Инхибирането на ариловия въглеводороден рецептор възстановява медиираната от индоксил сулфат ендотелна дисфункция в аортни пръстени на плъх

Резюме:Theуремичен токсин индоксил сулфат(IS), повишена вхронично бъбречно заболяване(CKD), е известно, че допринася за прогресивно сърдечно-съдово заболяване. IS активира арил въглеводороден рецептор (AhR), медииращ оксидативния стрес иендотелна дисфункциячрез активиране на пътя на CYP1A1. Настоящото проучване изследва инхибирането на AhR с антагониста, CH223191, при IS-медиирано увреждане на съдовата ендотелна функция и нарушаване на редокс баланса. Острите ефекти на IS върху ендотелиум-зависимата релаксация бяха оценени в аортни пръстени от плъхове Sprague Dawley, изложени на следните условия: (1) контрола; (2) Е (300µМ); (3) IS + CH223191 (1µМ); (4) IS + CH223191 (10µМ). След това тъканите бяха оценени за промени в експресията на редокс маркери. IS намалява максималното ниво на ендотелиум-зависима релаксация (Rmax) с 42% (p < 0.001) compared to control, this was restored in the presence of increasing concentrations of CH223191 (p < 0.05). Rings exposed to IS increased expression of CYP1A1, nitro-tyrosine, NADPH oxidase 4 (NOX4), superoxide, and reduced eNOS expression (p < 0.05). CH223191 (10 µM) възстановена експресия на тези маркери обратно до контролните нива (p < 0.05). These findings demonstrate the adverse impact of IS-mediated AhR activation on the vascular endothelium, where oxidative stress may play a critical role in inducing ендотелна дисфункциявъв васкулатурата на сърцето ибъбреци. AhR инхибиранеможе да осигури вълнуваща нова терапия за ССЗ вХБН настройка. 

Ключови думи:арил въглеводороден рецептор; индоксил сулфат; ендотелна дисфункция; хронично бъбречно заболяване; сърдечно-съдови заболявания; оксидативен стрес

Ключов принос: Известно е, че индоксил сулфатът (IS), най-проучваният протеин-свързан уремичен токсин и мощен агонист на арил въглеводороден рецептор (AhR), играе патологична роля вХБН прогресияиТравми, свързани с ХБНв други тъкани, като васкулатурата. Това проучване демонстрира, че ex vivo инхибирането на AhR може да предотврати индуцирана от IS ендотелна дисфункция и свързани промени в редокс баланса, реализирайки потенциално новцел за лечение на ХБН

Поддържаща услуга на Wecistanche-най-големият износител на cistanche в Китай:

Имейл:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/телефон:+86 15292862950

Пазарувайте за повече подробности за спецификациите:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

КЛИКНЕТЕ ТУК, ЗА ДА ВЗЕМЕТЕ НАТУРАЛЕН ОРГАНИЧЕН ЕКСТРАКТ ОТ ЦИСТАНША С 25% ЕХИНАКОЗИД И 9% АКТЕОЗИД ПРИ БЪБРЕЧНИ ИНФЕКЦИИ

1. Въведение

ХБН засяга 10% от световното население, засягайки не само здравните системи, но също така поставя тежко икономическо бреме и бреме за производителността на страните по света [1,2]. Рискът от сърдечно-съдови заболявания (ССЗ) е повишен при пациенти с хронично бъбречно заболяване (ХБН) [3]. При тези пациенти натрупването на недиализиращи се циркулиращи протеин-свързани уремични токсини (PBUTS) като индоксил сулфат (IS) не само демонстрира повишена смъртност от ССЗ [4], но също така предсказва нежелани сърдечно-съдови събития при пациенти с хронична сърдечна недостатъчност [ 5]. ХБН и повишените нива на IS също изострят сърдечно-съдовите усложнения като хипертрофия на миокарда, дислипидемия, хронично възпаление [6], както и ендотелна дисфункция, доказана от анормална дилатация, медиирана от брахиалния артериален поток (FMD), корелирана със серумните нива на IS [7,8] . Други проучвания показват, че стесняването на микроваскулатурата при пациенти с ХБН е свързано с намалена изчислена скорост на гломерулна филтрация [9]. Освен това, проучвания върху животни съобщават, че IS, независимо дали е повишен в модел на ХБН или се прилага екзогенно, допринася за нарушена ендотелиум-зависима вазорелаксация [10,11].

