Ефекти против стареене на антоцианините Ribes Meyeri върху нервните стволови клетки и стареещите мишки Част 2

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

Nar спасява стареещи фенотипове на 23M-NSCs

Антоцианините на R. Meyer са богати на много видове флавоноиди и биоактивни компоненти [1,3-5]. За да определим кой компонент на антоцианините на R. Meyer играе важна роля в борбата със стареенето, ние извършихме метаболомен анализ на R. антоцианини на Майер. Разкрихме, че Nar може да бъде важен флавоноиден метаболит, тъй като биосинтетичният път на флавоноидите е силно обогатен с антоцианини на R. Meyer (допълнителна таблица 1). За да се определят антисенесцентните ефекти на Nar, различни концентрации (0, 1.7,3.4,6.8,13.6 и 27.2 ug/mL) бяха приложени към 23M-NSCs и CCK-8 анализи бяха използвани за изследвайте жизнеспособността на клетките Както показва Допълнителна Фигура 3, лечението с Nar от 6,8 ug/mL повишава жизнеспособността на клетките със 150 процента. За по-нататъшно изследване на антисенесцентните ефекти на Nar, 23M-NSCs бяха третирани с Nar и след това бяха открити индикатори, свързани със стареенето .използва хесперидинВ 23M-NSCs, третирани с 6,8 ug/mL Nar, експресията на p16nk4a mRNA беше намалена (Фигура 3А). Nar също така удължава теломерите на култивирани mNSC и увеличава синтеза на ДНК (Фигура 3B, 3C). За по-нататъшно изследване на ефектите на Nar върху клетъчната пролиферация, ние извършихме имунофлуоресцентно оцветяване на Ki67, който е ядрен антиген на митотични клетки, който се експресира през целия клетъчен цикъл, с изключение на G0 [19,27]. Третирането с Nar засилва клетъчната пролиферация, измерена чрез увеличен брой Ki67-положителни клетки (Фигура 3D, 3E). След това открихме и потенциала за диференциация на NSC в неврони. Наистина, лечението с Nar с 6,8 ug/mL също повишава броя на MAP2-положителните клетки (Фигура 3F, 3G). Тези резултати последователно показват, че Nar може да обърне стареенето на 23M-NSC.

Фигура 2. Антоцианините на Ribes Meyer подобряват паметта и способностите за учене на мишката чрез увеличаване на нервните стволови клетки (NSC). (A)Отнема време за намиране на платформата. (B) Отнема време за първо достигане до платформата. (C) Средна скорост за намиране на платформата. (D) Преплувано разстояние, преди да намери платформата. (E. F) Лечение с R.изгубената империя cistancheвсеки антоцианин увеличава броя и размера на невросферите в сравнение с контролите. (G) Невросферите с размер 50-100 um са увеличени на брой чрез лечение с антоцианин на R. Meyer при мишки. Данните са представени като средна ±SD от три независими експеримента. *П<><0.01, and=""><0.0001 compared="" with="" untreated="" cells."n"="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" in="" each="" experimental="">

Фигура 3. Ефект на нарингенин (Nar) върху стареенето на миши неврални стволови клетки (MNC). (A) експресията на p16k4a mRNA се измерва чрез qRT-PCR в 23M-NSCs със и без лечение с 6.8 ug/mL Nar за 48 часа. (B) Разпределения на фазите на клетъчния цикъл на 23M-NSCs, третирани с Nar за 48 часа и контролни клетки. (C) Относителната дължина на теломерите на 23M-NSCs се увеличава значително при лечение с Nar, (D) Имунофлуоресцентно оцветяване с Ki67 на мускули, третирани с Nar за 48 часа, с DAPI ядрено маркиране, (E) Количествено определяне на (D), (F) представител полета на MAP2 и GFAP имунофлуоресцентно оцветяване на култивирани mNSCs след контрола и Nar лечение. (G) Количествено определяне на (F). Данните са представени като средна стойност ± SD от три независими експеримента. *П<>< 0.01,="" and="">< 0.0001="" compared="" with="" untreated="">

