Изследване на химични профили и метаболити на суров и преработен Cistanche Deserticola при плъхове от UPLC-Q-TOF-MSE

Имейл за връзкаtina.xiang@wecistanche.comза повече информация

Резюме

Заден план: Обработката на китайската materia medica е отличителна и уникална фармацевтична техника в традиционната китайска медицина (TCM), използвана за намаляване на страничните ефекти и увеличаване или дори промяна на терапевтичната ефикасност на суровите билки. Промените в основните компоненти, предизвикани от оптимизирана процедура на обработка, са основно отговорни за повишената ефикасност на лечебните растения. Бъбречно-ян ободряващият ефект на оризово вино, приготвено на параCistanche deserticola(C.deserticola) е по-силен от суровия C.deserticola (CD).

Методи: Извършен е сравнителен анализ с помощта на UPLC-Q-TOF-MS' с информационната платформа UNIFl, за да се определи влиянието на обработката. Бяха проведени in vitro проучвания за характеризиране на съставките, както иметаболитиin vivo. Химичните компоненти са определени в CD и неговите преработени продукти. Многовариантните статистически анализи бяха проведени за оценка на вариациите между тях, докато OPLS-DA беше използван за сравнение по двойки.

Резултати: Резултатите от това проучване разкриват значителни вариации във фенилетаноидните гликозиди (PhG) ииридоидислед обработка. Общо 97 съединения са открити в екстрактите от CD и неговия преработен продукт. PhG с 4-O-кафеоилова група в 8-O- -D-глюкопиранозилната част, като актеозид, цистанозид C, кампнеозид II, османтузид, намаляват след обработка, докато PhG с 6' -О-кафеоилната група в 8-O- -D-глюкопиранозилната част, като изоацетозид, изоцистанозид С, изокампнеозид l, изомартинозид се увеличава, особено в CD-NP групата. Интензитетът на ехинакозид и цистанозид В, чиято структура притежава 6'-O- -D-глюкопиранозилна част също се увеличава. При in vivo проучване, 10 прототипни компонента и 44 метаболита са открити в плазма, изпражнения и урина на плъхове. Получените резултати разкриха, че обработката води до значителна вариация в химичните съставки на CD и повлия на разположението на съединенията in vivo, а фаза Ⅱ метаболитни процеси са ключовите каскади на всяко съединение и повечето от метаболитите са свързани с ехинакозид или актеозид.

Изводи: Това е първото глобално сравнително изследване на сурови и обработени CD. Тези констатации допълват нашето разбиране за въздействието на обработката на CD и дават важни данни за бъдещи изследвания на ефикасността.

Ключови думи: Cistanche deserticola, обработка, UPLC-Q-TOF-MS5, химични профили, метаболити in vivo

Въведение

Обработката на китайската materia medica (CMM) демонстрира значителна приложимост в клиничната практика на традиционната китайска медицина (TCM) и се счита за жизнеспособно лечение от няколко века. Това е уникална фармацевтична технология, която е извлечена от теорията на TCM. След обработката са идентифицирани значителни разлики във външния вид, химическите съставки, характеристиките и медицинското значение на всички видове TCM, което води до предположението, че обработката може да подобри ефикасността или да намали токсичните ефекти на TCM.

В продължение на стотици години,Cistanche deserticola(Rou Cong Rong на китайски, CD) обикновено се използва в клиничната практика на TCM за допълване на функциите на бъбреците. Той също така помага за овлажняването на червата, което води до отпускане на червата [1].Цистанчее записано за първи път в ShenNongBencaoJing. Среща се често в сухи и полусухи местообитания в Евразия и Северна Африка, включително Иран, Китай, Индия и Монголия [2]. Обработката на CD е извършена чрез задушаване с оризово вино при нормално налягане, което е метод на приготвяне, документиран в китайската фармакопея (Jiucongrong на китайски, наричана по-нататък "CD-NP"). И запарването на CD с оризово вино под високо налягане е по-ефективен метод за приготвяне (наричан по-нататък "CD-HP") [3, 4]. Няколко проучвания са разкрили, че фармакологичните ефекти на CD са различни от неговите преработени продукти [5]. CD може да тонизира бъбречния ян и да отпусне червата, докато след като се задуши с оризово вино, ефектът от попълването на бъбречния ян ще се засили. В нашето по-ранно проучване беше установено, че CD-NP може да подобри тонизирането на бъбреците и да поддържа Ян и да облекчи ефекта от овлажняване на червата и дефекация [6–8]. В клиничната практика преработените продукти са най-често използваната форма.

До момента няколко проучвания са анализирали химичните компоненти на CD, последвани от изолиране и идентифициране на повече от 100 съединения [9–11], като фенилетанол гликозиди (PhGs),иридоиди, лигнани и олигозахариди като негови основни химични съставки. Също така се съобщава, че има много фармакологични активности на PhG, включително имуномодулаторни, невропротективни, хепатопротективни, противовъзпалителни, антиоксидантни и т.н. [12–14]. Иридоидите притежават противовъзпалителни действия [15, 16]. Също така беше разкрито от по-ранни проучвания, че някои химически компоненти показват вариации по време на обработката [17–20]. Въз основа на тези доклади може да се предположи, че последващата обработка, вариациите в химическия състав водят до различни фармакологични ефекти, които трябва да бъдат допълнително проучени.

