Повишаване на противораковата активност на Aspergillus Favus "ендофит от жожоба" таксол чрез конюгиране със златни наночастици, медиирано чрез облъчване

Таксол Алтернативни китайски билки Cistanche

Ключови думи:Aspergillus favus · Жожоба · Ендофитни гъби · Златни наночастици · Таксол · -Облъчване · Хранителна оптимизация

Въведение

Таксолът е един от най-комерсиализираните широкоспектърнипротиворакови лекарства[1]. Активността на Taxol се развива от неговата уникална специфичност за свързване с хетеродимера на клетъчните тубулинови субединици, насърчавайки полимеризацията на тубулина, като по този начин нарушава митотичното делене на туморните клетки [2]. Таксол показва силна активност срещу рак на гърдата, белия дроб, главата и шията, рак на матката и напреднали форми на саркома на Капоши [3]. Таксолът е произведен за първи път от кората на тисови дървета Taxus brevifolia "семейство Taxaceae" [4, 5]; обаче, по-ниският добив на таксол е този<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as астма,възпаление, ирак[32]. По този начин основната цел на тази работа беше да се изследва нов гъбичен изолат от растението жожоба с уникална метаболитна стабилност за производство на таксол, да се оценят различните подходи за максимизиране на техния добив на таксол, както и да се подобри антипролиферативната активност на извлечените съединения на таксол чрез конюгиране със златни наночастици, медиирано от гама облъчване.

Материали и методи

Изолиране и култивиране на ендофитни гъби

Различни части от жожоба (Simmondsia chinensis) като листа, кори, клонки и пъпки бяха събрани от Факултета по селско стопанство на Кайроския университет и използвани като източник на ендофитни гъбички. Растителните части бяха събрани и измити под течаща чешмяна вода, повърхностно стерилизирани със 70 процента етанол за 1 минута и след това изплакнати със стерилна вода [28]. Повърхностно стерилизираните растителни части се нарязват на малки парчета при стерилни условия и се поставят върху плочи със среда с картофен декстрозен агар (PDA), Czapek's-Dox и агарна среда с малцов екстракт [33–36], и плочите се инкубират при 30 градуса за 10 дни. Ефективността на повърхностната стерилизация на растителните части се оценява чрез центрофугиране на водата за изплакване, след което 500 ul стерилна вода се добавят към утайката и се поставят в PDA среда [37]. Пречистените ендофитни гъбични изолати се инокулират върху наклонени PDA в продължение на 7 дни и се съхраняват при 4 градуса

Скрининг, екстракция и количествено определяне на таксол от ендофитни гъби

Възстановените ендофитни гъбички, обитаващи жожоба, бяха проверени за производство на таксол чрез отглеждане в бульон от картофена декстроза (PDB) [38]. По една запушалка от всеки от 7-дневните изолати на гъбичките се инокулира в 100 ml PDB/250 ml ерленмайерови смеси, инкубирани в продължение на 15 дни при 30±1 градуса, при условия на разклащане (120 обороти в минута). След инкубиране, културите се филтруват и филтратът се допълва с 0,2 процента натриев бикарбонат за утаяване на мастни киселини. Таксолът се екстрахира с дихлорометан и органичната фаза се събира и изпарява до сухо, а остатъците се разтварят отново в метанол [17, 39]. Таксолът се отделя и идентифицира чрез TLC, като се използват Merck 1 mm (20 × 20 cm) предварително покрити силикагелни плочи (TLC Silica gel 60 F254, Дармщат, Германия), открити чрез UV осветяване при 254 nm [39]. Предполагаемите петна от таксол се изстъргват от тънкослойните плочи със силикагел и се разтварят в метанол, разбъркват се енергично за 10 минути и се центрофугират при 1000 rpm за 5 минути. Утаените силициеви частици бяха отстранени и супернатантата беше взета за количествено определяне на таксол и проверка на чистотата чрез HPLC (YOUNG In, Chromass, 9110 плюс Quater nary Pump, Корея) на C18 колона с обратна фаза (Eclipse Plus C18 4).6 ×150 mm, 3,5 μm, кат. # 959,963–902). Използваната подвижна фаза беше метанол/ацетонитрил/вода (25:35:40, v/v/v) при скорост на потока от 1,0 ml/min за 20 минути [40], а фракциите на таксол бяха измерени при 227 nm и техните химическата идентичност и концентрациите са потвърдени от времето на задържане и пиковата площ на абсорбция в сравнение с автентична проба.

