследване анастатини А и В и 24 от техните производни са синтезирани и оценени за антиоксидантни способности, като се използват тестове за намаляване на мощността и извличане на радикали. В допълнение, прост H9c2 клетъчен модел на H/R и плъши модел на миокардно I/R увреждане бяха използвани за оценка на кардиопротективните ефекти на съединенията.

2. Резултати

2.1. Създаване на H/R модел

Концентрацията на обработка с Na2S, O4 беше оценена, както е показано на Фигура 1А, и степента на преживяемост на H9c2 клетки беше намалена с увеличаване на концентрацията на Na2S2O4. При 4 mM Na, S, Oa жизнеспособността на клетките намалява до по-малко от 5 0 процента (13,7, 25 и 43,4 процента, съответно при времето за реоксигениране от 2,1 и 0 часа) и нивото на намаляване на клетъчната жизнеспособност е по-ниско. Следователно, 4 тМ концентрация на Na2S2O4 се използва за имитиране на хипоксично лечение. Фигура 1B показва, че третирането с 4 mM Na2S2O4 за 2 часа без реоксигениране (0 h) значително намалява жизнеспособността на клетките и остава стабилно. При условие на 4 mM концентрация на NazS2O4 за 2 часа имитираща хипоксия, 2 часа реоксигенация намалява степента на оцеляване на клетките до 17,37 процента (Фигура 1C). Както е ясно показано на Фигура 1D, 10 μM ресвератрол обръща намалената клетъчна жизнеспособност, причинена от H/R, която е по-мощна от същата концентрация на галова киселина (74,34 срещу 60,44 процента за галова киселина).

В резултат на това моделът на хипоксия/реоксигенация беше установен чрез използване на Na2S, O4 при крайна концентрация от 4 mM за 2 часа имитиране на хипоксия, последвано от култура в нормална DMEM (модификация на Dulbecco на среда на Eagle)/висока глюкоза за имитиране на увреждане на реоксигенацията . Ресвератрол в крайна концентрация от 10 μM се използва като положителна контрола.

2.2. Анастатините и техните дериотии подобряват жизнеспособността на H9c2 клетките, подложени на H/R лечение

Първо, изследвахме ефектите на анастатини A и B (Фигура 2A, B) и техните производни върху жизнеспособността на H9c2 клетки в MTT(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1){{ 10}},5-ди-фенилтетразолиумромид) анализ [13]. Съединения 20a, 21a, 22a, 20b, 22b, 20c, 20c', 21c, 22c, 10 и 11 не са значително цитотоксични за H9c2 клетки (Фигура 3A, B, Таблица S2). Анастатини A и B, техните производни и ресвератрол (положителна контрола) обърнаха клетъчно увреждане, предизвикано от хипоксия (Фигура 4). В моделната група клетъчната жизнеспособност беше намалена до 20,31 процента, което беше увеличено до 82,68 процента от ресвератрол, а анастатин А и съединения 22b, 22c, 24b, 24c, 13 и 14 увеличиха степента на клетъчно оцеляване до повече от 70 процента ( 71.49,71.00,76.50, 73.24,77.57, 80.82 и 77.13 процента, съответно). Следователно, съединение 13 (Фигура 2C) има най-силния защитен ефект сред анастатиновите производни от H/R увреждане и е използвано в следващите експерименти.

2.3. Съединение 13 облекчава H/R-индуцираното увреждане на клетките и оксидативния стрес

