Достъпност на хроматин и експресия на микроРНК в нефронови прогениторни клетки по време на развитие на бъбреците

За повече информация:ali.ma@wecistanche.com

Андрю Клъгстън^1,2,3, Андрю Боднар^2,3, Débora Malta Cerqueira^2,3, Ю Ленг Фуа^2,5,6, Алиса Лоулър^8,9,10, Кристи Богс⁷, Андреас Пфенинг^8,10, Жаклин Хо^2,3*и Денис Костка^1,4*

¹Катедра по биология на развитието, Медицински факултет на Университета на Питсбърг, Питсбърг, Пенсилвания, САЩ²Изследователски център Rangos, Детска болница UPMC в Питсбърг, Питсбърг, Пенсилвания, САЩ³Катедра по педиатрия, Отдел по нефрология, Медицински факултет на Университета в Питсбърг, Пенсилвания, САЩ⁴Катедра по компютърна и системна биология и Питсбъргски център за еволюционна биология и медицина, Медицински факултет на Университета на Питсбърг, Питсбърг, Пенсилвания, САЩ⁵Отдел по генетична и геномна медицина, Департамент по педиатрия, Детска болница UPMC в Питсбърг, Питсбърг, Пенсилвания, САЩ⁶Катедра по патология, Лаборатория по клинична биохимична генетика, Детска болница UPMC в Питсбърг, Питсбърг, Пенсилвания, САЩ⁷Катедра по педиатрия, Отдел по гастроентерология, хепатология и хранене, Медицински факултет на Университета на Питсбърг, Питсбърг, Пенсилвания, САЩ.⁸компютърна биология,⁹Биологични науки и¹⁰Институт по невронауки, Университет Карнеги Мелън, Питсбърг, Пенсилвания, САЩ

Резюме

Нефроните на бозайниците произхождат от популация нанефронни прогениторни клеткии промените в транскриптомите на тези клетки допринасят за спирането на нефрогенезата, важен фактор, определящ броя на нефроните. За да характеризираме експресията на микроРНК (miRNA) и да идентифицираме предполагаеми цис-регулаторни региони, ние събрахме нефронни прогениторни клетки от мишкабъбрецина ембрионален ден 14.5 и постнатален ден нула и анализирана експресия на малка РНК и достъпен за транспозаза хроматин. Открихме експресия на 1104 miRNA (114 с промени в експресията) и 46 374 достъпни области на хроматин (2103 с недостъпност на промените). В целия геном нашите данни подчертават процеси като клетъчна диференциация, клетъчна миграция, взаимодействия на извънклетъчната матрица и сигнални пътища за развитие. Освен това, те идентифицират нови кандидат-цис-регулаторни елементи за Eya1 и Pax8, и двата гена с роля в диференциацията на нефронните прогениторни клетки. И накрая, ние свързваме миРНК, променящи експресията, включително let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p и miR{{ 20}}p, с кандидат цис-регулаторни елементи и целеви гени. Тези анализи подчертават нови предполагаеми цис-регулаторни локуси за miRNA в прогениторите на нефрона.

Въведение

Функционалната единица набъбреке нефронът, който служи за филтриране на отпадъците и поддържане на нормална хомеостаза на вода, киселинна основа и електролити в тялото. Броят на нефроните варира в широки граници при хората (обикновено между двеста хиляди и повече от един милион нефрони (Hughson et al., 2003)) и се установява преди раждането при хората (приблизително следродилния ден 2-3 при мишки (Hartman et al. ., 2007 г.; Хинчлиф и др., 1991 г.)). Нефроните не могат да се регенерират след раждането и намаленото натрупване на нефрони е свързано с повишен риск от хронично бъбречно заболяване и хипертония (Bertram et al., 2011). Броят на нефроните от своя страна до голяма степен се определя от популация от клетки, нареченинефронни прогениторни клетки(Cebrian et al., 2014b). В последните етапи набъбрекразвитие, нефронните прогенитори увеличават своята склонност към диференциация, което постепенно изчерпва тяхната популация и бележи евентуалното спиране на нефрогенезата (Hartman et al., 2007; Rumballe et al., 2011; Volovelsky et al., 2018). Разбирането на механизмите, които регулират спирането на нефрогенезата, има значителни последици за определянето на наличността на нефрони и риска от последващо бъбречно заболяване.

