Мишки с условен нокаут на карбоксипептидаза Е проявяват дефицити в ученето и паметта и невродегенерация, част 1

Карбоксипептидаза Е (CPE) е многофункционален протеин с много неензимни функции в различни системи. Предишни проучвания, използващи CPE нокаут мишки, показаха, че CPE има невропротективни ефекти срещу стреса и участва в ученето и паметта.

Устойчивостта на стрес и паметта са два неразделни аспекта. Независимо дали става дума за работа, обучение или живот, ние ще се сблъскаме с всякакъв вид натиск. Понякога тези стресове могат да ни накарат да се чувстваме депресирани, тревожни, уморени и дори да повлияят на паметта ни. В този случай трябва да намерим начини да подобрим своята устойчивост на стрес и памет.

Първо, подобряването на толерантността към стрес може да се постигне чрез упражнения. Изследванията показват, че упражненията могат да помогнат на хората да намалят тревожността и депресията. В допълнение, подходящите упражнения могат също да стимулират метаболизма, да подобрят съня и да подобрят физическата форма. Всичко това спомага за подобряване на нашата устойчивост на стрес и памет.

Второ, психологическото консултиране също е ефективно средство за подобряване на устойчивостта на стрес. Когато срещнете трудности и неуспехи, незабавно общувайте със семейството или приятелите си, за да освободите вътрешните си лоши емоции и да намалите психологическото си бреме, така че да можете по-добре да се изправите пред натиска и предизвикателствата.

В допълнение, добрите навици за сън също са от съществено значение за подобряване на паметта и устойчивостта на стрес. Лошият сън може да доведе до физическа умора, депресия и загуба на паметта. Следователно трябва да развием добри навици за сън, да осигурим достатъчно време за сън всяка вечер и да гарантираме качеството на съня.

И накрая, положителното отношение също е от решаващо значение. Трябва да поддържате добро отношение, да продължите да учите и подобрявате уменията си, активно да се изправяте пред предизвикателствата, да поддържате оптимистична нагласа, когато се сблъсквате с трудности, и да вярвате, че можете да преодолеете напрежението и да постигнете успех.

Накратко, устойчивостта на стрес и паметта са два тясно свързани аспекта. Чрез упражнения, психологическо консултиране, добри навици за сън и положителна нагласа можем ефективно да подобрим способността си да издържаме на стреса и паметта си и да се справяме по-добре с различни предизвикателства в живота и работата. Вижда се, че трябва да подобрим паметта и Cistanche deserticola може значително да подобри паметта, тъй като Cistanche deserticola е традиционен китайски лекарствен материал, който има много уникални ефекти, един от които е да подобрява паметта. Ефикасността на мляното месо идва от различните активни съставки, които съдържа, включително киселина, полизахариди, флавоноиди и др. Тези съставки могат да насърчат здравето на мозъка по различни начини.

Щракнете върху познайте 10 начина за подобряване на паметта

Функциите на CPE в невроните обаче все още са до голяма степен неизвестни. Тук използвахме система Camk2a-Cre за условно нокаутиране на CPE неврони. Мишките от див тип, CPEflox/− и CPEflox/flox бяха отбити, маркирани на ушите и подрязани на опашката за генотипиране на 3-седмична възраст и те бяха подложени на тестове за открито поле, разпознаване на обекти, Y-лабиринт и тестове за кондициониране на страх на 8 години на седмици.

Мишките CPEflox/flox имат нормално телесно тегло и глюкозен метаболизъм. Поведенческите тестове показаха, че мишките CPEflox/flox имат нарушено учене и памет в сравнение с мишките от див тип и CPEflox/-. Изненадващо, субикулумната (Sub) област на CPEflox/flox мишки е напълно дегенерирана, за разлика от CPE напълно нокаутирани мишки, които проявяват невродегенерация на CA3 област. В допълнение, имунооцветяването с двоен кортин предполага, че неврогенезата в зъбчатия гирус на хипокампуса е значително намалена при CPEflox/flox мишки.

Интересното е, че TrkB фосфорилирането в хипокампуса е понижено при CPEflox/flox мишки, но нивата на невротрофичен фактор, получени от мозъка, не са. Както в хипокампуса, така и в дорзалния медиален префронтален кортекс, наблюдавахме намалена експресия на MAP2 и GFAP в CPEflox/flox мишки. Взети заедно, резултатите от това проучване показват, че специфичен невронален нокаут на CPE води до дисфункция на централната нервна система при мишки, включително дефицити на учене и памет, субдегенерация на хипокампа и нарушена неврогенеза.