За да изследваме антиоксидантния капацитет на съединението, триоксидативен стресиндикатори, LDH (лактат дехидрогеназа), GSH (L-глутатион) и SOD (супероксид дисмутаза), бяха избрани за оценка на антиоксидантния капацитет на съединенията. LDH е стабилният цитоплазмен ензим, присъстващ в клетките на миокарда, който бързо се освобождава от клетка в среда за клетъчна култура при увреждане на миокардната клетъчна мембрана. Колкото по-сериозно е нараняването, толкова по-високо е нивото на LDH в хранителната среда. Фигура 5A демонстрира, че 2 часа хипоксия, последвана от 2 часа реоксигенация, значително увеличава освобождаването на LDH (478,98 U/L спрямо 55,84 U/Lin празната група, p<0.001), which="" was="" inhibited="" by="" resveratrol="" (284.07="" u/l="" vs.="" the="" model="" group=""><0.01) and="" compound="" 13(276.61="" u/l="" vs.the="" model="" group,=""><0.001).gsh can="" act="" as="" a="" hydrogen="" donor="" for="" glutathione="" catalase="" (cat),="" eliminating="" o2-="" and="" its="" derivatives="" in="" the="" organism,="" thereby="" cells="" are="" protected="" from="" oxidant="" damage.="" additionally,="" sod="" can="" catalyze="" the="" disproportionation="" of="" superoxide="" anions="" and="" protect="" cells="" from="" damage.="" as="" shown="" in="" figure="" 5b,="" c,="" compound="" 13="" significantly="" increased="" gsh="" release="" and="" sod="" activity=""><0.01）. it="" increased="" gsh="" level="" to="" 39.93="" μmol/gprot="" which="" was="" higher="" than="" the="" level="" in="" the="" model="" group="" （18.2="" μmol/gprot）="" but="" slightly="" lower="" than="" that="" in="" the="" resveratrol="" group.="" additionally,="" it="" reversed="" h/r-induced="" reduction="" in="" sod="" activity="" by="" increasing="" sodlevel="" from="" 12.00="" u/mgprot="" to="" 22.98="" u/mgprot.="" these="" findings="" demonstrate="" that="" compound="" 13="" has="" a="" protective="" effect="" on="" h9c2="" cells="" subjected="" to="" h/r="">

2.4. Антиоксидантен капацитет на съединение 13

Vitamin C(Vc) was used as an antioxidant control in order to evaluate the antioxidant effects of resveratrol and compound 13 intuitively. FRAP assay was used to evaluate the reducing power of the compound that can transfer ions from Fe3+ into Fe2+ to determine the antioxidant capacity of compounds. The results of the experiment showed that the reducing power of compound 13 was 354.80 mg/mmol, significantly stronger than the values obtained for the positive control Vc (127.47 mg/mmol) and resveratrol (261.91 mg/mmol) (Figure 6A).ABTS (2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)and DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) are stable free radicals insolvent, but when a radical scavenger is added to the solvent, the result is a reduction in the number of free radicals and the degree of reduction in the number of free radicals is directly proportional to the antioxidant capacity. Figure 6B, C show the ABTS and DPPH radical scavenging abilities of compound 13. The results indicate that compound 13 had the strongest scavenging activity on ABTS and DPPH with EC50 values of 1.38 and 0.07 mM, respectively. The antioxidant capacities of the compounds tested in all three antioxidant assays followed the same trend: compound 13>ресвератрол. Следователно, антиоксидантният капацитет на съединение 13 може да бъде по-висок от този на други типични антиоксиданти.

2.5. Ефекти на анастатин производно 13 върху миокардно I/R увреждане при плъхове

2.5.1. Ефекти на съединение 13 върху оксидативния стрес и активността на антиоксидантните ензими

Нивото на увреждане на миокарда се оценява чрез откриване на маркера за оксидативен стрес и активността на антиоксидантните ензими. Бяха оценени ефектите на съединение 13 върху активността на MDA (малондиалдехид) в миокардната тъкан, както и нивата на LDH, CK (креатин киназа), GSH и SODin серум. Както е показано на Фигура 7, I/R нараняването е довело до повишаване на нивата на LDH (Фигура 7A) и CK (Фигура B) и значително намаляване на активността на GSH (Фигура 7C) и SOD (Фигура 7D) (p<0.001). the="" level="" of="" mda(figure="" 7e)increases="" after="" i/r="" injury,="" which="" is="" a="" critical="" diagnostic="" marker="" of="" i/r="" injury.="" however,="" pretreatment="" with="" a="" positive="" control="" drug="" and="" different="" concentrations="" of="" compound="" 13="" significantly="" alleviated="" these="" injuries.="" ldh="" activity="" obtained="" for="" the="" i/r="" model="" group="" was="" 771.37="" u/ml,="" which="" was="" remarkably="" decreased="" to="" 416.129="" u/ml="" under="" resveratrol="" treatment.="" in="" the="" high-and="" low-dose="" 13="" groups,="" ldh="" activity="" decreased="" to="" 408.05="" and="" 462.81="" u/ml,="" respectively="" similar="" trends="" were="" observed="" for="" other="" myocardial="" injury="" markers,="" including="" the="" level="" of="" ck,="" gsh,="" sod,="" and="" mda="" release.="" these="" results="" indicated="" that="" compound="" 13="" exerted="" protective="" effects="" against="" oxidative="" stress-induced="" i/r="" injury="" in="" a="" dose-dependent="">