По време набъбрекразвитие, самообновяващи се Cited1 плюс /Six2 плюс нефронни прогенитори се индуцират да станат първични Cited{3}}/Six2 плюс прогенитори и впоследствие да се диференцират в Wnt4-експресиращи бъбречни везикули в отговор на Wnt9b/-катенин (McMahon и др., 2016; Rumballe и др., 2011). Вътрешните транскрипционни промени в ранните спрямо късните нефронови предшественици включват гени и пътища, които влияят върху стареенето на стволовите клетки, по-специално mTor и неговия репресор хамартин (S. Chen et al., 2015; Volovelsky et al., 2018). Наистина се смята, че хамартин десенсибилизира нефронните прогенитори към сигнали за самообновяване и по този начин допринася за спирането на нефрогенезата (S. Chen et al., 2015). В съответствие с идеята, че ранните нефронови прогенитори имат по-голяма склонност към самообновяване, е наблюдението, че достъпността на хроматина е обогатена за местата на свързване на основните транскрипционни фактори на нефронните прогениторни клетки, включително Six2 и Wt1 в сравнение с късните нефронни прогенитори (Hilliard et al. , 2019). Доказано е, че тези транскрипционни фактори свързват усилващи последователности, разположени в "регулаторни горещи точки" в генома (O'Brien et al., 2018). Индукцията на нефронови прогенитори възниква поради повишаване на нивата на -катенин, което води до активиране на Lef1/Tcf7 комплекси в гени, готови за активиране на програмата за нефрогенеза (Park et al., 2012), и се предполага, че се комплексират с Tcf7l1 и Tcf7l2 за установяване и поддържане на регулаторни хроматинови бримки, които улесняват генното активиране (Guo et al., 2021).

Кликнете, за даCistanche tubulosa на прах за лечение на бъбречни заболявания

Последните проучвания показват, че микроРНК (miRNA) регулират спирането на нефрогенезата. miPHK са къси, некодиращи РНК молекули, които са насочени към информационни РНК транскрипти (mRNA) за намалена транслация или засилено разграждане чрез РНК-индуцирания заглушаващ комплекс (RISC) (Bartel, 2009). Протеинът Lin28b е известен репресор на let-7семейството на miRNAs (Heo et al., 2008). Експресията на Lin28b намалява в прогениторите на нефрона, докато протича нефрогенезата, и това съвпада с увеличаването на експресията на let-7 miRNA семейството (Yermalovich et al., 2019). Освен това, условната индукция на експресия на Lin28b в Wt1-линията води до потискане на let-7 miRNA, което е достатъчно за удължаване на нефрогенезата (Yermalovich et al., 2019). Не е известно дали други miPHK регулират времето на нефрогенезата. В допълнение, докато са идентифицирани подобрители, които регулират експресията на дълга некодираща РНК по време на нефрогенезата (Nishikawa et al., 2019), не е доказано, че нито един от тях регулира експресията на miPHK в прогенитори на нефрон.

В това проучване се опитахме едновременно да идентифицираме нова miRNA, която допринася за прекратяването на нефрогенезата, заедно с потенциални цис-регулаторни характеристики. Следователно, за да наблюдаваме промените в експресията на miRNA и достъпността на хроматина между ембрионален ден 14.5 (E14.5) и постнатален ден нула (P0), ние създадохме съвпадащи набори от данни mRNA-seq и ATAC-seq от първични и непасиранинефронни прогениторни клеткив тези двувременни точки. Идентифицирахме 114 miPHK, които са различно експресирани внефронни прогениторни клеткимежду тези две времеви точки, както и 2103 региона на променяща се достъпност на хроматина, които наричаме диференциално достъпни региони (DAR). Анализите на обогатяване на прогнозираните генни мишени на значително променяща се miRNA, както и сред геномните местоположения на DARs, включват пътища, които засягат диференциацията на епителните клетки, клетъчната миграция, взаимодействията на извънклетъчната матрица и ключовите сигнални пътища за развитие като Wnt, Notch и TGF-сигнализация . Ние наблюдаваме значителни промени в достъпността в хроматина и представяме множество линии от доказателства, включващи два геномни региона като предполагаеми подобрители за гените Eya1 и Pax8 в нефронните прогениторни клетки. И накрая, идентифицирахме постоянна достъпност на хроматина и промени в експресията на miRNA за 33 двойки miPHK и DAR, включително let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a{ {11}}p и miR-9-3p и представят предполагаеми целеви гени, експресирани в нефронни прогенитори за диференциално експресирани miPHK.