В настоящото проучване е извършен чувствителен и ефективен метод, т.е. ултрависоко ефективна течна хроматография, съчетана с TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE) за сравнителен анализ и са проведени in vitro изследвания за качествен анализ на екстрактите на CD, CD-NP и CD-HP за изясняване на техните химични профили. Като цяло, екзогенните химикали с висока експозиция в целевите органи се считат за ефективни компоненти. Следователно, при плъхове CD и неговите преработени продукти се прилагат съответно перорално, последвано от тяхното характеризиране. Съществуващото проучване разкрива сравнително изследване (както in vitro, така и in vivo) на суров и обработен CD за първи път. Получените резултати биха разширили нашето разбиране относно ефекта от обработката на CD, което може да бъде полезно за по-нататъшни проучвания.

Материали и методи

Материали

Стандартни съединения на аджугол (180120) и 2'-ацетил-ацетозид (M0601AS) са предоставени от Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Chengdu, Китай). Цистанозид F (MUST-17022620), ехинакозид (D1105AS), цистанозид A (M0906AS) и изоактеозид (M0106AS) са предоставени от компанията Must (Сичуан Китай); актеозид (O0618AS), салидрозид (J0526AS), каталпол (S0728AS), генипозид (A0407AS) и генипозидова киселина (MB6001-S) са придобити от Dalian Meilun Bio.Co., Ltd (Далиан, Китай).8-епидната оксилоганова киселина (B31123) е получен от Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, Китай. Метанолът и ацетонитрилът са от клас MS и са получени от Merck KGaA, Дармщат, Германия. Метанова киселина (CH, O,) от HPLCgrade е предоставена от Merck KGaA (Дармщат, Германия). Водата, използвана в съществуващото проучване, е обработена чрез системата Milli-Q (18.2 MQ, Millipore, Ma, USA). Оризовото вино беше предоставено от Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Китай).

Cistanch deserticola е събрана от Neimenggu wangyedi cistanche Co.Ltd. Пробите са идентифицирани от проф. Yanjun Zhai (училище по фармация, Liaoning University of TCM). Образците бяха предадени на Университета за традиционна китайска медицина в Ляонин.

Животни

Мъжки плъхове Sprague–Dawley (SPF клас) с общо телесно тегло 180–220 g бяха осигурени от Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Ресурсен център за лабораторни животни на провинция Ляонин, номер на лиценз: SCXK-2015–0001). Тези плъхове бяха настанени в стая за развъждане с добре поддържана температура и влажност, т.е. 20-26 градуса, 50-70 процента за една седмица. Плъховете са хранени с обичайната лабораторна храна и вода преди експеримента. Животните гладуваха цяла нощ, но водата беше осигурена ad libitum преди експеримента. Плъховете са екзекутирани с 10 процента хлоралхидратен анестетик. Институционалният комитет по етика на животните към провинциалната болница по китайска медицина в Ляонин одобри всички експериментални протоколи (2019.3.25, 2019015).

Приготвяне на CD, CD-NP и CD-HP екстракт

CD-NP, CD-HP бяха обработени от една и съща партида Cistanch deserticola. За да се приготви CD-NP, сухи CD парчета (5 mm дебелина, 100 g) се овлажняват с оризово вино (30 mL) и се запарват при 100 градуса за 16 часа, последвано от сушене при 55 градуса чрез сушилня. Докато CD-HP се приготвя чрез инфилтрация на сухи CD парчета (5 mm дебелина, 100 g) с оризово вино (30 mL), последвано от пара при 1.25 атмосферно налягане в продължение на 4 часа. и след това се суши в сушилня при 55 градуса.

В мерителна колба от 100 ml, един грам от праха се пресява през сито #4, последвано от добавяне на 50 процента метанол (50 mL) и след това се покрива плътно и се смесва. Тази смес се претегля, последвано от половин час. мацерация. След накисване, сместа се обработва с ултразвук (мощност 250 W, честота 35 kHz) в продължение на 40 минути, последвано от охлаждане и отново претегляне. Загубата на тегло се допълва с 50 процента метанол, правилно смесен и оставен да престои, последвано от филтриране на супернатанта и след това използване на получения филтрат като тестов разтвор.

MSE анализ на активни компоненти

Приготвяне на стандартни субстанции: тубулозид-А (3.02 mg), ехинакозид (3.00 mg), 2'-ацетилактеозид (2,34 mg), актеозид (2,45 mg), изоактеозид (0,61 mg), цистанозид-F (2,14 mg), салидрозид (3,39 mg), генипозид (2,84 mg), аджугол (1,58 mg), каталпол (2,39 mg), генипозидова киселина (2,56 mg) и 8-епидеоксилоганова киселина (2.34 mg) бяха добавени в 10 mL обемен контейнер, добавен метанол с постоянен обем в мащаб, конфигуриран в съответния референтен разтвор на концентрация. Всеки от 100 μL беше конфигуриран в смесен референтен разтвор.

Условие за MS анализ: Стойността на масата Te беше коригирана преди експеримента и беше използван режимът на отрицателни йони. Диапазонът на масата беше 50–1200 Da и пробата беше инжектирана чрез инжекционна помпа. Скоростта на конуса беше 100 L/час, скоростта на потока на разтворителя беше зададена на 800 L/час. Капилярното и коничното напрежение бяха фиксирани съответно на 2500 и 40 V. Температурата на източника на йони и газа на разтворителя беше съответно 100 градуса и 400 градуса, а честотата на получаване на сигнала беше 0,5 S-1.

UPLC-Q-TOF-MS анализ на CD екстракт (15-16 минути), 65 процента до 55 процента А (16-18 минути). Скоростта на потока беше 0.3 mL min−1, докато температурата на помещението за автоматично вземане на проби и колоната беше 30 градуса и 8 градуса поотделно. Инжекционният обем беше 1,0 μL.