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Nar подобрява паметта и познавателните способности при стареещи мишки

Когнитивните нива намаляват с напредване на възрастта и лечението против стареене може да подобри когнитивните нива [11, 28]. За да проверим анти-стареещите ефекти на Nar in Vivo, ние инжектирахме 20 mg/kg Nar в стареещи мишки C57BL/6 (на възраст 12 месеца) през опашната вена. Тестът MWM е използван за изследване на пространствената памет и когнитивните способности на мишките.микронизирана пречистена флавоноидна фракция 1000 mg използваВ продължение на 5 дни на повтарящо се обучение, времето, необходимо на третираните с Nar стареещи мишки, за да намерят платформата, постепенно намалява в сравнение с контролната група (Фигура 4А). Резултатите от теста разкриха, че времето, необходимо за първо достигане до платформата, е намалено (Фигура 4B), докато времето, прекарано в зоната на платформата, е увеличено (Фигура 4C). Освен това, стареещи мишки, третирани с Nar, се наблюдават в зоната на платформата с по-висока честота от контролната група (Фигура 4D). Заедно тези резултати предполагат, че Nar може да подобри пространствената памет и когнитивните способности при стареещи мишки.

Анализ на РНК секвениране на третирана с Nar кръв от застаряващи мишки

За да изследваме Nar-специфичните механизми против стареене, ние анализирахме профила на генна експресия на третирана с Nar кръв от застаряващи мишки, използвайки РНК секвениране (RNA-seq). Резултатите разкриват 1961 диференциално експресирани гени (DEG). Като цяло, Nar намалява генната експресия и само малък брой гени са регулирани нагоре в сравнение с нетретираната контролна група (Фигура 5A, 5B). Освен това, важните гени на сигналния път, свързани със стареенето, бяха регулирани надолу, особено тези в TNF сигналния път (Фигура 5C).отефлавоноидТези резултати предполагат, че Nar засяга TNF сигналния път, като по този начин дълбоко влияе върху функцията на TNF-a, който участва в свързаните със стареенето когнитивни увреждания [29,30]. Затова ние изследвахме нивата на TNF- в плазмата на мишки. Резултати от d имуносорбентни анализи (ELISA), свързани с ензима

Фигура 4. Нарингенин (Nar) подобрява паметта и способностите за учене при стареещи мишки. (A) Латентността на бягство на стареещите мишки, третирани с Nar, е по-кратка в сравнение с контролната група. (B) Времето, необходимо за първо достигане на платформата, е по-кратко при стареещи мишки, третирани с Nar, отколкото в контролната група. (C) Продължителност на времето, прекарано в зоната на платформата. (D) Честота на наблюдаване в зоната на платформата за стареещи мишки, третирани с Nar, в сравнение с контролната група. Данните са представени като средна ±SD от три независими експеримента.*P<>< 0.01,=""><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group."n"="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" used="" for="" each="" experimental="" group.="" revealed="" that="" nar="" treatment="" led="" to="" the="" downregulation="" of="" plasma="" tnf-a="" levels="" (figure="" 5d).="" we="" also="" examined="" pl6ink4agene="" expression="" in="" the="" hippocampus="" of="" mice="" and="" demonstrated="" that="" nar="" treatment="" downregulates="" pl6ink4amrna="" expression(figure="">