IS се получава от метаболизма на триптофан, който прогресивно се натрупва в серума на напреднала ХБН стадии 2-5; неговият висок афинитет на свързване с албумин възпрепятства клирънса му дори след диализа [4,12]. Предишни проучвания идентифицираха IS като ендогенен агонист на арил въглеводороден рецептор (AhR), цитозолен лиганд-зависим транскрипционен фактор, който е конститутивно експресиран и участва в множество биологични процеси като оксидативен стрес, възпаление, съдово ремоделиране и атерогенеза [13, 14]. IS-медиирано активиране на AhR индуцира ензима, цитохром P450 1A1 (CYP1A1) в ендотелните клетки и това е свързано с повишено производство на реактивни кислородни видове (ROS) [14,15]. Освен това се наблюдава повишена експресия на CYP1A1 в кръвта на пациенти с ХБН [16]. Инхибиране на IS-медиирано активиране на AhR със селективни антагонисти като 2-метил-2Н-пиразол-3-карбоксилна киселина (2-метил-4-о-толи- Съобщава се, че лазо-фенил)-амид (CH223191) [17] обръща индуцираното от IS възпаление и производството на ROS, за да контролира нивата в ендотелните клетки [14,15].

Известно е, че AhR играе роля в поддържането на геномния редокс баланс чрез активиране на фаза I ксенобиотици и фаза II елементи на антиоксидантен отговор (ARE). Активирането на AhR задейства клетъчна система за детоксикация, която е разделена на фаза I ензими като CYP1A1, участващи в Производство на ROS. Продължаващото генериране на ROS води до неговото взаимодействие с антиоксидантния транскрипционен фактор еритроиден 2-свързан фактор (Nrf2), освен това, активирането на AhR също стимулира Nrf2 [18,19]. Nrf2 заедно с протоонкогенния транскрипционен фактор c-Maf се свързва с ARE-индуциращата експресия на фаза II антиоксидантни ензими NAD(P)H: хинон оксидоредуктаза (NQO1) и глутатион S-трансфераза (GSTA1/2). CYP1A1 и NRF2 играят хомеостатична роля в поддържането на баланс между про- и антиоксиданти [18,19].

Възможностите за лечение, които ограничават вредните ефекти на PBUT, като IS, са ограничени. Оралният адсорбент AST-120, който премахва прекурсорите на уремичния токсин от червата, като индол, намалява образуването и циркулиращите нива на IS и други PBUT, получени от индол. AST-120 е използван в малки клинични изпитвания с известен успех [20–22], което го е одобрило в няколко азиатски страни. Въпреки това, големите клинични изпитвания фаза III EPPIC-1 и -2 (Оценка на предотвратяването на прогресията при ХБН) показаха, че AST-120 не отговаря на своята първична крайна точка [23]. Това поражда необходимостта от алтернативни стратегии, които могат да предотвратят механизма на действие на ИВ. In vitro е доказано, че AhR е ефективна мишена, чието инхибиране може да блокира действията надолу по веригата на IS и потенциално други метаболити на триптофан [13,14] и може да осигури терапевтична полезност за намаляване на риска от ССЗ при ХБН и облекчаване на прогресията му.

