Благоприятни ефекти на обща фенилетаноидна гликозидна фракция, изолирана от Cistanche Deserticola върху костната микроструктура при овариектомирани плъхове

Lingling Yang, Shuqin Ding, Bo Zhang, Jingjing Liu, Yanhong Dong, Qiwen Tang, Pingping Yang и Xueqin Ma

1 Катедра по фармацевтичен анализ, Факултет по фармация, Медицински университет Нинся, улица Шенли 1160, Инчуан 750004, Китай

2 Училище по клинична медицина, Ningxia Medical University, 692 Shenli Street, Yinchuan 750004, Китай

3 Ключова лаборатория за модернизация на етническата медицина Хуей, Министерство на образованието, Медицински университет Нинся, улица Шенли 1160, Инчуан 750004, Китай

Това е статия с отворен достъп, разпространявана под лиценза Creative Commons Attribution, който позволява неограничено използване, разпространение и възпроизвеждане във всеки носител, при условие че оригиналното произведение е правилно цитирано.

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Резюме

Настоящото изследване е предназначено да оцени антиостеопорозната активност на общата фенилетаноидна гликозидна фракция, изолирана отЦистанчеdeserticola(CDP) върху плъхове, предизвикани от овариектомия (OVX), както и свързаните с това механизми. След 3 месеца перорално приложение намалената костна минерална плътност, серумен Ca и P при OVX плъхове бяха възстановени и влошената трабекуларна костна микроархитектура беше частично подобрена чрез интервенция с Cistanche deserticola (60, 120 и 240 mg/kg), дейностите на маркерите за костна резорбция бяха регулирани надолу и биоактивността на индекса на костно образуване беше регулирана нагоре; междувременно, съдържанието на MDA е намаляло и GSH е увеличен чрез лечение с CDP. По отношение на състава са идентифицирани 8 фенилетаноидни гликозидни съединенияЦистанчеdeserticola(CDP), като общото съдържание е количествено определено като 50,3 процента чрез използване на метода HPLC. Механично,Цистанчеdeserticola(CDP)намаляват нивата на TRAF6, RANKL и RANK, като по този начин потискат RANKL/RANK/TRAF6-индуцираното активиране на низходящите NF-κB и PI3K/AKT сигнални пътища и в крайна сметка предотвратяват активностите на ключовите остеокластогенни протеини на NFAT2 и c -Фос. Всички горепосочени данни предполагат, че CDP проявява благоприятни ефекти върху костната микроструктура при овариектомирани плъхове и тези ефекти могат да бъдат свързани с NF-κB и PI3K/AKT сигналните пътища, които са задействани от свързването на RANKL, RANK и TRAF6.

Cistanche tubulosaима много ефекти, щракнете тук, за да научите повече

1. Въведение

Постменопаузалната остеопороза, от която ще страда 1 от 3 жени над 50 години, се превръща в основна опасност за здравето, засягаща повече от 200 милиона жени по целия свят [1]. При менопаузата рязкото намаляване на нивото на естроген обикновено води до прекомерна костна резорбция, причинена от засилена остеокластогенеза; след това балансът между индуцираното от остеобласти образуване на кости и индуцираната от остеокластите костна резорбция беше нарушен и ускорената костна резорбция накрая причини остеопороза и дори фрактура на бедрото или гръбначния стълб [2]. Смята се, че диференциацията на остеокластите се задейства, когато рецепторният активатор на ядрен фактор капа B (RANK) се свърже с RANKL, лиганда на RANK. Въпреки това, комбинацията от RANK към RANKL не може да бъде активирана, освен ако към нея не е присъединен фактор 6, свързан с протеин тумор некротизиращ фактор (TRAF6) [3], последвано от стимулиране на низходящи сигнални пътища, включително PI3K/AKT и NF-κB. И накрая, експресиите на ядрен фактор на активирани Т клетки c2 (NFAT2) и c-Fos бяха регулирани [4], за да модулират диференциацията на остеокластите, както и костната резорбция. По този начин, факторите и регулаторите, които са пряко или косвено свързани с активирането и диференциацията на остеокластите, се считат за решаващи цели за предотвратяване на костна загуба.

Наистина има някои клинични и синтетични лекарства за хормонозаместителна терапия като естрадиол валерат, които са ефективни при лечението на постменопаузална остеопороза. За съжаление, някои от тях повишават риска от сериозни ракови заболявания, включително рак на гърдата и ендометриума [5], което ограничава клиничните им приложения. Ето защо е необходимо да се изберат други алтернативи с ефикасност и минимални странични ефекти. Традиционните китайски лекарства (TCM), както и изолираните биоактивни съединения и фракции [6–9], се оказаха ефективни при различни заболявания, включително постменопаузална остеопороза. Сред тези биоактивни компоненти и фракции, фенилетаноидни гликозидни (PhG) съединения с потенциална ефикасност се считат за обещаващи средства за лечение на остеопороза [10–12]. Структурите на PhG се състоят от агликон на канелена киселина, хидроксил фенил етил група, която е комбинирана с -глюкопираноза, апиоза, галактоза, рамноза или ксилоза чрез гликозидна връзка. Те съществуват широко в медицинските видове от родаЦистанче[13]. ЦистанчеdeserticolaYC Ma е официален TCM, който е записан в китайската фармакопея, и освен че е важен TCM [14], C deserticola е и тонизираща билка против стареене с малко странични ефекти, която е разработена в медицински ликьор и хранителна течност, одобрена от State Food и Администрация по лекарствата. Въз основа на данните от китайската фармакопея, C. deserticola е била традиционно използвана от местните жители за справяне с проблеми с дефицит на бъбречна есенция като мускулна слабост и лумбална слабост, а фенилетаноидните гликозидни съединения, включително ехинакозид и актеозид, са основните биоактивни съставки в тази билка. Според теорията на ТКМ за „бъбреците, които управляват костите“, костната система се управлява от бъбречната есенция [15] и проблеми, свързани с костите, като остеопороза, могат да бъдат възстановени от билки или съединения, притежаващи активността на подхранване на бъбречната есенция. Следователно, ние предположихме, че общата фенилетаноидна гликозидна фракция, изолирана от C. deserticola, поне отчасти е била полезна при лечението на остеопороза. Следователно настоящият експеримент беше създаден, за да потвърди нашата хипотеза чрез използване на овариектомиран (OVX) модел на плъх; освен маркерите за костна резорбция и образуване, които трябва да бъдат оценени, индексът на антиоксидант, както и RANKL/RANK/TRAF6- индуцирани PI3K/AKT и NF-κB сигнални пътища също бяха използвани за изследване на основните механизми на антиостеопорозната биоактивност .