2.5.2. Ефекти на съединение 13 върху промените в електрокардиограмата (ЕКГ) и сърдечната честота

Типичните промени в ЕКГ (електрокардиограма), предизвикани от миокардно I/R увреждане, са показани на Фигура 8. В сравнение с нормалната ЕКГ (Фигура 8A), миокардното I/R увреждане може да причини увеличение на амплитудата на ORS (част от електрокардиографската вълна) (Фигура 8B); Сливане на QRS вълна и ST вълна (Фигура 8C); Елевация на ST сегмента (интервала между S вълната и Т вълната) (Фигура 8D); и инверсия на ST-сегмент (Фигура 8E). След 15 минути лигиране на LAD, амплитудата на QRS беше значително повишена от около 0.5 mV до 1,2 mV в моделната група (Фигура 9A), докато по-ниско увеличение на амплитудата на QRS беше наблюдавано във всички групи на лечение (от около 0.4 mV до 1,0.8 и 0.6 mV съответно за групата с ресвератрол, ниска доза 13 и висока доза 13) (Фигура 9B-D ). Освен това, подобна тенденция се наблюдава при лигиране от 30 минути. По време на реперфузията амплитудата на QRS започва да намалява; въпреки това QRS вълната в моделната група остава най-висока за целия период. След 20 минути реперфузия, амплитудата на QRS в моделната група намалява до около {{30}}.8 mV, стойността в групата на лечение е около 0,6, 0,5, 0,5 mV за групата с ресвератрол, ниска доза 13 и висока доза 13, съответно. Като цяло, лечението с ресвератрол, ниска доза 13 и висока доза 13 намалява патологичното увеличение на амплитудата на QRS в сравнение с моделната група по време на исхемията и ранния процес на реперфузия, което може да се отдаде на тяхната миокардна защитна активност.

Наред с мониторирането на ЕКГ, промените в сърдечната честота бяха открити отблизо. Както е показано в таблица S3, 30 минути лигиране намалява драстично сърдечната честота във всички групи, докато не са открити значителни разлики между нито една от групите на лечение и групите на модела. След 2 часа реперфузия сърдечната честота се повишава, но не са открити значителни промени сред нито една от групите.

2.5.3. Ефекти на съединение 13 върху инфарктната област и хистопатологични промени

За да се оцени нивото на миокардно увреждане, сърдечните тъкани се оцветяват с TTC (2,35-трифенилтетразолиев хлорид) и се откриват хистопатологични промени. Както е показано на фигура 10, във фиктивната група не са наблюдавани промени в миокарда след оцветяване с TTC, докато в I/R групата е наблюдавана скала от около 30 процента бели инфарктни зони. В групата с ресвератрол и групите с ниска доза 13 инфарктните зони бяха значително намалени до около 10 процента, а инфарктната зона в групите с висока доза 13 беше сведена до минимум до около 5 процента. Фигура 10 показва резултата от изследването на оцветяването с HE (хематоксилин-еозин): в тъканните срезове от моделната група се наблюдава увеличение на сърдечни клетки, частично разтворени мембрани и ядра и възпалителна клетъчна инфилтрация. Въпреки това, предварителната обработка със съединение 13 значително облекчава тези хистопатологични промени. Резултатите от ТТС оцветяване и НЕ оцветяване показват, че съединение 13 може да намали I/R-индуцирания миокарден инфаркт по дозозависим начин.

3. Дискусия

Насочвайки се към потенциалната антиоксидантна активност на анастатини А и В, нашата лаборатория синтезира 24 производни на анастатини и проведе предварителен анализ на цитотоксичността на съединенията срещу PC-12 и техните цитопротективни активности при HO,-индуцирано оксидативно увреждане [13] . В това проучване ние основно проведохме задълбочена биологична оценка на 13 от 24-те производни с най-силна антиоксидантна активност.