ВЪВЕДЕНИЕ

Карбоксипептидаза Е (CPE), известна още като невротрофичен фактор - 1, е мултифункционален протеин с много основни неензимни функции в ендокринната и нервната система [1]. CPE е обогатен със зрели секреторни везикули и играе критична роля в биосинтезата на пептидни хормони и невропептиди [2]. CPE също така действа като сортиращ рецептор на много пропротеини, включително проинсулин, проенкефалин, проопиомеланокортин и про-мозъчен невротрофичен фактор (pro-BDNF) [3].

Естествено срещаща се мутация на фенотип на затлъстяване при мишка, наречена "мазнина", е картографирана към CPE гена [4]. Последващо проучване показа, че CPEfat/fat и CPE-нокаут (KO) мишки показват сходни фенотипове, включително безплодие и затлъстяване при възрастни [5]. Съобщава се, че човешкият CPE ген има мутации, включително нулеви мутации, мутации, които дават пресечени протеини, и такива с елиминирани ключови каталитични остатъци [6].

Хомозиготни индивиди с тежки мутации са болезнено затлъстели и имат хипогонадизъм. В допълнение, CPE missense полиморфизъм е открит при пациенти с диабет тип 2. Мутацията променя ензимната активност на CPE и пациентите показват ранно начало на диабет тип 2 [7]. Освен това CPE играе важна роля във везикуларния транспорт, както е показано в невроните и синапсите на хипокампа [8].

Предишни проучвания показват, че високите нива на CPE се експресират в хипокампуса и имат невротрофична роля, независима от неговата ензимна активност за защита срещу индуцирана от стрес смърт на пирамидален неврон и когнитивно увреждане [9, 10]. Стресът уврежда структурата и функцията на серия от мозъчни региони [11].

Префронталната кора (PFC) е основната невропатологична цел на стреса, която е свързана с множество кортикални и субкортикални области и допринася за когнитивните функции [12, 13]. Дорзалната медиална PFC (dmPFC) включва rostralanterior cingulate cortex и prelimbic cortex, които са региони, участващи в модулирането на болката, емоциите и познанието. Доказано е, че функционалното инактивиране на dmPFC предизвиква негативни емоции и намалява когнитивните способности [14]. Активността на dmPFC невроните предава информация за минали избори и резултати, а отстраняването или инактивирането на dmPFC влошава насоките за реплики [15].

В допълнение, стресът води до увреждане на невронните мрежи, когнитивна дисфункция, дегенерация на хипокампа и намалена неврогенеза [10]. Пирамидалните неврони в dmPFC и хипокампуса показват атрофия при стрес, а психосоциалният и задръжкият стрес предизвикват атрофия в рамките на приблизително 3-4 седмици [11, 16]. Морфологичните промени варират в зависимост от мозъчната област. Стресът от хронично напрежение води до дендритна ретракция и намалява гръбначната плътност в прелимбичната област на dmPFC и хипокампуса [17].

Индуцираното от стреса намаляване на сложността на апикалния дендрит на хипокампа е в съответствие с нарушени функции на хипокампа, като учене и памет [18]. В допълнение, невроналното увреждане и апоптозата в региона CA3 водят до дефицит на пространствена памет [19]. От гледна точка на поведението е установено, че стресът уврежда различни функции, зависими от хипокампуса, като памет [20].

CPE се модулира при различни видове стрес и е важен за защитата на невроните. Невроните в хипокампуса и кортекса повишават експресията на CPE след исхемичен стрес, което е свързано с оцеляването на невроните [21].

В допълнение, след CPEknockout (KO) мишките получиха стресова парадигма, когато бяха отбити на 3-седмична възраст, те показаха дегенерация на CA3 региона и намалена неврогенеза в зъбния гирус (DG) [1, 22].

В това проучване използвахме обща специфична за неврон Camk2aCre система за изтриване на CPE на неврон. Ние генерирахме CPE условен KO (cKO) модел на мишка, за да изследваме фенотипа на загуба на функция на CPE в невроните на мозъка. Ние оценихме ефекта на парадигмата на стреса (отбити, с маркирани уши и подрязани опашки) на 3-седмична възраст върху CPE-cKO мишки. Използвахме тестове за разпознаване на обекти, Y лабиринт и тестове за обуславяне на страха на възраст 8–10 седмици, за да оценим когнитивното представяне. В допълнение, ние анализирахме фенотиповете на неврони и астроцити, както и неврогенезата в хипокампуса.