Морфологична и молекулярна идентификация на възстановени ендофитни гъби

Ендофитните гъбични изолати бяха идентифицирани до техните видови нива въз основа на техните макро- и микро-морфологични характеристики чрез отглеждане върху PDA, Czapek's-Dox и среда с екстракт от малц съгласно ключовете на справката [33–36]. Идентичността на най-мощните гъбични изолати, продуциращи таксол, беше допълнително потвърдена молекулярно въз основа на последователността на вътрешния транскрибиран спейсер (ITS) [41, 42]. Гъбична геномна ДНК (gDNA) се екстрахира чрез пулверизиране на мицела (~0.2 g) в течен азот, след което се разпределя в 1 ml CTAB екстракционен буфер (2 процента CTAB, 2 процента PVP40, { {21}}.2 процента 2-меркаптоетанол, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl в 100 mM Tris-HCl, pH 8,0). Комплектите PCR праймери бяха ITS4 5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′ и ITS5 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′. PCR реакцията съдържа 10 ul от 2 × PCR основна смес (i-Taq™, кат. № 25027), 2 ul gDNA, 1 ul от всеки праймер (10 pmol/ul) и завършен до 20 ul със стерилна дестилирана вода. PCR се програмира за първоначална денатурация при 94 градуса за 2 минути, денатурация при 94 градуса за 30 s, отгряване при 55 градуса за 10 s, удължаване при 72 градуса за 30 s за 35 цикъла и окончателно удължаване при 72 градуса за 2 мин. PCR ампликоните бяха анализирани с 1,5 процента агарозен гел в 1 × TBE буфер (Ambion Cat # AM9864), използвайки 1 kb ДНК стълба (Cat. # PG010-55DI) и визуализирани чрез система за документиране на гел. Ампликоните бяха пречистени и секвенирани чрез Applied Biosystems Sequencer, HiSQV Bases, версия 6.0 със същите комплекти праймери. Получените последователности бяха BLAST претърсени без излишък в базата данни на NCBI, импортирани в софтуера MEGA 6.0 и подравнени с мускулния алгоритъм Clustal W [43] и филогенетичното дърво беше конструирано с метода за свързване на съседи на MEGA 6.0 [44].

Химическа структура на екстрахирания таксол

Предполагаемите петна от таксол бяха изстъргани от тънкослойните слои със силикагел и пречистени, а чистотата и концентрацията бяха определени чрез UV-Vis анализи при λ 227 nm (RIGOL, Ultra-3000 серия) в сравнение с автентичния таксол [39]. Празни среди при същите условия бяха използвани като отрицателна базова линия за спектрофотометричните анализи. FT-IR спектърът на пречистените проби от таксол се анализира с JASCO FT-IR 3600 спектрофотометър. Пробата от таксол беше смляна с KBr пелети, пресована в дискове под вакуум и абсорбцията беше измерена в областта от 400 до 4000 cm-1 [3], в сравнение с автентичната. Химическата структура на екстрахирания таксол беше потвърдена от HNMR спектроскопия (JEOL, ECA-500II, 500 MHz NMR) в сравнение с автентичния таксол. Пробите се разтварят в CDCl3, химичните отмествания са дадени в ppm (δ-скала), а константите на свързване са изразени в херцове (Hz).

Ефект на различни видове среди върху производството на таксол

Две агарови тапи (9 mm) от 7-дневни култури от всеки гъбичен изолат се инокулират трикратно в 100 ml среда/250 ml Ерленмайерова колба с картофена декстроза (PDB), Czapekʼs-Dox (CZD), M1D и малцов екстракт (ME). ) бульонна среда. Неинокулираните контроли от всяка среда, които са свободни от гъбични спори, се използват като отрицателна контрола, инкубирани при 30 градуса за 15 дни при същите условия. След инкубиране, гъбичните култури се филтруват и таксолът се екстрахира и определя, както е споменато по-горе.

