Бактериалните везикули блокират вирусната репликация в макрофагите чрез TLR4-TRIF-ос
Sep 27, 2023
Резюме
Грам-отрицателните бактерии естествено отделят наноразмерни външни мембранни везикули (OMV), които са важни медиатори на комуникацията и патогенезата. Поемането на OMV от клетките-гостоприемници активира TLR сигнализиране чрез транспортирани PAMPs. Като важни резидентни имунни клетки, алвеоларните макрофаги са разположени на интерфейса въздух-тъкан, където съставляват първата линия на защита срещу вдишани микроорганизми и частици. Към днешна дата се знае малко за взаимодействието между алвеоларните макрофаги и OMV от патогенни бактерии. Имунният отговор към OMV и основните механизми все още са неуловими. Тук изследвахме отговора на първичните човешки макрофаги към бактериални везикули (Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella enterica, Streptococcus pneumoniae) и наблюдавахме сравнимо NF-кВ активиране във всички тествани везикули. За разлика от това, ние описваме диференциално тип I IFN сигнализиране с удължено STAT1 фосфорилиране и силна Mx1 индукция, блокираща репликацията на вируса на грип A само за Klebsiella, E.coli и Salmonella OMV. Индуцираните от OMV антивирусни ефекти са по-слабо изразени за Clear coli OMV без ендотоксин и OMV, третирани с полимиксин. LPS стимулацията не може да имитира този антивирусен статус, докато TRIF нокаутът го отменя. Важно е, че супернатантата от третирани с OMV макрофаги индуцира антивирусен отговор в алвеоларните епителни клетки (AEC), което предполага индуцирана от OMV междуклетъчна комуникация. Накрая, резултатите бяха валидирани в ex vivo модел на инфекция с първична човешка белодробна тъкан. В заключение, Klebsiella, E.coli и Salmonella OMV индуцират антивирусен имунитет в макрофагите чрез TLR4-TRIF-сигнализиране за намаляване на вирусната репликация в макрофагите, AECs и белодробната тъкан. Тези грам-отрицателни бактерии предизвикват антивирусен имунитет в белите дробове чрез OMV, с потенциално решаващо и огромно въздействие върху резултатите от бактериална и вирусна коинфекция.
растение цистанче, повишаващо имунната система
Ключови думи
Екстрацелуларни везикули, външни мембранни везикули, бактериална и вирусна коинфекция, пневмония, макрофаги, алвеоларни епителни клетки, антивирусен вроден имунитет
Въведение
Външните мембранни везикули (OMVs) се освобождават естествено от грам-отрицателни бактерии, които са с диаметър до 300 nm. Грам-положителните бактерии са еднакво способни да освобождават мембранни везикули (MV). В резултат на тяхната биогенеза, тези липидни двуслойни мембранни структури съдържат, в допълнение към периплазменото съдържание, основни компоненти на бактериалната (външна) мембрана като липиди, протеини и, в случай на грам-отрицателни бактерии, липополизахариди (LPS) [1]. В допълнение към тяхната роля в бактериалната комуникация, OMVs са свързани с патогенни ефекти и транспорт на вирулентни фактори, например VacA от Helicobacter pylori, Shiga токсин от Shigella dysenteriae или ClyA от ентерохеморагична Escherichia coli [2]. Показано е, че тези OMV манипулират епителните клетки и имунните отговори. Наличието на бактериален ендотоксин на повърхността на OMV заедно с други транспортирани свързани с патогени молекулярни модели (PAMP) ги прави мощни стимулатори за имунните клетки, тъй като те все още могат да бъдат разпознати от съответните им рецептори [3]. Ангажирането на Tolllike рецептори (TLRs) и Nod-подобни рецептори във вродени имунни клетки може да предизвика освобождаването на провъзпалителни и имунорегулаторни цитокини, включително набиране на неутрофили или разрушаване на плътни връзки в слоевете на епителните клетки [4]. Един важен резидентен тип имунни клетки в белия дроб са алвеоларните макрофаги (AM), които се намират на интерфейса въздух-тъкан в алвеолите. Чрез поглъщане на вдишани частици, АМ представляват първата линия на защита срещу микроорганизми и частици чрез фагоцитоза и разграждане. При среща с патогена макрофагите представят антигени на адаптивните имунни клетки и освобождават провъзпалителни цитокини. По този начин те могат да действат върху тип I и II алвеоларни епителни клетки (AEC) и други имунни клетки (Допълнителен файл 1: Фиг. S1A). AM могат да бъдат активирани от няколко PAMP, за да индуцират вътреклетъчно сигнализиране и индуциране на различни модели на генна експресия чрез различни имунни рецептори [5, 6], което води до MyD88 или TRIF сигнализиране, които и двете от своя страна индуцират различни подгрупи от гени (Допълнителен файл 1 : Фиг. S1B). Освен това те изпълняват други функции в белодробната хомеостаза и патогенеза, което ги прави централен сигнален център и оркестратор в белодробния имунитет. Грипните вируси принадлежат към семейството на Orthomyxoviridae и причиняват инфекции на горните и долните дихателни пътища, вариращи от леки до тежки случаи. Докато повечето сезонни грипни вирусни инфекции са самоограничаващи се, някои пациенти развиват пневмония и синдром на остър респираторен дистрес, което се оценява на до 650 000 смъртни случая годишно в световен мащаб [7]. Вирусът на грип А (IAV) инфектира главно епителните клетки на дихателните пътища и се репликира в тях. Вирусната инфекция води до активиране и сигнализиране на рецептора за разпознаване на образи (PRR) чрез няколко транскрипционни фактора, а именно ядрен фактор капа B (NF-κB) и регулаторен фактор на интерферон (IRF) -3/7, които индуцират тип I и III производство на интерферони (IFN). Този изявен отговор на IFN впоследствие индуцира клетъчно „антивирусно състояние“ по авто- и паракринен начин [8]. Освен това, няколко други цитокини и хемокини се секретират при инфекция. Тази строго регулирана цитокинова мрежа за защита на гостоприемника набира популации от имунни клетки към мястото на инфекцията и организира вродени и адаптивни имунни отговори [9]. Въпреки това, IAV може също да зарази AM, което води до драстично намален брой AM по време на остра инфекция, които трябва да бъдат възстановени, за да се разреши инфекцията. Активирането на вродени имунни клетки и секрецията на провъзпалителни цитокини водят до набирането на допълнителни вродени клетки, контролирайки инфекцията и инициализирайки възстановяването на тъканите [10, 11]. Тук анализираме реакцията на макрофагите към бактериални извънклетъчни везикули и тяхното въздействие върху последваща IAV инфекция.
Ползи от добавката Cistanche - как да подсилим имунната система
Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity
【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
материали и методи
Химикали и антитела
Средата F12 на Ham е получена от GE Healthcare Europe (Фрайбург, Германия). RPMI-1640, DMEM, GlutaMAX, пеницилин/стрептомицин и FCS бяха закупени от Life Technologies (Дармщат, Германия). PBS е придобит от Capricorn Scientific GmbH (Ebsdorfergrund, Германия). Opti-MEM е получен от Thermo Fisher Scientific (Франкфурт, Германия). Форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA) е доставен от Sigma-Aldrich Chemie (Мюнхен, Германия). LPS (Salmonella Minnesota R595, TLR grade) е получен от Enzo Life Sciences (Lausen, Швейцария). Pam3CSK4 е закупен от Invivogen (Сан Диего, САЩ). JAK инхибитор Руксолитиниб е получен от Biozol Diagnostics Vertrieb GmbH (Eching, Германия). Полимиксин В е закупен от Merck Millipore (Billerica, САЩ). Антитела бяха получени от Abcam (Cambridge, UK): Mx1 (ab95926), грипен нуклеопротеин (9G8); Клетъчно сигнализиране (Кеймбридж, Обединеното кралство): фосфо-IRF-3 (Ser396)(4D4G), фосфо-TBK-1 (Ser172)(D52C2), TBK-1 (61223S), фосфо- STAT1 (Tyr)(58D6), STAT1 (D1K9Y), миши анти-заешки (L27A9), IRAK-1 (4359S), фосфо-p38 (Tr180/Tyr182)(9211S), p38 (9212S); Thermo Fisher Scientific: коза против мишка (Alexa за 488); ProteinTech: анти-IRF-3 (66670-1) или Santa Cruz Biotechnology (Хайделберг, Германия): -актин (C4), анти-миши (mIgGκBPHRP, sc-516102). Всички други приложени химикали са с аналитичен клас и са придобити от търговски източници.