2. Материали и метод

2.1. Растителни материали и подготовка.

Общо 30 кг стръкове отЦистанчеdeserticolaY.C. Ma бяха събрани от окръг Йонгнинг през септември на 2015 г. с координати 106.026597 и 38.262816, провинция Нинся, Китай. Билката е идентифицирана от д-р Лин Донг (Катедра по фармакогнозия, Медицински университет Нинся) и съответстващ екземпляр (#201509{{40}}1) се съхранява в отдела за фармацевтичен анализ. Първо, 30.0 kg прахообразна C. deserticola се екстрахират чрез използване на метода на обратен хладник със 70 процента етанол като разтворител; съотношението материал към разтворител беше зададено като 1:10 и времето на кипене под обратен хладник беше 2 часа за 3 пъти. След това всички филтрати бяха комбинирани и кондензирани при понижено налягане при 60 градуса С. Второ, AB-8 колони с макропореста смола бяха използвани за предварително разделяне и различни съотношения на етанол във вода (0 процента, 20 процента, 30 процента, 40 процента, 50 процента и 60 процента, всеки по 60 L) бяха използвани за елуиране. Трето, 40 процента и 50 процента елуенти бяха комбинирани и допълнително пречистени чрез използване на повтарящи се AB-8 колони с макропореста смола с елуенти от 0 процента, 20 процента, 30 процента, 40 процента и 50 процента етанол във вода, и всеки елуент беше 12 L. Накрая, 40-процентната фракция беше събрана и кондензирана при понижено налягане до получаване на 150 g бледожълта утайка от фенилетаноидна гликозидна фракция на C. deserticola (CDP, добивът беше 0.5 процента). За in vivo експерименти, 0,5 процента CMC-Na разтворител беше използван за разтваряне на CDP; пероралното приложение на животни е определено като 1 mL/100 g телесно тегло; за in vitro Western blot анализ, CDP се разтваря с DMSO и след това се разрежда с DMEM, за да се получат крайните концентрации от 0,1 mg/mL, 0,01 mg/ml и 0,001 mg/mL.

2.2. Химикали и разтворители.

Естрадиол валерат (EV) е от Delpharm Lille SAS, Франция; алкална фосфатаза (ALP), костен gla-протеин (BGP), устойчива на тартарат кисела фосфатаза (TRAP) и дезоксипиридинолин (DPD) кръстосано свързване ELISA комплекти от Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Шанхай, Китай, 201605; комплекти реактиви за малондиалдехид (MDA, 20181221), супер оксид дисмутаза (SOD, 20121218) и глутатион (GSH, 20181221) от Института по биологично инженерство Nanjing Jiancheng, Nanjing, Китай; Интактен паратхормон (l-PTH, NEWASHE7UZ), калцитонин (2L9ISN7AIU) и естроген-свързан рецептор алфа (ERR, Y3AY8QEWB3) кръстосано свързване ELISA комплекти от Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Ухан, Китай; комплект реактиви за катепсин К ELISA от BioVision, Америка, 11300141; първични антитела на RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κB p65 (AH04138226), PI3 киназа p85 алфа (AC09021266) , AKT 1 (AF05173234), -актин (17AV0411) и вторични антитела на кози анти-заешки IgG, конюгирани с пероксидаза от хрян от ZSGB-BIO, Китай, 136080; комплект за анализ на общ BCA протеин и търговски комплект за откриване на образуване на осте окласти и фетален говежди серум и модифицирана среда на Dulbecco Eagle (DMEM) от HyClone, Logan, UT, USA; мембрана от поливинилиден флуорид (PVDF) от Millipore Life Sciences, Billerica, MA, САЩ; пеницилин и стрептомицин от Gibco, Rockville, MD, САЩ. Всички други използвани химични агенти са от клас AR.

2.3. HPLC количествено определяне на Cistanche Deserticola P.

Използван е Agilent 1220 HPLC инструмент за идентифициране и количествено определяне на състава на CDP. Хроматографските условия бяха както следва: С18 колона (TSK-GEL, 4 6 I d × 250 mm, 5 μm); градиентното елуиране съдържа разтворители А (ацетонитрил) и В (вода, съдържаща 0,5 процента оцетна киселина) (0-10 мин: 17-20 процента А; 10-30 мин: 20-25 процента А; и 30-40 min: 25-30 процента A); дължината на вълната на детекция е 333 nm; температура на околната среда; скоростта на потока е 1.0 mL/min; инжектираният обем на пробата е 5 μL. Идентифицирани са осем PhG съединения, а именно цистанозид F, ехинакозид, 6'-ацетилактеозид, цистанозид С, цистанозид А, актеозид, 2'-ацетилактеозид и изоактеозид; чрез използване на съответните референтни вещества и външен стандартен метод, съдържанието на горните 8 PhGs беше количествено определено чрез HPLC анализ (Фигура 1).

2.4. Протокол за експерименти с животни.