Резултати

Изолиране на популации на нефронни прогениторни клетки от E14.5 и P0бъбреци

Нефронови прогениторни клеткибяха изолирани чрез положителна селекция за Itg 8 при E14.5 или при P0 и всяка проба беше разделена за извършване на mRNA-seq, ATAC-seq и контрол на качеството (допълнителна фигура 1 AB). Количествената PCR (qRT-PCR) потвърди, че маркерните гени на нефрон прогенитор Six2 и Cited1 (Huang et al., 2016) са силно експресирани в изолирани проби от нефрон прогенитор спрямо цялотобъбрек, повече от маркери за други видове клетки (включително уретерна пъпка (Caleb) (Cebrian et al., 2{{10}}14a), ендотелни клетки (Pecan) (Kobayashi et al., 2008), бъбречна строма (Pdgfr ) (S. Chen et al., 2015) и бъбречна везикула (Lhx1) (Brunskill et al., 2014) (допълнителна фигура 1 C). По отношение на пола, котилото, използвано за E14.5 проби, варира от 27 процента до 50 процента женски, а котилата за проби P0 варираха от 31 процента до 75 процента женски.Средно пробите E14.5 бяха 38 процента женски, а пробите P0 бяха 49 процента женски (допълнителна фигура 1 D). Те внимателно остаряват -съвпадащи популации на нефронни прогениторни клетки ни позволиха да анализирамедостъпност на хроматинаи експресия на малка РНК в същите етапи на развитие в две времеви точки (E14.5 и P0).

Ранните и късните нефронови прогенитори имат различни miRNA транскрипционни профили

Секвенирането на малка РНК откри 1,104 известни миРНК транскрипта и идентифицира 114 miРНК, които показват значителна промяна в експресията между E14.5 и P{{10}} проби (степен на фалшиво откриване ( FDR)=0.05; Допълнителна таблица 1). Половината от диференциално експресираните miRNAs показват повишена експресия при P0 в сравнение с E14.5, а анализът на главния компонент подчертава по-голяма хомогенност в експресията на miRNA сред E14.5 пробите в сравнение с P0 (Фигура 1A). Йерархичното групиране разкрива ясно групиране на miPHK в тези с нарастваща и намаляваща експресия между E14.5 и P 0, съответно (Фигура 1B). Членовете на let-7семейството на miRNAs са сред откритите miPHK с най-висока експресия и ние отбелязваме, че всички членове на семейството със значителни промени показват повишена експресия при P0 (данните не са показани). Това е в съответствие с резултатите, показващи, че намаляването на експресията на Lin28b води до широко увеличение на експресията на семейството let-7 в хода на нефрогенезата (Yermalovich et al., 2019). Други miPHK със значително по-висока експресия при P0 включват miR-429-3p, член на семейството miR-200, за който е известно, че засяга диференциацията на подоцитите (Z. Li et al., 2016), и двете miR{{30 }}a-5p и miR-125b-5p. Известно е, че последните две от тях потискат транскриптите на Lin28 в различни клетъчни среди (Chaudhuri et al., 2012; Potenza et al., 2017). miPHK със значително по-ниска експресия при P0 включва ангиогенезата - (S. Wang et al., 2008) и насърчаване на пролиферацията (Schober et al., 2014) miR-126.