Бактериална култура и OMV/MV препарат
L. pneumophila щам Corby див тип се обработва, както е описано по-горе [12]. K. pneumoniae (#700721/ MGH78578), E.coli (#25922) и S. enterica serovar Typhimurium (#14028) са получени от American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). ClearColi™ BL21 беше от BioCat GmbH (Хайделберг, Германия). S. pneumoniae D39 Δcps бяха любезно предоставени от Sven Hammerschmidt. Бактериите се отглеждат върху агарови плаки за една нощ (MacConkey: Kp, Ec, Sal; LB: Clear coli; кръвни агарни плаки: Sp) и след това се използват за инокулиране на течна среда (LB: Kp, Ec, Sal, Clear coli; THY: Sp) . Бактериите се отглеждат до късната логаритмична фаза при 37 градуса при постоянно разклащане (MaxQ 6000, Thermo Fisher Scientific, Карлсруе, Германия; с изключение на Sp). След това бактериалните култури се центрофугират три пъти (4500 × g, 15 минути, 4 градуса; Multifuge X3R, Thermo Fisher Scientific). Останалите бактерии се отстраняват чрез стерилна филтрация през 0.22 цт пори. Супернатантата се концентрира с филтри за прекъсване на молекулно тегло от 100 kDa (Merck KGaA, Дармщат, Германия) и везикулите се пречистват или чрез ултрацентрофугиране, или чрез хроматография с изключване по размер (SEC). За ултрацентрофугиране супернатантата се ултрацентрофугира при 100 000 × g, 3 часа, 4 градуса. След промиване на получената OMV/MV пелета със стерилен PBS, ултрацентрофугирането се повтаря и везикулната пелета се разтваря в стерилен PBS. Съдържанието на протеин се определя от комплекта за анализ на протеини Pierce BCA съгласно инструкциите на производителя (Thermo Fisher Scientific) и равни количества протеин се използват за експерименти за стимулиране. За SEC супернатантата се концентрира до 500 µL и се зарежда в оригинални/70 nm Gen 2 колони (IZON Science LTD, Лион, Франция), които се промиват предварително с 10 mL PBS съгласно протокола на производителя. Везикулите се елуират при използване на стерилен PBS и се събират фракции от 500 uL. Везикулите се елуират във фракции 7–12, което се определя чрез нано-поточна цитометрия (nFCM; NanoFCM Co., Ltd, Нотингам, Обединеното кралство). Обединените фракции, съдържащи везикули, се концентрират до 200-400 µL, като се използват филтри за прекъсване на молекулното тегло (Merck KGaA). Концентрацията на везикули на всички препарати се определя от nFCM и равни количества везикули се използват за експерименти за стимулиране. Приготвянето на OMV/MV и от двата метода за пречистване беше проверено за замърсяване на бактерии чрез посяване и съхранение в аликвотни части при -20 градуса.
НФК
За nFCM нано анализатор (NanoFCM Co., Ltd, Нотингам, Обединеното кралство), оборудван с 488 nm лазер, беше калибриран с 200 nm полистиренови перли (NanoFCM Co.) с определена концентрация на 2,08×10^8 частици/ml и се използва също като референтна стойност за концентрацията на частиците. В допълнение, монодисперсни гранули от силициев диоксид (NanoFCM Co.) с четири различни размера бяха използвани като референтен стандарт за размер за калибриране на размера на везикулите. Прясно филтриран (0.1 µm) 1 × PBS се анализира като фонов сигнал и се изважда от другите измервания. Всяка хистограма на разпределение или точкова диаграма беше получена от данни, събрани за 1 минута с налягане на пробата от 1 kPa. Пробите OMV бяха разредени с филтриран (0,1 µm) 1 × PBS, което доведе до брой частици в оптималния диапазон от 2500–12, 000 събития. Концентрацията на частиците и разпределението на размера се изчисляват с помощта на софтуер nFCM (NF Profession V1.08).
Трансмисионна електронна микроскопия (ТЕМ)
Медни решетки с въглеродно покритие (400 меша) бяха хидрофилизирани чрез светещ разряд (PELCO easiGlow, Ted Pella, САЩ). Пет µL проби се нанасят върху хидрофилизираните решетки и се оцветяват с 2% (w/v) уранил ацетат след кратка стъпка на промиване с двойно дестилирана вода. Пробите бяха анализирани с трансмисионен електронен микроскоп JEOL JEM-2100 при използване на ускоряващо напрежение от 120 kV. Изображенията са получени с F214 FastScan CCD камера (TVIPS, Gauting, Германия).
cistanche tubulosa - подобряват имунната система
Клетъчна култура
Човешки клетъчни линии (THP-1, A549, BEAS2B, Calu-3, HCC827) са получени от American Type Culture Collection. Madin-Darby Canine Kidney II клетки (MDCK II) са закупени от ECACC-Sigma-Aldrich (Дармщат, Германия). THP-1 Dual™ (Dual) и THP-1 Dual™ TRIF-KO (TRIF−/−) клетки бяха получени от Invivogen Europe (Тулуза, Франция). Клетките се култивират в Ham's F12, DMEM или RPMI-1640, допълнен с 1 mM натриев пируват, 2 mM глутамин, както и 10% топлинно активиран FCS при условия на клетъчна култура. THP-1 Dual™ клетки се култивират в RPMI-1640, допълнен с 1% пеницилин/стрептомицин, 2 mM глутамин, 10% топлинно инактивиран FCS, 100 µg/mL Normocin™ и 25 mM HEPES буфер. THP-1, Dual и TRIF−/− клетки се диференцират в макрофагоподобни клетки чрез добавяне на 20 nM PMA за 24 часа.
Клониране на Mx1 във вектор SparQ
Кодиращата последователност на Mx1 беше генерирана от THP-1 cDNA чрез Phusion PCR, използвайки Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, Ipswich, USA) съгласно инструкциите на производителя. HAtag беше добавен чрез сливане на HA кодиращата последователност към обратния праймер (сенс: 5'-atcggaTTCGAAATGGTTGTT TCCGAAGTGGAC-3', антисенс: 5'-tccgatGCGGCC GCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAA CCGGGGAACTGGGCAAG-3'). PCR фрагментът, както и SparQ векторът (Addgene, Watertown, USA) се усвояват с BstbI и NotI рестрикционни ензими (Thermo Fisher Scientific) и се лигират с Т4 ДНК лигаза (New England Biolabs) във SparQ вектора.
Трансфекция на HEK293T клетки и производство на Lentivirus
Клетките HEK293T бяха трансфектирани с вектора SparQ, разреден в Opti-MEM, съдържащ последователността за Mx1 и GFP последователност, вирусния опаковъчен вектор psPAX2 и обвиващия плазмид pVSV-G (Addgene) с липофектамин 2000 (Thermo Fisher Scientific) съгласно протокола на производителя. Произвежда се лентивирус и супернатантата, съдържаща вирус, се събира всеки ден в продължение на 72 часа. Супернатантата се филтрира с помощта на 0,45 цт филтър и ТНР-1 клетките се трансдуцират (вижте по-долу). Празен SparQ вектор без Mx1 последователност беше използван за трансдукция на клетки за генериране на съответна контролна клетъчна линия (VC=векторен контрол).
Трансдукция на THP-1 клетки
THP-1 клетки бяха трансдуцирани с лентивирус от филтрираната супернатантата на HEK293T клетъчната култура (виж по-горе). Беше добавен полибрен (4 µg/mL, Sigma-Aldrich) за подобряване на ефикасността на трансдукцията. Клетките се инкубират до шест дни. GFP-позитивните клетки бяха сортирани чрез поточна цитометрия.
Изолиране и диференциране на BDM
Човешки моноцити от здрави донори се изолират чрез магнитна CD14 положителна селекция от мононуклеарни клетки на периферна кръв и се диференцират в кръвни макрофаги (BDM) в присъствието на 1% човешки ABserum, както е описано по-горе [13].
OMV/MV стимулация на макрофаги
Първични човешки макрофаги или диференцирани THP-1 клетки се инкубират с пречистени OMVs/MVs (1 µg/mL всеки за везикули, пречистени чрез ултрацентрофугиране и множество везикули (MOV) от 1,000 за SEC-пречистени везикули) до 20 часа в пълна среда. Допълнително приложение на инхибитор се извършва 1 час преди третирането с везикули. Te-стимулираните макрофаги се използват или за изолиране на протеин или РНК, или последващи експерименти с инфекция. Полученият цитокин-съдържащ супернатант се използва за ELISA или LDH анализ или се филтрира стерилно и се използва за стимулация на епителните клетки.
