Ефект против стареене на уролитин А върху говежди ооцити in vitro 2

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

2.8. Статистически анализ

Данните от производството на ембриони и качествените сесии бяха анализирани с помощта на Proc Glimmix от SAS (Системи за статистически анализ, SAS Inst., Inc., Cary, NC, САЩ), използвайки двоичното разпределение и logit като функции за връзка. Обобщеният линеен смесен модел включва лечение (UA дози, ефект на стареене и възраст на жената и тяхното взаимодействие) като фиксиран ефект и реплики като случаен ефект. В допълнение, средните стойности за всяко лечение бяха изчислени и сравненията между групите бяха извършени с помощта на PDIFF теста. Данните за JC-1, нивата на mRNA транскрипт и броя на копията на mt-DNA бяха анализирани с помощта на Proc Mixed на SAS с модел, включващ лечение (UA ефект, ефект на стареене и/или възраст на жената и тяхното взаимодействие) като фиксиран ефект. Сесията се считаше за случаен ефект. Данните за хромозомните конфигурации бяха сравнени между групите, използвайки точния тест на Fisher, в таблица за непредвидени обстоятелства 2 x 2. Анализът на резултатите се счита за статистически значим, когато p<>

Моля, щракнете тук, за да научите повече

3. Резултати

3.1. Предишен анализ — изследване на доза-отговор

Статусът на узряване на ооцитите, наблюдаван по време на изследването доза-отговор на UA, допълнен със среда за зреене, е представен на Фигура 1. Тази добавка значително повлиява етапите на ядрено съзряване на ооцитите. Групата с 50 UA (38,9±0.5 процента) разкри по-висок процент на ооцити в състояние на AI/TI фаза в сравнение с контролата (10.8±{{ 15}}.5 процента ,P=0.03)и 10 UA(0.0±0.{{ 45}} процента ,p=0.0006) групи. В тази фаза по-висок процент в 25 UA (17,2±0,5 процента ,p=0.05) група в сравнение с групата от 10 UA също беше идентифицирана. Освен това беше открита тенденция между групата с 50 UA и 1 UA (14,3±2,0 процента, p=0.08). Най-високата доза също показа вреден ефект, намалявайки броя на овоцитите, класифицирани в метафаза-II (MII) стадий (50 UA, 44,4 ±2,0 процента) в сравнение с контролата (86.5±7,0 процента, p=0.003), 1 UA (82,1±2,5 процента, p{{ 53}}.01), 10 UA (89,3±6,5 процента, p=0.002) и 25UA(82,8±9,0 процента, p=0.01) групи. Не са наблюдавани разлики между останалите етапи на узряване на ооцитите. Фазите на съзряване на GV и CCl не са показани на Фигура 1, тъй като не са оценени ооцити в тези категории.

Тестът доза-отговор не показва значим ефект на концентрациите на UA върху разцепването и честотата на излюпени ембриони. Въпреки това, скоростта на ембрионите, произведени на ден 7, е повлияна от различните концентрации на UA. Групата с 50 UA (7,2±2,7 процента) има по-ниски нива на ембриони на ден 7 в сравнение с 1 UA (28,5±4,8 процента, p=0.004), 10 UA (20,4±4,0 процента , p=0.03) и 25 UA(18,5±4,7 процента, p=0.05) групи. Въпреки че не са открити значими разлики между контролната и 50 UA групите, е идентифицирана тенденция (p=0.06). Нещо повече, нивата на ембриони на ден 7 са склонни (p =0.07) да бъдат по-високи след добавяне на 1 UA доза в сравнение с контролата. Освен това, групата с 1 UA удвои броя на отлично/добро качество на ембриона (68,9 процента от ембрионите от степен 1, n =20) в сравнение с контролата (34,6 процента, n =10) и 10 UA (26,8 процент ,n=10). Малък брой ембриони от степен 1 ​​бяха получени с по-високите дози: 25UAгрупа (15,4 процента,n=4) и 50UA (35,4 процента,n=3). Въз основа на горепосочените резултати, 1 uM UA беше избран за преминаване към следните проучвания.