Инструментът DIANA miRPath позволява анализ на пътя на KEGG на miRNA въз основа на техните съответни генни мишени, както е предвидено от micro T-CDS (Vlachos et al., 2015). Откриваме, че miPHK с най-големи промени в експресията между E14.5 и P0 (нагоре или надолу) са тези, които регулират пътища с ключова роля в нефрогенезата (Фигура 1C, Допълнителна фигура 2). Например, Tgf- се секретира от околните стромални клетки, за да насърчи диференциацията на нефронните прогенитори (Rowan et al., 2{{50}}18), и ние отбелязваме намалена експресия сред miRNA на нефронните прогенитори, насочена към ефекторите надолу по веригата на "TGF-сигналния път" (KEGG път mmu04350, p-стойност 1,45e- 6). „МАРК сигналният път“ (mmu04010) влияе върху организацията и подготовката на нефронните прогенитори за диференциация и регулира техните взаимодействия с извънклетъчния матрикс (ECM) чрез Itg 8 (Ihermann-Hella et al., 2018). Отбелязваме значителен брой регулирани нагоре и надолу miPHK, които са насочени към различни гени в този сигнален път на MAPK (p-стойности от 3,5e- 6 и 3,0e- 4 за списъци нагоре и надолу, съответно) . И накрая, пътят на KEGG "взаимодействие с рецептори на извънклетъчния матрикс (ECM)" (mmu04512) е идентифицираният най-значително обогатен път и неговите съставни гени са много по-значително насочени от miPHK, която увеличава експресията си с течение на времето (p-стойност от 7,4e{ {32}} сред увеличаващата се miPHK спрямо 1.1e-2 сред намаляващата). Свързаните с ECM гени са насочени към някои от най-силно експресираните и значително нарастващи miRNA, които откриваме, включително miR-196a-5p, miR-148a-3p, miR -125a-5p и нека-7f-5p. По-специално, miR-196a-5p е най-силно експресираната miPHK в нашите проби и се наблюдава 8-кратно увеличение между E14.5 и P0. Генни транскрипти, които са били предвидените мишени на miRNA (използвайки TargetScan (Agarwal et al., 2015)) с повишена експресия при P0, включват Bach2, предложена молекулярна връзка между MAPK/AP1 и Six2/-catenin пътища за самообновяване и диференциация в прогениторите на нефрона, съответно (Hilliard et al., 2019).

За идентифициране на предполагаеми мишени на диференциално експресирани miPHK в прогенитори на нефрон, ние използвахме изчислителна анотация на miPHK, предоставена в miRDB (Y. Chen & Wang, 2020), и анотираните експериментални miPHK-mRNA взаимодействия от базата на хоросан (HY Huang et al., 2020), в комбинация с нашия предварително генериран набор от данни за секвениране на едноклетъчна РНК E14.5 (Bais et al., 2020). По този начин, ние генерирахме списък с потенциални miRNA-mRNA взаимодействия, базирани на диференциална експресия на miR между E14.5 и P0 в нефронови прогенитори със съответната промяна в експресията на целевия ген между самообновяващи се и праймирани нефронни прогенитори, както и праймирани и диференциращи нефронни прогенитори (Фигура 2). Нашият анализ предполага, че Meis2 и Hmga2 са потенциални мишени на let-7 семейството на miPHK в нефронни прогенитори (Фигура 2), с намалена експресия на Meis2 и Hmga2, свързана с повишена експресия на let-7 членове на семейството при диференциране или стареене на нефронни прогенитори. Транскрипционният фактор Meis2 е силно експресиран в нефронните прогенитори и бъбречната строма по време набъбрекразвитие (Lam et al., 2014) и е свързано с регулирането на клетъчната пролиферация в други контексти (Abruzzese et al., 2019). Hmga2 е нехистонов хроматин-свързващ протеин, той се експресира силно в стволови клетки и е свързан с различни мезенхимни тумори (Fusco & Fedele, 2007; Lam et al., 2014). По подобен начин има нарастваща Jag1 експресия, свързана с намаляваща експресия на miR-34b-5p, miR-983p и miR-200a-3p при диференциране или стареещи нефронни прогенитори (Фигура 2). Jag1 е ключов лиганд в сигнализирането на Notch, чиято експресия се увеличава, когато прогениторите на нефрона се диференцират (Chung et al., 2016). Всички предвидени или анотирани миРНК мишени за гени с промени в експресията между самообновяващи се, праймирани и диференциращи нефронни прогенитори са достъпни в Допълнение.