Пречистване на вируса и титруване на вируса
Пречистването на вируса и титруването на вируса се извършват в MDCK II клетки, както е описано по-горе [14]. Вирусният титър се определя чрез анализ на плаки, както е описано по-горе [15]. Накратко, конфлуентни MDCK II клетки бяха заразени със серийно разреден вирус или тъканен супернатант (в MDCK II културална среда без FCS). Вирусът се оставя да се адсорбира в клетките в продължение на 1 час при 37 градуса. Десето, инокулумът беше заменен със свежа среда (допълнена с 1 ug/mL третиран с TPCK трипсин (за IAV) и 1% Avicel® PH-101 (Sigma-Aldrich)). Клетките MDCK II се оцветяват с кристално виолетово или инфектираните с вирус клетки се оцветяват с първично антитяло (1:2, 000) (миши анти-грипен А нуклеопротеин, MCA400, Bio-Rad, Германия) и вторичното антитяло ( 1:4,000) (кози анти-миши IgGHRP, 170–6516, Bio-Rad, Германия) за анализ на плака. Плаките се преброяват ръчно и се изразяват като образуващи плака единици (pfu) на ml.
Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система
Вирусна инфекция
След 20 часа предварителна стимулация с бактериални везикули или супернатант, съдържащ цитокин, клетките бяха инфектирани с IAV или вирус на везикуларен стоматит (VSV). Макрофагите бяха инфектирани с H1N1 (A/WSN/33) или VSV, докато епителните клетки бяха инфектирани с H1N1 (A/Hamburg/2009/PDM) и двете в прясна среда без FCS. След 1 час инокулация, свободният вирус беше отстранен и средата беше заменена със среда, съдържаща TPCK-трипсин за IAV или празна среда за VSV. Клетките се инкубират до 48 часа, за да се позволи мултициклична репликация.
Приготвяне на човешки PCLS
Белодробна тъкан е придобита от пациенти, които са претърпели резекция на лоб поради рак на белия дроб в Медицинското училище в Хановер (MHH, Хановер, Германия). За експерименти са използвани само тъкани от макроскопски и микроскопски свободни от заболяване части на белия дроб. Човешки прецизно изрязани белодробни срезове (PCLS) бяха приготвени, както е описано по-горе [16]. Два тъканни резена на ямка се култивират в 24-плака с ямки при потопени условия (DMEM/F12, допълнен с 1% пеницилин/стрептомицин) при 37 градуса, 5% CO2 за една нощ.
IAV инфекция на PCLS
PCLS бяха стимулирани с 1 µg/mL OMVs, пречистени от L. pneumophila или K. pneumoniae, разредени в DMEM/F12, допълнени с 1% пеницилин/стрептомицин при 37 градуса, 5% CO2 за 20 часа. Средата се отстранява и PCLS се инокулират с 25,000 pfu/ямка в 250 µL от грипен вирус A/California/04/2009 (H1N1pdm). PCLS се инкубират при 35 градуса и се разклащат на всеки 15 минути по време на инокулацията, за да се даде възможност за хомогенна вирусна инфекция. След това инокулумът се изхвърля и се заменя с DMEM/F12, допълнен с 1% пеницилин/стрептомицин. След инкубиране в продължение на 48 часа, супернатантата се събира за откриване на вирус, освобождаване на LDH и количествено определяне на цитокини. Пробите за измерване на цитокини бяха допълнени с 0, 2% коктейл от протеазен инхибитор (P1860, Sigma-Aldrich, Мюнхен, Германия) и съхранени при 80 градуса до анализа. PCLS се замразяват и съхраняват при 80 градуса до пречистване на РНК, както е описано по-горе [17].
ЛДХ
Анализът на освобождаване на LDH се извършва съгласно инструкциите на производителя, като се използва Pierce™ LDH Cytotoxicity Assay Kit, получен от Roche (Mannheim, Германия) или Cytotoxicity Detection KitPLUS (LDH) (Roche, Merck). Абсорбцията се измерва с помощта на четец за микроплаки infinite F200Pro (Tecan, Männedorf, Швейцария).
Елайза
Цитокините CXCL8/IL-8, CXCL10/IP-10 и IL-1 бяха количествено определени от безклетъчен супернатант с помощта на налични в търговската мрежа комплекти ELISA (R&D Systems, Wiesbaden, Германия) според производителя инструкции.
QUANTI‑blue™ анализ
За определяне на репортерната активност на SEAP в супернатантата на клетъчната култура от THP-1 Dual™ и съответните TRIF−/− клетки, беше извършен QUANTI-Blue™ анализ съгласно протокола на производителя. Накратко, супернатантата на клетъчната култура беше събрана след стимулиране на клетки с OMVs. Първо разтворът QUANTI-Blue™ и супернатантът от клетъчна култура се разпределят в 96-ямкова плака с мазнина. След инкубиране при 37 градуса за 150 минути, оптичната плътност при 630 nm беше определена в безкраен четец на микроплаки F200Pro.
QUANTI‑luc™ анализ
За определяне на репортерната активност на Lucia луцифераза в супернатантата на клетъчната култура от THP{{0}} Dual™ и съответните TRIF−/− клетки, беше извършен QUANTI-Luc™ анализ съгласно протокола на производителя. Накратко, супернатантата от клетъчна култура се разпределя в бяла плака с маслено дъно 96-ямки (BRAND GmbH & Co. KG, Wertheim, Германия). Беше добавен анализен разтвор QUANTI-Luc™ и незабавно беше извършено измерване на луминесценцията с време за отчитане от 0,1 s в безкраен четец на микроплаки F200Pro.
Уестърн петно
За определяне на протеинова експресия или фосфорилиране се извършва Western Blot, както е описано по-горе [18].
Подготовка на РНК и PCR в реално време
За анализ на генната експресия, изолирането на РНК се извършва чрез екстракция с фенол-хлороформ и се транскрибира обратно, както е описано по-горе [12]. След това се извършва количествен PCR в реално време във ViiA7 (Thermo Fisher Scientific) с Luna Universal qPCR Master Mix (New England BioLabs) и специфични двойки праймери. Чрез използване на метода 2−ΔΔCT [19] се изчислява х-кратна индукция и резултатите се нормализират към съответните контролни клетки. 18S: напред: 5′-GACTCTTTCGAGGCCCTGTA-3′, ревизия: 5′-CACCAGACTTGCCCTCCAAT-3′ CXCL8: напред: 5′-ACTGAGAGTGATTGAGAG TGGAC-3′, ревизия: 5′-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC{ {20}}′ IFI44: fwd: 5′-TATCCAGACAGAGCAGCTACC-3′, ревизия: 5′-ATAGAGAAGGCTAAGCCGCTTC-3′ IFIT1: fwd: 5′-ATGCAGGAAGAACATGACAACC-3′, ревизия: 5 ′-TCTGGACACTCCATTCTATAGCG-3′ IFNA1: fwd: 5′-ACAGGAGGACCTTGATGCTC-3′, rev: 5′-TCTGCTGGATCAGCTCATGG-3′ IFNB: fwd: 5′-AACATGACCAACAAGTGTCTCC-3′ , rev: 5′-TGTCCTTGAGGCAGTATTCAAG-3′ IL1B: fwd: 5′-AGCTCGCCAGTGAAATGATGG-3′, rev: 5′-CAGGTCCTGGAAGGAGCACTTC-3′ IL12B: fwd: 5′-GCCCAGAGCAAGATGTGTCA{{{ 58}}′, рев: 5′-CACCATTTCTCCAGGGGCAT-3′ Mx1: fwd: 5′-GGGCTTTGGAATTCTGTGGC-3′, рев: 5′-CCTTGGAATGGTGGCTGGAT-3′ NP: fwd: 5' -GAAATTTCAAACAGCTGCACAAAG -3′, ревизия: 5′-AATATGAGTGCAGACCGTGC-3′ RPS18: fwd: 5'-GCGGCGGAAAATAGCCTTTG-3′, ревизия: 5′-GATCACACGTTCCACCTCATC-3′
Имунофлуоресценция
Клетките THP{{0}} се диференцират върху покривни стъкла чрез добавяне на 20 nM PMA и се инкубират с OMVs/MVs за 20 h. След това клетките бяха заразени с H1N1 (A/WSN/33; множествеността на инфекцията (MOI) 0.1) в продължение на 4 часа. След 15 минути фиксиране с 3% параформалдехид, предметните стъкла се промиват три пъти с PBS и се пропускат с 0.2% тритон X -100 в TBS (10 минути, стайна температура). След блокиране (1% BSA в TBS/0,2% тритон X-100), клетките се инкубират с -NP антитяло (1:250, в блокиращ разтвор). Вторичното антитяло (1: 1000) заедно с DAPI (1: 2000) се инкубира в продължение на 1 час на тъмно. Монтираните покривни стъкла бяха анализирани на флуоресцентен микроскоп (AxioVision, Zeiss, Йена, Германия).
