Приложения на аптамер в невронауките, част 2

Друг невротрансмитер, серотонинът, играе роля в невромодулационните дейности, засягащи съня, агресията, апетита и сексуалната активност. Произвежда се в различни части на тялото, като мозъка, гръбначния мозък, тромбоцитите и червата [81–84].

Серотонинът е невротрансмитер, който играе важна роля за човешкото физическо и психическо здраве. В човешкото тяло серотонинът регулира настроението, контролира апетита и съня и насърчава чувството на физическо удоволствие и благополучие. Въпреки това, серотонинът също играе важна роля за повлияване на паметта.

Изследванията са установили, че серотонинът може да насърчи подобряването на паметта чрез регулиране на сигнализирането между невроните. Когато хората са положително стимулирани, тялото освобождава серотонин, който помага за укрепване на връзките между невроните и подобрява ефективността на паметта. Серотонинът може също да направи хората по-креативни, да подобри умствената гъвкавост и да помогне на хората да учат и мислят по-бързо.

В допълнение, серотонинът може да помогне за намаляване на симптомите на тревожност и депресия, проблеми с настроението, които могат да повлияят негативно на концентрацията и паметта на хората. Щастливото настроение и психическото състояние често могат да насърчат разпознаването и способността на хората да учат нови неща.

За да обобщим, серотонинът играе незаменима роля в нашето физическо и психическо здраве, учене и памет. Можем да увеличим освобождаването на серотонин и [подобрим паметта], като променим хранителните си навици, количеството упражнения, методите на учене и т.н., култивирайки позитивен и здравословен манталитет и постоянно предизвиквайки себе си непрекъснато да насърчаваме подобряването на паметта. Може да се види, че трябва да подобрим паметта и Cistanche deserticola може значително да подобри паметта, тъй като Cistanche deserticola има антиоксидантни, противовъзпалителни и анти-стареене ефекти, които могат да помогнат за намаляване на окисляването и възпалителните реакции в мозъка, като по този начин предпазват здраве на нервната система. В допълнение, Cistanche deserticola може също така да стимулира растежа и възстановяването на нервните клетки, като по този начин подобрява свързаността и функцията на невронните мрежи. Тези ефекти могат да помогнат за подобряване на паметта, ученето и скоростта на мислене и могат също така да предотвратят развитието на когнитивна дисфункция и невродегенеративни заболявания.

Щракнете върху познайте добавките за увеличаване на паметта

Дисбалансът на нивата на периферния серотонин е свързан с няколко болестни състояния, включително хипертония, бъбречно заболяване и депресия. Следователно използването на серотонин за прогнозиране на болестното състояние и за започване на правилно лечение има клинично значение.

Разработен е плазмоничен анализ за серотонин с конюгат аптамер-AuNP, за който агрегацията се променя в присъствието на серотонин. Промяната в агрегацията на частиците може да бъде измерена като промяна в пиковата дължина на вълната на абсорбция.

Анализът показа специфичен отговор към серотонина и не даде статистически значим сигнал с неговите метаболити, 5-хидроксииндолоцетна киселина (5-HIAA), епинефрин или норепинефрин, когато всеки беше тестван при 1 µM.

Фетален говежди серум, като имитатор на човешки серум, също не инициира сигнал [85]. Наскоро бяха разработени имплантируеми аптамерни транзистори с полеви ефекти (FET) невросонди за наблюдение на нивата на серотонин в мозъчната тъкан. Ултратънките In2O3 повърхности на наномащабни FETs бяха модифицирани с аптамери и тези невросонди позволиха fM граници на откриване на серотонин in vivo с минимално биообрастване [86].

С допълнителни невро сонди ще бъдат възможни пространствено-времеви записи на невроактивността, така че мозъчните функции да могат да бъдат разбрани на много по-дълбоко ниво. Епинефринът е катехоламинов невротрансмитер с широк спектър от физиологични функции, за които абнормните нива могат да причинят здравословни проблеми като аритмия, миокарден инфаркт, кръвни повишаване на налягането и белодробен оток.

