Част 2: Противовъзпалителни, антиоксидантни, овлажняващи и антимеланогенезни ефекти на кверцетин 3-O- -D-глюкуронид в човешки кератиноцити и меланомни клетки чрез активиране на NF-κB и AP-1 пътища

За повече подробности, свържете се сtina.xiang@wecistanche.com

Щракнете върху връзката, за да научите част 1:https://www.xjcistanche.com/news/part-1-anti-inflamator-antioxidant-moistu-55118257.html

3. Дискусия

В предишни публикувани проучвания Q-3-G е използван за инхибиране на оток на ушите, перитонеален пермеабилитет и белодробен оток [50], действайки като мощенантиоксидантв кръвна плазма с липопротеин с ниска плътност [42], намалявайки индуцираната от пероксинитрит окислителна модификация [51], упражнявайкипротивовъзпалителноефект чрез инхибиране на JNK и ERK сигнални пътища при предизвикателство с LPS [52] и притежаване на противоракови свойства срещу клетки от рак на гърдата [56]. Въпреки това, за разлика от своето широко изследвано изходно съединение,кверцетин, фармакологичните ползи и механизмите на Q-3-G остават да бъдат проучени. Доколкото ни е известно, ролята на Q-3-G върху защитните ефекти на кожата не е напълно изяснена. В това проучване, използвайки различни in vitro оценки, ние се съсредоточихме върху характеризирането на кожните защитни ефекти на Q-3-G срещу UVBor H2O2, индуциран от оксидативен стрес и възпаление, хидратация на кожата в HaCaT (клетъчна линия от човешки кератиноцити) иантимеланогенезаактивност в B16F10 (клетъчна линия на миши меланом).

Жизнеспособността на клетки HaCaT, B16F10 и HEK293T се определя след третиране с Q-3-G в диапазон от нецитотоксични концентрации. Резултатите показват, че няма значително инхибиране на клетъчната жизнеспособност в HaCaT, B16F10 и HEK293T клетки при концентрации на Q-3-Gup до 20 μM （Фигури 2a, 3a и 4f）. Установено е, че клетъчната жизнеспособност в HaCaT, B16F10 и HEK293T клетки при концентрации на O-3-G до 20 μM е по-ниска от концентрацията на кверцетин, когато се използва за изследване на цитотоксичните ефекти при SCC{{18} } и HSC-6 клетки（50 μM）【57】или жизнеспособност на спермата （50-100μM）【58】. Доказано е обаче, че Q-3-G е много по-малко токсичен в сравнение с неговия агликон [59]. Липсата на свободна ОН група в три позиции може да допринесе за по-малко токсичен ефект на Q-3-G [29].

UVB лъчите с дължина на вълната 280-315 nm проникват в горния слой на кожата и са по-ефективни от UVA и UVC[60]. UVB лъчите са причина за повечето видове рак на кожата и клетъчна смърт. Освен това е доказано, че клетъчното увреждане в HaCaT клетките се индуцира от UVB облъчване [61]. Следователно, ние изследвахме клетъчната жизнеспособност на HaCaT клетки след UVB облъчване в сравнение с Q-3-G лечение. Както е показано в предишни доклади, един от основните фактори, които водят до увредени клетки, тъкани и органи, е излагането на UVB [62,63]. Q-3-G възстановява намалената клетъчна жизнеспособност, предизвикана от UVB облъчване (Фигура 2b-d). Показано е, че резултатите са подобни на предишното проучване за ефекта и механизма върху UVB-индуцираната цитотоксичност в HaCaT на кверцетин [64].