Етична декларация
Експериментите с резени от човешка белодробна тъкан са одобрени от комисията по етика на Медицинското училище в Хановер (MHH, Хановер, Германия) и са в съответствие с Етичния кодекс на Световната медицинска асоциация (номер 2701–2015). Всички пациенти или техните близки са дали писмено информирано съгласие за използване на белодробна тъкан за изследване. Всички кръводарители са дали информирано писмено съгласие (номер на етично одобрение: 161/17).
Фиг. 1 Характеризиране на бактериални везикули и реакция в човешки макрофаги. A Разделяне на бактериални извънклетъчни везикули от свободни протеини чрез хроматография с изключване на размера от различни бактериални супернатанти (Legionella pneumophila (Lp), Klebsiella pneumoniae (Kp), Escherichia coli (Ec), Salmonella enterica serovar Typhimurium (Sal) и Streptococcus pneumoniae (Sp) ). Концентрацията на везикули във всяка фракция се определя чрез нано-поточна цитометрия (nFCM) и протеините се определят количествено чрез BCA. B Разпределението на размера на везикулите на пречистени OMVs/MVs се определя чрез NFC. C TEM изображения на пречистени OMVs/MVs. Мащабна лента=50 nm. D–G BDMs бяха стимулирани с OMVs/MVs (1 µg/mL всеки) от различни бактерии или оставени нетретирани за контрол до 48 часа. Освобождаването на D CXCL8 се определя чрез ELISA и се изобразява в ng/mL. Експресията на IL1B (E) и IL12B (F) се определя чрез qPCR, резултатите се нормализират до RPS18 и са изобразени спрямо нетретирани контролни клетки. G След 1 час инкубиране с бактериални везикули, експресията и фосфорилирането на IRAK-1, p38 и TBK-1 бяха определени чрез Western Blot. Показани са представителни резултати от четири биологично независими повторения. Лентите представляват средни стойности + SEM от три (B) до четири (D–F) независими експеримента. Статистика: 2-way ANOVA (DF); *стр<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001; ns=not significant; n=3–4
Статистика
Данните са показани като средни стойности + SEM за поне три биологично независими експеримента. Използвана е Prism 6.07 (GraphPad, La Jolla, САЩ). Едно- или двупосочните ANOVA тестове бяха извършени за несдвоени проби. P-стойности По-малки или равни на 0,05 се считат за статистически значими. Ако не е посочено друго, тестовете са извършени спрямо съответната контрола (*).
Наличие на данни и материали
Всички данни, генерирани или анализирани по време на това проучване, са включени в тази статия и нейния допълнителен файл.
Резултати
Провъзпалително активиране на макрофаги от OMV/MVs
За тестване на вродения имунен отговор на човешки първични кръвни макрофаги (BDM) към OMV/MV от различни бактерии, везикули от Legionella pneumophila (Lp), Klebsiella pneumoniae (Kp), Escherichia coli (Ec), Salmonella enterica serovar Typhimurium (Sal ) и Streptococcus pneumoniae (Sp) бяха изолирани чрез хроматография с изключване по размер (SEC). Фракциите бяха анализирани за броя на везикулите чрез нано-поточна цитометрия (nFCM) и за наличието на протеини чрез BCA (фиг. 1А). Везикулите от фракции 7–12 бяха събрани и използвани за експерименти. OMVs/MVs имаха сравним профил на разпределение по размер (Фиг. 1B), не се различаваха по среден размер (Допълнителен файл 1: Фиг. S2A), бяха концентрирани еднакво (Допълнителен файл 1: Фиг. S2B) и бяха визуализирани чрез трансмисионен електрон микроскопия (TEM; фиг. 1C). BDMs бяха стимулирани с OMVs/MVs за до 48 часа, съответстващи на равни концентрации на везикули на различните бактерии (Допълнителен файл 1: Фиг. S2C). Инкубирането на BDM с везикули не е цитотоксично (Допълнителен файл 1: Фиг. S2D). OMVs/MVs широко индуцират CXCL8 експресия и освобождаване от макрофаги (Допълнителен файл 1: Фиг. S3A и 1D), докато индукцията на IL1B и IL12B mRNA зависи от времето и вида (Фиг. 1E+F). Освобождаването на IL-1 зависи от вида, от който са изолирани бактериалните везикули (Допълнителен файл 1: Фиг. S3B). Въпреки че фосфорилирането на р38 е сравнимо в BDMs след 1 час инкубация на везикули, само OMVs от индуцирано от грам-отрицателни бактерии разграждане на IRAK-1 и фосфорилиране на TBK-1, но не и MVs от грам-положителни (фиг. 1G и допълнителен файл 1: S4A-D).
Фиг. 2 Бактериалните екстрацелуларни везикули активират интерфероновия отговор тип I в BDM. BDMs бяха стимулирани с OMVs/MVs (1 µg/mL всеки) от различни бактерии или оставени нетретирани като контрола. Фосфорилирането и експресията на IRF-3 се определят след 1 час OMV/MV инкубиране чрез Western Blot. Показан е представителен резултат от три биологично независими повторения. Експресията на IFNA1 (B), IFNB (C), IFIT1 (E) и IFI44 (F) се измерва чрез qPCR, резултатите се нормализират до RPS18 и се изобразяват спрямо нетретирани контролни клетки. D Фосфорилирането на STAT1 се определя чрез Western Blot след 2 часа OMV/MV стимулация. Показан е представителният резултат от четири биологично независими повторения. G Фосфорилирането на STAT1 и експресията на Mx1 се определят чрез Western Blot след 20 часа стимулация на бактериални везикули. Изобразени са представителни резултати от четири биологично независими повторения. Стълбчетата представляват средни стойности + SEM от четири независими експеримента. Статистика: 2-way ANOVA; *стр<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; n=4
Освен активирането на NF-κB и AP-1 и техните цели надолу по веригата, PRR сигнализирането може да доведе до активиране на IRF. Така беше определено фосфорилирането на IRF-3. Kp/Ec/SalOMV повишават фосфорилирането на IRF-3 в BDMs (Фиг. 2A), което води до експресия на IFN I (Фиг. 2B+C), фосфорилиране надолу по веригата на STAT1 (Фиг. 2D и Допълнителен файл 1: S4E) и индуциране на интерферон-стимулирани гени (ISGs; IFIT1, IFI44 и Mx1; Фиг. 2E-G). Тъй като събитията на фосфорилиране обикновено са краткотрайни и е известно, че играят критична роля при включването и изключването на имунните сигнални каскади, фосфорилирането на STAT1 също беше изследвано 20 часа след добавянето на Kp/Ec/SalOMV (фиг. 2G и допълнителен файл 1: S4F+G). Експериментите показват, че OMV не само активират провъзпалително сигнализиране в макрофагите, но също така се индуцира антивирусно сигнализиране.
Предварителната инкубация на OMV променя репликацията на IAV в макрофагите
Mx1 е добре известен антивирусен фактор, инхибиращ репликацията на IAV [20], който се експресира при Kp/Ec/SalOMV лечение на макрофаги. Затова предположихме, че предварителното третиране с OMV променя репликацията на вируса. Експериментите с инфекция с IAV бяха настроени в THP-1 клетки, които експресират подобни нива на Mx1 при третиране с Kp/Ec/SalOMV върху нивата на mRNA и протеин (Допълнителен файл 1: Фиг. S5A+B) и индуцират фосфорилирането на STAT1 , докато общият STAT1 протеин остава стабилен (Допълнителен файл 1: Фиг. S5C), с H1N1 щам (A/WSN/33), който заразява и се репликира в макрофагите [21]. Предварителната стимулация на THP-1 клетки с LpOMV/SpMV повишава репликацията на IAV 24 часа след инфекцията (pi) в сравнение с инфектираната контрола (–-), докато предварителното третиране с Mx1-индуциращи OMV (Kp /Ec/Sal) блокира репликацията на IAV (фиг. 3A). Докато предварителното третиране с TLR2/1 агонист Pam3CSK4 може да имитира ефекта, наблюдаван с LpOMV/SpMV, за които е известно, че сигнализират чрез TLR2/1 [12, 22, 23], разтворимият LPS като TLR4 агонист не възпроизвежда Kp/Ec /SalOMV ефект (Допълнителен файл 1: Фиг. S5D). Разликите в IAV натоварването след предварително третиране могат също да се наблюдават чрез имунофлуоресцентно оцветяване срещу вирусния нуклеопротеин (NP) (Фиг. 3B). Предварителното третиране с Kp/Ec/SalOMV блокира репликацията на IAV и NP-позитивната област е значително намалена (фиг. 3C). Това не може да се наблюдава след предварително третиране с LpOMV/SpMV. За да се изследва дали индукцията на Mx1 е достатъчна за наблюдаваната блокирана репликация на IAV, Mx1 беше стабилно свръхекспресиран (пол) в THP-1 макрофагите, за да имитира предварителната стимулация на OMV (Допълнителен файл 1: Фиг. S5E). Инфекцията с IAV на Mx1oex клетки доведе до намаляване на имунофлуоресцентната NP-позитивна област 4 h pi (Фигура 3D) и до намалена вирусна репликация 6 h pi в сравнение с празна векторна контрола (VC) (Фигура 3E), макар и до по-малка степен в сравнение с предварителната стимулация на OMV (фиг. 3A). В заключение, Kp/Ec/SalOMV активира макрофагите по класически провъзпалителен начин и индуцира антивирусни гени, водещи до активиране на IFN-/рецептор (IFNAR), фосфорилиране надолу по веригата на STAT1 и експресия на Mx1, което може директно да повлияе на репликацията на IAV ( Фиг. 4A). За да се потвърди важността на JAK/STAT сигнализирането за наблюдаваната индукция на антивирусен отговор, беше приложен JAK инхибитор (JAKi) преди стимулация на везикули. Инхибирането на JAK не променя индуцираната от Kp/SalOMV експресия на CXCL8 (Фиг. 4B), но значително намалява Mx1 на mRNA (Фиг. 4C) и нивото на протеин дори при IAV инфекция (Фиг. 4D и Допълнителен файл 1: S6A). Съответно, JAKi обърна индуцираната от OMV блокада на вирусна репликация (фиг. 4E).