Масспектрометричната оценка беше извършена чрез Waters XEVO G{{0}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, USA), включваща ESI източник. Скоростта на потока на азотния газ беше фиксирана на 800 L·hrs−1 с температура 400 градуса, температурата на източника беше фиксирана на 100 градуса, а конусният газ беше настроен на 50 L h−1. Напрежението на конуса и капиляра се регулира съответно на 40 и 2000 V. Енергията на сблъсъка на рампата беше използвана в диапазона от 20–30 V. Te centroided данни за всички проби бяха получени от 50 до 1200 Da, с 5-време за сканиране от 0,5 s за време за анализ от 10 минути . LockSpray TM беше използван за валидиране на прецизността на масата. Te [M–H]– йон на левцин енкефалин (200 pg·μL−1 инфузионен поток 10 μL min−1) при m/z 554,2615 се използва като заключваща маса. Софтуерът MassLynx V4.1 (Waters Co., Milford, USA) беше използван за точната маса, състава на прекурсорните йони и изчисляването на фрагментните йони.

Анализ на данни в платформата Masslynx

Освен това, вътрешна библиотека, включваща името на съединението, неговата структура и молекулната формула (в mol.) беше създадена въз основа на литературата. Всички съединения бяха отбелязани в специален шаблон, изработен в Excel. Освен това mol файловете (Chemdraw Ultra 8.0, Cam-bridge soft, САЩ) и Excel файловете на всички отделни съставни структури също бяха запазени на локалния компютър. Създаденият Excel лист с важни данни беше директно импортиран в научната библиотека в UNIFI

UNIFI 1.8.2, Waters, Манчестър, Обединеното кралство беше използван за оценка на структурните характеристики, особено за характерните фрагменти и фрагментацията на MS. Минимална пикова площ от 500 беше зададена за 2D пиково откриване. По време на разкриването на 3D пикове бяха избрани нисък енергиен пиков интензитет от повече от 300 отброявания и повишен енергиен пиков интензитет от повече от 80 отброявания. Установено е, че грешката на масата е до ±10 ppm за известни съединения, а толерансът на времето на задържане е зададен в диапазона от ±0,1 min. Избрахме отрицателните адукти, съдържащи -H, плюс HCOOH. Обработката на необработените данни, получени от MS, беше извършена чрез рационализиран софтуер UNIFI за бързо определяне на химическите компоненти, които отговарят на стандартите със самостоятелно изградената база данни и вътрешната библиотека за традиционна медицина.

След това, за да се провери химическата структура на всяко целево съединение, изомерите бяха разграничени чрез техните характерни MS фрагментационни модели, които бяха разкрити в докладваните проучвания, и чрез сравняване на времената на задържане на референтните стандарти.

Метаболомичен анализ, базиран на мултивариантен статистически анализ

Преди обработката на необработените данни параметрите бяха зададени, като маса, варираща от 150 до 1200 Da, диапазон на времето на задържане (0 до 20 минути), прагова интензивност ( 2000 преброявания), толерантност към масата, т.е. 5 MDA, докато масата и прозорецът на времето на задържане бяха съответно 0,20 минути и 0,05 Da. В следващия списък на базата данни идентификаторът на йони беше двойките RT-m/ по отношение на времето им на елуиране. Същите стойности за RT и m/z в различни партиди проби се считат за едно и също съединение.

Беше проведен многовариантен статистически анализ за оценка на ефективните биомаркери, които значително допринесоха за вариациите между различните групи. По време на анализа беше използван анализ на главните компоненти (PCA), за да се посочат максималните разлики и разпознаване на образи за получаване на преглед и класификация. OPLS-DA е инструмент за моделиране, който осигурява визуализация на зареждането на предсказуем компонент OPLS-DA, за да подпомогне оценката на модела. Променливата важност за проекцията (VIP) беше използвана за оценка на оценката на различни компоненти иметаболитиwith VIP values>1.0 и P-стойност<0.05 were="" regarded="" as="" effective="" markers.="" furthermore,="" a="" permutation="" test="" was="" conducted="" for="" providing="" reference="" distributions="" for="" the="" r²/o²values="" that="" could="" show="" the="" statistical="">

Експерименти с животни плъховете бяха произволно категоризирани в четири групи (n=6 за всяка група), последвани от перорално приложение на различни екстракти: (1) Празна контролна група: на плъховете беше даден нормален физиологичен разтвор (2 mL/100 g) ; (2) CD група: на плъховете е даден CD екстракт (2 mL/100 g); (3) CD-NP група: на плъховете е даден CD-NP екстракт (2 mL/100 g); (4) CD-HP група: на плъховете е даден CD-HP екстракт (2 mL/100 g). По-нататъшното категоризиране на всички групи беше извършено в три подгрупи съответно за плазма, урина и изпражнения. Два часа по-късно на всеки плъх се прилага перорално същото и равно количество екстракти.

След прилагане, събирането на кръвни проби се извършва на 1.0 h, 2.0 h и 4.0 h в хепаринизирани 1,5 mL полиетиленови епруветки (от орбитални вени) , последвано от центрофугиране (при 4500 rpm) на всички проби за 15 min.

За проби от урина и изпражнения, плъховете се държат в метаболитни клетки и след това събирането на проби от урина и изпражнения се извършва в продължение на 24 часа след прилагането. Центрофугирането на проби от урина се извършва при 4500 rpm за 15 минути, докато пробите от изпражненията се изсушават на сянка, смилат се на прах, след това се вземат 0,2 g и се добавят към 0,5 ml физиологичен разтвор разтвор, ултразвук за 5 минути и центрофугиран при 12,000 rpm за 15 минути. Всички биопроби бяха държани при -80 градуса до анализа.