Общо 60 възрастни женски плъха Sprague-Dawley на възраст 3 месеца бяха избрани от центъра за изпитване върху животни на Медицинския университет в Нинся, със средно първоначално телесно тегло от около 234 ± 25 g. Плъховете бяха настанени в стандартна среда, свободна от специфични патогени, за да се аклиматизират в продължение на 1 седмица. След това всички плъхове бяха анестезирани (хлоралхидрат, 100 mg/kg, ip) само или фиктивно овариектомизирани (SHAM), или два яйчника бяха отстранени и след това произволно разделени на 5 подгрупи: перорално третирани с носител (0,5 процента CMC- Na) беше определен като моделна група (OVX), естрадиол валерат (1 mg/kg/ден) като положителна група (EV) и 60, 120 и 240 mg/kg/ден CDP като нисък (CDPL), групи с умерена (CDPM) и висока (CDPH) дози, съответно. Всички плъхове са приемани перорално всеки ден и е продължило 3 месеца с коригиране на дозата на всеки 2 седмици, което зависи от промяната на цялото телесно тегло. В последния ден от експеримента с животни беше получена 24-часова урина чрез използване на метаболитни клетки; серумът се събира от феморалната артерия на анестезирани плъхове; дясната бедрена кост, тибията и всички органи бяха дисектирани и съхранени при -80 градуса С за допълнителен анализ. Експериментите с животни, които проведохме, бяха одобрени от Институционалния комитет за грижа и използване на животните към Медицинския университет в Нинся.

2.5. Определяне на костна минерална плътност и микро-CT анализ.

Първо, апарат за рентгенова абсорбциометрия с двойна енергия (Lunar, САЩ) беше използван за оценка на общата костна минерална плътност на дясната бедрена кост на всеки плъх; второ, същата бедрена кост беше използвана за оценка на 3D изображението на микроархитектурата на трабекуларната кост чрез използване на микро-CT скенер (GE, Америка). Изотропната разделителна способност беше зададена на 14 μm, за да се получи идеално 3D изображение; регионът на интерес (ROI) беше избран чрез задаване на едни и същи координати в растежната плоча на бедрената кост на всяка проба; и костните морфометрични параметри, включително трабекуларно отделяне (Tb. Sp), трабекуларен брой (Tb. N), трабекуларна дебелина (Tb. Th), костно минерално съдържание (BMC), тъканна минерална плътност (TMD) и тъканно минерално съдържание (TMC) ) са получени чрез анализиране на ROI.

2.6. Биохимичен анализ на серум и урина.

Активностите на серумния катепсин К, TRAP, SOD и GSH, както и съдържанието на серумния PTH, калцитонин, ERR, MDA, BGP и DPD на урината, бяха определени чрез използване на съответните комплекти реагенти съгласно инструкциите на производителя и нивото на алкалната фосфатаза (ALP) и съдържанието на калций в серума и урината (Ca) и фосфор (P) бяха оценени чрез използване на автоматична машина (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, USA).

2.7. Уестърн блот анализ.

Остеокластите бяха индуцирани чрез използване на RAW 264.7 клетки, добавени с макрофаг колония-стимулиращ фактор (MCSF) и RANKL. Накратко, 1 × 107 RAW 264.7 клетки бяха култивирани в 6-ямкова плака в присъствието на 30 ng/mL MCSF и 25 ng/mL RANKL. След 6 дни индукция, зрелите остеокластни клетки бяха идентифицирани чрез използване на TRAP-оцветения метод със съответния комплект, след което третирани с CDP (0.1, 0.01 и 0.001 mg/mL , съответно) за 24 часа; след това клетките се лизират с лизисен буфер, съдържащ 0,5 mmol фенилметилсулфонил флуорид, протеазни и фосфатазни инхибитори. След това лизатът се отделя чрез използване на 10 процента SDS-PAGE и се прехвърля към PVDF мембрана, която се изследва с AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3K-p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos и -актин (1: 400) след блокиране с 5 процента обезмаслено мляко за 2 часа. Същите мембрани бяха оголени и изследвани отново с горните 9 съответстващи антитела, съответно, след което бяха открити от софтуера Image Lab в края. Експериментите бяха повторени три пъти.

2.8. Статистически анализ.

Всички данни, получени от in vivo и in vitro експерименти, описани като средна стойност ± SD, бяха анализирани чрез използване на еднопосочен ANOVA, последван от тест на Dunnett (SPSS 22.0 софтуер, SPSS, САЩ); p < 0="" 05="" беше="" статистически="">

Резултати

3.1. Химичен състав на Cistanche Deserticola P.

Чрез използване на метода HPLC, осемфенилетаноиден гликозидсъединения са открити в тази фракция, както показва Фигура 1. Чрез използване на стандартни препратки и външен стандартен метод, съединенията и тяхното съдържание бяха идентифицирани и количествено определени, както следва: (1) актеозид F (3,6 процента), (2) ехинакозид (8,8 процента), (3) цистанозид А (5.{ {9}} процента), (4) актеозид (13,3 процента), (5) изоактеозид (3,3 процента), (6) актеозид С (3,6 процента), (7) 2'-ацетилактеозид (9,9 процента) и (8 ) 6'-ацетилактеозид (3,2 процента). Общото съдържание на тези осем компонента е количествено определено като 50,7 процента.

3.2. Ефекти на Cistanche Deserticola P върху костната минерална плътност и микроархитектурата на трабекула.