Кликнете върху нея, за да получите повече информация за продуктите

Няколко проучвания описват, че UVB може да насърчи тежки възпалителни реакции, водещи до проблеми в кожата [1,2,4,27]. UVB активира важни провъзпалителни ензими като COX-2 и цитокини като TNF-. COX-2 е свързан с възпалението ензим, който се задейства от провъзпалителни цитокини и медиатори [65], което стимулира възпалителния отговор. Тъй като COX-2 произвежда възпалителния медиатор PGE-2, той индуцира възпалителен отговор [66,67], а TNF- е основният провъзпалителен цитокин [68] във възпалителните отговори. Тези възпалителни реакции причиняват увреждане на кожата, което води до стареене на кожата [69]. Нивата на експресия на иРНК на възпалителния ензим COX-2 и провъзпалителните цитокини TNF- бяха инхибирани от Q-3-G (Фигура 2е). Според предишни публикувани резултати, кверцетинът също намалява генната експресия и производството на TNF- [70]. По отношение на антиоксидантните свойства, анализите за отстраняване на радикали DPPH и ABTS са бързи, надеждни и възпроизводими методи за оценка in vitroантиоксидантна активностна чисти съединения и растителни екстракти [54] и се използват широко в общи методи за изследване на изчистващата активност на природни съединения или екстракти [1,46,71,72]. Установено е, че Q-3-G намалява реактивността на радикалите както в анализите, така и в поточната цитометрия по начини, зависими от концентрацията. Тези резултати са в съответствие с докладвано по-рано проучване, в което Q-3-G значително инхибира образуването на ROS в феохромоцитомни PC-12 клетки [34]. Освен че действа химически с антиоксидантен ефект, ние показахме, че Q-3-G повишава нивото на Nrf2, един от важните регулатори на оксидативния стрес в клетките. Съобщава се, че няколко съединения или естествени екстракти притежават антиоксидантни свойства чрез Nrf2-зависима ARE сигнализация [46,73,74]. Взети заедно, тези открития показват, че Q-3-G притежава антиоксидантна активност (Фигура 2g-j). Меланозомата от синтеза на меланин се среща във вътреклетъчните органели [75-77]. Свръхпроизводството на меланин може да повлияе на външния вид на кожата и свързаните с хиперпигментация кожни заболявания. Открихме, че лечението с O-3-G в c -MSH-индуцирани B16F10 клетки инхибира секрецията на меланин. Както в предишни работи, вътреклетъчната меланогенеза също се контролира от метаболити на кверцетин и някои кверцетин-3-O- -D-глюкопиранозиди [24,78,79].

Поддържането на здрава кожа изисква адекватна хидратация на кожата, а NMFs и HA играят важна роля в този процес [12]. FLG е съставна част на кожната бариера, така че повишеното ниво на експресия на FLG може да бъде свързано с овлажняване [80]. В нашето проучване беше установено, че Q-3-G влияе върху активността на задържане на влага в кожата чрез увеличаване на FLG и TGM-1 (Фигура 3c,d). Нивата на експресия на FLG и TGM-1 бяха блокирани от JNK, IKK и IkBainhibitors (SP600125 и Bay11-7082, съответно). Фокусирахме се върху ензимите, свързани с MAPK, тъй като нашите проучвания имаха за цел да определят молекулярните механизми, чрез които Q-3-G проявява своите защитни ефекти върху кожата. JNK играе важна роля в индуцираната от оксидативен стрес апоптоза на кератиноцитите [81]. Фосфорилирането на c-Jun, TAK1, MKK4 и INK се повишава с Q-3-G. В допълнение, ретинолът не повишава значително фосфорилирането на c-Jun, TAK1, MKK4 или JNK, което предполага, че има някои разлики в инхибиторните характеристики между Q-3-G и ретинол в сигнализирането на AP-1 пътека. Както в предишни публикувани резултати, пътят на JNK-c-Jun/AP-1 е свързан с антиапоптотичния ефект накверцетин[82]. В сравнение с предишното проучване [83], чрез регулиране на NF-kB и AP-1 сигнални пътища, тези пътища също се оказаха включени в основния механизъм на кверцетина. В съответствие с механизма на неговото изходно съединение, нашите резултати показват, че пътят на NF-kB също е включен в кожния защитен ефект на Q-3-Gaby активирането на p50, p65, IKK, IkB, Akt и Src след третиране с Q-3-G в HaCaT клетки. В допълнение, Q-3-G регулира нагоре AP-1-медиирана Luc и NF-B-Luc активност (Фигура 4). Тези констатации предполагат, че MAPK-медиираното AP-1 и NF-kB сигнализиране е допринесло за Q-3-G-медиираните защитни свойства на кожата.