Важно е да се определи количествено циркулиращият епинефрин за наблюдение на тези свързани болестни състояния. С тази цел беше разработен колориметричен метод за откриване, базиран на взаимодействието на епинефрин с аптамерно функционализиран Au-NP. Системата е по-евтина и по-специфична от други техники за количествено определяне на епинефрин, като течна хроматография и спектрофотометрия.

Също така, граница на откриване от 0,9 nM беше определена чрез UV-видима спектроскопия, което е най-ниската граница на откриване, регистрирана за епинефрин при използване на колориметричен метод. Аналозите на епинефрин, 3,4-дихидроксифенилоцетна киселина (DOPAC), триптофан, аскорбинова киселина, допамин, тирозин и хомованилова киселина показват много малък или никакъв отговор, което показва висока специфичност на аптасензора [87].

Промяна в нивото на един невротрансмитер може да показва някое от няколко заболявания, което прави много малко вероятно диагнозата на заболяването да може да бъде постигната въз основа на измерването на един невротрансмитер. Следователно, способността на повечето аптасензори да бъдат интегрирани в мултиплексна платформа ще доведе до диагностични инструменти, по-подходящи за клиники и с потенциал да поддържат по-точни идентификации на заболявания.

2.3. Откриване на биомаркери
Биомаркерът е всяко вещество, структура или процес в тялото, което или води до резултат, или показва наличието на специфично заболяване. Много биомаркери са вещества, които могат да бъдат измерени в биофлуиди като кръв, слюнка и урина.

Основният проблем при характеризирането на биомаркера за неврологични заболявания е кръвно-мозъчната бариера (BBB), през която много молекули, включително много протеини, не могат да преминат. Въпреки че протеините са доминиращите биомаркери за определени заболявания, малки пептиди, като невропептид Y или фрагменти от протеини, е по-вероятно да преминат през BBB и да бъдат открити в кръвообращението.

Метаболитите са друга важна група биомаркери за неврологични разстройства. NeoVentures Biotechnology Inc. разработи подход за избор на аптамер, наречен FRELEX, който позволява избор на аптамери въз основа на конкуренцията между къс олигонуклеотид, прикрепен към повърхността, и целта. Подобно на клетъчния SELEX и други форми на структурно превключващ SELEX, този протокол може да бъде изпълнен с проба, съдържаща смес от компоненти, без предварително познаване на целта(ите), към която ще бъдат избрани аптамерите.

С тези форми на SELEX се извършват противоположни селекции с определени подгрупи от компоненти, за да се управлява селекцията на аптамери, които отговарят на желаните специфики. Използвайки FRELEX, аптамерите бяха избрани срещу серум от трансгенни мишки, които свръхекспресират човешкия тау протеин.

За да се насочи селекцията на аптамер към човешки тау и последствията от свръхекспресията на тау, серумът от мишки от див тип беше използван в обратната селекция. Групата идентифицира обогатените аптамерни последователности, използвайки NGS и характеризира определени аптамери за трансгенни мишки в късен стадий и див тип мишки чрез сравняване на тяхното относително изобилие.

Те предположиха, че разликата в изобилието отразява съответната концентрация на епитопите (повишени в отговор на свръхекспресия на тау), с които аптамерите могат да взаимодействат [29].

3. Диагностични и терапевтични приложения

Невродегенеративните заболявания (ND) включват дегенерация на неврони в мозъка, което води до загуба на структури и функции на централната нервна система. ND може да бъде причинено от стареене, генетични фактори и фактори на околната среда.

Деменцията е едно от най-честите свързани с възрастта ND, както и болестта на Алцхаймер (AD). Болестта на Паркинсон (PD) може да се дължи на генетични мутации и/или токсини от околната среда. Амиотрофичната латерална склероза (ALS), множествената склероза (MS), болестта на Huntington (HD) и прионните заболявания са други често срещани ND с генетични връзки.

За съжаление не съществуват нито ефективни лечения, нито стратегии за ранно откриване на тези заболявания. Подобно на широко използваните антитела, аптамерите са се превърнали в атрактивни агенти за прилагане при разработването на нови биосензори за ранна диагностика на НЗ и лечение на тези заболявания [88].