Фигура 1. Съществени промени в експресията на miPHK между E14.5 и P0 нефронови прогенитори. A) Анализът на основните компоненти показва, че времевата точка на развитие е основен фактор за вариацията на експресията на miRNA. B) Топлинна карта, изобразяваща относителна експресия на всички значително променящи се miRNA. Колоните, съдържащи E14.5 проби отляво, са анотирани в светлозелено, а колоните с P0 проби отдясно са анотирани в тъмнозелено. C) Обогатяване на гени от специфични пътища на KEGG сред прогнозирани генни цели на регулирана нагоре и надолу miPHK (съответно червени и сини ленти). Минималната включена p-стойност е 1e-5.

Фигура 2. Взаимодействия miRNA-mRNA с възможна роля в стареенето и диференциацията на прогениторните клетки на нефрона. Показани са miRNA (кръгове) и mRNA (квадрати). miPHKs с повишена експресия между E14.5 и P0 са показани в червено, miRNAs, които намаляват, са показани в синьо. Анотирани целеви гени (от mirDB и mir TarBase) с нарастваща експресия между самообновяване, праймиране или диференцираненефронни прогениторни клетки(Bais et al., 2020) са показани в червено, mRNA с намаляваща експресия в синьо. Краищата от mirDB и mirTarDB, които са несъвместими с наблюдаваните промени в израза, са пропуснати, но са включени в допълнителна таблица 2.

Ранните и късните нефронни прогенитори имат различни хроматинови среди

ATAC-seq данни от E14.5 и P0 нефронови прогенитори ни позволиха да идентифицираме 46 374 области на достъпен хроматин (с нередуцируем процент на откриване (Boleu et al., 2015) праг на {{ 22}}.1, вижте (Допълнителна фигура 3 C, Допълнителна таблица 3), комбинирани между извадки и времеви точки. Отбелязваме, че нашите данни съответстват на насоките за ATAC-seq на проекта ENCODE (ENCODE, nd) (Допълнителна фигура 3 A, B) и че наблюдаваме повишени нива на запазване сред пиковете на IDR, отколкото се наблюдава при рандомизираните контроли (допълнителна фигура 3 D). Сред IDR, които докладваме, 3576 съдържат подобрители, документирани във VISTA (Visel et al., 2007) и/или FANTOM5 (de Rie et al., 2017) бази данни за усилватели и 13 495 съдържат ДНК последователности с предсказани регулаторни роли в поне една тъкан или клетка на мишка според EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020).

Анализът на основните компоненти (коригиран за половите разлики между пробите) разкри ясно групиране на пробите по времева точка на развитие (Фигура 3А). За да идентифицираме геномни локуси с промени в достъпността на хроматина, сравнихме ATAC-seq сигнала между E14.5 и P 0 проби. Наблюдавахме 2,103 DARs, контролирайки FDR при 10 процента. От тях 1323 (55 процента) показаха повишена достъпност при P0 в сравнение с E14.5, а йерархичното групиране разкри ясно разграничение между DAR, които се отварят и затварят съответно между E14.5 и P0 (Фигура 3B).

Отпечатъците на транскрипционния фактор бяха идентифицирани с помощта на HINT и съпоставени с ДНК свързващи протеини, използвайки мотиви от базата данни HOCOMOCO 11 (Kulakovskiy et al., 2018). Сред 431 тествани мотива, DAR, съдържащи отпечатъци за няколко протеини на транскрипционен фактор, свързани с нефрогенезата, показват увеличение на достъпността между E14.5 и P0. Сред отпечатъците, намиращи се в DAR, които увеличават средно достъпността, първите шест принадлежат на отпечатъците на транскрипционния фактор, съответстващи на Pax8 ({{10}}.15), Six2 (0.14), Cebpd (0.13), Six4 (0.13), Jun (0.12) и Fos (0.11). Отпечатъците, отбелязани в затварящите DAR, включват транскрипционни фактори E2F2 и E2F4, за които е известно, че влияят върху прогресията на клетъчния цикъл (Gaudet et al., 2011) и насърчават клетъчната пролиферация (D. Wang et al., 2000) в други клетъчни контексти (допълнителна фигура 4).