3.2. Експеримент 1——Качество на овоцитите и потенциал за развитие на остарели и физиологично узрели овоцити

3.2.1.Ядрено съзряване

Изследвахме ефекта от добавянето на UA върху статуса на хромозомно съзряване на възрастни и физиологично зрели ооцити, събрани от препубертетни и възрастни жени. Независимо от ефекта на UA, стареенето на ооцитите и възрастта на жените предизвикват значителен вреден ефект върху съзряването. По-високи нива на MII фаза бяха идентифицирани в контролните овоцити в сравнение със старите (22h=93.2±5.4% спрямо 30h=77.6±4.1% , p {{11 }}.02). Освен това е установено забавяне на прогресията на съзряването при стари гамети и предпубертетни женски с повече ооцити във фаза AI/TI (22h=3.4±0.5 процента спрямо 30h =17.9±0.6 процента, p=0.01 и предпубертетен=21.1±1,1 процента спрямо възрастен=6.8±0,7 процента p =0.03). Освен това, по-голям брой дегенерирали ооцити след 30 часа IVM беше идентифициран в сравнение с след 22 часа (7,1 ±1,39 процента спрямо 4,1±0,89 процента, p =0.02) . Възрастта на жената и добавянето на UA не повлияха (p 0,05) на броя на дегенерираните ооцити.

Както in vitro стареенето, така и добавянето на UA към средата за съзряване значително повлияват хромозомната конфигурация на ооцитите при препубертетни и възрастни жени (p<0.05, figure="" 2).="" on="" the="" al/ti="" phase="" of="" the="" maturation="" status,="" higher="" rates="" of="" oocytes="" were="" found="" in="" this="" stage="" in="" the="" control="" aged="" 30="" h="" prepubertal="" group="" (46.7±0.5%)="" when="" compared="" to="" control="" prepubertal="" (0.0±0.0%,p="0.05)" and="" ua="" aged="" 30h="" prepubertal="" (0.0="" ±0.0%,p="0.02),and" both="" adult="" control="" (5.6±0.5%,p="0.01" and="" ua="" adult,0.0±0.0%,="" p="0.0002)and" control="" aged="" 30h="" adult="" (9.1±10%,p="0.02)groups." a="" trend="" was="" also="" identified="" between="" ua="" adults="" and="" ua="" aged="" 30="" h="" adult="" (p="">

По отношение на MII фазата, съответстваща на пълно ядрено съзряване, бяха открити значителни разлики между групите (Фигура 2). По-ниски нива на овоцити на етап MII са открити в контролата на възраст 30 h преди пубертета (53,3±2.0 процента) в сравнение с контролната група преди пубертета (10{{2{ {27}}}}0±1,5 процента, p=0.05), UA на възраст 30 часа преди пубертета (100,0±2,5 процента, p=0.02) и UA възрастен (100,0) ±10,5 процента, p=0.0002), а контролната група на възраст 30 години имаше възрастни (86.0±5,5 процента p =0.056) групи. Освен това, UA възрастна група показа по-висок процент на зрели ооцити (MII) в сравнение с UA на възраст 30 часа възрастен (76,2±11,3 процента, p=0.01), контрола на възраст 30 часа възрастен (86). 0±5,5 процента, p=0.08) и контролен възрастен (83,3±4,5 процента, p=0.057).

Не са наблюдавани разлики между останалите етапи на узряване на ооцитите.флавоноиди,В обобщение, добавянето на UA подобрява прогресията на съзряване in vitro в ооцитите, подложени на процеса на стареене, особено при жени в предпубертетен период. Така беше идентифициран важен ефект против стареене на UA.

3.2.2. Потенциал на митохондриалната мембрана

За да се анализира участието на митохондриалната дисфункция в женските ооцити на възраст и ефекта от UA и възрастта на майката, потенциалът на митохондриалната мембрана (MMP) беше оценен в ооцити от различни групи.

Cistanche може да спре стареенето

Независимо от възрастта на жената и ефектите на UA, стареенето на ооцитите има значително вредно въздействие върху MMP, оценено като съотношение на измерената червена и зелена флуоресценция (22 h съотношение =0.54±1.8 процента спрямо 30hratio{{6} }.47±1.5 процента, p=0.002).