Приготвяне на биологични проби. Добавянето на проби от плазма, урина и изпражнения се извършва с 3 обема метанол, последвано от завихряне за 3 минути. След това се извършва центрофугиране (при 12, 000 rpm) на смесите за 10 минути, последвано от прехвърляне на супернатанта в EP епруветката и след това се изсушава с азот при 37 градуса. Освен това беше извършено добавяне на 200 μL разтвор на HCN–H2O (50%). Десето, вортексът се използва за смесване (1 минута), последвано от центрофугиране (при 12,000 rpm) за 5 минути. Супернатантът (5 μL) от третираните проби се инжектира в системата UPLC-Q-TOF-MSE.

Течно хроматографско и масспектрометрично състояние Анализът заметаболитисъщо беше извършено от инструмента Waters UPLC чрез ESI интерфейс. Разделянето се извършва с помощта на колона Acquity UPLC HSS T3 (100 mm × 2,1 mm, 1,8 µm), подвижната фаза е 0,1 процента мравчена киселина (A): ацетонитрил (B), условието на градиентно елуиране беше 0-3 min (99,8 процента → 98 процента A).3-5 min (98 процента → 95 процента A), 5-8 min (95 процента → 90 процента A), { {18}} min (90 процента → 85 процента A), 12-17 min (85 процента → 70 процента A), 17-22 min (70 процента → 60 процента A), 22-23 min (60 процента → 58 процента A), 23-25 min (58 процента A), 25-32 min (58 процента → 45 процента A) и 32-37 min (45 процента → 35 процента A ),0,4 mL min-1 беше скоростта на потока. Температурата за колоната и помещението за проби беше зададена съответно на 40 градуса и 8 градуса. Използвани са масспектрометричните условия, споменати по-горе.

Стратегия за систематичен анализ на метаболити в био-проби За обработка на данни беше използван софтуер UNIFI (1.8.2). Функцията Binary Compare се използва за идентифициране на ефективните метаболити. Оценените метаболити не съществуват в еквивалентната контролна проба или съществуват при нисък йонен интензитет. Относителният праг на интензитет беше зададен на 3 или 5 и метаболитите, които отговаряха на подчертаните критерии, можеха да бъдат оценени. Общите и предвидими метаболити след това се определят от EIC. За търсене на двуфазни метаболити беше приложена функцията NLF. Например, в софтуера UNIFI, параметрите могат да бъдат зададени на 176.0321 за търсене на възможни конюгати на глюкуронова киселина. След обработката може да се зададе неутрална загуба в метода или да се идентифицира. MassFragment се използва за определяне или характеризиране на структурите на откритите метаболити, функцията за спектрална интерпретация на UNIFI е основната функция, използвана за анализ на вторичната фрагментация на родителските компоненти. Тази функция може да се използва за бърза проверка на пътя на фрагментиране дали е разумен.

Резултати

Правило за масово фрагментиране на фенилетаноидни гликозиди и иридоиди

Фенилетаноидните гликозиди са основните химични съставки на CD. Стандартните разтвори на изоактеозид,

цистанозид F, тубулозид А, ехинакозид, актеозид и 2'-ацетил-актеозид бяха взети, последвани от осигуряване на различно ниво на енергии на сблъсък (Таблица 1) и след това бяха получени съответните MS2 карти (Фиг. 1).

Масспектрометричният анализ разкри, че фенилетаноидните гликозиди имат сходни модели на фрагментиране на масовия спектър, пътищата на разцепване в режим на отрицателни йони включват главно (1) разцепване на естерна връзка: загуба на неутрална кафеоилова група (C, H, O162.03) и неутрален ацетил група (C, H, O, 42.00); (2) Гликозидно разцепване: загуба на неутрални рамнозни остатъци (C.HIO, 146.05) и неутрален глюкозен остатък (CgHO, 162.05). От масспектрометрия с висока разделителна способност могат да се разграничат кафеоил (162.03) и глюкозен остатък (162.05).

Бяха взети стандартни разтвори на иридоиди аджугол, каталпол, генипозидова киселина, генипозид и 8-епидоксилоганова киселина, последвано от предоставяне на различни енергии на сблъсък и бяха получени съответните MS'карти (фиг. 2).

Иридоидните гликозиди имат подобни модели на фрагментиране на масовия спектър, пътищата на разцепване в режим на отрицателни йони включват главно (1) Гликозидно разцепване: Загуба на неутрален глюкозен остатък (CHoO, 162.05); (2) Загуба на неутрален CO, (43.99) и H , O(18.01).

Идентифициране на съединенията в CD, CD-NP и CD-HP екстракти

UPLC-QTOF-MSE анализ

Извършена е оптимизация на хроматографските условия. След това съединенията на CistancheHerba бяха оценени както в отрицателни, така и в положителни йонни режими с високи, както и ниски CE. Получените резултати показват, че съвместимостта на отрицателния режим е по-висока спрямо положителния режим за тези съединения. Фигура 3 показва хроматограма на йони с основен пик на MS (BPI), проследена с номерирани пикове. Интензитетът на всеки открит йон в анализа на UPLC-Q-TOF-MS беше нормализиран по отношение на целия брой йони за генериране на матрица с данни, която се състои от m/z стойност, нормализираната площ на пика и време на задържане.

Оценката на компоненти от CD и преработените продукти на платформата UNIFl

Общо 97 съединения бяха идентифицирани с -SEM (n=6) режим от CD и неговия преработен продукт (Таблица 2), включително фенилетаноидни гликозиди (PhGs), иридоиди, лигнани и олигозахариди. Компонентите 95, 91 и 94 бяха открити съответно в CD, CD-NP и CD-HP. Сред тях 64 са фенилетаноиди, 13 са иридоиди и са определени 20 други вида съединения. Имаше сходство в химичния състав на CD и неговия преработен продукт, но количеството на компонентите се оказа различно между CD и неговия преработен продукт.