В настоящото проучване миокардното I/R увреждане е установено в H9c2 клетки чрез индукция с H/R лечение. Резултатите от проучването показват, че анастатини А и В и техните изследвани производни подобряват жизнеспособността на клетките H9c2 след лечение с H/R. Установено е, че съединение 13 е най-мощното сред 26-те изследвани съединения и следователно е избрано за допълнителна оценка. Активността на LDH (маркер за клетъчно увреждане), SOD и GSH (маркери за оксидативен стрес) бяха открити в супернатантите на H9c2 клетки след H/R лечение. Установихме, че предварителната обработка с тестовите съединения значително намалява нивата на LDH и повишава нивата на SOD и GSH в клетките. По този начин предположихме, че производните на анастатин притежават кардиопротективна активност, която може да се дължи на способността им да потискат оксидативния стрес. Анализите DPPH и ABTS се използват за оценка на способността на съединението да улавя радикали [14]. В резултат на това съединение 13 има висока антиоксидантна сила и пречиства ABTS и DPPH при ниски стойности на EC50, което допълнително показва потискане на оксидативния стрес. LAD лигирането е обичаен метод, използван за установяване на миокардни I/R модели. Чрез оценка на амплитудата на QRS комплекса преди исхемия, след исхемия и след реперфузия, ние открихме, че предварителното третиране със съединение 13 може значително да облекчи вентрикуларната аритмия по време на исхемия и ранна реперфузия. Освен това, съединение 13 повлиява зоните на инфаркт и хистопатологичните промени на инфаркта на миокарда също. Тези резултати, заедно с констатациите, че съединение 13 потиска оксидативния стрес и повишава нивата на антиоксидантни ензими в серума на плъх по дозозависим начин, показват, че съединение 13 има мощен ефект срещу увреждане на миокарда.

В заключение, производните на анастатин имат мощни антиоксидантни способности, като съединение 13 показва най-високата антиоксидантна активност сред тестваните съединения. Механизмите, отговорни за ефекта на производните на анастатините върху свързаните с оксидативния стрес сигнални пътища, все още трябва да бъдат обсъдени. Астаксантинът (подвид на каротеноида) може да почисти ROS и допълнително да облекчи исхемичното/реперфузионното увреждане [15]. Лекарства с потенциал да предотвратят генерирането на ROS могат да бъдат обещаващи при заболявания, свързани с оксидативен стрес [4], като клетъчна терапия и сърдечно-съдови заболявания. Освен това, ROS потиска хипоксичната индукция на експресията на прицелен ген на индуцируем от хипоксия фактор -1 (HF-1), за който се съобщава, че има кардиопротективен ефект върху исхемично-реперфузионно увреждане [16]. Ние предполагаме, че ROS и HIF-1 регулаторните протеини могат да играят решаваща роля в кардиопротективния ефект на съединение 13. Турнефолиевата киселина B (TAB), която се извлича от китайската билкова медицина, предпазва от миокардно I/R увреждане [17 ]. Проучването разкрива важната роля на TAB в стреса на ендоплазмения ретикулум (ER), апоптозата и пътищата на PI3K (фосфатидилинозитол 3 киназа)/AKT (протеин киназа B) при лечението на миокардно I/R увреждане. Други пътища, като пътя на митоген-активираната протеин киназа (MAPK) [18] и AMPK (аденозин 5'-монофосфат-активирана протеин киназа) сигнален път [19], също могат да бъдат включени в миокардно I/R увреждане. Следователно, следващата стъпка е да се започне с ROS и HIF-1 регулаторни протеини и да се използват TAB-медиирани пътища, за да се изследват механизмите, чрез които 13 упражнява антиоксидантен ефект и защитава миокардния I/R. Освен това, експериментите на клетъчно ниво в това изследване трябва да се извършват и в човешки клетъчни линии.