3.1. Болест на Алцхаймер

Като свързано с възрастта прогресивно мозъчно разстройство, водещо до умствени недостатъци, AD е най-честата форма на деменция. Неговата патология се характеризира с агрегация на амилоид- (А), получен от амилоидния прекурсорен протеин (АРР) и иницииран в мозъчната област на хипокампуса.

Въпреки че учените предположиха, че A-индуцираната невротоксичност е свързана с неразтворимите A плаки (AP) и фибрили (AF), скорошни доказателства показват, че разтворимите A олигомери (AO) също са свързани с появата на AD.
Следователно, AO е идентифициран като привлекателен биомаркер за ранна диагностика на AD, а A и tau се считат за значими терапевтични цели за лечение на AD [89].

3.1.1. AD диагностика

Рано описаните аптамери срещу АО имат нисък афинитет и специфичност, но по-късните проучвания са по-успешни при идентифицирането на аптамери, които селективно разпознават фибрили на 40-остатъчна форма на А (А 40), но не и А 40 полимери [90].

Въпреки това, аптамерите нямат висока специфичност за А 40 фибрили спрямо фибрилите на няколко други амилоидогенни протеини, които са тествани. ДНК аптамер, избран да взаимодейства с -синуклеинов (-syn) олигомер с 68-nM афинитет, също беше показано, че свързва АО с 25-nM афинитет [91]. През 2019 г., използвайки същите аптамери, получени от Tsukakoshi et al., беше разработен електрохимичен аптасензор без етикети за по-специфично разпознаване на AO [92].

Аптамерът се самосглобява върху електроди със златна пръчка чрез взаимодействие с тиол (-S) и системата има граница на откриване от 30 ppm, определена от EIS. Това беше първият аптасензор, успешно използван за наблюдение на агрегацията на A протеин на базата на EIS, което беше възможно поради високата селективност на аптамера сред A видовете. С лесно производство и ефективна регенерация, този аптасензор може да бъде обещаващ диагностичен инструмент за ранно откриване на AD и за демонстриране на натрупване на A протеин [92].

Аптасензор за откриване на А олигомери е разработен с помощта на -syn ДНК аптамер [91] в комплекс с метиленово синьо (MB) и прикрепен към нанопорест анодиалуминий. Високият коефициент на поглъщане на MB за бяла светлина води до нисък интензитет на отразената бяла светлина.

В присъствието на А олигомери, комплексът аптамер/MB се дисоциира и увеличаването на отразената светлина се открива чрез интерферометрична спектроскопия на отразяване (IRS) [93]. Аптасензорът има граница на откриване от 8 pM и добър отговор към А олигомерите в диапазона на концентрация от 0.5 до 50 nM. Неврофибриларните възли (NFTs) са патологични отличителни белези на AD.

Образуването на NFT се инициира в хипокампуса и степента на образуване на NFT е свързана с тежестта на деменцията при AD. Хиперфосфорилирането на протеина, свързан с микротубулите, тау насърчава способността му да набира и организира нормален тау във влакна, които се превръщат в NFT. По този начин хиперфосфорилирането на тау се предлага като една от основните причини за AD.

В допълнение към нормалните си роли в насърчаването на сглобяването на микротубулите и стабилизирането на сглобените микротубули, tau се наблюдава чрез неравновесна капилярна електрофореза (CE) за свързване на три произволно избрани ssDNA олигонуклеотида, единият от които, ssDNA1, се свързва с tau381 с висок афинитет (Kd {{ 3}} nM) [94].

Беше разработен аптамер/антитяло сандвич анализ с помощта на ssDNA1 за откриване на фемтомоларни концентрации на tau протеин в човешка плазма чрез повърхностен плазмонен резонанс (SPR) [95].

В друго проучване ДНК аптамерите са избрани срещу целия тау протеин от 441 аминокиселини (tau441) чрез техника за бърза селекция, базирана на разделяне на капилярна електрофореза с три кръга на селекция, завършени за един ден. Пет аптамера, избрани от резултатите от секвенирането с висока пропускателна способност, бяха оценени от SPR за тяхната способност за разпознаване на tau.

