Антиалергични и противовъзпалителни ефекти на неферин върху RBL-2H3 клетки

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

Резюме:Мастните клетки играят много важна роля при кожни алергии и възпаления, включително атопичен дерматит и псориазис. В миналото беше установено, че референтът има противовъзпалителни и антистареещи ефекти върху кожата, но ефектът му върху мастните клетки все още не е проучен в детайли. В това проучване използвахме мастоцити (RBL-2H3 клетки) и миши модели, за да изследваме антиалергичните и възпалителните ефекти на референтните. Първо, открихме, че референтът инхибира дегранулацията на мастоцитите и експресията на цитокини. В допълнение, ние наблюдавахме, че когато мастните клетки бяха стимулирани от A23187/форбол 12-миристат-13-ацетат (PMA), повишаването на вътреклетъчния калций беше инхибирано чрез справка. Фосфорилирането на MAPK/NF-KB пътя също е намалено чрез предварителна обработка на еталон. Резултатите от in vivo проучвания показват, че препратката може да подобри появата на дерматит и инфилтрация на мастни клетки, причинени от динитрохлоробензен (DNCB). Освен това, експресията на бариерните протеини в кожата също се възстановява.цистанчНакрая беше установено, че справката може да намали поведението на надраскване, причинено от съединение 48/80. Взети заедно, нашите резултати показват, че Reference е много добър антиалергичен и противовъзпалителен естествен продукт. Ефектът му върху мастоцитите допринася за неговия фармакологичен механизъм.

Ключови думи:справка; натурален продукт; мастоцити; дерматит; сърбеж

Моля, щракнете тук, за да научите повече

1. Въведение

Много изследвания потвърждават, че алергичните заболявания са резултат не само от вродена имунна активация, но и от адаптивна активация. Сред тях мастните клетки играят много важна роля при различни алергични заболявания като алергичен ринит, астма и алергичен дерматит. Мастните клетки експресират IgE рецептори (FceRI) върху техните клетъчни мембрани, а FceRI рецепторите имат висок афинитет към IgE антитела [1,2]. Когато антиген-специфичният IgE се свърже с FceRI, възниква взаимодействие и възниква алергична реакция. Агрегацията на FceRI може да активира рецепторни тирозин кинази, да инициира реакции надолу по веригата и да насърчи фосфорилирането на различни ключови протеини (като митоген-активирана протеин киназа; MAPK), което в крайна сметка води до притока на калциеви йони (Ca2 plus), което е ключово събитие при дегранулация на мастоцитите [3].cistanche АвстралияАктивираните мастоцити дегранулират и освобождават химически медиатори. Тези химични медиатори, използвани при алергични реакции, могат да причинят възпаление [4], така че лечението на алергичните симптоми включва инхибитори на дегранулацията на мастоцитите. Следователно, инхибирането на IgE-медиирана дегранулация на мастни клетки често се използва за идентифициране на нови съединения за предотвратяване и лечение на алергични заболявания. Установено е, че анти-динитрофенил (DNP) IgE антитела и антигени могат да индуцират реакции на пасивна кожна свръхчувствителност (PCA) като типичен in vivo модел на незабавна свръхчувствителност и като изследователско лекарство за потенциала на анти-антигенни алергии [5,6]. ]. В допълнение, дегранулацията на мастоцитите може също да бъде причинена от неимунни стимуланти, като съединения 48/80 и A23187. A23187 калциев йонофор, отдавна е известно, че стимулира секрецията на мастоцитите с освобождаване на предварително формирани медиатори, като хистамин от техните гранули, служещи като пример [4] Съединение 48/80 е смесен полимер на р-метокси-N-метилфенетиламина омрежен от формалдехид, който се използва широко за независимо стимулиране на мастоцитите [7,8] Следователно подходящи количества от съединение 48/80 и A23187 обикновено се използват като реагенти за изследване на механизма на алергичните реакции. Според статистически оценки около 15-20% от населението страда от атопичен дерматит. Независимо дали става дума за деца или възрастни, които страдат от това заболяване, без подходящо лечение, атопичният дерматит може да причини психологически стрес на пациентите и да натовари семейните и социалните разходи за здраве [9]. За съжаление, няма подходящ метод за лечение на алергичен дерматит. Настоящите възможности за лечение все още избягват причиняващите болести алергени, а продължителната употреба на стероиди е златният стандарт за лечение. Неизбежните алергени и страничните ефекти на лекарствата подтикнаха спешното разработване на нови терапевтични лекарства. Естествените съединения, изолирани от лечебни билки и растения, са потенциални източници на терапевтични средства за предотвратяване и лечение на възпалителни заболявания и подобряване на качеството на живот на пациенти с алергични заболявания.