Cistanche може да спре стареенето

ДИСКУСИЯ

Стареенето е свързано с повишен риск от когнитивен спад, както и загуба на способността за учене и памет [22,23]. Загубата на неврони и нарушената неврогенеза са тясно свързани със свързаната с възрастта мозъчна дисфункция [11-13]. По този начин увеличаването на броя на невроните и подобряването на неврогенезата са от решаващо значение за лечението против стареене. R. Meyer, растение, богато на флавоноиди и други биоактивни вещества [1, 3-6], има много функции, които все още не са описани. В настоящото изследване антоцианините на R. Meyer насърчават пролиферацията на NSC и увеличават образуването на невросфери с еднаква морфология. Лечението с антоцианин на R. Meyer също подобрява фенотипа на клетъчното стареене, с намалени нива на ROS и свързаната със стареенето P16nk4 генна експресия, повишена фаза на синтез на ДНК и удължени теломери.пуритански витамин cОсвен това резултатите от имунофлуоресцентното оцветяване разкриват, че антоцианините на R Meyer стимулират образуването на неврони. Тези резултати предполагат, че антоцианините на R. Meyer имат ефект против стареене върху mNSC и могат също така директно да насърчават образуването на неврони in vitro. Освен това, когнитивният спад е тясно свързан със стареенето [22, 23]. Нашите резултати от MWM показват, че интрагастралното приложение на антоцианините на R. Meyer подобрява пространствената памет и способностите за учене при стареещи мишки, а също така повишава

Figure 5. Tumor necrosis factor(TNF)-a plays an essential role in naringenin (Nar)-mediated anti-aging effects. (A) Summary of gene expressions in mouse blood, as determined by RNA-seq. (B)Heatmap showing differentially expressed genes (DEGs) in the blood between control and Nar-treated mice. DEGs were identified by a fold change of >2.0 или<0.5. (c)bar="" graph="" showing="" the="" major="" correlated="" signaling="" pathways.="" (d)="" heatmap="" showing="" degs="" in="" the="" tnf="" signaling="" pathway="" (e)="" plasma="" tnf-a="" levels="" determined="" by="" enzyme-linked="" immunosorbent="" assay.="" (e)="" p16hka="" gene="" expression="" levels,="" as="" determined="" by="" qrt-pcr.="" data="" are="" presented="" as="" the="" mean="" ±="" sd="" of="" three="" independent=""><><><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group.="" nsc="" and="" neuronal="" numbers="" in="" the="" hippocampus="" of="" aging="" mice.="" these="" results="" suggest="" that="" r.="" meyer="" anthocyanins="" may="" enhance="" cognitive="" function="" by="" increasing="" nsc="" proliferation="" and="">

Използването на метаболомен анализ за изследване на специфичния състав на антоцианините на R. Meyer разкри, че Nar може да бъде важен флавоноиден метаболит. По-рано се съобщава, че Nar подобрява стареенето на миокардните клетки [31], подобрява метаболитния капацитет на чревния тракт [32] и упражнява противовъзпалителни [33] и противоракови [34] ефекти. Въпреки това, ефектите на Nar върху NSC по време на стареене остават неизвестни. За да проучим ефектите против стареене на антоцианините на R. Meyer, ние проведохме допълнителни проучвания, използвайки Nar. Третирането с 6,8 ug/mL Nar повишава жизнеспособността на клетките, намалява експресията на ген P16ink4a, удължава теломерите и насърчава диференциацията на NSC в неврони in vitro. За по-нататъшна оценка на ефектите на Nar върху клетъчната пролиферация, ние проведохме имунофлуоресцентни изследвания. Резултатите показват, че лечението с Nar увеличава както броя на Ki67-позитивните клетки, така и дела на MAP2-позитивните клетки, което предполага, че Nar може да стимулира неврогенезата. Освен това ефектите на Nar върху ученето и паметта също са оценени при стареещи мишки. Резултатите от теста MWM последователно показват, че лечението с Nar подобрява пространственото обучение при стареещи мишки. Интересното е, че анализът на RNA-seq разкри, че Nar може да повлияе на стареенето чрез сигналния път на TNF, особено чрез понижаване на експресията на TNF-a в кръвта на стареещи мишки. Анализите ELISA също показват, че лечението с Nar намалява плазмените нива на TNF-a в сравнение с контролните стареещи мишки. TNF-a е ключов фактор в сигналния път на TNF и е тясно свързан с когнитивното стареене. Неговите функции включват насърчаване на патологични промени в хипокампалните синапси [29] и инхибиране на пролиферацията на прекурсорни клетки [35]. Променените нива на TNF се свързват с когнитивно увреждане при депресия, шизофрения, биполярно разстройство и болестта на Алцхаймер [30,36,37]. По-конкретно, TNF-a се регулира нагоре при пациенти с болестта на Алцхаймер [38].