Комбинацията от възрастта на жената, ефекта на стареене и добавянето на UA по време на узряването значително (p{{0}}.{{10}}07) повлиява MMP (Фигура 3). Както се наблюдава на Фигура 3, по-високи нива на ММР са получени в UA препубертетни (съотношение=0.55±0.04) и UA възрастни (съотношение=0.63±0.04) групи, където овоцитите са узрели за 22 часа , в сравнение с контролата на възраст 30 часа възрастен (съотношение=0.45±0.04,p=0.04 и p=0.0007, съответно) и UA на възраст 30 часа възрастен (съотношение{ {23}}.45±0.03,p=0.03 и p=0.0003, съответно) групи.използва хесперидинОсвен това, значително увеличение на съотношението JC{{0}} агрегат/мономери, което показва значително увеличение на MMP, се наблюдава в групата на UA възрастни в сравнение с контролните възрастни (съотношение =0).47 ±0.04,p =0.0031),контролен предпубертетен (съотношение=0.52±0.04, p=0. 03), контрола на възраст 30 часа възрастен (съотношение =0.48±0.03, p=0.003) и UA на възраст 30 часа възрастен (съотношение=0.47±0.03, p{{25 }}.001)групи. Идентифицирана е също тенденция между UA преди пубертета и UA на възраст 30 часа преди пубертета (p=0.07).

В обобщение, UA подобрява MMP по време на физиологичното съзряване, но не е в състояние да преодолее отрицателния ефект от стареенето както в препубертетните, така и в възрастните ооцити.

3.2.3. Ембрионално развитие

Потенциалът за ембрионално развитие беше оценен чрез разцепване, D7 и проценти на излюпени ембриони, получени с различните лечения (стареене и добавяне на UA), приложени към КОК на предпубертетни и възрастни жени по време на узряването. Независимо от възрастта на жената и ефектите на UA, стареенето на ооцитите има значително вредно въздействие върху разцепването (22h=79.5±1.7 процента спрямо 30h=68.6±2.0 процента, p=0.0001) и D7 проценти на ембриони (22h=18.6±1,9 процента

срещу 30h=12.1±1,7 процента ,p=0.01). Показано е също, че добавянето на UA подобрява нивата на ембриони D7 (контрола{ {8}}.1±1,5 процента спрямо UA=20.0±2,0 процента ,p=0.0009).

Комбинацията от възрастта на жената, ефекта на стареене и добавянето на UA по време на съзряването значително (p {{0}}.{{30}}1) повлиява ембрионалното развитие, а именно разцепването и D7 нива на ембриони (Таблица 2). По-високи нива на разцепване са постигнати, когато възрастните овоцити са узрели в продължение на 22 часа със или без добавяне на UA (контролен възрастен=1.4±3,2 процента и UA възрастен=80). 9±3,4 процента) и препубертетните овоцити узряват за 22 часа с UA добавки (UA препубертет=80.6±3,2 процента), в сравнение с UA на 30възрастни (66,5±4,2 процента, p По-малко от или равно на 0,01), контролна група на възраст 30 часа препубертета (66,9±3,9 процента, p по-малко или равно на 0,02) и UA на възраст 30 часа препубертета (67,2±4,0 процента, p по-малко или равно на 0,01) (Таблица 2). Тенденция (p=0.09) също беше идентифицирана между контролните възрастни и контролните групи на възраст 30 часа.

Another parameter that was significantly (p=0.01) influenced by the combination of the female age, the supplementation with UA, and COCs aging was the rate of embryos produced at day 7(Table 2). Exceptions were made for the UA prepubertal and UA 30 h prepubertal groups, the UA adult group presented the highest rates of the embryo at day7 (26.8±4.3%,p≤0.05). Moreover, lower D7 embryo rates were produced from aged oocytes from both adult and prepubertal females without the supplementation of UA (control aged 30hprepubertal=7.7±2.6% and control aged 30h adult=7.7±2.6%)compared to those that were supplemented with UA, respectively (UA aged 30 h prepubertal=18.9±4.0%,p=0.03 and UA aged 30 h adult=15.9±4.0%,p=0.09). The supplementation of UA to the maturation medium did not significantly (p>0.05) повлияват нивата на качество на произведените ембриони от степен 1, 2 и 3, нито ефектът на стареене или всички изследвани ефекти заедно (Таблица 3). Въпреки това, броят на ембрионите с отлично/добро качество, които са произведени, когато UA е допълнен към овоцити, узрели за 22 часа, се удвоява (Таблица 3).