Аналитичният потенциал на аптамера с по-висок афинитет беше демонстриран чрез анализ на анизотропия на хомогенна фаза на флуоресценция. Този аптамер с висок афинитет свързва tau441 протеин и по-късите изоформи, tau352, tau381 и tau383 с граници на откриване от 28 nM, 6,3 nM, 3,2 nM и 22 nM, съответно, в този анализ [96].

3.1.2. AD Терапевтични средства

Като една от потенциалните терапии, РНК аптамерите бяха избрани да инхибират А40 агрегацията. По време на селекцията, А олигомер беше конюгиран със златни наночастици (A -AuNPs) и два аптамера бяха идентифицирани като кандидати за аптамер след SELEX.

Децата на 10–20 nM. Тези аптамери инхибират образуването на плаки и фибрили, както се разкрива чрез трансмисионна електронна микроскопия и ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) [97].

Алкохол дехидрогеназа (ABAD) примамващ пептид (DP), който взаимодейства с A, антагонизира цитотоксичността на A пептида. Последователността ABAD-DP беше вмъкната между дватиола, които образуват дисулфидна връзка в тиоредоксина (TRX), за да се създаде TRX1-ABAD-DP-TRX2 пептидният аптамер. Неговата стабилна експресия в NIH 3T3 клетки, използвайки адено-асоциирани вируси, беше потвърдена с имунофлуоресцентно оцветяване.

Експресираният аптамер може да свърже А пептида и да подобри клетъчната жизнеспособност. Това изследване потвърждава ефективното инхибиране на цитотоксичния ефект на А пептид от пептидни аптамери [98]. Тау протеините обикновено се свързват с и стабилизират микротубулите, но тяхното хиперфосфорилиране може да доведе до протеинови агрегати, наречени "тауопатия", което е токсично.

ДНК аптамер Tau-1, който е избран срещу човешки tau441, инхибира олигомеризацията на Tau1 in vitro [99]. Това инхибиране също беше потвърдено в проучвания на клетъчни култури, използващи клетки HEK293 [100]. Бета-секретазата (BACE1) играе роля в производството на A и инхибирането на експресията на BACE1 е смъртоносно при мишки. Лечението на AD може да включва BACE1 модулация.

Въпреки това, неговият голям активен център прави BACE1 предизвикателна цел за малки молекулни инхибитори. За да се заобиколи това, аптамерите на нуклеинова киселина могат да бъдат нови инструменти за инхибиране на активността на BACE1. Този ензим има цитоплазмена опашка, B1-CT, служеща като докинг място за протеини като меден шаперон за супероксид дисмутаза-1 (CCS) и ADP рибозилиращ фактор-свързващ (GGA1) протеин.

Физиологичната роля на B1-CT е до голяма степен неизвестна. РНК аптамерът, насочен към B1-CT, свързва мембраната-проксималната половина на C края на BACE1, предотвратява набирането на CCS, като същевременно позволява GGA1 да се свързва с BACE1 и регулира транспорта на BACE1 към рециклиращи ендозоми [101].

За специфично насочване към BACE1, ДНК аптамерите, BI1 и BI2, бяха генерирани срещу BACE1, който инхибира BACE1, но не и алфа-, или гама-секретаза. Използвайки стабилно трансфектирана клетъчна линия HEK293, те експресират прекурсора на амилоидния протеин (АРР) и, използвайки in vitro анализ на флуоресцентен резонансен енергиен трансфер (FRET), те показват, че нивото на А е намалено и клетъчният дефицит е спасен в първично култивирана невронална клетъчна линия [102]. Ефективността на аптамера беше допълнително подобрена чрез добавяне на холестерилтетра етилен гликол (TEG).

3.2. Болест на Паркинсон

Болестта на Паркинсон (PD) е второто най-разпространено невродегенеративно заболяване, засягащо около седем милиона души по света. Въпреки че е прогресивно заболяване, характеризиращо се с двигателни и немоторни характеристики, то има значителни клинични въздействия върху пациентите поради тяхната загуба на подвижност и мускулен контрол.

Загуба на стриатални допаминергични неврони и загуба на неврони в недопаминергични области характеризират PD. Загубата на неврони обикновено се свързва с характерното образуване на телца на Lewy. По този начин, наличието на телца на Lewy, съдържащи -syn олигомери в мозъка, се счита за възможна терапевтична и диагностична цел за PD.