4. Материали и методи

4.1. Материали

Q-3-G беше получено от Sigma Aldrich Co. (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Клетките HaCaT, HEK293T и B16F10 бяха закупени от American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). ABTS диамониева сол, DPPH, аскорбинова киселина (AA), ABTS и ретинол са закупени от Sigma Chemical Co. (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Фетален говежди серум (FBS), модифицирана среда на Dulbecco Eagle Medium (DMEM) и буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS) бяха закупени от Gibco (Гранд Айлънд, Ню Йорк, САЩ).3-(4-5-Диметилтиазол{{ 7}}ил)-25-дифенилтетра-натриев бромид (MTT) е закупен от Amresco (Бризбейн, Австралия). TRILzol и PCR премикс бяха закупени от Bio-D Inc. (Сеул, Корея). Комплектите за синтез на cDNA бяха закупени от Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Прави и обратни праймери за PCR (полимеразна верижна реакция) бяха синтезирани от Macrogen, Inc. (Сеул, Корея). Всички антитела, свързани с фосфорилираните или общите форми на целевия протеин, бяха закупени от Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA).

4.2. Клетъчни култури

Клетките HaCaT и B16F10 се култивират в DMEM с 10% FBS и 1% антибиотици (стрептомицин и пеницилин). Клетките HEK293T се култивират в DMEM с 5% FBS и 1% антибиотици. Тези клетъчни линии се инкубират в 5 процента CO, при 37 градуса.

4.3. Тестове за жизнеспособност на клетките

Клетките B16F10 се посяват при 2 × 10 градуса клетки на ямка в 96-плаки с ямки за 24 часа, към тях се добавят различни концентрации на Q-3-G（0-20 μM） и след това те се инкубират в продължение на 48 часа. HaCaT клетките се посяват в 96-ямкови плаки и клетките се посяват при 6 × 10 градуса клетки/mL. След инкубиране за една нощ, клетките се инкубират с различни концентрации на Q-3-G （0-20 μM） за 24 часа. HEK293T клетки се посяват при 6 × 10 градусови клетки/mL в 96-плаки с ямки за 24 часа и след това се третират с Q-3-G （0-20 μM）. Инкубираните клетки бяха третирани с 10 μL/ямка разтвор на МТТ и след 3 часа бяха третирани със 100 μL разтвор за спиране на МТТ. Използвайки конвенционалния МТТ анализ за измерена клетъчна жизнеспособност [84], абсорбцията при 570 nm беше измерена с помощта на четец (BioTek Instruments, Winooski, VT, САЩ).

4.4.mRNA анализ чрез полуколичествена RT-PCR и количествена PCR в реално време

HaCaT клетките бяха третирани с Q-3-G（5-30 μM） или ретинол（10ug/mL） за 12 часа. РНК беше утаена с помощта на TRI реагент, както беше докладвано по-рано [85]. Използван е комплект за синтез на cDNA за синтезиране на комплементарната ДНК. RT-PCR се провежда с помощта на специфични обратни и предни праймери. Праймерите за RT-PCR и PCR в реално време са изброени в Таблица 1.

4.5. DPPH анализ

Използван е DPPH анализ за оценка на способността за отстраняване на радикалите на Q-3-G. Метанолът се използва за разтваряне на DPPH до крайна концентрация от 250 μM. След това бяха 475 mL DPPH

реагира с 5 mL Q-3-G（0-40 μM） или AA（500 mM）при 37 градуса за 30 минути. Положителната контрола беше АА. Определянето на ефекта на прочистване на DPPH и изчислението беше извършено, както е описано по-рано [86].

4.6. ABTS анализ

Беше извършен ABTS анализ, както беше съобщено по-рано [72]. Накратко, равни обеми от 7.4 mM ABTS разтвор и 2.4 mM разтвор на калиев персулфат се смесват и се държат при стайна температура за една нощ, за да се генерират ABTS радикални катиони. Разтворите на ABTS бяха добавени към всяка ямка на 96-плаки с ямки, с добавяне на Q-3-G（0-40 μM） или AA（500 mM） на ямка. Смесите се инкубират при 37 градуса за 30 минути и след това се измерва тяхната абсорбция при 730 nm.

4.7. Клетъчен ROS анализ чрез поточна цитометрия

За да се провери образуването на вътреклетъчни ROS, беше използвано чувствително към окисление багрило, 2', 7'-дихлородихидрофлуоресцеин диацетат (DCFDA). HaCaT клетките бяха изложени на UV и след това клетките бяха събрани и ресуспендирани с 300 ul PBS с 20 μM DCFDA за 30 минути при 37 градуса на тъмно. След това клетките се промиват с PBS и флуоресценцията се измерва при 485/535 nm с поточен цитометър Beckman CytoFLEX (Beckman Coulter, Brea, СА, САЩ).