Вариации в химическите компоненти на преработените продукти Софтуерът Simca-P 13.0 беше използван за анализиране на многовариантната матрица с данни. Преди PCA всички променливи бяха средно центрирани и скалирани по Парето, последвани от идентифициране на потенциални дискриминантни променливи. В диаграма на PCA резултат всяка точка показва индивидуална проба. Пробите, които показват сходство в техните химически компоненти, са разпръснати една до друга, докато тези, които показват вариации в техните компоненти, са разделени. Както се вижда в PCA (фиг. 4), групата на CD-HP беше отделена от групите на CD и CD-NP.

To distinguish CD from CD-HP and CD-NP, OPLS-DA, permutation test, S-plot, and VIP value were developed. (Figs.5, 6,7)The obtained results revealed that many components were key characteristic components of each product. The screening condition was the VIP>1 и П<0.05. from="" the="" date="" of="" the="" s-plot,="" the="" characteristic="" components="" were="" evaluated,="" which="" were="" commonly="" existing="" in="" the="" three="">

От фиг. 8 открихме интензитета на актеозид (54), цистанозид С (74), кампнеозид I (43), османтузид (75) и 2'-актилактеозид (80), имащи 4'-О-кафеоилна група в 8-O- -D-глюкопиранозилната част (виж Фиг. 9) намалява след обработка с оризово вино, докато интензитетът на изоацетозид (60) е кастанозид (71), изо-кампнеозид I (69), изомартинозид (86), имащ 6'-O-кафеоилна група (виж Фиг. 9), повишен, особено за CD-NP групата. Въпреки че тубулозид B (72) има 6'-O-кафеоилова група, същата като изоактеозида, интензитетът намалява поради неговата 2'-ацетилова група. Интензитетът на ехинакозид (38) и цистанозид В, имащ 6'-O- -D-глюкопиранозилни остатъчни групи, се увеличи, но интензитетът на тубулозид А (55) намаля също поради неговата 2'-ацетилова група.

Нашият изследователски екип също проучи термичната стабилност на актеозид и изоактеозид и установи, че актеозидът е нестабилен във вода, метанол и разтвор на жълто оризово вино и може да се превърне в изоактеозид отчасти при условия на нагряване. Но термостабилността на изоактеозида е по-добра, особено в разтвор на жълто оризово вино. Фигура 10 показва възможните промени на PhG в CD по време на обработката:

Идентифициране на метаболитите при плъхове От масспектрометрични данни с висока разделителна способност бяха анализирани и сравнени точното молекулно тегло и елементен състав за метаболити и протомолекулни съединения. Тъй като едни и същи видове съединения в TCM показват сходство в метаболитните модификации, корелациите на фитохимичните съставки in vitro могат да се разширят до техните метаболити in vivo. Междувременно, въз основа на конвенционалните пътища на биотрансформация, беше направен извод за разумна промяна на молекулното тегло. Накрая, метаболитите бяха идентифицирани чрез анализиране на MSE масспектърите на метаболитите и пътя на фрагментация на прото-съединенията в масспектъра [21, 22]. В сравнение с празната проба, нейните компоненти бяха идентифицирани in vivo въз основа на информацията, предоставена от хроматограмния масспектър, възможността за метаболитна реакция, характеристиките на структурата на съединението и правилото за фрагментиране на неговия масспектър. Вижте таблица 3.

Идентифициране на метаболити, свързани с фенилетанол гликозиди

За обработка е използвана платформа UNIFI. Фигура 11 показва TIC хроматография на урина, изпражнения и плазма за CD и нейните преработени продукти. В сравнение с празните проби, общо 54 метаболита са идентифицирани при плъхове, включително 10 прототипни компонента и 44 метаболита, в които 24, 49 и 6 са съответно във фекалиите, урината и плазмата.

Въз основа на точна маса, каскада на фрагментация и предвидими неутрални загуби чрез биотрансформация, общо 35 метаболита, свързани с фенилетаноидни гликозиди, бяха ориентировъчно оценени. Свързаните метаболити на фенилетаноидни гликозиди имат подобни модели на фрагментиране на масовия спектър, като типичния декафеоилов фрагмент m/z 461.1605, след което се хидролизира допълнително чрез гликозидни и естерни връзки in vivo и се метаболизира в хидрокситирозол (HT)(m/ z153.0504, C.HO.4.73 min) и кафеена киселина (CA) (m/z179.0389, CH, 0.77 min), виж Фиг. 12A.

M11 посочено [MH]~ при m/ 153.0504 с формула т.е., C.HO, и идентифицирано като НТ. M16 представя [MH]- при m/z 329,0851, което е със 176 Da повишено от това на HT, разкривайки, че може да е глюкурониран метаболит на HT. [MH]- на M26 беше при m/z 343.1037,14 Da по-висок от този на HT-глюкуронид. Следователно, M26 беше идентифициран като НТ-метилиран глюкуронид. M17 беше идентифициран като HT-сулфат въз основа на неговия [MH]- при m/z 233.0112,80 Da над HT, който можеше да бъде допълнително метилиран, след което се получи M22, който показа m/z 247.0278, което показва, че е HT- метилиран сулфатиран метаболит. M7 (m/167.0335) и M5 (m/z 167.0762) се разглеждат съответно като продукти на окисление и метилиран НТ (фиг. 12B).

M1 показва [MH]- при m/z 179.0389, изяснената молекулна формула е CH-O и идентифицирана като кафеена киселина (CA). M25 разкрива [MH]- при m/355.0704, които са 176 Da повишени от тези на CA, показва че може да е глюкурониран метаболит на CA. M27 имаше m/z 258,994, което беше с 80 Da по-високо от това на CA, така че го изяснихме като CA сулфат и можеше да произведе M35 (m/z 273,0064). Тъй като M4 дава [MH]7 при m/z 193.0524,14 Da по-висок от CA, той беше идентифициран като CA метилиран метаболит. M39 е метаболит на дехидроксилиране на CA с m/z 163,04 и може да бъде сулфатиран в M32 (m/z 242,9951).