Cistanche може да спре стареенето

Справката идва от сърцевината на лотоса (ембриона на семето) на растението Nelumbo nucifera и е основен бисбензилизохинолинов алкалоид. Има доказателства, че референтът има широк спектър от фармакологични свойства, като противоракови, антиоксидантни, противовъзпалителни и невропротективни ефекти при много заболявания [10-15].Cistanche ползиХан и др. установено, че референтът предизвиква ефекти против фотостареенето чрез инхибиране на медиираното от ултравиолетовите лъчи повишаване на ROS и нивата на малондиалдехид (MDA) в човешки кератиноцити и фибробласти [16,17] Наскоро установихме, че референтът има потенциал като алтернативно лекарство за лечение на атопични дерматит или други свързани с кожата възпалителни заболявания[18]. Все още обаче остава несигурно дали препратката играе противокожно-алергичен ефект в мастните клетки. В това проучване ние имахме за цел да проучим ефектите от референтните данни върху медиирани от мастоцитите алергични заболявания, като използвахме човешки мастоцитни линии (RBL-2H3 клетки) и съединение 48/80- и DNCB-индуцирана анафилаксия модел на мишка.

La referencencia proviene del nucleo de loto (el embrión de la semilla) de la planta Nelumbo nucifera y es un importante alcaloide de bisbencilisoquinolina. Съществуват доказателства за това, че референтната информация е разширена от фармакологични пропиедади, като противоракови, антиоксидантни, противовъзпалителни и невропротектори и много други лекарства [10-15]. Beneficios de la cistanche Khan et al. encontró que la referencencia produce efectos anti-fotoenvejecimiento al inhibir el aumento de los niveles de ROS y malondialdehído (MDA) mediado por UV en queratinocitos y fibroblastos humanos [16,17] Recientemente, descubrimos que la referencia tiene potencijal como medicina alternativa para el tratamiento de atópica dermatitis u otras enfermedades inflamatorias relacionadas con la piel[18]. Sin embargo, sigue siendo incierto si la referencia tiene un efecto contra la alergia cutánea en los mastocitos. En este estudio, nuestro objektivo fue investigar los efectos de referencia en las enfermedades alérgicas mediadas por mastocitos, utilizando líneas de mastocitos humanos (células RBL-2H3) y un modelo de ratones con anafilaxia inducida por compuesto 48/80 y DNCB .

2. Резултати

2.1. Тест за цитотоксичност на неферин върху мастни клетки на плъх (RBL-2H3)

Тъй като базофилната левкемия на плъх (RBL) -2H3 клетки, хистамин-освобождаващ аналог на мастоцитите, са подходящи клетки за изследване на ефектите на медиирано от мастоцитите възпаление [19], ние използвахме тези клетки, за да изследваме антиалергичните ефекти на справката. Първо тествахме дали референтният продукт може да предизвика цитотоксичност в мастоцитите. Когато клетките са предварително третирани с референтна концентрация от 1 до 30 μM за 24 часа, клетъчната жизнеспособност на клетките няма да бъде повлияна от референтната обработка (Фигура 1).

2.2. Неферинът намалява дегранулиращия ефект на RBL-2H3, стимулиран от различни активатори

RBL-2H3 клетки обикновено се използват за in vitro изследвания на дегранулация [20-22]Стимулиране на RBL-2H3 клетки с анти-динитрофенол (DNP)IgE и DNP-конюгиран човешки серумен албумин (HSA) предизвиква дегранулация. Освен това е известно, че мастните клетки дегранулират в отговор на синтетични съединения, като съединение 48/80 и калциевия йонофор A23187, и тези съединения са използвани като удобни реагенти за директни изследвания на механизмите на in vitro алергични отговори [23, 24]. Резултатите показват, че цитоплазмата на RBL-2H3, която не е активирана от активатора, съдържа ограничени секреторни гранули.цистанчен холестеролСамостоятелното третиране с референтен （10 μM） не повлиява активността на RBL-2H3 (Фигура 2A, B). Въпреки това, добавянето на различни активатори, включително съединение 48/80, A23187 и анти-DNP/IgE плюс DNP/HSA, ясно запълни цитоплазмата със секреторни гранули. Под електронен микроскоп може да се види, че в цитоплазмата има голям брой секреторни гранули, а някои секреторни гранули дори се сливат с клетъчната мембрана, което води до дегранулация (Фигура 2C-E). След предварителна обработка с референтни 10 uM, секреторните гранули в цитоплазмата бяха значително намалени (Фигура 2F-H). Тези резултати показват, че препратката може ефективно да инхибира активирането и дегранулацията на RBL-2H3, стимулирани от активатора.