Докато повечето in vitro проучвания, оценяващи инхибирането на AhR, използват siRNA или малки молекулни инхибитори като чистия AhR антагонист CH223191 [17], не са провеждани ex vivo проучвания, оценяващи ефекта на този антагонист върху ендотелната релаксация, за да се определи „доказателство за принципа“. Целта на настоящото проучване е да се оцени ефектът от инхибирането на AhR върху изолирана аортна тъкан, за да се предотврати индуцирано от IS увреждане на ендотелно-зависимата съдова функция чрез облекчаване на медиирания от IS оксидативен стрес и генната експресия на CYP1A1, свързана с активирането на AhR, и освен това изследва ефекти върху антиоксидантната система.

2. Резултати

2.1. Ефект на инхибирането на арил въглеводороден рецептор върху IS-увредена ендотелиум-зависима релаксация

Аортни пръстени от здрави плъхове бяха изложени на IS (10–300 µM), за да се определи оптималната доза IS, причиняваща увреждане на ендотелната релаксация. IS при 300 µM, но не и 10 µM или 100 µM, значително намалява ендотелиум-зависимата релаксация (Rmax) до ацетилхолин (ACh) в сравнение с контролата с 32% (p <0,05; Фигура 1A) и тази концентрация е използвани в по-нататъшни експерименти. В последващи експерименти в присъствието на инхибитора на AhR, CH223191 (1 и 10 µM), IS-индуцираното увреждане на Rmax (42%) беше предотвратено (p <0.001, Фигура 1B, Таблица 1). В аортни пръстени, стимулирани само с IS, ефикасността на ACh (-pEC50) беше намалена спрямо контролата (p <0.01) и възстановена в присъствието на CH223191 (p <0.05; Таблица 1). За да се определи дали инхибиторът на AhR самостоятелно показва някакъв присъщ ефект върху зависимата от ендотелиума релаксация, аортните пръстени се инкубират само с CH223191 и не показват ефект върху стойностите на Rmax или -pEC50 (Таблица 1, също допълнителна фигура S1).

Фигура 1. Ефект на CH223191 върху съдовата реактивност. (A) Излагане на аортни пръстени на IS (300 µM) намалена ACh-стимулирана ендотелиум-зависима релаксация (p <0.05; N=6). (B) Предварителната инкубация с CH223191 (1 µM и 10 µM) предотвратява намаляването на IS-индуцираната ендотелиум-зависима релаксация (p <0.001; N=10). Точки от данни, изразени като средна стойност ± SEM

2.2. Ефект на IS върху ендотела и ендотелната синтаза на азотен оксид

При завършване на отговорите на функционална релаксация към ACh, тъканни срезове от тези аортни пръстени бяха анализирани чрез имунохистохимия за ендотелни клетки и експресия на ендотелна азотен оксид синтаза (eNOS). Няма промяна в ендотелните клетки, както е определено чрез оцветяване за антиген на ендотелни клетки на плъх{{0}} (RECA-1) при четирите изследвани условия (Фигура 2А). Въпреки това, участъци от аортен пръстен, оцветени за eNOS, показват, че експозицията на IS значително намалява експресията на eNOS със 75% от ендотелната луминална повърхност (p < 0.01), докато в присъствието на CH223191 това намаление е предотвратено в присъствието от 10 µM CH223191 (Фигура 2B–F; p <0.05).

Фигура 2. IS намалява експресията на eNOS без загуба на ендотелни клетки. (A) Ендотелният клетъчен маркер RECA-1 оцветяване в аортни пръстени, третирани с IS в отсъствие и присъствие на CH223191. (B) Експресията на ендотелиална NOS, намалена в присъствието на IS, беше предотвратена с CH223191. Представителни изображения на оцветяване с eNOS в (C) контролна тъкан, (D) третирана с IS, IS в присъствието на (E) 1 uM и (F) 1{{10}} uM CH223191. Стрелките показват положително оцветяване. Данни, изразени като средно 土 SEM от=10 експеримента. ** p < 0,01 в сравнение с контролната тъкан, #fp < 0,05 в сравнение с IS експонирана тъкан Увеличение X400.