Общата костна минерална плътност на плъховете в различни подгрупи е показана на Фигура 2. Наблюдава се тенденция на намаляване на съдържанието на костна минерална плътност при плъхове от моделната група OVX, която намалява с близо 12.0 процента след 12 седмици от операцията в сравнение с плъховете от групата SHAM (p < 0="" 001).="" всички="" плъхове,="" третирани="" с="" cdp,="" показват="" значително="" повишена="" костна="" минерална="" плътност="" съответно="" с="" 11,2="" процента,="" 12.0="" процента="" и="" 10,7="" процента="" (p="">< 0="" 01),="" в="" сравнение="" с="" плъховете="" от="" модела="" ovx="" група.="" освен="" това,="" в="" съответствие="" с="" данните="" за="" общата="" костна="" минерална="" плътност,="" реконструкцията="" на="" микро-кт,="" както="" и="" хистоморфометричното="" определяне="" на="" бедрената="" кост="" показаха,="" че="" плъховете="" в="" групата="" ovx="" показват="" очевидно="" влошаване="" на="" трабекуларната="" архитектура,="" доказано="" от="" значително="" намаления="" брой="" и="" площ="" на="" трабекулите.="" като="" значително="" повишен="" tb.="" sp="" в="" сравнение="" с="" плъховете="" от="" групата="" sham.="" лечението="" с="" cdp="" предотвратява="" предизвиканото="" от="" ovx="" влошаване="" на="" трабекуларната="" архитектура;="" както="" показва="" фигура="" 3,="" bmc,="" tmc="" и="" tb.="" стойностите="" на="" n="" бяха="" значително="" увеличени="" и="" площта="" на="" tb.="" sp="" беше="" значително="" намален,="" докато="" стойностите="" на="" tmd="" и="" tb.="" изглежда="" не="" бяха="" значително="" засегнати="" от="" операцията="" ovx="" и="" нашата="" намеса="" на="">

3.3. Ефекти на Cistanche Deserticola P върху биохимичните параметри на урината и серума.

Както показва Фигура 4, бяха установени значителни тенденции на намаляване на нивото на P в урината и серумното съдържание на калцитонин при плъхове от моделната група OVX, което беше почти 30 процента и 60 процента по-малко от плъховете SHAM (p < 0="" 001="" ),="" съответно,="" като="" има="" предвид,="" че="" не="" са="" наблюдавани="" очевидни="" нарастващи="" или="" намаляващи="" тенденции="" в="" нивата="" на="" ca="" и="" серумен="" ca="" в="" урината,="" както="" и="" серумен="" p="" и="" серумен="" pth="" между="" групите="" ovx="" и="" sham.="" третирането="" с="" cdp="" значително="" предотвратява="" загубата="" на="" серумния="" p="" и="" ca="" при="" ovx="" плъхове,="" доказано="" от="" нивата="" на="" серумния="" p="" и="" ca="" значително="" повишени="" (p="">< 0="" 05)="" в="" сравнение="" с="" плъховете="" от="" моделната="" група="" ovx.="" в="" допълнение,="" повишени,="" но="" нестатистически="" значими="" тенденции="" на="" калцитонин="" се="" наблюдават="" както="" в="" групите="" с="" ниска,="" така="" и="" при="" висока="" доза="" на="" cdp="" в="" сравнение="" с="" групата="" на="" модела="">

3.4. Ефекти на Cistanche Deserticola P върху образуването на кост и маркерите за костна резорбция.

Благоприятните ефекти на CDP върху индекса на костно образуване, както и влиянието на инхибирането върху маркерите за костна резорбция, са описани на Фигура 5. По отношение на маркерите за костно образуване, нивата на серумния BGP почти не се повлияват от операцията с овариектомия, доказана от не- значителни промени, наблюдавани във всички третирани групи, докато статистически значими подобрения на серумната ALP са получени както при ниски (60 mg/kg), така и при умерени (120 mg/kg) дози на CDP интервенционните групи, когато в сравнение с плъховете от групата SHAM (p < 0="" 01).="" по="" отношение="" на="" индекса="" на="" костна="" резорбция,="" нивата="" на="" серумен="" катепсин="" к="" и="" dpd,="" както="" и="" trap="" при="" плъхове="" от="" моделната="" група="" ovx,="" бяха="" значително="" повишени="" съответно="" с="" около="" 75,0%,="" 41,4%="" и="" 21,0%="" в="" сравнение="" с="" плъховете="" sham="" и="" когато="" са="" третирани="" с="" cdp,="" особено="" ниската="" доза="" от="" 60="" mg/kg,="" свойствата="" на="" катепсин="" к="" и="" dpd,="" както="" и="" на="" trap="" в="" моделната="" група="" ovx="" са="" значително="" инхибирани="" съответно="" с="" 67,3="" процента,="" 41,4="" процента="" и="" 25,9="" процента,="" като="" в="" сравнение="" с="" плъховете="" в="" групата="" на="" модела="">

3.5. Ефекти на Cistanche Deserticola P върху вагината и матката, както и теглото на цялото тяло.

Незначителни разлики в първоначалното тегло на цялото тяло на плъхове са наблюдавани преди лечението в шест групи (Фигура 6). Въпреки това, операцията с овариектомия доведе до значително увеличение на крайното телесно тегло на плъховете в групата на модела OVX, което е близо 36.0 процента, докато мокрите тегла на матката и вагината бяха драстично намалели с близо 9{{4 }}.0 процента и съответно 60,0 процента в сравнение с плъховете SHAM (p < 0="" 001).="" въпреки="" че="" съдържанието="" на="" err="" не="" показва="" значителна="" разлика="" между="" групите="" ovx="" и="" sham,="" всички="" групи="" на="" лечение,="" включително="" cdp="" и="" ev,="" значително="" повишават="" нивото="" на="" err.="" освен="" това,="" когато="" са="" третирани="" с="" ev,="" гореспоменатото="" наддаване="" на="" цялото="" телесно="" тегло,="" както="" и="" загубата="" на="" тегло="" на="" вагината="" и="" матката="" на="" ovx="" плъхове,="" са="" частично="" обърнати="" (p="">< 0="" 001),="" но="" не="" са="" повлияни="" от="" cdp="">

3.6. Ефекти на Cistanche DeserticolaP върху нивата на серумния MDA, SOD и GSH.