2.3. Неферинът инхибира PMA/A23187-индуцираното вътреклетъчно повишаване на калция в RBL-2H3

Калциевите йони играят ролята на вторичен посредник в процеса на клетъчно активиране. A23187 е най-ефективният начин за увеличаване на проникването на калциеви йони през клетъчните мембрани и стимулиране на активирането на мастоцитите. Форбол миристат ацетат (PMA) може да активира протеин киназа Cand и да увеличи вътреклетъчните калциеви йони, за да подобри ефекта на A23187. Увеличаването на калциевите йони в мастоцитите също се счита за важен фактор за индуциране на активирането на мастоцитите, така че да повлияе на дегранулацията на мастоцитите и да освободи повече възпалителни цитокини и хемокини.Cistanche deserticola странични ефекти,Следователно, това проучване се стреми да проучи дали референтният източник може да инхибира концентрацията на калциевите йони в RBL-2H3, когато инхибира възпалението. Експерименталната група беше разделена на със или без референтна предварителна обработка за 20 минути и бяха добавени 1 mM CaClz и PMA/A23187 за стимулиране и активиране на RBL-2H3. Експерименталните резултати показват, че третирането на RBL-2H3 само с различни еталонни концентрации не повлиява повишаването на концентрацията на вътреклетъчните калциеви йони. В групата с PMA/A23187-индуциран приток на Ca2t, концентрацията на вътреклетъчните калциеви йони се повишава значително. Клетките RBL-2H3 бяха предварително третирани за 20 минути с референтни (3 μM и 10 μM) и концентрацията на калциевите йони беше значително намалена (Фигура 3).

2.4. Неферинът намалява експресията на иРНК на провъзпалителни цитокини в PMA/A23187, стимулирани от RBL-2H3

Имунният отговор на кожата ще увеличи броя на мастоцитите в тялото и след това мастоцитите ще произвеждат провъзпалителни цитокини и ще ускорят развитието на заболяването. Провъзпалителните цитокини, особено TNF-a, IL-6, IL-1 и IL-8, не само предизвикват възпаление, но също така причиняват левкоцитна инфилтрация, образуване на грануломи и тъканна фиброза. PMA/A23187 действа върху мастоцитите и ги индуцира да произвеждат IL-16, IL-6, TSLP и TNF-, причинявайки възпаление, свързано с алергия. Следователно, ние третирахме предварително RBL-2H3 с референтна стойност за 20 минути и стимулирахме с PMA/A23187 за 6 часа, за да установим дали референтната стойност може да регулира надолу експресията на иРНК на IL-1, IL{{ 19}}, TSLP и TNF-a. Резултатите показват, че в групата, лекувана само с референтна стойност, експресията на цитокинова иРНК не е засегната и експресията на иРНК в групата, която индуцира възпаление от PMA/A23187, се увеличава значително. В групата, третирана с еталон, се наблюдава, че нивата на експресия на иРНК на IL-1, IL-6, TSLP и TNF-a са значително потиснати (Фигура 4).

2.5. Неферинът инхибира PMA/A23187-индуцираното фосфорилиране на MAPK пътя в RBL-2H3

Предишни проучвания изтъкнаха, че мастоцитите трябва да освободят вътреклетъчни калциеви йони, за да активират MAPK. В допълнение, сигналният път на MAPK регулира експресията на моноцити, Т-лимфоцити, В-лимфоцити, цитокини и хемокини и индуцира автоимунитет. Този механизъм е подобен на пътя на активиране на PMA/A23187. В това проучване проучихме дали препратката може да участва в регулирането на MAPK пътищата. Третирахме различни референтни концентрации (1,3 и 10 uM) на RBL-2H3 в продължение на 20 минути и след това стимулирахме с PMA/A23187 в продължение на 30 минути, за да предизвикаме възпаление. Резултатите показват, че когато RBL-2H3 е третиран само с различни концентрации на еталон, активирането на p38, JNK и ERK протеините не е засегнато. В групата, лекувана само с PMA/A23187, открихме, че p38, JNK и ERK протеините са активирани и имат значително фосфорилиране. В групата, третирана предварително с еталон, беше наблюдавано, че за по-високи еталонни концентрации, фосфорилирането на p38, JNK и ERK протеини беше значително намалено (Фигура 5A-C).

2.6. Неферинът инхибира PMA/A23187-индуцираното фосфорилиране на NF-B пътя в RBL-2H3

Експресията на провъзпалителни цитокини зависи от активирането на транскрипционния фактор NF-kB в мастоцитите. Когато IKB протеинът е фосфорилиран и разграден, NF-kB се освобождава и мигрира в ядрото, свързвайки се със съответните му ДНК-реагиращи елементи и насърчавайки транскрипцията на провъзпалителни медиатори. Бяха произведени много цитокини и хемокини, които регулират имунния отговор, диференциацията и възпалението. Следователно, ние проучихме дали предварителната обработка с референтна информация засяга протеиновото фосфорилиране, индуцирано от PMA/A23187. Ние третирахме различни референтни концентрации（1,3 и 10 μM） към RBL-2H3. След 20 минути PMA/A23187 стимулира RBL-2H3 за 1 час или 2 часа, за да предизвика възпаление. Резултатите показват, че третирането на RBL-2H3 само с различни референтни концентрации не повлиява фосфорилирането на IKBa и NF-KB. Когато PMA/A23187 се използва за стимулация, се наблюдава значително увеличение на фосфорилирането на IkBo и NF-KB. В групата, обработена предварително с референтна стойност, беше установено, че фосфорилирането на IkBa (Фигура 6А) и NF-KB (Фигура 6В) е значително намалено.