3.2.1. PD диагностика

Първият аптамер, "M5-15", избран срещу -syn, нямаше специфичност за олигомери и може също да се свърже с -syn мономери [103]. Показано е, че ДНК аптамерите, избрани след това, взаимодействат с -syn олигомери, а не с -syn мономери, но свързват А 1–40 олигомери.

Изследователите също изследват спецификата на аптамера за -syn олигомери спрямо други протеини със структури, които са предимно -sheet, като например propeller структурата на -sheet на пиролохинолин хинин глюкоза дехидрогеназа (PQQH), и демонстрират, че аптамерът не свързва PQQH [91]. на аптасензорите се съобщава, че са способни да определят количествено -синолигомери.

Колориметричен аптасензор, използващ ДНК аптамер срещу -синолигомера, беше адсорбиран към златни наночастици (AuNP), което предотврати индуцираната от сол агрегация на наночастиците. Свързването му с -syn олигомера предотвратява абсорбцията на аптамера върху повърхността на AuNPs, което позволява агрегирането на AuNPs да бъде задействано при високи концентрации на сол и води до промяна на цвета.

Тази система беше докладвана с LoD от 10 nM. Въпреки това, серумът (дори при 2%) допринася за абсорбиране на съединения в обхвата на промяна на цвета в анализа и пречи на зависимото от солта агрегиране на аптамер-Au-NPs.

Аптасензорите, използващи EIS и SPR, са по-чувствителни, с LoD от 1 pM и 8 pM, съответно [104]. Установено е, че EIS аптасензорът е много специфичен за олигомери спрямо мономери и не се влияе от наличието на серум [104]. Сложен дизайн за електрохимичен аптасензор за откриване на -syn олигомер включва хибрид, образуван от комплементарната последователност към -syn олигомерен аптамер, свързан със златна повърхност чрез тиолова връзка и включващ терминална деоксинуклеотидил трансфераза (TdT) и dTTP за разширяване на 30-те краища на аптамера и неговия допълни с допълнителен полип.

Разширената ssDNA свързва метиленово синьо и насърчава свързването му със златната повърхност, като по този начин създава електрохимичен сигнал. Освен това системата съдържа екзонуклеаза I (Exo I), която е специфична за ssDNA. Когато аптамерът беше отстранен от бинарния комплекс с неговия комплемент чрез свързването му към -syn олигомера, комплементарните нишки бяха усвоени от Exo I, предотвратявайки натрупването на метиленово синьо на златната повърхност и по този начин намалявайки електрохимичния сигнал.

Границата на откриване беше 10 PM (S/N=3) и възстановяването на сигнала в присъствието на 10% и по-ниски концентрации на серум беше много приемливо 95,3–107% [105]. Въпреки това, нейната сложност и включването на ензими правят тази система по-малко вероятно да бъде стабилна за съхранение и възпроизводима на полето. Комбинация от капилярна електрофореза-масспектрометрия (CE-MS) с екстракция на твърда фаза (SPE) за предварително концентриране на целта с модифицирана с аптамер микропатрон в голям обем инжектирани проби намали границата на откриване 100-кратно в сравнение със системите CE-MS.

В тази нова система пробата се почиства и обемът се свежда до минимум за подобрен анализ чрез използването на микропатрон, който селективно задържа целта. Установено е, че сорбентът с аптамерен афинитет (AA) в патрона е по-добра алтернатива на антитялото базиран на имуноафинитет (IA) сорбент като фоновите електролити, необходими за изплакване на системата, също денатурират антителата.

Разработването на AA-SPE-CE-MS беше постигнато чрез модифициране на микропатрона с M5-15 ДНК аптамера. Системата демонстрира LoD от 2,8 nM и има линеен обхват на откриване между 7 и 140 nM от -syn в кръвната проба.

Също така, идентифицирането на свободни и N-ацетилирани -syn протеоформи беше възможно в резултат на високоточното масово откриване и разделителна способност на MS. И накрая, микропатронът беше открит стабилен дори с кисел BGE и може да се използва за около 20 анализа с малък шанс за погрешно количествено определяне на целта [106].

For more information:1950477648nn@gmail.com