Фиг. 3 Mx1-индуциращи OMVs блокират репликацията на вируса на грип A в THP-1 клетки. Репликация на грипен вирус А в диференцирани THP-1 клетки. Клетките бяха или предварително третирани с OMVs/MVs (1 µg/mL всяка) или оставени нетретирани за контрола (–). След 20 часа предварителна обработка, клетките бяха заразени с A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.001) за 24 и 48 часа. Репликацията на IAV се определя чрез qPCR срещу IAV-NP, нормализиран до 18S. Показани са средни стойности ±SEM от три до пет независими експеримента. B Диференцирани THP-1 клетки бяха предварително третирани с OMVs/MVs (1 µg/mL всеки) или оставени нетретирани за контрола (–). След 20 часа предварителна инкубация, клетките бяха заразени с A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.1) в продължение на 4 часа. След фиксиране, клетките бяха оцветени с -influenza NP антитяло (жълто) и DAPI (синьо). Показан е представителен резултат от четири независими биологични експеримента. C Количествено определяне на NP положителна (NP+) област от (B). Стълбовете представляват средни стойности на четири независими експеримента + SEM. D THP-1 клетки, стабилно свръхекспресиращи Mx1 (Mx1oex) и празни векторни контролни (VC) клетки бяха инфектирани с грипен вирус A/WSN/33(H1N1) (MOI 0,1) в продължение на 4 часа. След фиксиране и имунофлуоресцентно оцветяване с -influenza NP, NP+ областта се определя количествено и се изобразява спрямо VC клетки. Стълбчетата показват средни стойности на четири независими експеримента+SEM. E Mx1oex и VC клетки бяха заразени с A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.001) в продължение на 6 часа. Вирусната репликация се определя чрез анализ на плака и резултатите са изобразени като образуващи плака единици (pfu) на mL. Стълбчетата представляват средни стойности + SEM от четири независими експеримента. Статистика: 2-way ANOVA (A), 1-way ANOVA (C), несдвоен t-тест (D+E); *стр<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; n=3–5
Антивирусният отговор на OMV е зависим от TLR4-TRIF
За да се идентифицира участващият PRR, търговските имунни агонисти бяха приложени самостоятелно или в комбинация с LPS за имитиране на OMV. Въпреки това, не се наблюдава огледална Mx1 индукция с KpOMVs (Допълнителен файл 1: Фиг. S7), което предполага диференциално и продължително активиране на макрофагите от OMVs поради техния лиганден състав или пространствено представяне на PRRs. Включените имунни рецептори бяха допълнително оценени от THP-1 репортерни клетки за NF-кВ- и IRF-сигнализиране (Фиг. 5А). При лечение с KpOMV, THP-1 клетки показват значително повишена експресия на Mx1 протеин (фиг. 5B и допълнителен файл 1: S6B), който се губи в TRIF дефицитни (TRIF−/−) THP-1 клетки ( Фиг. 5B и допълнителен файл 1: S6B). Същото се наблюдава за IRF репортера (Фиг. 5C), докато активирането на NF-кВ репортер и индукцията на CXCL8 са високи както в THP-1, така и в TRIF-/- клетките при стимулация (Фиг. 5D+E). STAT-зависима IFIT1, IFI44 и Mx1 генна експресия бяха индуцирани при KpOMV стимулация в THP-1 репортерни клетки (Фиг. 5E), докато тя беше значително намалена в еднакво стимулирани TRIF-/- клетки (Фиг. 5E). Допълнителна IAV инфекция след предварителна стимулация доведе до намалена вирусна репликация, докато делецията на TRIF спаси репликацията на IAV (фиг. 5F). За да се изследва дали KpOMVs предизвикват общ антивирусен отговор в макрофагите, клетките бяха заразени с вирус на везикуларен стоматит (VSV), който се репликира в контролни клетки, но беше блокиран в предварително третирани с KpOMV клетки и можеше да бъде спасен и чрез делеция на TRIF (фиг. 5G). Тъй като разпознаването на LPS чрез TLR4 е от съществено значение за ендоцитозата и TRIF-активирането, LPS на повърхността на OMV се неутрализира от липопептидния антибиотик Полимиксин B (PB), което води до 50% намалена индукция на Mx1 (фиг. 6A+B и допълнителен файл 1 : S6C), но няма значителна разлика в NF-κB-зависимата CXCL8 транскрипция (фиг. 6C). Вирусната репликация беше спасена до базално ниво при KpOMV+PB предварителна стимулация (фиг. 6D). Тъй като инхибирането на разпознаването на LPS от PB беше недостатъчно за пълно блокиране на Mx1, OMVs от свободен от ендотоксин Clear coli (Cc) бяха изолирани и използвани за предварителна стимулация. Cc експресира променен липид А и не може да индуцира активиран TLR4/MD2 комплекс [24]. CcOMVs не индуцират Mx1 (фиг. 6A+B и допълнителен файл 1: S6C) и не намаляват репликацията на IAV в макрофагите (фиг. 6D). Добре известно е, че изолирането на извънклетъчни везикули чрез диференциално ултрацентрофугиране води до съвместно изолиране на замърсители (напр. протеини или бактериални клетъчни придатъци) заедно с везикулите. В съответствие с насоките на MISEV2018 [25] ключовите експерименти бяха повторени с OMVs, изолирани чрез комбинация от ултрафилтрация (UF) и хроматография с изключване по размер (SEC). Стимулирането на THP-1 репортерни клетки с UF-SEC пречистени KpOMVs доведе до индукция на Mx1 (Допълнителен файл 1: Фиг. S8A) и IRF репортер (Фиг. S8B), докато той беше загубен в TRIF−/− макрофаги ( Допълнителен файл 1: Фиг. S8A+B). Репликацията на IAV беше блокирана в предварително третирани с KpOMV клетки и спасена при изтриване на TRIF (Допълнителен файл 1: Фигура S8C). NF-кВ репортерната активност се индуцира от KpOMVs независимо от TRIF статуса на клетките (Допълнителен файл 1: Фиг. S8D).