2.7. Ефектът на неферин върху 2,4-динитрохлоробензен (DNCB) индуциран атопичен дерматит

Животински модел за изследване на заболявания, DNCB е представителен дразнител, който причинява атопичен дерматит[25]. Нашият експеримент използва 1 процент динитрохлоробензен (DNCB), разтворен в 75 процента алкохол, за да предизвика първия етап на реакция на сенсибилизация. Референтен (3 mg/kg и 10 mg/kg) и дексаметазон (Dexa, {{10}}.2 mg/kg), разтворени в DMSO, се прилагат интраперитонеално на петия ден в продължение на десет дни . На 8-ия, 1-вия и 14-ия ден се прилага 0,5% DNCB като втори етап на предизвикване на възпаление. Мишките бяха разделени на четири групи - контролна група, DNCB група, референтна група и група, лекувана с дексаметазон - и след това, след сравнение между групите, бяха отбелязани разликите. Ние наблюдавахме, че DNCB индуцира реакция на атопично възпаление на кожата върху кожата на мишки. След прилагане на DNCB беше установено, че кожата на мишките се зачервява и лющи. Всички те се дължат на анормална пролиферация на кератиноцити, инфилтрация и агрегация на имунни клетки. Групата, лекувана с референтни 3 mg/kg и дексаметазон 0,2 mg/kg в продължение на четири дни, е облекчила зачервяването. Продължихме да наблюдаваме състоянието на дорзалната кожа на мишките до ден 15. В сравнение с контролната група, DNCB групата имаше силно зачервени и подути кожни състояния и имаше пърхот и рани, които изглежда бяха причинени от сърбеж и болка . Можем да открием тенденция на намаляване на степента след лечение с референтен и дексаметазон (Фигура 7А). Оцветяването с толуидиново синьо се използва за наблюдение на броя на агрегираните мастни клетки. Мастните клетки изглеждат лилави, когато се наблюдават под микроскоп. Може да се покаже количествено, че много мастни клетки са инфилтрирани и натрупани в дермата в експерименталната група с DNCB, значително увеличени в сравнение с контролната група. В групата, лекувана с еталон и дексаметазон, инфилтрацията, агрегацията и броят на мастоцитите са намалени (Фигура 7B, C).

2.8. Неферин подобрява експресията на иРНК на свързани с бариера молекули след лечение на DNCB

Възпалението, свързано с кожата, причинено от AD, може да причини ненормална функция на кожната бариера. Ако кожната бариера е дефектна, за антигените или дразнителите е по-лесно да проникнат през епидермиса на кожата и да навлязат в тялото, за да предизвикат имунни реакции. В същото време производството на диференциационни протеини, включително филагрин, лорикрин и инволукрин, ще бъде потиснато. Следователно, възстановяването на увредената кожна бариера е много важно за предотвратяване и лечение на AD [26]. В нашето проучване използвахме препратки, за да се намесим в животинския модел на DNCB-индуциран атопичен дерматит. След умъртвяване на мишки, дорзалната кожна тъкан беше заземена за RI-qPCR анализ, за ​​да се оцени дали справката може да подобри намаляването на експресията на иРНК във филагрин, лорикрин и инволукрин след лечението с DNCB. Резултатите показват, че експерименталната група на DNCB има значително намалена експресия на иРНК на филагрин, лорикрин и инволукрин в сравнение с контролната група. Експресията на иРНК на филагрин, лорикрин и инволукрин беше значително повишена в групата, лекувана с референтна група и дексаметазон, в сравнение с групата на DNCB (Фигура 8).

Освен това доказахме, че референтът има антиалергичен ефект на надраскване. Използвахме агент за дегранулация на мастни клетки, съединение 48/80, за да предизвикаме поведение на надраскване при BALB/c мишки. Както е показано на Фигура 9, ние открихме, че референтното третиране инхибира поведението на надраскване, причинено от съединение 48/80（50 ug/място）. Повтарящото се прилагане на по-ниски и по-високи референтни дози (3 и 10 mg/kg) в продължение на 5 последователни дни значително намалява броя на одраскванията, причинени от съединение 48/80.