Нямаше статистически значима разлика в свойствата на серумните SOD и GSH между групите на модела SHAM и OVX; както е описано на фигура 7, може да се наблюдава нарастваща тенденция в GSH между горните две групи. В допълнение, нивото на серумния MDA беше рязко повишено с близо 50 процента при плъховете от моделната група OVX в сравнение с плъховете SHAM. Активността на SOD не се повлиява от третирането с CDP, докато свойствата на GSH се подобряват значително чрез намесата на CDP и CDP значително намалява нивото на MDA с 33,9 процента и 42,4 процента при дози съответно от 60 и 240 mg/kg ( p < 0="">

3.7. Ефекти на Cistanche deserticola P върху нивата на експресия на протеини.

Нашите данни, показани на Фигура 8, предполагат, че лечението с CDP значително намалява протеиновите нива на TRAF6, RANK и RANKL в сравнение с контролата. Сигналните пътища надолу по веригата, включително NF-κB, бяха потиснати и PI3K/AKT беше стимулиран от CDP интервенция, доказано от експресията на регулиране надолу на NF-κB-p65, докато PI3K-p85 и AKT1 бяха регулирани нагоре. Следователно, експресията на NFAT2 беше значително намалена, а c-Fos беше повишен след третиране с CDP при концентрация 0.001-0.1 mg/mL. Предложен механизъм е описан на Фигура 9, където CDP регулира надолу нивата на RANKL и RANK, което води до намаляване на количествата на свързване на този лиганд с неговия рецептор, а връзката на RANKL с RANK е допълнително намалена чрез понижаване на TRAF6, последвано от потискане на низходящите пътища, включително пътя на NF-κB, докато сигналният път на PI3K/AKT беше стимулиран, което накрая доведе до намаляване на експресията на NFAT2 и повишаване на нивото на c-Fos.

4. Обсъждане

Фенилетаноидните гликозиди са естествено срещащи се водоразтворими компоненти, които широко съществуват в царството на лечебните растения [11]. Досега съединенията на фенилетаноидните гликозиди привличаха все повече и повече изследователи поради очевидната им роля при справянето с различни човешки заболявания и аномалии [13]. Редица антиостеопорозни биоактивни фракции и съединения, включително полифенолни и фенилетаноидни гликозиди, бяха идентифицирани и изолирани от десетки естествени лечебни билки [5, 10, 12, 16, 17]. C. deserticola е добре известен като „женшен на пустинята“, което предполага профила на безопасност на този ядлив TCM [18, 19]. Като обща тонизираща билка и естествена здравословна храна, която отдавна се използва в азиатските страни, C. deserticola показва полезна функция за подобряване на бъбречната сила. Установено е, че TCM, традиционно използван за ободряване и поддържане на есенцията на бъбреците, обикновено се използва за лечение на остеопороза, както in vitro, така и in vivo публикуваните данни са доказали антиостеопорозната активност на C. deserticola [20–23] и фенилетаноидните гликозидни съставки, включително ехинакозид и актеозид са основните биоактивни компоненти, които съществуват в това ядливо лечебно растение; всички от които предполагат, че не само самите ехинакозид и актеозид, но и други фенилетаноидни гликозидни компоненти, съдържащи се в C. deserticola, се считат за отговорни за антиостеопорозните свойства на тази билка. В нашето настоящо проучване беше използвана благоприятна безопасна макропореста смола за изолиране и обогатяване на фенилетаноидната гликозидна фракция от C. deserticola и чрез използване на метода HPLC, осем основни фенилетаноидни гликозидни компонента, а именно актеозид F, ехинакозид, цистанозид А, актеозид, изоактеозид, актеозид С, 2'-ацетилактеозид и 6'-ацетилактеозид, бяха открити в изолираната фенилетаноидна гликозидна фракция и съдържанието беше 3,6 процента, 8,8 процента, 5,0 процента, 13,3 процента, 3,3 процента, 3,6 процента, 9,9 процента, и съответно 3,2 процента. Ехинакозидът, едно от основните активни съединения, регистрирани в C. deserticola [14], е доказано, че притежава антиостеопоротична активност; обаче, дозата от 270 mg/kg е толкова висока, че ограничава по-нататъшното й клинично приложение [24]. В настоящите експерименти общата фенилетаноидна гликозидна фракция с по-ниска доза от 60-240 mg/kg телесно тегло/- ден беше използвана върху OVX плъхове и съдържанието на идентифицираните съставки беше почти 50 процента чисто в тази фракция чрез използване HPLC метод.

Беше добре известно, че OVX може да причини остеопороза и OVX плъх се смяташе за класически и подходящ модел за симулиране на човешка остеопороза след менопауза. В същото време се наблюдава значително намаляване на костната минерална плътност, микроархитектурата на трабекуларната кост, влажното тегло на матката и влагалището и нивото на естроген, както и очевидното подобрение на костната резорбция и телесното тегло, след операция за овариектомия, от които в отчасти поради загуба на естроген [25]. Нашите данни досега ясно демонстрираха, че OVX наистина предизвиква постменопаузална остеопороза и винаги е придружена от рязък спад в качеството на костите, костната микроархитектура и мокро тегло на матката и вагината. Тъй като EV е общо хормонално заместително средство, което се използва в клиничната практика, той беше използван като положителна контрола в нашия in vivo експеримент и натрупаното телесно тегло и теглото на атрофираната матка, както и влошената костна минерална плътност и трабекуларната костна микроархитектура , очаквано бяха обърнати чрез добавяне на EV. За разлика от положителната контрола, намаленото тегло на вагината и матката, както и наддаването на цялото телесно тегло на плъхове в моделната група OVX, не са повлияни от лечението с CDP, което предполага, че CDP може да подобри образуването на кост, без да предизвиква странични ефекти върху тялото и органичните тъкани на матката. Въпреки че нивата на ERR бяха значително повишени от лечението с CDP, не бяха наблюдавани странични ефекти върху органичните тъкани на матката и вагината, точно като ефект на фитоестроген. В допълнение, лечението на CDP значително укрепва качеството на костите при OVX плъхове, които са били влошени от операция за овариектомия.