4.8. Уестърн блот анализ

HaCaT клетки се посяват при плътност от 6 × 10 градуса клетки/mL. След инкубация за една нощ се добавят различни концентрации на Q-3-G（0-10 μM） или ретинол （10 ug/mL） и се инкубират допълнително за 24 часа. Приготвянето на протеини и лизатите на цели клетки се извършват, както е описано по-рано [87]. Използвани са специфични антитела за откриване на общата форма и фосфорилираната форма на Jun, JNK, MKK4, TAK1, p50, p65, IKK, IkB, Src и Akt, които са визуализирани с хемилуминесцентни реагенти [88].

4.9. Анализ на съдържанието и секрецията на меланин

Клетките B16F10 се посяват при плътност от 2 × 10 градуса клетки/mL в 12-ямкови плаки и се инкубират за една нощ. Културалната среда беше сменена със свежа среда, допълнена с Q-3-G（10-20 μM） или арбутин （1 mM）. Производството на меланин се стимулира с a-MSH (100 nM) в продължение на 48 часа. За анализа на секрецията на меланин беше измерена оптичната плътност при 475 nm. След това клетките бяха събрани, за да се определи вътреклетъчното съдържание на меланин, като се използва лизисен буфер за лизиране на клетките и утаяването им чрез центрофугиране (12,000 rpm, 5 минути). Концентрираните клетъчни пелети се разтварят в 100 mL буфер за разтваряне (1 М NaOH, 10 процента DMSO) и се стопяват при 55 градуса. Абсорбцията се измерва при 405 nm с помощта на четец за оптична плътност [89].

4.10.UVB облъчване

HaCaT клетки се посяват при плътност от 1 × 105 клетки/mL в 6-плаки с ямки, като се използва MEM без серум и се подлагат на 24 часа гладуване. HaCaT клетките бяха предварително третирани с G-3-Q за 30 минути и след това UVB облъчване. След това HaCaT клетките се промиват с PBS и се излагат на UVB облъчване (UVBLamp BLX-312, Vilber Lourmat, Франция). Енергията на UVB облъчване е 30 mJ/cm2²【90】.

4.11. Третиране с H2O2

Клетките HaCaT бяха посяти в 6-плаки с ямки и бяха подложени на 24 часа гладуване, използвайки MEM без серум. Клетките бяха предварително третирани с различни концентрации на Q-3-G（5-10 μM и след 30 минути бяха инкубирани с H2O2 （500 μM） за 12 часа.

4.12. Анализ на луциферазен репортерен ген

Клетките HEK293T се посяват при плътност от 3 × 10 градуса клетки/mL в 24-плаки с ямки. Клетките HEK293T бяха прехвърлени с 2 ug плазмиди, съдържащи AP-1-Luc или NF-kB-Luc и b-галактозидаза, като се използва полиетиленимин [91]. След 24 часа инкубация клетките бяха третирани с Q-3-G（5-10 μM） или ретинол（10 ug/mL） за още 24 часа. Анализът на луциферазата беше извършен с луминометър при абсорбцията на всяка проба беше измерена при 475 nm с помощта на четец на микроплаки Spectramax 250 (Molecular Devices, Сан Хосе, Калифорния, САЩ), както беше съобщено по-рано [92].

4.13. Снимане на клетъчна морфология

HaCaT клетки бяха посяти в 6-плаки с ямки при клетъчна плътност от 1 × 10 градуса клетки/mL. HaCaT клетките бяха третирани с G-3-Q за 30 минути и след това UVB облъчване. След 24 часа бяха направени 4 ×, 10 × и 20 × обективни снимки на микроскоп (Olympus, Токио, Япония).