Фиг. 4 Инхибирането на JAK-сигнализирането спасява репликацията на вируса на грип А в макрофагите. OMV активира TRIF-IRF-сигнализирането в макрофагите, което от своя страна индуцира IFN-експресия и освобождаване с последващо IFNAR-сигнализиране. IFNAR сигнализира чрез JAK/STAT и индуцира експресията на ISG, един от които е Mx1. Това води до блокиране на IAV репликация. B–E THP-1 клетки бяха предварително инкубирани за 1 час с 10 µM JAK инхибитор (JAKi) преди добавянето на OMVs (1 µg/mL; Kp/Sal) за 2{{22 }} з. Експресията на B–C CXCL8 (B) и Mx1 (C) се определя чрез qPCR и резултатите се нормализират до RPS18 и се изобразяват спрямо нетретирана контрола. Стълбчетата показват средни стойности от три до четири независими експеримента+SEM. Предварително третирани с D+E OMV клетки бяха допълнително инфектирани с IAV (MOI 0.001). D Western blot показва експресия на Mx1 протеин на 0–3 часа след инфекцията (pi). E Вирусната репликация се определя чрез анализ на плака 24 часа след инфекцията. Стълбчетата показват средни стойности на четири независими експеримента+SEM. Статистика: 1-way ANOVA (B+C+E); *стр<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001; *compared to DMSO control, # as depicted in the graph; ns=not significant; n=4
Фиг. 5 OMV индуцират антивирусно сигнализиране в макрофагите чрез TRIF. A THP-1 Двойни репортерни клетки индуцират експресията на секретирана ембрионална алкална фосфатаза (SEAP) след активиране на NF-κB пътя и експресията и секрецията на Lucia луцифераза при активиране на IRF пътя. В допълнение, TRIF (сиви ленти) бяха диференцирани и впоследствие стимулирани с −/− клетките имат стабилен нокаут на адаптерната молекула TRIF. (BF) THP-1 репортерни клетки (=Двойни; черни ленти) и TRIF−/− клетки KpOMV (1 µg/mL) за 20 h или оставени нетретирани за контрола. След посоченото време се събира супернатантата, РНК и/или протеините. B Представително Western Blot изображение на Mx1 протеинова експресия. C+D Lucia репортерна активност (C) и SEAP репортерна активност (D) се определят в супернатанта на клетъчна култура. Същият супернатант се използва за определяне на активността на двата репортера. E Относителна mRNA експресия за STAT- и NF-κB-зависими целеви гени (отгоре надолу: IFIT1, IFI44, Mx1, CXCL8) се определя чрез qPCR и резултатите се нормализират до RPS18 и се изобразяват спрямо нестимулираната двойна контрола. Промените на сгъване бяха трансформирани в log2. Клетките бяха допълнително инфектирани с A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.1) за 24 часа (F) или VSV (MOI 0.1) за 12 часа (G). Вирусната репликация се определя чрез анализ на плака. Стълбчетата показват средни стойности от четири (C–F) до пет (G) независими експеримента + SEM. Статистика: 2-way ANOVA (C–G); *стр<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; * compared to unstimulated Dual control, # as depicted in the graph; ns=not signifcant; n=4–5
Фиг. 6 OMV-индуцирана Mx1 експресия се губи след инхибиране на LPS. THP-1 клетки се инкубират за 20 h с OMVs (1 µg/mL; Kp или Clear coli (Cc)) самостоятелно или в комбинация с 20 µg/mL Полимиксин B (PB) или оставени нетретирани за контрол. Експресията на Mx1 протеин се определя чрез Western Blot. Показан е представителен резултат от три биологично независими експеримента. Експресията на Mx1 B и CXCL8 C се определя чрез qPCR. Стълбчетата показват средни стойности на четири независими експеримента+SEM. D THP-1 клетки се инкубират в продължение на 20 часа с OMVs (1 µg/mL; Kp или Cc) самостоятелно или в комбинация с 20 µg/mL PB или се оставят нетретирани за контрол и след това допълнително се заразяват с A/WSN/33 (H1N1) (MOI 0,001). Репликацията на вируса се определя чрез анализ на плака 24 часа след инфекцията. Стълбчетата показват средни стойности на четири независими експеримента+SEM. Статистика: 1-way ANOVA B–D; *стр<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; *compared to control, #compared to KpOMV; ns=not significant; n=3–4
Ефектът на инхибиране на репликацията на IAV на OMV може да се прехвърли на AEC
Тъй като макрофагите не са основният клетъчен тип за репликация на IAV в белите дробове и тъй като IFN I действа и паракринно, беше тествана възможността за прехвърляне на ефекта на репликация на IAV към AEC, тъй като тези клетки, за разлика от макрофагите, не реагират директно на OMVs/MVs ( Допълнителен файл 1: Фиг. S9). Супернатантата (SN) от третирани с KpOMV макрофаги индуцира Mx1 в A549 клетки, за разлика от LpOMV-SN (Фиг. 7A), докато CXCL8 се индуцира след двете (Фиг. 7B). KpOMVSN намалява вирусната репликация (фиг. 7C), което е в съответствие с експериментите с макрофаги и модела на Mx1 индукция. За да се потвърди зависимостта на наблюдавания IAVограничаващ ефект върху JAK/STAT-сигнализирането, KpOMV-SN се комбинира с JAKi, блокирайки индукцията на Mx1 при KpOMV-SN-третиране (Фиг. 7A) и възстановявайки IAV репликацията (Фиг. 7C). За да се имитира сложната регулация на имунните процеси в белия дроб, беше създадена ex vivo IAV инфекция на човешки прецизно изрязани белодробни срезове (PCLS). Lp/KpOMVs не са цитотоксични за PCLS (Фиг. 8A) и комбинацията от OMV предварителна стимулация и IAV инфекция доведе до Mx1 индукция (Фиг. 8B) и освобождаване на CXCL10 (Фиг. 8C). KpOMVs, но не и LpOMVs значително намаляват репликацията на IAV в PCLS (фиг. 8D). Наблюдаваните ефекти бяха премахнати чрез инфекция с UV инактивиран IAV (фиг. 8A–C). Нашите открития водят до модел на възпаление на белите дробове, при който АМ реагират на OMVs от грам-отрицателни бактерии с индукция на IFN I, предизвиквайки антивирусни отговори по автокринен начин в АМ и по паракринен начин в AECs in vitro и в ex vivo PCLS модел (Фиг. 8E).
Фиг. 7 Инхибиращият репликацията на вируса на грип A ефект на OMVs може да се прехвърли на AECs. THP-1 клетки се инкубират с LpOMV или KpOMV за 20 h или се оставят нетретирани за контрола. Супернатантата (SN) се филтрира стерилно и се използва за предварително стимулиране на A549 клетки за 20 часа самостоятелно или в комбинация с 10 µM JAKi. Експресията на A+B Mx1 (A) и CXCL8 B се определя чрез qPCR в момента на инфекцията (0 h pi). Стълбовете показват средни стойности на четири независими експеримента + SEM, нормализирани към нетретирани контролни клетки. C Предварително третирани A549 клетки бяха допълнително инфектирани с грипен вирус A/Hamburg/5/2009 (H1N1pdm) (MOI 0.01) за 24 часа. Вирусната репликация се определя чрез анализ на плака. Стълбовете са средни стойности на четири независими експеримента + SEM. Статистика: 1-way ANOVA; **стр<0.01, ****p<0.0001; * compared to control-SN; # compared to KpOMV-SN; n=4
Дискусия
Открихме, че везикулите от различни бактерии индуцират диференциално сигнализиране в макрофагите, което е в състояние да ограничи репликацията на IAV при последваща инфекция. В съответствие с литературата, изолирани OMV от Lp, Kp, Ec и Sal и MV от Sp са сравними по размер [26–28]. Макрофагите, инкубирани с бактериални везикули, не показват цитотоксичност [29, 30], но индуцират провъзпалителна реакция. Всички везикули задействаха p38 фосфорилиране и освобождаване на CXCL8 и IL-1 от първични човешки макрофаги, докато имаше разлики в индукцията на IFN I и тяхното сигнализиране надолу по веригата. Ние и други вече показахме, че LpOMVs сигнализират чрез TLR2 [12, 22] и също така SpMVs индуцират различен модел на активиране в макрофагите [31]. LpOMVs/SpMVs активират провъзпалителни NF-κB целеви гени, както е описано за бактериите на произход [12, 22, 31]. И все пак, разпознаването на Kp/Ec/SalOMVs провокира, в допълнение към NF-κB целевите гени, индуцирането на IRF-3 фосфорилиране с експресия на IFNB надолу по веригата и дълготрайно фосфорилиране на STAT1 заедно с индуциране на ISGs, аргументирайки активен IFNAR-JAK/STAT сигнализация. OMV носят LPS на повърхността си, но провъзпалителният капацитет на OMV не може да бъде имитиран с чист LPS. Ние и други наблюдавахме, че макрофагите са по-чувствителни към OMV в сравнение със същото количество чист LPS [32, 33]. OMV съдържат сума от имунни агонисти, които са необходими за индуцирането на силен имунен отговор [32]. Търговските TLR и RIG-I агонисти самостоятелно или в комбинация с LPS не могат да имитират ефекта. Преди беше демонстрирано, че натоварените с LPS липозоми индуцират по-продължително активиране на TRIF-IRF-3 в макрофагите в сравнение със свободните LPS [34]. Използвайки TRIF-/- макрофаги, ние показахме зависимостта на индукцията на ISG от тази адапторна молекула. Освен това, CcOMVs или OMVs без ендотоксин, комбинирани с LPSmasking PB, бяха достатъчни, за да отменят отговора на макрофагите. Това показва разпознаването на OMVs чрез TLR4 с последваща ендоцитоза и TRIF-сигнализиране. Съответно, Kp/Ec/SalOMVs са в състояние да индуцират провъзпалително активиране на макрофаги чрез TLR4, което води до MyD88 сигнализиране и NF-кВ зависима генна експресия, както и TRIF сигнализиране с IFN I отговор. Това е в съответствие с литературата, показваща, че TLR4 и TRIF заедно са необходими за имуногенността на OMV на Neisseria meningitidis при мишки [35]. Тъй като тип I IFNs са главни регулатори на антивирусните отговори, ние предположихме, че разпознаването на Kp/Ec/SalOMVs засяга репликацията на IAV. Ние демонстрирахме, че макрофагите ефективно блокират IAV и VSV репликацията след TRIF-активиращи OMV предварителни обработки, докато TRIF−/− спаси вирусната репликация. За да се определи точно ефектът върху сигнализирането на IFNAR, инхибирането на JAK1/2, комбинирано с OMV, успешно блокира STAT1-зависимата Mx1 индукция и спаси вирусната репликация в макрофагите. Комбинацията от KpOMVs с PB или прилагането на CcOMVs без ендотоксин не намалява репликацията на IAV в макрофагите, тъй като те не са в състояние да индуцират антивирусни гени. Тъй като препаратите от извънклетъчни везикули, получени чрез ултрацентрофугиране, съдържат свободни протеинови и бактериални клетъчни прикрепвания заедно с везикулите, OMV препаратите бяха допълнително генерирани чрез комбинация от ултрафилтрация и хроматография с изключване на размера [25].