4. Материали и методи

4.1.Клетъчна култура

Клетъчна линия H9c2 на кардиомиоцити на плъх е закупена от Nanjing Kebai Biotechnology Company (Nanjing, Китай). Клетките се култивират в DMEM/High glucose (Hyclone, USA) и се допълват с 10 процента FBS (Lanzhou Minhai Biological Engineering co.LTD, Lanzhou, Китай) и 1 процент пеницилин/стрептомицин (Hyclone, Marlborough, MA, USA) във влажен инкубатор при 37 градуса с 5 процента CO2.

4.2. Анализ на клетъчната жизнеспособност

Клетъчната жизнеспособност се измерва с помощта на МТТ анализ. H9c2 клетки се посяват в 96-плака с ямки при 1 × 10* клетки/ямка за 24 часа. След това клетките бяха третирани с анастатини А и В и техните производни в продължение на 48 часа или предварително третирани с анастатини А и В и техните производни, последвано от H/R лечение. След това се добавя МТТ （20 μL/ямка） и се култивира при 37 градуса за 4 часа. Абсорбцията се измерва при 578 nm с помощта на четец на микроплаки (Tecan, Infinite 50). Жизнеспособността на клетките в празната група се счита за 100 процента.

4.3. Модел на хипоксия/реоксигенация (H/R) и администрация на лекарства

4.3.1.H/R модел

NazS, O4 беше използван за имитиране на хипоксично състояние, което реагира с [20] кислород и намалява напрежението на кислорода. Бяха проведени различни седем концентрации на 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 mM, за да се определят оптималните концентрации на Na2S, O4. За да се избере оптимално време на хипоксия, се провеждат култури от 0.5, 1, 2, 3 или 4 часа след третиране с разтвор на Na2S2O4. Култивирането при нормална DMEM/среда с високо съдържание на глюкоза за 0, 1, 2, 3 или 4 часа се провежда, за да се имитира времето за реоксигениране [21].

4.3.2. Лекарствена администрация

За администриране на лекарства анастатини А и В и техните производни (химични структури в Таблица S1) бяха разделени на две групи: анастатини А и неговите производни и анастатини В и неговите производни. Ресвератролът, за който се съобщава, че има кардиопротективен ефект чрез своята антиоксидантна активност, е използван като положителна контрола. За да се определи концентрацията на положителната контрола, ресвератролът и друго антиоксидантно съединение, галова киселина （3-100 μM）, бяха оценени с помощта на МТТ анализ, при който клетките бяха третирани в продължение на 48 часа 【22】. Като цяло, H9c2 клетките бяха предварително третирани с анастатини А и В и техните производни (10 uM крайна концентрация), както и 10 uM ресвератрол за 30 минути преди H/R лечение.

4.4. Оценка на антиоксидантния капацитет

4.4.1. Тест за намаляване на желязо антиоксидантната сила (FRAP).

FRAP анализът беше направен съгласно метода на Oivuan 【23】. Общо 25 μL от 1 процент калиев ферицианид K3Fe（CN）6 се пипетират и 10 μL от съединение 13, витамин c (аскорбинова киселина, Vc) и ресвератрол (0.{{8} } mM) плюс 1 × PBS (рН =6.6) бяха добавени. Сместа се държи в 50-градусова водна баня за 20 минути, последвано от бързо охлаждане с лед. След това бяха добавени последователно 25 μL от 10 процента трихлороцетна киселина (TCA), 0,1 процента железен хлорид (FeCl) и дестилирана вода. Сместа се прехвърля в 96-плака с ямки и абсорбцията се анализира при 650 nm. Vc разтвор (20-200 ug/mL) се използва за изграждане на стандартна крива. Антиоксидантните способности бяха изчислени от линейната калибровъчна крива и представени като Vc еквиваленти.