2.3. Ефект на IS и CH223191 върху про- и анти-оксиданти

Известно е, че индуцираното от IS активиране на AhR повишава CYP1A1. Установихме, че IS (3{{10}}0 µM) значително повишава експресията на CYP1A1 в аортните пръстени след 1 и 4 часа съответно с близо девет и седем пъти в сравнение с контролните условия (p <0,05, Фигура 3). CH223191 при 1 и 10 µM намалява IS-медиираната CYP1A1 генна експресия след 1 h IS стимулация до подобни нива, наблюдавани в пръстени с контролна експозиция, докато след 4 h IS стимулация само 10 µM CH223191 успява значително да намали нивата на CYP1A1 (p <0,001 , Фигура 3). При изследване на антиоксидантния път, IS в отсъствието и присъствието на CH223191 не успя да предизвика промяна в генната експресия на Nrf2, NQO1 и GSTA1/2 (вижте допълнителна фигура S2)

2.4. Ефект на IS и CH223191 върху маркерите на оксидативен стрес и възпаление

За по-нататъшно изследване на промените в редокс баланса, тъканите от функционалните експерименти бяха анализирани, за да се изследват промените в маркерите на оксидативния стрес, а именно никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADPH) оксидаза 4 (NOX4), експресия на супероксид и нитро-тирозин. Тъканите, изложени на IS, показват 180% увеличение на експресията на NOX4 (Фигура 4; p < 0.001). В присъствието на CH223191 (1 и 1 0 µM), експресията на NOX 4 беше значително намалена в сравнение с IS (Фигура 4; p < 0.001). Експозицията на IS повишава нивата на експресия на нитро-тирозин, маркер за клетъчно увреждане и оцветяване на възпаление с 90% в сравнение с контролата (Фигура 5; p <0,05), докато в присъствието на CH223191 (10 µM), експресията на нитро-тирозин е намалена обратно към контролните нива (Фигура 5; p <0,05). Експресията на молекулата на реактивните кислородни видове, супероксид, се определя чрез оцветяване с дихидроетидий (DHE). Експозицията на IS повишава DHE оцветяването с 430% в сравнение с контролата (Фигура 6; p <0.001), докато в присъствието на CH223191 и при двете дози експресията на супероксид се намалява обратно до контролните нива, както е показано на Фигура 6; (р <0,001

Генната експресия на възпалителни маркери също беше изследвана в аортата, стимулирана с в отсъствието или в присъствието на CH223191. IS предизвиква незначително увеличение от 111 и 55% в генната експресия на фактора на туморна некроза a (TNFa) и молекулата на васкуларната клетъчна адхезия-1VCAM-1, съответно, на 4 часа. В присъствието на CH223191 нивата на експресия на двата гена бяха значително намалени, както е показано на Фигура 7 (p < 0.05).

Фигура 6. CH223191 предотвратява индуцирана от IS експресия на супероксид. (A) Количествено определяне на DHE оцветяване в S-третирани аортни пръстени в отсъствие и присъствие на CH223191. Представителни изображения на експресия на супероксид в (B) контролна тъкан, (C) третирана с IS, IS в присъствието на (D) 1 uM и (E) 1{{10}} M CH223191 Данни, изразени като средна SEM от N=10 експеримента. *** p < 0,001 в сравнение с контролната тъкан#### p < 0,001 в сравнение с тъканта, изложена на IS. Увеличение х200.

Фигура 7. Ефект на инхибирането на IS и Ahk върху експресията на възпалителния ген. Излагането на аортни пръстени на IS незначително повишена (A) TNFa и (B) VCAM-1 генна експресия на 4 h. В присъствието на CH223191 експресията на TNFx и VCAM-1 беше предотвратена. Данни, изразени като средно 土 SEM от=6 експеримента. # p < 0.05 в сравнение с IS експонираната тъкан.