За да оценим биологичния контекст на отваряне и затваряне на DAR, ние използвахме инструмента за обогатяване на анотации на геномни региони (GREAT) (McLean et al., 2010), за да подчертаем генни набори с обогатяване на свързаните променящи се хроматинови региони. С този подход ние идентифицираме биологичните процеси на генната онтология (GO), тясно свързани с развитието на нефронните прогенитори: по-специално, най-обогатеният процес сред отварящите DAR е "Регулиране на диференциацията на епителните клетки" (GO:0030856, биномиална Q-стойност {{3 }}.5e-5) и „Положителна регулация на диференциацията на епителните клетки“ (GO:0030858, Биномиална Q-стойност=5e-3) е сред първите 10 най-значително обогатени ( Допълнителна фигура 5). И двете са в съответствие с увеличаването на склонността на нефронните прогенитори да претърпят мезенхимни към епителни преходи (MET), докато се диференцират (S. Chen et al., 2015). Други значително обогатени пътища включват „Положителна регулация на пътеката на сигнализиране на Notch“ (GO:0045747, биномиална Q-стойност=2e-5), което е в съответствие с ролята, която сигнализирането на Notch играе в насърчаването на диференциацията на нефронните прогенитори ( Чунг и др., 2016). Откритите 10 083 затварящи DAR не разкриват значими GO термини въз основа на критериите по подразбиране на GREAT за значимост (вижте допълнителна фигура 5).

Фигура 3. Разлики в достъпността на хроматина характеризират E14.5 спрямо P0нефронни прогениторни клетки.A) Анализът на основните компоненти на ATAC-seq проби подчертава времевите точки на развитие като основен източник на вариация. B) Топлинна карта, показваща значително променящи се IDR региони в ATAC-seq проби. E14.5 проби/колони са анотирани в светлозелено, а P0 проби/колони са анотирани в тъмнозелено. C) Термини за биологичен процес GO, обогатени за геномни региони, които се отварят между E14.5 и P0 според GREAT, класирани по биномна P-стойност, FDR По-малко или равно на 0.001.

След това проучихмедостъпност на хроматинав региони на генома, съдържащи промотори и енхансери за гени с публикувани роли в диференциацията на нефронови прогениторни клетки. Сред тях транскрипционният фактор Six2 е критичен за поддържане на мултипотентност нанефронни прогениторни клетки(Self et al., 2006) и във всички проби наблюдавахме достъпен хроматин, заобикалящ неговия промотор и известен Six2 енхансер ~50 kb нагоре по веригата на Six2 началното място на транскрипция (TSS) (O'Brien et al., 2018) (Фигура 4A, B, зони със сини нюанси). Ние също така отбелязваме региони на достъпен хроматин върху промотора и публикуван енхансер за протеина Gdnf (Фигура 4D, E), който се секретира от прогениторите на нефрон за насърчаване на разклоняването на уретерната пъпка (Sanchez et al., 1996; Vega et al., 1996 ). Този усилвател е разположен на ~ 113 kb нагоре по веригата на генния промотор и е известно, че реагира на Wnt сигнализация в контекста на развиващите се нефронни прогенитори (Park et al., 2012). Докато промоторът за Gdnf не се променя значително с времето, поясненият подобрител значително увеличава недостъпността. Ние също така отбелязваме региони на достъпен хроматин, заобикалящ публикуван енхансер, активен в нефронови прогенитори за Eya1, разположен ~ 325 kb нагоре по течението на TSS на гена (Park et al., 2012) (допълнителна фигура 6). Eya1 е транскрипционен фактор, който взаимодейства със Six2, за да поддържа мултипотентността на нефроновия прогенитор (J. Xu et al., 2014).