В допълнение, нивата на P и Ca в урината и серума на OVX плъхове също се използват за отразяване на антиостеопоротичния ефект, а концентрациите на Ca и неорганичен P обикновено зависят от нивата на калцитонин и PTH [26]. В настоящото проучване, въпреки че не са получени значими тенденции на намаляване или нарастване на нивото на екскреция в урината на Ca, серумен P, серумен Ca и PTH при плъхове от моделната група OVX, значителните нива на P и калцитонин в урината (p < {="" {1}})="" бяха="" наблюдавани.="" в="" съответствие="" с="" публикуваните="" данни,="" че="" дефицитът="" на="" естроген,="" причинен="" от="" операция="" за="" овариектомия,="" винаги="" води="" до="" понижено="" ниво="" на="" калцитонин="" в="" кръвта,="" този="" намален="" серумен="" калцитонин="" накрая="" води="" до="" повишено="" ниво="" на="" птх,="" където="" се="" смята,="" че="" са2="" е="" основен="" регулатор="" на="" секрецията="" на="" птх.="" тъй="" като="" концентрацията="" на="" птх="" не="" показва="" значителна="" разлика="" между="" групите="" ovx="" и="" sham="" в="" настоящото="" изследване,="" нивото="" на="" ca="" в="" серума="" и="" урината="" също="" не="" показва="" очевидни="" промени="" между="" горните="" две="" групи.="" въпреки="" това,="" беше="" получена="" значително="" намалена="" тенденция="" на="" нивото="" на="" калцитонин="" между="" групите="" ovx="" и="" sham="" и="" следователно="" съдържанието="" на="" p="" в="" урината="" на="" ovx="" беше="" силно="" намалено.="" ние="" вярвахме,="" че="" горните="" данни="" могат="" да="" обяснят="" противоречивия="" феномен="" защо="" отделянето="" на="" ca="" в="" урината="" при="" плъхове="" ovx="" не="" показва="" очевидна="" промяна="" в="" сравнение="" с="" плъхове="" sham="" и="" това="" явление="" може="" също="" да="" бъде="" свързано="" с="" повишената="" скорост="" на="" костен="" обмен="" [27]="" .="" след="" лечение="" с="" cdp,="" нивата="" на="" p="" и="" ca="" в="" серума="" бяха="" значително="" повишени,="" а="" съдържанието="" на="" p="" в="" урината="" беше="" регулирано="" надолу="" при="" ovx="" плъхове,="" което="" отразява,="" че="" cdp="" може="" не="" само="" да="" предотврати="" екскрецията="" на="" костни="" минерални="" елементи,="" но="" и="" да="" повиши="" серумното="" съдържание="" на="" тези="" елементи,="" като="" по="" този="" начин="" индиректно="" потиска="" загубата="" на="">

Освен това, маркерите за образуване на кост и резорбция, както и антиоксидантните ензими, включително SOD и GSH, също бяха използвани за обяснение на основните антиостеопоротични механизми на CDP. Подобно на публикуваните данни, нивото на ALP при плъхове от моделната група OVX показва нестатистически значима нарастваща тенденция, която показва ускорена скорост на костен обмен при постменопаузална остеопороза [10]. Въпреки това, след лечение с CDP (60, 120 и 240 mg/kg/ден), свойствата на ALP са значително подобрени. Добре известно е, че OVX причинява рязък спад на нивата на естроген, което обикновено води до прекомерна костна резорбция и оксидативен стрес [28], доказано от нивата на TRAP, катепсин К и DPD, както и MDA, значително повишени при плъхове от Група модели OVX. Тези влошавания обаче бяха частично подобрени от намесата на CDP. В допълнение, лечението на OVX плъхове с CDP (60 и 240 mg/kg) показва значително повишаване на активността на GSH (p < 0="" 05).="" горните="" резултати="" предполагат,="" че="" cdp="" проявява="" терапевтичен="" ефект="" върху="" индуцираната="" от="" ovx="" остеопороза="" и="" тези="" ефекти="" са="" както="" чрез="" засилване="" на="" костното="" образуване="" и="" потискане="" на="" костната="" резорбция,="" така="" и="" чрез="" подобряване="" на="" костната="" антиоксидантна="">

Активирането на RANK от неговия лиганд RANKL стимулира експресиите на NFAT2 и c-Fos чрез PI3K/AKT и NF-κB сигнализиране [29]. Доказано е, че NF-κB е от съществено значение за остеокластогенезата, тъй като разрушаването на NF-κB може да доведе до нарушена остеокластна диференциация с остеопоротичен фенотип, а NF-κB повишава c-Fos и понижава NFAT2 експресиите по време на RANKL/RANK/TRAF-индуцирана остеокластогенеза. За да се оцени благоприятното влияние на CDP върху NFAT2 и c-Fos-медиирана остеокластогенеза, бяха анализирани нивата на експресия на RANKL и RANK. Очаквано, CDP значително инхибира NFAT2 и стимулира нивата на c-Fos чрез понижаване на експресиите на RANKL и RANK. Междувременно, самият RANK няма присъщо свойство на киназа, освен ако не се присъедини от TRAF6, за да задейства сигнализирането надолу по веригата [3]. CDP също намалява експресията на TRAF6, което води до значително намаляване на свързващите количества на RANKL и RANK. Хипотетичен антиостеопоротичен механизъм на CDP върху OVX плъхове покрива горните сигнални пътища и регулаторите са описани на Фигура 9. Накратко, CDP намалява нивата на TRAF6, RANKL и RANK, като по този начин потиска низходящите сигнални пътища, включително PI3K/AKT и NF-κB, които се задействат от RANKL/RANK и накрая намаляват експресиите и активностите на ключовите остеокластогенни протеини NFAT2 и c-Fos. Следователно множество улики от данни предполагат благоприятния ефект на CDP върху костния метаболизъм на OVX плъхове главно чрез RANKL/RANK/TRAF6-медиирани PI3K/AKT и NF-κB пътища.