3.3. Експеримент 2

3.3.1. Нива на генна експресия

За да се изследва ефектът на UA и влиянието на възрастта на майката върху Nrf2 сигналния път, анализът на нивата на експресия на NFE2L2 и NQO1 ген в GCs култура от препубертетни и възрастни крави беше оценен чрез RT-qPCR. Независимо от другите изследвани фактори, възрастта на жените значително повлиява генната експресия на NFE2L2, отразена в по-високото ниво на NFE2L2 транскрипти в GCs от жени в предпубертетна възраст (нива на иРНК в предпубертетна възраст=0.00015 ±0,0012 процента спрямо възрастен=0.00011±0.0012,p=0.048).

The supplementation of UA to the culture medium of GCs, both independently and considering female age, did not significantly(p>0.05) влияят върху нивата на генна експресия на гени NFE2L2, NQOl и mt-ND5. Фигура 4 представя нивата на експресия на тези гени, които са нормализирани със съответната контрола, както в третираните с UA препубертетни, така и в възрастни GC.

3.3.2.mt-ДНК номер на копие

Analysis of mt-ND5 DNA content in GC culture from prepubertal and adult cows was assessed by qPCR. The supplementation of UA to the culture medium of GCs, both independently and considering female age, did not significantly (p>0.05) влияят върху броя на копията на гена mt-ND5.изгубената империя cistancheФигура 5 представлява броя на копията на този ген, нормализиран със съответните контроли, както в третираните с UA препубертетни, така и в възрастни GC.

4. Обсъждане

През последните десетилетия се наблюдава нарастващо търсене на прилагане на АРТ при добитък [8,46,47]. Освен това забавеното раждане, свързано с напреднала възраст на майката, сега се превърна в основния фактор, каращ жените да прибягват до АРТ [5]. Качеството на овоцитите е от решаващо значение за настъпването на успешно зачеване, а стареенето на женската гамета е основна грижа за успеха на ART. Въпреки нарастващия напредък, постигнат в тази област, прилаганите технологии все още не са в състояние да възстановят плодовитостта, връщайки биологичния часовник [7]. В настоящата работа е разработен модел за изследване на свързаното с възрастта безплодие в яйцеклетки от говеда. Поради приликите с човешката бременност, фоликуларни и ендокринни събития [48,49], този модел може да бъде полезен и за изследвания при хора, като се избягват етичните и физически ограничения, които възпрепятстват тези изследвания в човешки ооцити. Нашият модел за стареене на женски гамети се оказа много ефективен и подходящ за изучаване на различни проблеми, свързани с репродуктивното стареене и увреждането на плодовитостта, което в момента е едно от най-критичните предизвикателства в света. Освен това, търсенето на нови предстоящи антиоксидантни терапии с потенциал за предотвратяване на безплодие, провокирано от стареенето на женските гамети, както е проучено в настоящата работа, е също толкова важно.

Представените резултати съобщават за първи път благоприятния ефект на UA върху резултатите от ART. UA е хранителен метаболит, способен да предотврати натрупването на свързани с възрастта дисфункционални митохондрии чрез индуциране на тяхната митофагия и удължен живот на клетките [28]. Тъй като UA никога преди не е бил тестван при репродукция на говеда, бяха използвани дози, успешно приложени в различни клетъчни линии, показващи неговите противоракови, противовъзпалителни и анти-стареене ефекти [28,35,39]. В нашето проучване, предишна доза- беше проведен анализ на отговора и концентрацията от 1 uM UA беше ясно идентифицирана като най-обещаваща. Освен това е демонстриран вреден ефект при по-високи дози, особено при доза от 50 uM UA, което уврежда прогресията на ядреното съзряване до MII. Този ефект се отразява върху увреждането на ембрионалното развитие. Съответно, Liu и колеги (2019) забелязват значително намалена клетъчна жизнеспособност и пролиферация на стареещи човешки фибробласти на кожата при концентрация на UA от 50 uM. Те посочиха, че високите дози UA водят до намалена клетъчна жизнеспособност, увеличавайки броя на клетките, задържани в G/M клетъчния цикъл [35]. Напротив, по-високи нива на ембриони са произведени на ден 7 след добавянето на 1 uM UA към средата за узряване в сравнение с другите дози. За по-нататъшно изследване на потенциалните механизми на действие на UA при женската репродукция беше проведено проучване по време на стареене на ооцити и използване на жени с различна възраст като донори на ооцити. Yamamoto и сътрудници (2010) съобщават за свързан с възрастта спад в степента на оплождане на стари крави, показвайки, че тези овоцити са по-склонни да възобновят първото мейотично делене по време на съзряването и често вече са започнали мейотичното съзряване при събиране на овоцити [50] Тези данни предполагат, че овоцитите от по-възрастни крави са имали по-бързо прогресиране на ядреното съзряване и са достигнали MII фаза по-бързо от овоцитите от млади женски поради по-ниската компетентност на овоцитите [51]. Съответно, нашето проучване разкрива, че възрастта на женските донори и процесът на стареене на овоцитите значително влияят върху хромозомната конфигурация на овоцитите по време на напредването на узряването. Всъщност овоцитите от крави в предпубертетен период показват по-висок процент на забавени стадии, като Al/TI фази (препубертет=21.1% спрямо възрастни =6.8% ), разкривайки по-бавно прогресиране на ядрената съзряване, което може да се дължи на по-ниска компетентност на овоцитите, както е предложено от Soto-Heras и колеги (2018). Старите овоцити също така показват по-ниски нива на овоцити, които са достигнали MII фаза по време на период от 30 часа (7,6 процента) в сравнение с физиологичния период (93,2 процента). Освен това е идентифициран положителен ефект при лечение с UA по време на физиологичния процес на съзряване, а също и ефекти против стареене както при предпубертетни, така и при възрастни жени.