4.4.2. ABTS метод

Активността за отстраняване на радикали ABTS [24] се извършва съгласно Sugahara et al. и Re et al. Разтворът на ABTS се разрежда, за да се регулира абсорбцията спектрофотометрично при 650 от 0.70±0.02 nm, и активностите на ABTSscavenging се измерват съгласно следната формула, E=((Acontrol-Ablank)-(A2 -A1)/(A control-Ablank))× 10, където Control е абсорбцията на контролната реакция, съдържаща 130 μL ABTS · плюс работен разтвор и 5,5 μL разредител на пробата （DMSO）, а Ablank е абсорбцията на 130 μL натриев ацетатен буфер и 5,5 μL DMSO. A е абсорбцията на 130 μL ABTS плюс работен разтвор （натриев ацетатен буфер） и 5,5 μL от съединение 13（0.02-20 mM）, а Az е абсорбцията на 130 μL натриев ацетатен буфер и 5,5 μL от съединение 13 （ 0.02-20 mM）. Всички смеси се разбъркват на вортекс за 30 s и се инкубират при стайна температура за 10 min, последвано от измерване на абсорбцията при 650 nm. ECs0 се изчислява като се използва линейната връзка между концентрацията на съединението и вероятността за процента на ABTS инхибиране.

4.5. Модел на исхемия-реперфузия

4.5.1. Грижи за животните

Плъхове Sprague Dawley (SD) са получени от PLA Военна академия на медицинските науки Laboratory Animal Center (Пекин, Китай). Петдесет мъжки SD плъха с тегло от {{0}} g бяха аклиматизирани за една седмица при стайна температура от 23±1 градуса с 12-часов цикъл светлина/тъмнина и бяха осигурени храна и вода. Плъховете бяха разделени на пет групи: празна група (плъхове не получиха лечение, а фиктивна операция), моделна група (плъхове получиха лечение с носител и операция MI/R), група с ресвератрол (плъхове получиха 200 mg/kg ресвератрол и MI/R операция), групата с ниска доза 13 (плъхове получават 100 mg/kg съединение 13 и операция MI/R) и групата с висока доза 13 (плъхове получават 200 mg/kg съединение 13 и операция MI/R). Съединенията се формулират в 0,5 процента натриева карбоксиметилцелулоза и се дозират като суспензия при 1 mL/kg перорално веднъж дневно в продължение на седем дни. Всички експерименти с животни са проведени в съответствие с ръководството на Националния здравен институт за грижа и използване на лабораторни животни и са одобрени от Академичния комитет на Университета за наука и технологии в Тиендзин.

4.5.2. Експериментален протокол

Плъхове Sprague Dawley бяха анестезирани с 20 процента уретан (0,8 mL/100 g) и след това извършихме миокардна исхемия чрез ляво предно низходящо (LAD) лигиране. Сърцето беше изложено през ляв торакален разрез и поставено върху 4-0 копринен шев за извършване на регионална исхемия за 30 минути исхемия, последвана от 2 часа реперфузия. Данните за миокардна исхемия се потвърждават от елевация на ST-сегмента и увеличаване на амплитудата на QRS. По време на експеримента плъховете се поддържат на вентилатор DW3000 (Beijing Zhishu Duobao Biological Technology Co. Ltd, Пекин, Китай). Сърдечната честота и ЕКГ бяха наблюдавани чрез системата за придобиване на биологичен сигнал MD3000 (Beijing Zhishu Duobao Biological Technology Co. Ltd, Пекин, Китай). След проследяване на процеса на исхемия/реперфузия, плъховете бяха умъртвени и кръвни проби и сърдечни хомогенати бяха използвани за откриване на миокардно увреждане с помощта на детективски търговски комплекти.

4.5.3. TTC оцветяване и HE оцветяване

Степента на исхемичната зона се определя количествено чрез оцветяване с трифенил тетразолиев хлорид (TTC). Сърдечните проби бяха замразени незабавно при {{0}} градуса за 10 минути и бяха направени пет резена от тънки 1 до 2 mm резени. След това срезовете се поставят в 1% TTCфосфатен буфер (рН =7.0) и се оцветяват при 37 градуса за 20 минути и се фиксират във формалин. Изображенията са получени с помощта на цифрова камера и процентът на инфарктната зона (TTC-отрицателна) и зоната в риск (TTC-положителна) са измерени с помощта на софтуера ImageJ [25]. За HE оцветяване, инфарктната зона се изрязва и фиксира в 10 процента формалдехид и след това се поставя в парафин. След това тъканите се оцветяват с HE (хематоксилин-еозин) и се изследват под светлинен микроскоп. Дехидратираните вградени секции и запечатващите секции бяха поръчани от Tianjin YiSheng Yuan Biotechnology Company (Тиендзин, Китай).