M33(m/z 181.0491, C.HO,9.06 min) е продуктът на редукция на CA, тоест 3,4-дихидрокси-бензенпропионова киселина, която може да бъде метилирана в M19 (m /z 195.0623, C10H12O4, 0.93 min). M33 може да се дехидратира в M43, което е 3-HPP (m/z 165.0558, C9H10O3, 11.29 минути), и M31 (m/z 341.0942, C15H17O9, 8.90 минути) и M29 (m/z 245.0125, C9H10O6S, 8.52 min) бяха глюкуронираните и сулфатираните продукти (Фиг. 12C).

За метаболитите, свързани с фенилетаноидни гликозиди, ключовите метаболитни каскади са фаза II метаболитни реакции, т.е. глюкурониране, метилиране и сулфатиране. Предложените метаболитни каскади на фенилетаноиди са изобразени на Фиг. 13.

Идентифициране на метаболити, свързани с иридоиди

Чрез анализиране на елементарния състав на метаболитите, фрагментацията на MSE и свързаната литература, общо 19 метаболита, свързани с иридоиди, бяха ориентировъчно оценени. Иридоидните гликозиди се хидролизират чрез гликозидни връзки, за да се образуват съответните им агликони. m/z 185.117 е за M8, 162 Da по-малко от ajugol, което се получава от загубата на глюкозен остатък.

M40 (m/z 199.0641, Rt 10.91 минути) е дегликозилиран продукт на каталпол. M45 m/z 169.0487, Rt 12.15 min) е по-малко от 30 Da на дегликозилиран метаболит на каталпол и е идентифицирано като отстраняване на молекула на метаболит CH, O. M34 (m/z 151.0352, Rt 9.08 минути), е допълнителна загуба на Н, О метаболит.

M44 (m/z 211.0665, Rt 11.31 min) е дегликозилиран метаболит на генипозид, а M37 (m/z 197.0833, Rt 15.03 min) е дегликозилиране на 8-епидеоксилоганова киселина. Метаболитните реакции за иридоиди могат да бъдат разкрити като метаболизъм на фаза I на дегликозилиране (фиг. 12D).

Сравнение на метаболитното профилиране в плазмата, урината и изпражненията между CD и неговите преработени продукти

Бяха сравнени 2 прототипа в плазма, 7 в урина и 3 в изпражнения. Имаше 7 прототипа, абсорбирани в CD, 7 прототипа, абсорбирани в CD-NP, и 8 прототипа в CD-HP. M21 беше открит само в групата на изпражненията на CD-NP, а M38 и M51 бяха открити само в групите с урина на CD-HP. В сравнение с метаболитите, идентичните метаболити в плазмата, урината и изпражненията са съответно 4, 42 и 21. Имаше 34 метаболита, абсорбирани в CD групата, 39 в CD-NP и 40 в CD-HP групата. M5, M7, M40 и M52 бяха открити само в CD-NP групи, докато M24, M4l и M48 бяха открити само в CD-HP групи.

Наблюдавани са вариации в абсорбцията, както и в метаболизма на активните съединения в различни преработени продукти на CD. От Фиг.14 открихме, че интензитетът на HT-сулфатната конюгация (M17) е най-висока в урината, последвана от 3-HPP сулфатна конюгация (M29), метилирана HT сулфатна конюгация (M22), дехидроксилиран CA сулфат конюгиране (M32) и 3,4-дихидрокси бензен пропионова киселина сулфатно конюгиране (M19). Съдържанието на метаболитни продукти в обработената група е по-високо, отколкото в CD групата, особено за M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2. Техният прекурсор 6'-O-кафеоилова група в 8-O- -D-глюкопиранозилната част, съединения като хидрокситирозол имат противотуморни, противовъзпалителни, антибактериални, антивирусни и противогъбични свойства [ 23]. Кафеената киселина притежава противовъзпалителни, противоракови и антивирусни действия [24]. Това беше в съответствие с клиничната употреба на CD и неговите преработени продукти.

Дискусия

CD е TCM и основните му биоактивни компоненти, включително PhG, иридоиди, полизахариди са документирани от различни изследвания. В клиничната практика на TCM преработените продукти на CD са широко използвани в сравнение със суровите. Химическият състав ще бъде променен по време на обработката, което може да доведе до промени в лечебните ефекти (фиг. 14).

PhG са вид фенолно съединение, характеризиращо се с -глюкопиранозидна структура, носеща хидрокси-фенилетилова част като агликон. Тези съединения често съдържат кафеена киселина и рамноза, прикрепени към глюкозния остатък чрез естерни или съответно гликозидни връзки. В настоящото проучване качествените анализи на CD, CD-NP. и CD-HP бяха проведени и бяха идентифицирани общо 97 съединения, включително фенилетаноидни гликозиди (PhGs), иридоиди и др. Получените резултати показват вариации в химическия състав преди и след обработката. Интензитетът на PhG с 4'-O-кафеоилна група в 8-O- -D-глюкопиранозилната част, като актеозид, цистанозид С, кампнеозид II, страна на османтус, намалява след обработката, докато PhGs с

като изоацетозид, изоцистанозид, изокампнеозид I, изомартинозид повишени, особено в групата на CD-NP. Интензитетът на ехинакозид и цистанозид В, чиято структура притежава 6'-O- -D-глюкопиранозилна част също се увеличава. PhG, имащи 2'-ацетилова група, често намаляват поради реакция на хидролиза по време на процеса, като тубулозид В, 2-ацетилактеозид.