В съгласие с нашите констатации, проучване показа, че добавянето на мелатонин по време на съзряването in oitro може да стимулира възобновяването на мейозата в говежди КОК, докато контролните ооцити, култивирани без хормони, имат по-бавни скорости на възобновяване на мейозата [52]. Напротив, добавките с други антиоксидантни агенти, като кверцетин, витамин С или ресвератрол, не оказват никакъв ефект върху скоростите на ядрено съзряване, дори когато се наблюдават намалени нива на ROS или повишени нива на антиоксидантни ензими [53,54].микронизирана пречистена флавоноидна фракция 1000 mg използваОбратно, нашите резултати показват, че UA може да спаси ооцитите от ефектите на стареене както при възрастни възрастни, така и при жени в предпубертетен период, които показват по-ниска компетентност, подобрявайки степента на съзряване.

Един от основните фактори, допринасящи за лошите резултати от плодовитостта, засягащи качеството на ооцитите, е свързан с митохондриалните функции, които се компрометират с напреднала възраст на майката и стареене след овулация [21,55]. MMP са широко изследвани в различни модели, разкривайки, че както старите гамети след овулация, така и стареенето на майката, предизвикват загуба на митохондриална функция [56]. Следователно загубата на ММР се отразява негативно върху развитието на ооцитите и ембрионите [26,57]. Според тези констатации, в нашето проучване е установено намалено съотношение на ММР в стари ооцити както от препубертетни, така и от възрастни крави. Освен това, добавянето на UA към културалната среда индуцира увеличение на ММР на препубертетни и възрастни ооцити, които узряват за 22 часа, отразявайки се в по-високи скорости на разцепване. Тези данни са в съгласие с резултатите, открити от Liang и колеги (2017), които наблюдават повишаване на MMP, когато ооцитите от говеда са допълнени с мелатонин в продължение на 22 часа [26]. Въпреки това, ние също така идентифицирахме намаляване на MMP в остарели ооцити, допълнени с UA, което означава, че UA може да не е в състояние да обърне отрицателния ефект от стареенето в MMP. Наблюдавани са противоречиви резултати по отношение на MMP след добавяне на остарели ооцити с антиоксидантни съединения. Наистина, няколко автори съобщават за по-високи нива на ММР върху яйцеклетките след добавки с мелатонин [26] и ламинарин [21], докато други са наблюдавали обратното, намалено ММР в остарели ооцити, третирани с L-карнитин [58] и мелатонин [38]. Освен това, Ryu и колеги (2016) показаха намаляване на MMP в миобласти на мишки, култивирани с UA [28]. По отношение на нашите резултати трябва да се насочат към допълнителни проучвания, за да се задълбочат познанията за механизма на действие на UA в митохондриите на ооцитите и да се обяснят идентифицираните диференциални ефекти върху остарели и физиологично зрели ооцити.