4.6. Спектрофотометрични търговски комплекти

Търговските комплекти, използвани в това изследване, са закупени от Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd. (Пекин, Китай) и Nanjing Jiancheng Bioengineering Company (Nanjing, Китай). В серум на плъхове и клетъчен супернатант, маркер за миокардно увреждане, лактат дехидрогеназа (LDH) ), бяха оценени активностите на креатин киназа (CK), глутатион (GSH) и супероксид дисмутаза (SOD). Активностите на малондиалдехид (MDA) се измерват с помощта на хомогенат на сърцето на плъх. Всички търговски комплекти бяха проведени в съответствие с инструкциите на производителя.

4.7. Процес на статистика

Всички експерименти бяха повторени поне три пъти. Експерименталните данни бяха обработени с помощта на софтуера GraphPad Prism7 и експерименталният резултат на всяка група беше изразен като средно ± стандартно отклонение (x± s). Използван е t-тест за сравняване на статистическата значимост между групите. П<0.05 was="" recorded="" as="" statistically="">

Препратки

1. Узденски, А. Б.; Демяненко, С. Хистоново ацетилиране и деацетилиране при исхемичен инсулт. Невронна регенерация. Рез. 2021, 16, 1529–1530. [CrossRef] [PubMed]

2. Ли, Х.; Ин, А.; Cheng, Z.; Фън, М.; Джан, Х.; Xu, J.; Wang, F.; Qian, L. Атенюацията на Na / K-ATPase / Src / ROS сигнален път за усилване с pNaktide подобрява миокардната исхемия-реперфузионно увреждане. Вътр. J. Biol. Macromol. 2018, 118, 1142–1148. [CrossRef] [PubMed]

3. Левин, RM; Xia, L.; Wei, W.; Schuler, C.; Легет, RE; Lin, ADY Ефекти на Ganoderma Lucidum, счупени от обвивката на спорите върху оксидативния стрес на пикочния мехур на заека, използвайки in vivo модел на исхемия/реперфузия. Mol. клетка. Biochem. 2017, 435, 25–35. [CrossRef] [PubMed]

4. Тан, З.; Liu, H.; Песен, X.; Линг, Й.; Той, С.; Ян, Й.; Ян, J.; Wang, S.; Уанг, X.; Chen, A. Honokiol след лечението подобрява миокардната исхемия/реперфузионно увреждане чрез засилване на автофагичния ефлукс и намаляване на вътреклетъчното производство на ROS. Chem. Biol. Взаимодействайте. 2019, 307, 82–90. [CrossRef] [PubMed]

5. Хаузенлой, DJ; Yellon, DM Миокардно исхемично-реперфузионно увреждане: пренебрегвана терапевтична цел. J. Clin. разследване. 2013, 123, 92–100. [CrossRef]

6. Ю, К.; Ли, Д.; Li, Z.; Ю, Д.; Zhai, G. Ефект на сакубитрил / валсартан върху възпаление и оксидативен стрес при модел на индуцирана от доксорубицин сърдечна недостатъчност при зайци. Acta Pharmaceut. 2021, 71, 473–484. [CrossRef]

7. Уанг, Й.; Che, J.; Zhao, H.; Танг, Дж.; Shi, G. Platycodin D инхибира оксидативния стрес и апоптозата в H9c2 кардиомиоцитите след увреждане на хипоксия/реоксигенация. Biochem. Biophys. Рез. Общ. 2018, 503, 3219–3224. [CrossRef]

8. Павлович, М.; BNáfrádi Rouster, P. Високо стабилен имитиращ ензим нанокомпозит с антиоксидантна активност. J. Colloid Interface Sci. 2019, 543, 174–182. [CrossRef]

9. Qi, HZ; Ванги, WZ; Той, JY Антиоксидативна система на Deinococcus radiodurans. Рез. Microbiol. 2019, 171, 822–831. [CrossRef]

10. Шао, Л.; Шао, Й.; Yuan, Y. Pinocembrin flavanone инхибира клетъчната жизнеспособност при PC-3 човешки рак на простатата чрез индуциране на клетъчна апоптоза, производство на ROS и спиране на клетъчния цикъл. Acta Pharmaceut. 2021, 71, 669–678. [CrossRef]