Китайска билка растение цистанче-Противотуморно
Получените препарати от чисти везикули бяха еднакво способни да индуцират TRIF-IRF сигнализиране с Mx1 индукция надолу по веригата и блокираха вирусна репликация, аргументирайки директен ефект на везикули. Въпреки че банкоматите са първата линия на защита в белия дроб, по-голямата част от IAV инфекцията и репликацията в човешкия бял дроб се извършва в AEC [36]. Следователно AEC бяха стимулирани с OMV, но те не реагираха на стимулацията като макрофагите. Само бронхиалната епителна клетъчна линия BEAS2B реагира с експресия на CXCL8, но липсва Mx1 индукция. Тъй като бихме могли да покажем експресия на антивирусен ген в зависимост от TLR4 и TRIF в макрофагите, ние предполагаме, че четирите тествани епителни клетъчни линии не експресират TLR4 в подобна степен като макрофагите и че те не са успели да ендоцитизират OMVs при активиране на TLR4. Това е в съответствие с литературата, показваща, че изолираните човешки AECs не реагират на LPS, както направиха сдвоените AM [37]. Тъй като свързахме антивирусния статус при предварителната инкубация на OMV с IFN I, ние използвахме супернатанта от OMV-стимулирани макрофаги за предварително стимулиране на AECs. Кондиционираната среда на KpOMV-стимулирани макрофаги, за разлика от директната стимулация на везикули, индуцира Mx1 експресия в тези клетки и намалява репликацията на IAV в последващи експерименти с инфекция. Супернатантата от третирани с LpOMV макрофаги индуцира CXCL8 в епителните клетки, но не причинява Mx1 индукция и промени във вирусната репликация. За да се припише ефектът, наблюдаван с кондиционираната среда, на IFN I, супернатантата се комбинира с JAK1/2 инхибитор, блокиращ индукцията на Mx1, и няма ефект върху вирусната репликация. Тъй като взаимодействието на различните типове клетки в човешкия бял дроб е по-сложно и не може да бъде напълно имитирано от кондиционирана среда, ние разширихме нашия подход към жизнеспособни участъци от човешка дистална белодробна тъкан, която беше широко използвана за проучвания на взаимодействията гостоприемник-патоген, включително грипни вирусни и бактериални инфекции [38–41]. За разлика от използваните in vitro модели, човешката белодробна тъкан ex vivo поддържа триизмерната архитектура на белия дроб и позволява физиологично взаимодействие между резидентните клетъчни типове в белия дроб, но й липсва възможност за приток на допълнително набрани имунни клетки. Последователната инфекция на KpOMV-стимулиран PCLS с IAV намалява вирусния товар в сравнение с нетретираните контроли. Тъй като всички AECs, тествани in vitro, не реагираха на директна стимулация на бактериални везикули, ние предполагаме, че в този ex vivo модел AMs са преобладаващият реагиращ клетъчен тип. Тъй като за последващата инфекция е избран грипен изолат, който инфектира и се репликира изключително в AEC, може да се предположи, че това е паракринен антивирусен ефект, произхождащ от AM и предаван на AEC. Въз основа на данните, получени тук, ние предлагаме следния модел (фиг. 8E): OMVs от грам-отрицателни бактерии могат да активират човешки макрофаги по класически провъзпалителен начин и да ги активират антивирусно чрез TLR4 и TRIF след успешна ендоцитоза на везикули. Освобождаването на IFN I може от своя страна да направи макрофагите и/или AECs антивирусни чрез IFNAR и JAK/STAT сигнализиране. Последващата инфекция на тези клетки причинява Mx1-медиирано намаляване на вирусния товар. Тъй като нямахме достъп до първични човешки AM, експериментите бяха проведени с помощта на човешки BDM като модел. Като се има предвид различният произход на развитието и подготовката на тези макрофаги, възможно е АМ да са показали по-слаб провъзпалителен отговор за разлика от BDM. Бактериалните везикули вече се използват в стратегии за ваксиниране срещу различни патогени, предизвикващи пневмония (прегледано в [42]). Следователно, OMVs не само представляват инструмент за потенциални стратегии за системна ваксинация срещу техните бактерии гостоприемници, но могат също така да се използват локално за борба с вирусни инфекции чрез активиране на резидентни вродени имунни клетки. Необходими са бъдещи проучвания in vivo, за да се тества дали тези открития in vitro са приложими за други вирусни патогени. В допълнение, трябва да се отбележи, че евентуален ендотоксичен отговор трябва да бъде критично наблюдаван, за да се избегнат преувеличени имунни отговори in vivo. Индукцията на тип I IFN трябва да бъде строго контролирана, тъй като е показано при здрави индивиди, че инхалацията на TLR7 агонист първоначално се понася добре след първата доза, но води до повишен TNF- и IFN I отговор и грипоподобни симптоми , след втора доза [43]. За борба с неблагоприятните ефекти може да са необходими генетично модифицирани версии на OMV, които да предизвикат балансиран имунен отговор и да постигнат добра приложимост. Взети заедно, тук представяме модел за това как OMV могат да индуцират антивирусно сигнализиране в човешки макрофаги и как това може да се използва за предотвратяване на репликацията на IAV.
Фиг. 8 KpOMV намалява репликацията на вируса на грип А в човешки прецизно изрязани белодробни срезове. Човешки PCLS се инкубират с 1 µg/mL OMV (Lp/Kp) в продължение на 20 часа и след това допълнително се заразяват с грип A/California/04/2009 (H1N1pdm) в продължение на 48 часа. UV инактивирането на вируса служи като контрола. Цитотоксичността се определя чрез количествено определяне на освободения LDH от PCLS и се изобразява в % в сравнение с общия лизис. B Mx1 експресията е количествено определена чрез qPCR и е представена спрямо RPS18 и нетретирана контрола PCLS. C Освобождаването на CXCL10 се определя чрез ELISA и се изобразява в ng/mL. D Вирусната репликация се определя чрез анализ на плака и е изобразена в pfu/mL. Стълбовете показват средни стойности от три до пет биологични реплики+SEM. E Предложен модел за индуциране на антивирусен имунитет на OMVs в белия дроб. Статистика: 1-way ANOVA (AC), Friedman-test (D); *стр<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001; * compared to IAV infected, but not pre-treated PCLS, # as depicted in the graph; ns=not significant; n=5
Препратки
1. Kulp A, Kuehn MJ. Биологични функции и биогенеза на секретирани бактериални външни мембранни везикули. Annu Rev Microbiol. 2010; 64: 163-84.
2. Ellis TN, Kuehn MJ. Вирулентност и имуномодулаторни роли на бактериални външни мембранни везикули. Microbiol Mol Biol Rev. 2010; 74 (1): 81–94.
3. Giordano NP, Cian MB, Dalebroux ZD. Липидна секреция на външната мембрана и вроденият имунен отговор към грам-отрицателни бактерии. Инфектирайте Имун. 2020. https://doi.org/10.1128/IAI.00920-19.
4. Mancini F, et al. OMV ваксини и ролята на TLR агонистите в имунния отговор. Int J Mol Sci. 2020. https://doi.org/10.3390/ijms21124416.