5. Заключение

В обобщение, общите фенилетаноидни гликозиди, изолирани от C. deserticola, показват значителни благоприятни ефекти върху постменопаузалната остеопороза на OVX плъхове и терапевтичният потенциал за потискане на костната загуба е главно чрез стимулиране на костното образуване и инхибиране на костната резорбция, както и подобряване на костния антиоксидант система; механизмите може да са свързани с RANKL/RANK/TRAF6-индуцирано NF-κB активиране и PI3K/AKT инактивиране, както и c-Fos стимулация и NFAT2 супресия, и накрая, диференциацията на остеокластите е инхибирана.

Съкращения

AKT: Протеин киназа B

ALP: Алкална фосфатаза

BGP: Костен GLA протеин

BMC: Съдържание на костни минерали

CDP: Фенилетаноидна гликозидна фракция на C. deserticola

CK: Катепсин К

КТ: Калцитонин

DPD: Дезоксипиридинолин

ERR: Свързан с естроген рецептор алфа

EV: Естрадиол валерат

GSH: Глутатион l-PTH: непокътнат паратхормон

MCSF: Фактор, стимулиращ колониите на макрофагите

MDA: Малонов диалдехид

NFAT2: Ядрен фактор на активирани Т клетки c2

NF-κB: Ядрен фактор-капа B

OPG: Остеопротегерин

OVX: Овариектомиран

PhGs: Фенилетаноидни гликозиди

PI3K: Фосфоинозитид 3-киназа

РАНГ: Рецепторен активатор на ядрен фактор капа B

RANKL: Рецепторен активатор на ядрен фактор-капа

B лиганд ROI: Област на интерес

SOD: Супероксид дисмутаза

Tb. N: Трабекуларен номер

Tb.Sp: Трабекуларно отделяне

Tb.Th: Трабекуларна дебелина

TCM: Традиционна китайска медицина

TMC: Тъканно минерално съдържание

TMD: Минерална плътност на тъканта

TNF: Фактор на туморна некроза

TRAF6: Фактор 6, свързан с рецептора на тумор некротизиращ фактор

КАПАН: Устойчива на тартарат кисела фосфатаза.

Наличност на данни

Данните, използвани в подкрепа на констатациите от това проучване, са достъпни от съответния автор при поискване.

Конфликт на интереси

Авторите не са имали конфликт на интереси.

Авторски принос

XM проектира и контролира експериментите; SD и LY извършиха повечето от експериментите и съставиха ръкописа; BZ и JL извършиха Western blot анализ и участваха в експерименти с животни; YD анализира данните; QT и PY ревизираха ръкописа. Всички автори прегледаха ръкописа. Lingling Yang и Shuqin Ding допринесоха еднакво за ръкописа.

Благодарности

Тази работа беше подкрепена от безвъзмездни средства от Фондацията за научни технологии за висше образование на Нинся (NGY2017090), Националната фондация за природни науки на Китай (№ 81560684), Програмата за ключови изследвания и развитие на Нинся (2018BHF2001), Ключовите изследвания на Нинся и Програма за изобретателство за сътрудничество в областта на науката и технологиите на Изтока и Запада (№ 2017BY084 и 2017BY079) и Фондация West Light към Китайската академия на науките – Млади учени на Запад 2017 г.

Препратки

[1] LJ Melton III, EA Chrischilles, C. Cooper, AW Lane и BL Riggs, „Перспектива. Колко жени имат остеопороза?“, Journal of Bone and Mineral Research, vol. 7, бр. 9, стр. 1005–1010, 1992.

[2] S. Schnell, SM Friedman, DA Mendelson, KW Bingham и SL Kates, „1-годишната смъртност на пациенти, лекувани в програма за фрактури на бедрото за възрастни,“ Гериатрична ортопедична хирургия и рехабилитация, том. 1, бр. 1, стр. 6–14, 2010.

[3] EM Tan, L. Li, IR Indran, N. Chew и EL Yong, "TRAF6 медиира потискането на остеокластогенезата и превенцията на костна загуба, предизвикана от овариектомия, чрез нов пренилфлавоноид," Journal of Bone and Mineral Research, vol. 32, бр. 4, стр. 846–860, 2017.

[4] JH Kim и N. Kim, "Регулиране на NFATc1 в остеокластната диференциация," Journal of Bone Metabolism, vol. 21, бр. 4, стр. 233–241, 2014 г.

[5] Q. Ye, XQ Ma, CL Hu et al., "Антиостеопоротична активност и съставки на Podocarpium podocarpus", Phytomedicine, vol. 22, бр. 1, стр. 94–102, 2015 г.

[6] SA Jang, HS Song, JE Kwon, et al., "Protocatechuic acid attenuates trabecular bone загуба при овариектомирани мишки," Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2018 г., номер на артикул 7280342, 11 страници, 2018 г.

[7] AB Abdel-Naim, AA Alghamdi, MM Algandaby, et al., "Рутинът, изолиран от Chrozophora tinctoria, подобрява пролиферацията на костните клетки и маркерите за осификация", Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2018 г., номер на артикул 5106469, 10 страници, 2018 г.

[8] J. Wattanathorn, C. Thipkaew, W. Thukham-mee, S. Muchimapura, P. Wannanon и T. Tong-un, „Екстрактът от листа на Morindacitrifolia L. предпазва от церебрална исхемия и остеопороза в in vivo експериментален модел на менопаузата," Оксидативна медицина и клетъчно дълголетие, том. 2018 г., номер на артикул 1039364, 13 страници, 2018 г.