Биопроцесно оптимизиране на хранителните условия за максимизиране на добива на таксол

Оптимизирането на състава на средата за максимизиране на добива на таксол от мощния гъбичен изолат беше проведено чрез методология на повърхността на отговор, използвайки дизайн на Placket-Burman, последван от централен композитен дизайн [17–20, 45]. От дизайна на RSM, положителните и значими променливи, засягащи производството на таксол от мощния гъбичен изолат, бяха оценени с помощта на статистическия софтуерен пакет от Design-Expert 7.0 (Stat Ease Inc., Минеаполис, САЩ). Всеки експеримент се провежда в три биологични повторения и се вземат предвид средните стойности. След инкубиране при желаните условия, гъбичната биомаса се филтрира и таксолът се екстрахира и количествено се определя чрез TLC и HPLC, както е описано по-горе.

Дизайн на Placket-Burman

Дизайнът на placket-Burman често се използва за оптимизиране на компонента на средата за растеж на гъбички и производство на биоактивни вторични метаболити, като се оценяват значимите променливи, влияещи върху производството на таксол [18, 20, 46]. Изборът на фактор се основава на средата, използвана при качествен и количествен скрининг. Включени са единадесет фактора; екстракт от малц, пептон, захароза, сойтон, глутамин, екстракт от говеждо месо и температура, рН, време на инкубация и скорост на разклащане и стойности и фактори бяха променени на две нива и бяха избрани диапазоните на минималните и максималните нива. Статистическият Design-Expert 7.0 беше използван за генериране на набор от 12 експеримента. За всеки експеримент производството на таксол се определя в три биологични повторения и се взема предвид средният добив на таксол.

Регресионният анализ на данните беше извършен с помощта на статистически софтуер. Ефектът на всяка променлива беше изчислен (Biometrika, 2020), като се използва следното уравнение:

където E е ефектът от тестова променлива, M плюс и M− са концентрацията на таксол в опитите, при които параметърът е съответно на по-високи и по-ниски нива, а N е броят на проведените експерименти. Ефектът на всяка променлива върху производството беше определен чрез изчисляване на съответните им Е-стойности.

Където Tot high е общият брой отговори на високо ниво, Tot low е общият брой отговори на ниско ниво, а No е броят на опитите.

Централен композитен дизайн и взаимодействия между фактори, влияещи върху производството на таксол

Най-значимите положителни фактори, влияещи върху производството на таксол от избрания гъбичен изолат, бяха оптимизирани с помощта на експериментален дизайн на CCD модел на отговорна повърхност [47]. Чрез използване на CCD, концентрациите на компонентите на средата бяха оптимизирани и техните изследвани взаимодействия бяха използвани за генериране на общо 20 експеримента за трите променливи. За да се определят оптималните нива на променливите за производство на таксол от мощния гъбичен изолат, бяха начертани триизмерни (3D) повърхностни криви на отговор, за да се проучи взаимодействието между различните фактори и да се определи променливото състояние на всеки фактор, влияещ върху производството на таксол. 3D графиките бяха направени чрез поддържане на константи на три фактора на идеално ниво и начертаване на получения отговор на добива на таксол за различни нива на другите два фактора.

Ефект на гама облъчване върху добива на таксол

Мощните ендофитни изолати, произвеждащи Таксол, бяха изложени на -облъчване с източник на 60кобалт (гама клетка 4000-A-Индия) при различни дози гама лъчение (0.25–3.0 kGy) в сравнение към контрола на необлъчената култура; мощност на дозата 1,2 kGy/h по време на експериментите. Оптимизираните среди се инокулират от облъчената култура при стандартни условия на култура, в сравнение с инокулума на необлъчени спори като контрола. Културите се инкубират при 30±2 градуса в продължение на 15 дни на ротационен шейкър (120 rpm). След инкубиране, културите се филтруват и таксолът се екстрахира, пречиства и определя количествено чрез TLC и HPLC, както е описано по-горе.

Синтез и характеризиране на златни наночастици (AuNPs); Конюгация с таксол

Противоракова активност на таксол

Активността на пречистените Taxol и Taxol-PVP-AuNPs конюгати срещу чернодробен карцином (HPG2) и карцином на гърдата (MCF7) се определя от 3- (4,5-диметилтиазол- 2-ил) -2,5-дифенил тетразолиев бромид (MTT) анализ [48]. 96-Плаката с ямки се посява със 103 клетки на ямка и се инкубира за една нощ при 37 градуса, след което се добавят различни концентрации на лекарството и плочите се инкубират отново за 48 часа. Добавя се МТТ реагент (25 ul) и се инкубира в продължение на 2 часа и лилавият цвят на развития формазанов комплекс се измерва при λ570 nm. Стойността IC50 се изразява чрез количеството лекарство, намаляващо растежа на 50 процента от първоначалния брой туморни клетки, нормализиращи се до положителна контрола.