5. Hu G, Christman JW. Редакция: алвеоларни макрофаги при белодробно възпаление и разделителна способност. Преден имунол. 2019; 10: 2275.
6. Grassin-Delyle S, et al. Ролята на подобни на такса рецептори в производството на цитокини от човешки белодробни макрофаги. J Вроден имунитет. 2020; 12 (1): 63–73.
7. Информационен лист за грипа (сезонен). 2018 г.; https://www.who.int/news-room/ fact-sheets/detail/influenza-(seasonal)
8. Crotta S, et al. Интерфероните тип I и тип III задвижват излишни амплификационни бримки, за да индуцират транскрипционен подпис в инфектирания с грип епител на дихателните пътища. PLoS Pathog. 2013; 9 (11): e1003773.
9. Bals R, Hiemstra PS. Вроден имунитет в белия дроб: как епителните клетки се борят срещу респираторни патогени. Eur Respir J. 2004;23(2):327–33.
10. Helft J, et al. Кръстосано представящите CD103+ дендритни клетки са защитени от инфекция с грипен вирус. J Clin Invest. 2012; 122 (11): 4037–47.
11. Ghoneim HE, Thomas PG, McCullers JA. Изчерпването на алвеоларните макрофаги по време на грипна инфекция улеснява бактериалните суперинфекции. J Immunol. 2013; 191 (3): 1250–9.
12. Jung AL, et al. Везикулите на външната мембрана, получени от Legionella pneumophila, насърчават бактериалната репликация в макрофагите. PLoS Pathog. 2016; 12 (4): e1005592.
13. Lindhauer NS, et al. Антибактериална активност на дефенсин на Tribolium castaneum в in vitro модел на инфекция на Streptococcus pneumoniae. Вирулентност. 2019; 10 (1): 902–9.
14. Данов О, и др. Цигареният дим засяга популациите на дендритни клетки, функцията на епителната бариера и имунния отговор на вирусна инфекция с H1N1. Front Med. 2020. https://doi.org/10.3389/fmed.2020.571003.
15. Matrosovich M, et al. Нова наслагваща среда с нисък вискозитет за анализи на вирусна плака. Virol J. 2006;3:63. 16. Neuhaus V, et al. Оценка на цитотоксичните и имуномодулиращите ефекти на веществата в човешки прецизно изрязани белодробни срезове. J Vis Exp. 2018 г. https://doi.org/10.3791/57042. 17. Niehof M, et al. Изолиране на РНК от прецизно изрязани белодробни срезове (PCLS) от различни видове. BMC Res Бележки. 2017; 10 (1): 121.
18. Schulz C, et al. Макрофагите, получени от THP-1-, правят белодробните епителни клетки хипочувствителни към Legionella pneumophila – системно биологично изследване. Sci Rep. 2017; 7 (1): 11988.
19. Livak KJ, Schmittgen TD. Анализ на данните за относителната генна експресия с помощта на количествена PCR в реално време и метода 2(-Delta Delta C(T)). Методи. 2001; 25 (4): 402–8. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262.
20. Haller O, et al. Mx GTPases: подобни на динамин антивирусни машини на вродения имунитет. Тенденции Microbiol. 2015; 23 (3): 154–63. 21. Anastasia M, et al. С краят на NS1 протеина на вируса на грип A/WSN/1933(H1N1) модулира антивирусните отговори в инфектирани човешки макрофаги и мишки. J Gen Virol. 2015; 96 (8): 2086–91.
22. Jager J, et al. Сливането на външни мембранни везикули на Legionella pneumophila с еукариотни мембранни системи е механизъм за доставяне на патогенни фактори към мембраните на клетката гостоприемник. Cell Microbiol. 2015; 17 (5): 607–20.
23. Lammers AJ, et al. Ролята на TLR2 в реакцията на гостоприемника към пневмококова пневмония при липса на далак. BMC Infect Dis. 2012. https://doi. org/10.1186/1471-2334-12-139.
24. Mamat U, et al. Производство на протеини без ендотоксини—ClearColi™ технология. Nat методи. 2013;10:916.
25. Théry C, et al. Минимална информация за изследвания на извънклетъчни везикули 2018 (MISEV2018): изявление за позицията на Международното общество за извънклетъчни везикули и актуализация на указанията на MISEV2014. J Екстраклетъчни везикули. 2018; 7 (1): 1535750. https://doi.org/10.1080/20013078.2018. 1535750. 26. Bonnington KE, Kuehn MJ. Производството на везикули на външната мембрана улеснява ремоделирането на lps и поддържането на външната мембрана в салмонелата по време на преходи в околната среда. MBio. 2016. https://doi.org/10.1128/mBio. 01532-16.
27. Jasim R, et al. Липидомен анализ на везикулите на външната мембрана от сдвоени полимиксин-чувствителни и резистентни клинични изолати на Klebsiella pneumoniae. Int J Mol Sci. 2018. https://doi.org/10.3390/ijms19082356.
28. Olaya-Abril A, et al. Характеризиране на защитни везикули, получени от извънклетъчна мембрана, произведени от Streptococcus pneumoniae. J Протеомика. 2014; 106: 46-60.
29. Kuhn T, Koch M, Fuhrmann G. Пробиомиметичните нови микрочастици, имитиращи лактобацилус, показват противовъзпалителни и бариерни защитни ефекти в стомашно-чревни модели. малък. 2020; 16 (40): e2003158.
30. Mehanny M, et al. Стрептококови екстрацелуларни мембранни везикули се интернализират бързо от имунните клетки и променят тяхното освобождаване на цитокини. Преден имунол. 2020; 11:80.
31. Volgers C, et al. Имуномодулираща роля за мембранни везикули, освободени от THP-1 макрофаги и респираторни патогени по време на инфекция с макрофаги. BMC Microbiol. 2017; 17 (1): 216.
32. Ellis TN, Leiman SA, Kuehn MJ. Естествено произведени външни мембранни везикули от Pseudomonas aeruginosa предизвикват мощен вроден имунен отговор чрез комбинирано усещане на липополизахаридни и протеинови компоненти. Инфектирайте Имун. 2010; 78 (9): 3822–31.
33. Alaniz RC, et al. Мембранните везикули са имуногенни факсимилета на Salmonella typhimurium, които мощно активират дендритни клетки, първични В и Т клетъчни отговори и стимулират защитен имунитет in vivo. J Immunol. 2007; 179 (11): 7692–701.
34. Watanabe S, Kumazawa Y, Inoue J. Липозомен липополизахарид инициира TRIF-зависим сигнален път, независим от CD14. ПЛОС ЕДИН. 2013; 8 (4): e60078.
35. Fransen F, et al. Различен ефект на TLR2 и TLR4 върху имунния отговор след имунизация с ваксина срещу Neisseria meningitidis или Bordetella pertussis. ПЛОС ЕДИН. 2010; 5 (12): e15692.
36. Travanty E, et al. Диференциална чувствителност на човешки белодробни първични клетки към H1N1 грипни вируси. J Virol. 2015; 89 (23): 11935–44.
37. Mubarak RA, et al. Сравнение на про- и противовъзпалителни реакции в сдвоени човешки първични епителни клетки на дихателните пътища и алвеоларни макрофаги. Respir Res. 2018; 19 (1): 126.
38. Wu W, et al. Вроден имунен отговор към H3N2 и H1N1 инфекция с инфуенца вирус в модел на култура на човешки белодробен орган. Вирусология. 2010; 396 (2): 178–88.
39. Wu W, et al. Вирусът на грип A(H1N1)pdm09 потиска инициираните от RIG-I вродени антивирусни отговори в човешкия бял дроб. ПЛОС ЕДИН. 2012; 7 (11): e49856.
40. Delgado-Ortega M, et al. Вроден имунен отговор към вирус на свински грип подтип H3N2 в трахеални клетки на новородени свине, алвеоларни макрофаги и прецизно изрязани белодробни резени. Vet Res. 2014;45:42.
41. Kolbe U, et al. Ранното индуциране на цитокини при инфекция с pseudomonas aeruginosa в миши прецизно изрязани белодробни срезове зависи от усещането за бактериална жизнеспособност. Преден имунол. 2020. https://doi.org/10.3389/fmmu. 2020.598636.
42. Jung AL, et al. Клиничната роля на извънклетъчните везикули, получени от гостоприемника и бактериите, при пневмония. Adv Drug Deliv Rev. 2021. https://doi.org/10. 1016/й.адр.2021.05.021.
43. Delaney S, et al. Поносимост при хора след инхалационно дозиране на селективния TLR7 агонист, AZD8848. BMJ Open Respir Res. 2016; 3 (1): e000113.