Вътрешното качество на овоцитите е широко докладвано като основен фактор за последващото ембрионално развитие. Натрупаните доказателства разкриват, че няколко клетъчни и молекулярни аномалии възникват по време на удължени периоди на съзряване in vitro, както и по време на стареене in oivo след овулация [57]. Освен това, тези аномалии могат да окажат съответни въздействия върху качеството на овоцитите, отразяващи се върху производството на ембриони [52]. За да демонстрираме, че UA може да действа като съединение против стареене и да подобри качеството на овоцитите, като забавя стареенето на овоцитите, ние изследвахме капацитета за развитие на остарелите овоцити след ин витро оплождане. В нашето проучване беше наблюдаван значителен (p По-малко или равно на 0.01) вреден ефект от стареенето на гаметите върху разцепването и нивата на производство на ембриони от ден 7. Съответно няколко автори посочват, че възрастните жени имат свързан с възрастта спад в репродуктивния капацитет, отразен в по-ниски нива на плодовитост и лошо качество на ембриона [44,55]. От друга страна, предишни проучвания, тестващи други антиоксидантни молекули за спасяване на остарели ооцити, съобщават за благоприятния ефект на някои от тези съединения по време на съзряване in vitro върху ембрионалното развитие на възрастни женски животни от различни видове, като говеда [58], прасе [ 38] и мишки [6]. Например, L-карнитинът е тестван върху говежди овоцити и не са открити значителни разлики в получените скорости на разцепване. Въпреки това, беше идентифицирано значително увеличение на скоростта на зиготите, развити до стадия на бластоциста, в сравнение със старите ооцити без L-карнитин [59]. Нашите резултати показват също, че добавянето на UA по време на физиологично съзряване подобрява скоростта на разцепване при предпубертетни и възрастни жени. Въпреки че скоростите на разцепване на UA-възрастните овоцити не се различават значително от контролните овоцити, по-високите D7 ембрионални нива са идентифицирани в UA-възрастните овоцити от препубертетни и възрастни жени. Тези резултати показват, че ефектът против стареене на UA, идентифициран преди това в различни клетъчни култури [28, 35], е валиден за ооцити и ембриони. Стареенето на овоцитите е многофакторен процес, който уврежда развитието на ембриона, и възстановяването на капацитета за развитие на остарелите овоцити е важна цел, постигната в настоящото изследване.

Освен това, ние също оценихме превантивната роля на UA в свързаното с възрастта влошаване на качеството на ембриона. Въпреки че в това проучване не са открити значителни разлики в нивата на качество на ембрионите, овоцитите, допълнени с UA, увеличават броя на прехвърляемите ембриони в сравнение с нетретираните. Предишно проучване съобщава, че лечението с L-карнитин може да подобри качеството на ембрионите, развити от остарели говежди овоцити чрез намаляване на нивата на ROS и по-високи нива на глутатион, както и други антиоксидантни ензими [58]. Разликите между тези резултати и нашите може да се дължат на различните техники, приложени за оценка на качеството на ембриона. Морфологичната оценка на качеството на ембриона остава субективен метод, който зависи от опита на наблюдателя. В бъдеще трябва да се проведат повече изследвания, като се използват други техники за точна оценка на качеството на ембриона.