4.14. Статистически анализ

Всички данни са представени като средно ± стандартно отклонение от поне три независими експеримента. Тестът на Mann-Whitney и t-тестът на Student са използвани за сравняване на статистическите разлики между групите. p-стойност<0.05 was="" regarded="" as="" statistically="" significant.="" all="" statistical="" tests="" were="" carried="" out="" using="" spss(ver.25,="" spss="" inc.,="" chicago,="" il,="">

5. Изводи

Нашето изследване показа, че Q-3-G проявява противовъзпалителна и антиоксидантна активност, предпазва от фактори на оксидативен стрес и възпаление при UVB облъчване и експозиция на H O . Ние също демонстрирахме, че Q-3-G има способност за стимулиране на овлажняване в HaCaT клетки. В допълнение към антимеланогенезния ефект на Q-3-G, беше показано, че инхибира секрецията на меланин в -MSH-индуциран B16F10. И накрая, ефектът на Q-3-G се медиира чрез активиране на AP-1 и NF-kB сигнални пътища. Кожно-защитните активности на Q-3-G в HaCaT човешки кератиноцитни клетки и B16F10 миши меланомни клетки са обобщени на Фигура 5. Това проучване установи, че Q-3-G може да бъде ефективен поради своето противовъзпалително, антиоксидантни, овлажняващи и антимеланогенни свойства в човешки кератиноцити и меланомни клетки чрез активиране на NF-kB и AP-1 пътища. В заключение, резултатите ясно показват, че този конюгиран метаболит има потенциала да защитава кожните клетки. Необходими са по-нататъшни изследвания за валидиране на ефекта на Q-3-G в различни in vivo модели, особено във връзка с модели за защита на кожата.

Препратки

1. Ким, Е.; Хванг, К.; Лий, Дж.; Han, SY; Ким, Е.-М.; Парк, Дж.; Cho, JY Защитен ефект на кожата на епигалокатехин галат. Вътр. J. Mol. Sci. 2018, 19, 173. [CrossRef]

2. Draelos, ZD Нови лечения за възстановяване на нарушената пропускливост на епидермалната бариера: кремове за възстановяване на кожната бариера. Clin. Dermatol. 2012, 30, 345–348. [CrossRef] [PubMed]

3. Slominski, AT; Zmijewski, MA; Zbytek, B.; Тобин, DJ; Теохаридес, TC; Rivier, J. Ключова роля на CRF в системата за реакция на стреса на кожата. Ендокр. Rev. 2013, 34, 827–884. [CrossRef] [PubMed]

4. D'Orazio, J.; Jarrett, S.; Amaro-Ortiz, A.; Скот, Т. UV радиация и кожата. Вътр. J. Mol. Sci. 2013, 14, 12222–12248. [CrossRef]

5. Рити, Л.; Fisher, GJ Индуцирани от UV-светлина сигнални каскади и стареене на кожата. Стареене Res. Rev. 2002, 1, 705–720. [CrossRef]

6. Видейра, ИФ; Моура, DF; Magina, S. Механизми, регулиращи меланогенезата. Ан. Сутиени. Dermatol. 2013, 88, 76–83. [CrossRef] [PubMed]

7. Че, Д.Н.; Xie, GH; Чо, БО; Шин, JY; Канг, HJ; Jang, SI Защитни ефекти на екстракт от гроздови стъбла срещу UVB-индуцирано увреждане в кожата на C57BL мишки. J. Photochem. Photobiol. B 2017, 173, 551–559. [CrossRef]

8. Джеонг, Д.; Лий, Дж.; Jeong, SG; Хонг, YH; Йоо, С.; Han, SY; Ким, JH; Ким, С.; Ким, JS; Chung, YS; et al. Екстрактът от етанол от Artemisia Asiatica проявява активност против фотостареене. J. Ethnopharmacol. 2018, 220, 57–66. [CrossRef]

9. Макданиел, Д.; Фарис, П.; Valacchi, G. Атмосферно стареене на кожата-Приноси и инхибитори. J. Cosmet. Dermatol. 2018, 17, 124–137. [CrossRef]

10. Рао, CV; Пал, С.; Мохамед, А.; Фаруки, М.; Doescher, MP; Asch, AS; Yamada, HY Биологични ефекти и епидемиологични последици от експозицията на арсен и реактиви, които могат да подобрят увреждането на арсен in vivo. Oncotarget 2017, 8, 57605–57621.

11. Синха, К.; Das, J.; Пал, П.Б.; Sil, PC Оксидативен стрес: митохондриално-зависимите и митохондриално-независимите пътища на апоптоза. арх. Токсикол. 2013, 87, 1157–1180. [CrossRef]