Антимикробна активност на таксол и конюгати на таксол-AuNPs

Антимикробната активност на Taxol и Taxol-AuNPs конюгатите беше оценена срещу различни бактериални изолати; Bacillus subtilis ATCC 6633 и Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli и Enterobacter agglomerans, в допълнение към Candida albicans. Тестваните бактериални клетки се суспендират в стерилна пептонна вода, за да се получи стандартен инокулум от ~0.5 McFarland (1–1.5) × 1{{10}}8 CFU/ ml при λ6{{18 }}0 nm. Инхибирането на растежа (mm) на растежа на микробни патогени се оценява чрез метода на дифузия на агар диск. Като положителни контроли се използват стерилни стандартни антибиотични дискове с диаметър 6,0 mm. Стерилни антибиотични дискове (6,0 mm) се зареждат с 20 ul метанол и амоксицилин-клавуланова киселина (AMC) като отрицателна и положителна контрола. Дисковете бяха заредени със същата концентрация на таксол, таксол-PVP-AuNPs и AuNPs (1,0 ug/ml). Подготвени са три биологични реплики. Плаките се инкубират при 37 градуса за 24 часа и се измерват зоните на инхибиране. Амоксицилин клавуланова киселина (AMC) и нистатин са използвани за нормализиране на антимикробната активност на Taxol. Зоната на инхибиране на растежа се определя с нониус (mm).

Статистически анализи

Морфологична и молекулярна идентификация на мощните продуценти на таксол

Морфологичните характеристики на мощния гъбичен изолат, произвеждащ Таксол, бяха изследвани съгласно макроскопските и микроскопските описателни ключове, както е описано в Материали и методи, и разкриха неговата морфологична близост с A. favus (фиг. 2). Гъбичният изолат се отглежда на PDA при 30 градуса в продължение на 10 дни и макроскопските и микроскопските характеристики разкриват неговата идентичност като конидиални глави, начин на разклоняване, идентичност на стигмата и конидиална онтология и образуване на плодни тела, според универсалния морфологични ключове [33] и беше установено, че са идентични с Aspergillus favus. Мощният таксол-продуциращ изолат A. favus беше допълнително идентифициран въз основа на техните ITS последователности, използвайки gDNA като шаблон. PCR ампликоните (~550 bp) на A. favus бяха разделени, пречистени и секвенирани (фиг. 2). ITS последователността на A. favus беше нередундантно търсене в базата данни на NCBI, показвайки 99 процента сходство с A. favus, с нулеви стойности на E. и 95 процента покритие на заявката. По този начин, от микроскопски и молекулярни анализи, целевият изолат беше потвърден като A. favus и депозиран в GenBank с номер за достъп MW485934.1, както и изолатът беше депозиран в микологичния център на университета Assiut (AUMC), Египет с депозитен номер AUMC13892. Настоящият изолат имаше 99 процента сходство с изолатите на A. favus MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551,

Фиг. 1 Морфологичен изглед на растение жожоба. B Култури на плочи от мощните ендофитни гъби, продуциращи таксол; A. favus Bd1 (13), A. niger Lv1 (21), Penicillium polonium (23) и A. oryzae Bd (25) на PDA след 8 дни инкубиране при 30 градуса. Гъбичните изолати се отглеждат върху PDB и се инкубират при стандартни условия, а Taxol се екстрахира и проверява чрез TLC (C). D HPLC хроматограма на таксол от мощни гъбични изолати. E Добив на таксол, определен количествено от HPLC. F, UV-Vis спектрален анализ на екстрахиран таксол от гъбичните изолати. G FT-IR анализ на екстрахиран таксол в сравнение с автентичен

Фиг. 2 A Макроморфологични характеристики на A. favus, ендофит на жожоба след 3, 5 и 8 дни растеж върху PDA. Микроморфологични характеристики, конидиална глава на A. favus с 400-кратно увеличение. C PCR ампликон на A. favus ITS регион от 500 bp, нормализиращ се до 1 kb стълба (Cat. #. SM0312). D Филогенетичен анализ на ITS A. favus чрез метода на максимална вероятност [44]