Широко известно е, че оксидативният стрес играе решаваща роля в свързаното с възрастта намаляване на плодовитостта. Оксидативният стрес е един от основните фактори, допринасящи за ниската ефективност на узряване на ооцитите и влошаването на качеството на ооцитите, като по този начин се нарушава последващото развитие на ембриона [11]. Междуклетъчната комуникация между гаметата и соматичните клетки е от решаващо значение за правилното развитие на висококачествени овоцити. Съобщава се за промени в микросредата на старите яйчници, като намалена антиоксидантна ензимна активност, водеща до нарушена ефективност на почистване на ROS.отефлавоноидОсвен това е показано, че GC от млади и по-възрастни жени имат диференциално експресирани гени, свързани с антиоксидантни дейности и възраст на майката [2,13]. Следователно е от голямо значение откритите механизми да управляват оксидативния стрес, за да спасят ооцитите от стареене и да преодолеят проблемите с безплодието. Пътят на Nrf2-Keapl е обстойно изследван поради способността му да се справя с вредните ефекти на оксидативния стрес и да упражнява антиоксидантни свойства [60] За по-нататъшно изследване на активирането на сигналния път на Nrf2 в GCs от говеда, ние оценихме Ниво на експресия на иРНК на NFE2L2 и неговия низходящ антиоксидант (NQO1). Нашите резултати показват значително влияние на женската възраст върху нивото на NFE2L2 транскриптите, което намалява с възрастта. Наистина, по-високи нива на експресия на mRNA се наблюдават при крави в предпубертетен период в сравнение с възрастни. Това е в съгласие с предишни проучвания, които съобщават за високо експресирано ниво на Nrf2 протеин и иРНК върху тъканите на яйчниците на млади мишки и жени в раждане на деца на възраст от 22 до 49 години, докато при възрастни мишки и жени е установена по-ниска експресия. Предполага се, че намалената експресия на Nrf2 може да е свързана с намаляването на репродуктивния капацитет на по-възрастните жени и контролът му може да има важни последици за забавяне на стареенето на яйчниците [15,61]. Освен това, Akino и сътрудници (2019) показват, че активирането на пътя на Nrf2-Keapl чрез прилагане на диметилфумарат може да намали нивата на ROS и да доведе до забавено безплодие [18]. Докладвани са подобни резултати по отношение на ефекта на UA при намаляване на ROS в стареещи фибробласти на човешка кожа. Когато тези клетки бяха третирани с UA, беше докладвано значително увеличение на експресията на mRNA на Nrf2 насочени гени, като SOD1, NQ01, GCLC и HMOX1. [35]. В нашето проучване наблюдавахме, че нивото на експресия на гените NFE2L2 и NQO1 в GCs не се повлиява значително от добавянето на UA. Въпреки това трябва да се насочат допълнителни проучвания, за да се потвърди намаляването на ROS и последващото подобряване на произведения бластоцист, както и ефекта на UA върху експресията на иРНК на гореспоменатите гени върху остарели ооцити.

В допълнение към увреждането на митохондриалната ДНК (mt-DNA) [25,57], разрушаването на експресията на митохондриален ген също е доказано, че допринася за митохондриална дисфункция с възрастта. Zhang и колеги (2019) съобщават, че някои гени, участващи в OXPHOS, а именно mt-ND2, mt-ND3, mt-ND4, mt-ND4L и mt-ND5, са значително понижени в GV стадия на ооцити от възрастни мишки, в сравнение с тези от млади мишки[62]. В нашето проучване не беше открита значителна разлика в експресията на mt-ND5 mRNA, между GCs, извлечени от препубертетни и възрастни крави. Освен това, ние също оценихме броя на копията на mt-DNA, тъй като съдържанието на mt-DNA в GCs е положително свързано с качеството на ооцитите и развитието на ембриона [63,64]. Въпреки че в нашето проучване не бяха идентифицирани значителни разлики между броя на копията на mt-DNA в GCs от препубертетни и възрастни крави, или когато са третирани с UA, ние наблюдавахме по-голям брой ооцити, развили се до стадия на бластоциста, в сравнение с нетретираните групи. Освен това Ryu и сътрудници (2016) съобщават, че съдържанието на mt-ДНК и нивото на протеини от респираторните комплекси не се променят в миобласти на мишки, допълнени с UA [28]. Трябва да се извършат допълнителни проучвания, за да се разкрие механизмът на действие на UA за подобряване на женската плодовитост.

5. Изводи

Резултатите, получени в това проучване, потвърдиха вредния ефект от стареенето на яйцеклетките върху тяхната компетентност за развитие. Освен това, нашият модел за стареене на женски гамети се оказа много ефективен и полезен за изследване на различни проблеми, свързани с репродуктивното стареене и последващото увреждане на плодовитостта. Освен това добавянето на UA по време на процеса на узряване на остарели ооцити подобрява скоростта на съзряване и произвежда ембриони. Следователно, анти-стареещият ефект на UA при спасяването на остарели гамети беше идентифициран за първи път, подобрявайки развитието на бластоциста, което води до увеличен брой ембриони за трансфер към реципиентни женски. Установен е също положителен ефект на UA върху физиологичното съзряване, MMP и ембрионалното развитие. В заключение, лечението с UA осигурява нов терапевтичен подход за предотвратяване или забавяне на стареенето на гаметите и подобряване на последващото образуване на бластоцисти и резултатите от плодовитостта при ART.

Тази статия е извлечена от Animals 2021, 11, 2048. https://doi.org/10.3390/ani11072048 https://www.mdpi.com/journal/animals