[9] S. Sungkamanee, J. Wattanathorn, S. Muchimapura и W. Thukham-mee, "Антиостеопоротичен ефект на комбиниран екстракт от Morus alba и Polygonum odoratum", Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 2014 г., номер на артикул 579305, 9 страници, 2014 г.

[10] J. Liu, Z. Zhang, Q. Guo, Y. Dong, Q. Zhao и X. Ma, "Syringin предотвратява загубата на кост при овариектомирани мишки чрез TRAF6 медиирано инхибиране на NF-κB и стимулиране на PI3K/AKT , " Фитомедицина, том. 42, стр. 43–50, 2018 г.

[11] CW Lu, SK Huang, TY Lin и SJ Wang, "Echinacoside, активна съставка на Herba Cistanche, потиска епилептиформната активност в хипокампалните CA3 пирамидални неврони," The Korean Journal of Physiology & Pharmacology, vol. 22, бр. 3, стр. 249–255, 2018 г.

[12] X. Xu, Z. Zhang, W. Wang, H. Yao и X. Ma, "Терапевтичен ефект на цистанозид А върху костния метаболизъм на овариектомирани мишки," Molecules, vol. 22, бр. 2, стр. 197, 2017 г.

[13] К. Алипиева, Л. Коркина, И. Е. Орхан и М. И. Георгиев, "Вербаскозид – преглед на неговата поява, (био)синтез и фармакологично значение", Biotechnology Advances, vol. 32, бр. 6, стр. 1065–1076, 2014 г.

[14] Редакционен комитет на Китайската фармакопея, Фармакопея на Китайската народна република, China Medical Science and Technology Press, Пекин, Китай, 10-то издание, 2015 г.

[15] H. Zhang, WW Xing, YS Li et al., "Ефекти на традиционен китайски билков препарат върху остеобласти и остеокласти", Maturitas, vol. 61, бр. 4, стр. 334–339, 2008 г.

[16] X. Ma, J. Liu, L. Yang, B. Zhang, Y. Dong и Q. Zhao, „Cynomorium songaricum предотвратява костната резорбция при овариектомирани плъхове чрез RANKL/RANK/TRAF6 медиирано потискане на PI3K/AKT и NF-κB пътища," Life Sciences, vol. 209, стр. 140–148, 2018 г.

[17] XQ Ma, T. Han, X. Zhang, et al., "Kaempferitrin предотвратява загубата на костна маса при овариектомирани плъхове," Phytomedicine, vol. 22, бр. 13, стр. 1159–1162, 2015 г.

[18] PL Liao, CH Li, LS Tse, JJ Kang и YW Cheng, „Оценка на безопасността на здравословния хранителен продукт от Cistanche tubulosa Memoregain®: генотоксичност и 28-дневен тест за токсичност при повтаряща се доза“, Хранителна и химическа токсикология , кн. 118, стр. 581– 588, 2018 г.

[19] CC Wong, HB Li, KW Cheng и F. Chen, „Систематично изследване на антиоксидантната активност на 30 китайски лечебни растения, използвайки анализ на антиоксидантната мощност, намаляващ желязото“, Химия на храните, том. 97, бр. 4, стр. 705–711, 2006.

[20] D. Song, Z. Cao, Z. Liu, et al., „Полизахаридът на Cistanche deserticola отслабва остеокластогенезата и костната резорбция чрез инхибиране на RANKL сигнализацията и производството на реактивни кислородни видове, Journal of Cellular Physiology, vol. 233, бр. 12, стр. 9674–9684, 2018 г.

[21] HD Liang, F. Yu, ZH Tong, HQ Zhang и W. Liang, „Водният екстракт от Cistanches Herba, засягащ серумния BGP и TRAP и костния мозък Smad1 mRNA, Smad5 mRNA, TGF- 1 mRNA и TIEG1 Нива на експресия на mRNA при остеопороза, "Molecular Biology Reports, vol. 40, бр. 2, стр. 757–763, 2013 г.

[22] TM Li, HC Huang, CM Su et al., „Екстрактът от Cistanche deserticola увеличава костното образуване в остеобластите“, Journal of Pharmacy and Pharmacology, vol. 64, бр. 6, стр. 897–907, 2012.

[23] H. Liang, F. Yu, Z. Tong и Z. Huang, „Ефект на водния екстракт от Cistanches Herba върху костната загуба при овариектомиран плъх,“ International Journal of Molecular Sciences, vol. 12, бр. 8, стр. 5060–5069, 2011 г.

[24] F. Li, X. Yang, Y. Yang, et al., "Антиостеопоротична активност на ехинакозид при овариектомирани плъхове," Phytomedicine, vol. 20, бр. 6, стр. 549–557, 2013 г.

[25] H. Nian, MH Ma, SS Nian и LL Xu, "Антиостеопоротична активност на икариин при овариектомирани плъхове," Phytomedicine, vol. 16, бр. 4, стр. 320–326, 2009 г.

[26] SR Fahmy, AM Soliman, AA Sayed и M. Marzouk, „Възможен антиостеопоротичен механизъм на екстракт от Cicer arietinum при овариектомирани плъхове,“ Международен журнал за клинична и експериментална патология, том. 8, бр. 4, стр. 3477–3490, 2015 г.

[27] R. Swaminathan, "Биохимични маркери на костния обмен", Clinica Chimica Acta, vol. 313, бр. 1-2, стр. 95–105, 2001.

[28] S. Muthusamy, I. Ramachandran, B. Muthusamy, et al., "Овариектомията индуцира оксидативен стрес и уврежда костната антиоксидантна система при възрастни плъхове," Clinica Chimica Acta, vol. 360, бр. 1-2, стр. 81–86, 2005.

[29] WJ Boyle, WS Simonet и DL Lacey, „Диференциране и активиране на остеокластите“, Nature, vol. 423, бр. 6937, стр. 337–342, 2003.