Изследването на метаболитите, абсорбирани in vivo, е проведено след перорално приложение на CD и неговите преработени продукти. Метаболитните процеси на фаза II бяха ключовите каскади и повечето от метаболитите бяха сулфат, глюкуронид и метилирани конюгати. Фенилетанол гликозидите имат ниска орална абсорбция и използване. Те трудно се абсорбират в кръвта и действат като предшественици, за да играят своите роли след метаболитно активиране in vivo. Фенилетаноиди, произведени във фенилета-нолагликон, като хидрокситирозол (HT) и кафеена киселина (CA) и нейното производно 3-хидроксифенилпропионова киселина (3-HPP), тези метаболити могат да се абсорбират по-лесно в плазмата и да имат по-добър лечебен ефект.

CD и неговите преработени продукти. HT-сулфатната конюгация (M17) има най-висок интензитет в урината, следвана от 3-HPP сулфатна конюгация (M29), метилирана HT сулфатна конюгация (M22), дехидроксилирана CA сулфатна конюгация (M32) и 3,{{ 7}}дихидрокси бензенпропионова киселина сулфатно конюгиране (M19). Съдържанието на метаболитни продукти в обработената група е по-високо, отколкото в CD групата, особено за M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2.

Като цяло компонентите с висока експозиция в целевите органи могат да бъдат ефективни. Достатъчно количество фенилетаноиди и техните производни са оценени и определени in vitro. Актеозидът е характерното съединение, чието съдържание намалява след обработка с оризово вино, а съдържанието на изоактеозид, изоцистанозид С, изокампнеозид I се повишава съответно. Продуктите на разграждане на PhGs, като производни на CA и HT, могат да бъдат оценени в био-пробите, а обработката на оризово вино може да подобри абсорбцията на метаболитите in vivo.

Заключение

В това проучване са открити 97 съединения в екстрактите от CD и неговия преработен продукт. Разграждането на няколко гликозида става при повишена температура и в резултат на това се синтезират някои нови изомери и комплекси. При in vivo проучване прототипните компоненти (10) и метаболитите (44) са определени или условно оценени в плазма, изпражнения и урина на плъхове. Фаза II метаболитни процеси бяха ключовите каскади, повечето от метаболитите бяха свързани с ехинакозид или актеозид, като HT, CA и техните производни 3-хидроксифенилпропионова киселина 3-HPP. Тези метаболити могат да се абсорбират по-лесно в плазмата и да имат по-добър лечебен ефект. Получените резултати показват, че химичният състав на CD е различен и влияе върху разположението на съединението in vitro и in vivo.

Съкращения

PhGs: Фенилетаноидни гликозиди; CD: Cistanche deserticola; CMM: китайски Materia Medica; TCM: традиционна китайска медицина; CD-NP: Gistanche deserticola Обработено чрез задушаване с оризово вино при нормално налягане; CD-HP: Cistanche deserticola Обработено чрез пара с оризово вино под високо налягане; UPLC-Q-TOF-MS: Течна хроматография със свръхвисока ефективност, съчетана с TOF-MS; PCA: Анализ на основните компоненти; VIP: Променливо значение за проекцията; CA: Caffeicacid; HA: Хидрокситирозол.

Благодарности

Не е приложимо.

Авторски принос

LZ, LBN, SJ участваха в изготвянето, писането на ръкописа. RJ, LPP подпомогнаха експериментите с животни и изготвиха и финализираха всички фигури и таблици. ZC, HY. ITZ помогна с дизайна и изпълнението на това проучване и прегледа ръкописа. Всички автори прочетоха и одобриха окончателния ръкопис.

Финансиране

Тази работа беше подкрепена от Националната природонаучна фондация на Китай (Грант №: 81874345) и Природонаучната фондация на провинция Ляонин (Грант №: 2020-MS-223).

Наличие на данни и материали

Наборите от данни, използвани и/или анализирани по време на настоящото проучване, са достъпни от съответния автор при разумно искане.

Декларации

Етично одобрение и съгласие за участие

Етичното одобрение за използване на експериментални животни за това проучване е получено от Комитета по медицинска етика към Университета за традиционна китайска медицина в Ляонин (Номер на одобрението: 2018YS(DW)-044-01). Всички експериментални процедури в това проучване са подчинени на етичните стандарти на комисията по медицинска етика към Университета по традиционна китайска медицина в Ляонин.

Съгласие за публикуване

Не е приложимо.

Конкуриращи се интереси

Авторите декларират, че нямат конфликт на интереси за разкриване.

Подробности за автора

„Фармацевтичен отдел, Университет за традиционна китайска медицина в Ляонин, Далиан, Ляонин, Китай.“ Изследователски институт за лекарства на Monos Group, Улан Батор 14250, Монголия.

Получено: 31 май 2021 г. Прието: 17 септември 2021 г. Публикувано онлайн: 28 септември 2021 г.