В обобщение, нашето проучване демонстрира, че антоцианините на R. Meyer подобряват ефектите от стареенето в NSCs чрез Nar, което понижава нивата на TNF-a in vivo и подобрява познанието при стареещи мишки. Взети заедно, нашите открития предоставят нова стратегия за разработване на клинични лечения, насочени към по-голяма реализация на лечебната стойност на антоцианините на R.Meyer.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Опитни животни

Това проучване беше одобрено от Комитета за грижа за животните на университета Тонгджи и проведено в съответствие с институционалните указания. Антоцианините на R. Meyer се прилагат интрагастрално в продължение на 2 месеца на 12-месечни мишки, поддържани на фона на C57BL/6. Nar се инжектира в опашната вена за мишки на възраст от 1- до 12- месеца, поддържани на фона на C57BL/6. На контролните мишки се дава същия обем фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS).

Получаване на R. Meyer антоцианини и Nar

Плодът на R. Meyer (500 g) се хомогенизира с помощта на тъканен хомогенизатор и се суспендира в 1 L метанол, съдържащ 0,1 процента солна киселина. Ултразвуковата екстракция се извършва три пъти в продължение на 30 минути при стайна температура. Екстрактите се комбинират и метанолът се концентрира при понижено налягане, за да се получат екстракти от R Meyer. Екстрактът беше допълнително пречистен с AB-8 макропореста смола, за да се увеличи съдържанието на антоцианин.

Нарингенин (C15H1205; MW:272.25; чистота: по-голяма или равна на 98 процента; HPLC степен) е закупен от Chengdu Push Biotechnology Co. Ltd. (Сичуан, Китай) и се съхранява при 2 градуса {{6 }} градуса в суха среда без светлина. Концентрацията на изходния разтвор беше 100 тМ в диметилсулфоксид (DMSO). Крайната концентрация на DMSO не надвишава 0,1 процента в културалната среда.

Тестове за невросфера и диференциация

NSCs са получени от миши SVZ. Мишките бяха умъртвени след анестезия и SVZ беше внимателно дисектиран и дисоцииран на единични клетки с 0.4 U/mL папаин (Imogen, Александрия, Вирджиния, САЩ; кат. номер: LS003126). NSCs се поставят в 10 cm панички, съдържащи 10 mL NSC базална среда с 10 ng/mL EGF (PeproTech, Cranbury, NJ, USA; кат. №: AF-100-15) и 10 ng/mL FGF (PeproTech, Cranbury, NJ , САЩ; кат. номер: AF-100-18B). Невросферите се прекарват на всеки 5 дни. NSCs от прясно дисоциирани пасаж-2 невросфери се посяват върху ламинин (Gibco, Gaithersburg, MD, САЩ; кат. №: 23017015) и поли-L-орнитин хидробромид (Poly-L; Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA ; Каталожен номер: P3655) стъклени предметни стъкла в NSCBasalMedium без добавки за диференциация. Диференцираните клетки бяха имунооцветени за Tu1 (бета-тубулин II; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA; Cat No: 480011), MAP2 (Thermo Fisher Scientific, Cat No: MA 5-12826) и глиален фибриларен кисел протеин (GFAP; Thermo Fisher Scientific, кат. № PA5-16291), и след това обратно оцветени с 4'6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI; Thermo Fisher Scientific, кат. №: D1306). Слайдовете бяха изследвани с помощта на микроскоп Olympus BX53 (Olympus, Madison, WI, USA). Количественото определяне на TuJ1- и MAP2-положителните клетки беше извършено чрез преброяване на белязани клетки от три независими експеримента. Статистическият анализ беше извършен с помощта на несдвоен t-тест.

Тази статия е извлечена от www.aging-us.com AGEING 2020, Vol. 12, № 17