МЕТОДИ

Животни

Camk2a-Cre мишки и CPEflox/flox мишки бяха получени от CyagenBiosciences (Суджоу, Китай). Всички животни бяха настанени при стайна температура (22 градуса ± 2 градуса) с естествен цикъл светлина/тъмнина и им беше позволен свободен достъп до чиста вода и стандартна храна за гризачи. Camk2a-Cre и CPEflox/flox мишки се наричат ​​CPE-cKO мишки. На 3-седмична възраст мишките бяха отбити, маркирани на ушите и подрязани на опашки за генотипиране, причинявайки парадигма на емоционален и физически стрес. Ние се позоваваме на Camk2a-Cre; CPEflox/flox мишки като CPEcKO, Camk2a-Cre; CPEflox/− мишки като хетерозиготни (HE) и CPE−/− мишки като див тип (WT). Всички експериментални процедури за животните бяха одобрени от Комитета по етика на експерименталните животни към университета Minzu в Китай.

Полимеразна верижна реакция (PCR)

Подрязаните опашки бяха събрани, за да се изолира ДНК за PCR за идентифициране на генотипа. Последователностите на праймерите са както следва:

Телесно тегло

WT, CPEflox/− и CPEflox/flox мишки (на възраст 1–20 седмици; n=10 за всеки генотип) се претеглят всяка седмица, което се използва за определяне на промените в теглото. Теглото на всяка мишка беше осреднено за всяка група.

Плазмена глюкоза

Венозна кръв от опашките на мишката беше събрана и открита от системата за мониторинг на кръвната глюкоза (Yuwell, Китай) след гладуване в продължение на 12 часа. Взети бяха кръвни проби от опашната вена на 0 минути за плазмена глюкоза на гладно. След това всяка мишка се инжектира интраперитонеално с 1 g/kg разтвор на глюкоза. След това определихме плазмената глюкоза за 15, 30, 60, 90 и 120 минути, за да измерим нивата на кръвната захар.

Поведенчески тестове

За да се оцени поведението на мишки WT, CPEflox/− и CPEflox/flox, животни на възраст 8–10- седмици са подложени на тестове за открито поле, разпознаване на обекти, Y лабиринт и тестове за обуславяне на страха.

Открито поле

Проучвателното поведение беше измерено с помощта на апарат с открито поле (50 × 50 × 40 cm). Всяко животно се поставя в единия ъгъл на апарата и се измерва в продължение на 7 минути. Изминатото разстояние е записано за последните 5 минути със система за видеоизображение (Taimeng, Chengdu, Китай).

Разпознаване на обекти

Тестът за разпознаване на обекти беше използван за тестване на ученето и паметта при мишки. В деня на обучението два еднакви обекта бяха поставени по диагонала на апарат (50 × 50 × 40 cm). Животните бяха оставени свободно да изследват в продължение на 7 минути. За процедурата на тестване един обект беше заменен с нов обект на същия диагонал като деня на обучението. Животните бяха оставени да изследват свободно в продължение на 7 минути. Времето на изследване на 2–3 cm около новия обект е записано за последните 5 минути.

Y лабиринт

Изследователската активност и работната памет бяха измерени с помощта на Y-лабиринт (дължина на ръката: 30 cm, ширина на ръката: 6 cm, височина на стената: 15 cm). Всяко животно беше поставено в централната зона. Броят и промените на влизанията в ръцете бяха записани за 7 минути със система за видеоизображение (Taimeng, Chengdu, Китай). Резултатът беше изчислен като правилен номер на алтерация/общо въведено число на рамото.

Обуславяне на страха

Кондиционирането на страха се състоеше от две камери, а кутията за монитор за замразяване (23 × 23 × 30 cm) беше поставена в по-голяма звукоизолирана стая (30 × 30 × 37 cm). Кутията за монитор за замразяване съдържаше метална решетка за шок на краката и бяха записани вертикалните и хоризонталните движения на животните. Първият ден беше обучение по условен рефлекс. Процедурата беше следната: бездействие за 60 s и след това стимулация 12 пъти.

Съдържанието на стимулацията включва условен стимул от 30 s (75 dB), последван от интервал на проследяване (30 s) и завършва с 2 s крачен удар (30 mA) и 15 s бездействие. Шест часа по-късно беше проведен тестът за краткосрочна памет и броят на стимулите беше намален до 6. По време на процеса на стимулация всеки опит се състоеше от условния стимул, последван от интервал на проследяване (30 секунди) и завърши без доставяне на шок на крака.

Тестът за дългосрочна памет се провежда на следващия ден с интервал от един ден. Методът беше същият като този на краткосрочната памет за измерване на качеството на дългосрочната памет.

For more information:1950477648nn@gmail.com