Zhe Li1, Lkhaasuren Ryenchindorj2, Bonan Liu1, Ji Shi1*, Chao Zhang1, Yue Hua1, Pengpeng Liu1, Guoshun Shan1 и Tianzhu Jia1

Препратки

1. Китайска фармакопейна комисия. Фармакопея на Китайската народна република, том. I. Пекин: China Medical Science Press; 2020. стр. 140.
2. Li Z, Lin H, Gu L, Gao J, Tzeng CM. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): един от най-добрите фармацевтични дарове на традиционната китайска медицина. Front Pharmacol. 2016; 7:41.
3. Liu BN, Shi J, Zhang C, Li Z, Hua Y, Liu PP, Jia TZ. Ефекти от различни методи за обработка на сушене за Fresh Cistanche deserticola върху съдържанието на неговите компоненти. J Chin Med Mater. 2020; 10: 2414–8.
4. Liu BN, Shi J, Jia TZ, Lv TT, Li Z. Оптимизиране на процеса на пара под високо налягане за Cistanches Herba. Chin Trad Patent Med. 2019; 11: 2576-80.
5. Fan YN, Huang YQ, Jia TZ, Wang J, La-Sika, Shi J. Ефекти на Cistanches herba преди и след обработка върху функцията против стареене и имунната функция на стареещи плъхове, индуцирани от D-галактоза. Chin Arch Trad Chin Med, 2017; 11:2882-2885.
6. Гао YJ, Jiang Y, Dai F, Han ZL, Liu HY, Bao Z, Zhang TM, Tu PF. Проучване на слабителни съставки в Cistanche deserticola YMCA. Modern Chin Med. 2015; 17 (4): 307–10.
7. Liu BN, Shi J, Li Z, Zhang C, Liu P, Yao W, Jia T. Проучване на невроендокринно-имунната функция на Cistanche deserticola и неговите продукти от оризово вино на пара в модел на плъх, индуциран от глюкокортикоиди. Базирано на доказателства допълнение Alternat Med. 2020;22:5321976.
8. Guo Y, Wang L, Li Q, Zhao C, He P, Ma X. Подобряване на функцията за укрепване на бъбреците в миши модел от Cistanches herba, изсушен бързо при средно висока температура. J Med Food. 2019; 22 (12): 1246–53.
9. Wang T, Zhang X, Xie W. Cistanche deserticola YC Ma, „Пустинен женшен“: преглед. Am J Chin Med. 2012; 40 (6): 1123–41.
10. Fu Z, Fan X, Wang X, Gao X. Cistanches Herba: Общ преглед на неговите химични, фармакологични и фармакокинетични свойства. J Ethnopharmacol col. 2018; 219: 233–47.
11. Lei H, Wang X, Zhang Y, Cheng T, Mi R, Xu X, Zu X, Zhang W. Herba Cistanche (Rou Cong Rong): преглед на неговата фитохимия и фармакология. Chem Pharm Bull. 2020; 68 (8): 694–712.
12. Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Невропротективни ефекти на ехинакозид в миши MPTP модел на болестта на Паркинсон. Eur J Pharmacol. 2007; 564: 66-74.

13. Deng M, Zhao JY, Ju XD, Tu PF, Jiang Y, Li ZB. Защитен ефект на тубулозид В върху TNF алфа-индуцирана апоптоза в невронни клетки. Acta Pharmacol Sin. 2004; 25 (10): 1276–84.
14. Nan ZD, Zhao MB, Zeng KW, Tian SH, Wang WN, Jiang Y, Tu PF. Противовъзпалителни иридоиди от стъблата на Cistanche deserticola, култивирани в пустинята Тарим. Chin J Nat Med. 2016; 14 (1): 61–5.
15. Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y, Tu PF. Фенилетаноидни гликозиди с противовъзпалителни действия от стъблата на Cistanche deserticola, култивирани в пустинята Тарим. Фитотерапия. 2013; 89: 167–74.
16. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, Yoshikawa M, Hayakawa T, Muraoka O. Иридоидни и ациклични монотерпенови гликозиди, канканозиди L, M, N, O и P от Cistanche tubulosa. Chem Pharm Bull. 2010; 58 (10): 1403–7.
17. Li SL, Song JZ, Qiao CF и др. Нова стратегия за бързо изследване на потенциални химични маркери за разграничаване между сурови и обработени Radix Rehmanniae чрез UHPLC-TOF-MS с мултивариантен статистически анализ. J Pharm Biomed Anal. 2010; 51 (4): 812–23.
18. Peng F, Chen J, Wang X, Xu CQ, Liu TN, Xu R. Промени в нивата на фенилетаноидни гликозиди, антиоксидантна активност и други качествени характеристики в резени Cistanche deserticola чрез обработка с пара. Chem Pharm Bull. 2016; 64: 1024-30.
19. Ma ZG, Tan YX. Промени в съдържанието на шест фенилетаноидни гликозида при варене на пара с вино в Desertliving Cistanche. Chin Trad Pat ent Med. 2011; 33 (11): 1951–4.
20. Peng F, Xu R, Wang X, Xu C, Liu T, Chen J. Ефект от процеса на пара върху качеството на Cistanche deserticola след прибиране на реколтата за медицинска употреба по време на сушене на слънце. Biol Pharm Bull. 2016; 39 (12): 2066–70.
21. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. Метаболити на диетичен актеозид: профили, изолиране, идентификация и хепатопротективни способности. J Agric Food Chem. 2018; 66 (11): 2660–8.
22. Cui Q, Pan Y, Bai X, Zhang W, Chen L, Liu X. Систематично характеризиране на метаболитите на ехинакозид и актеозид от Cistanche tubulosa в плазма, жлъчка, урина и изпражнения на плъхове на базата на UPLC-ESI-Q-TOF -ГОСПОЖИЦА. Biomed Chromatogr. 2016; 30 (9): 1406–15.
23. Bertelli M, Kiani AK, Paolacci S, Manara E, Kurti D, Dhuli K, Bushati V, Miertus J, Pangallo D, Baglivo M, Beccari T, Michelini S. Хидрокситирозол: естествено съединение с обещаваща фармакологична активност. J Biotechnol. 2020; 309: 29-33.
24. Touaibia M, Jean-François J, Doiron J. Cafeic Acid, универсален фармакофор: преглед. Mini Rev Med Chem. 2011; 11 (8): 695–713.

Бележка на издателя

Springer Nature остава неутрален по отношение на претенции за юрисдикция в публикувани карти и институционални връзки.