Наблюдаваме няколко DAR, които не припокриват известни регулаторни характеристики, но обхващат региони, за които се предполага, че имат усилваща активност за специфични гени в различни видове миши клетки, както е отбелязано в EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020). В допълнение към публикувания енхансер на Eya1 (Park et al., 2012) (допълнителна фигура 6), затварящ DAR в един от интроните на Eya1 (Фигура 5A-B) обхваща регион, за който се предполага, че има енхансерна активност върху гена Eya1 в мишка неврални прогениторни и гранулоцитно-моноцитни прогениторни клетки (Gao & Qian, 2020). В съответствие с намаляването на усилващата активност, преди това сме наблюдавали, че експресията на Eya1 е намалена при диференциране на нефронови прогенитори, използвайки E14.5 scRNA-seq данни (допълнителна фигура 7) (Bais et al., 2020). Това е в съответствие с публикуваните ChIP-seq данни в първични E16.5 нефронни прогенитори, които показват липса на активен усилвател, H3K27ac, и липса на свързване от Ctnnb1, Lef1, Six2 и Tcf7 (Фигура 5) (Guo et al ., 2021). Този потенциален енхансер също съдържа отпечатъци на транскрипционен фактор за Hoxd10 в рамките на неговия пик, транскрипционен фактор, който е от съществено значение за диференциацията и интегрирането на нефронови прогенитори по време на мезенхимни към епителни преходи (MET) (Yallowitz et al., 2011).

DAR, който увеличава недостъпността на хромозома 24, припокрива хроматинова област с прогнозирана усилваща активност за транскрипционния фактор Pax8 в клетки, култивирани от миши бъбрек, чревен епител и матка (Gao & Qian, 2020). Pax8 е частично излишен с Pax2, но поне един от тези два транскрипционни фактора е необходим в нефронните прогенитори забъбрекразвитие (Bouchard et al., 2002; Narlis et al., 2007). По-рано наблюдавахме, че експресията на Pax8 се увеличава в диференциращите и диференцирани нефронови прогенитори (допълнителна фигура 7) и отбелязваме значително увеличение на достъпността в DAR, който обхваща тази регулаторна характеристика. Този регион също е свързан с активна енхансерна маркировка, H3K27ac, и свързване на Ctnnb1, Lef1, Six2 и Tcf7 в публикувани ChIP-seq данни от първични E16.5 нефронови прогенитори (Фигура 5) (Guo et al., 2021). Ние наблюдаваме редица отпечатъци на транскрипционен фактор, които попадат в силно запазения пик на достъпност на този DAR, включително два за Sall1, ядрен фактор, за който е известно, че засяга нефрогенезата (Kanda et al., 2014), и седем тясно групирани отпечатъци за MYC-асоцииран цинков пръст протеин (Maz), транскрипционен фактор, за който е доказано, че има зависими от дозата ефекти върхубъбрекразвитие при хора и мишки (Haller et al., 2018). Допълнителна таблица 3 съдържа пълен списък на достъпните региони, които откриваме, както и техните съответни диференциални статистически данни за достъпност, анотации за гени, екзони и промотори, които те припокриват, и списъци на идентифицирани ключови отпечатъци на транскрипционен фактор, свързани с нефрогенезата.

Фигура 4. ATAC-seq профили при известни и предполагаеми регулаторни локуси. За всеки панел отгоре надолу фасетите означават обогатяване на гънките надостъпност на хроматинав E14.5 и P0 проби, с IDR и DAR, идентифицирани като акценти в синьо (непроменлив IDR) и зелено (отваряне на DAR). и червено (затваряне на DAR). Следният аспект изобразява генни анотации, нуклеозомни позиции (сиви) и свободни от нуклеозоми региони (червени), измерени в обединени проби E14.5 и P0, и резултати за запазване на PhastCon60 (черното показва 1{{ 12}}0 процента запазване, бялото 0 процента запазено A) Промотор и генно тяло на транскрипционния фактор Six2. B) Enhancer за Six2, публикуван от Park et. ал. C) Диференциално достъпен усилвател за Gdnf с повишена достъпност при P0. D) Промоутър за Gdnf.

Фигура 5. DARs, припокриващи потенциални нови енхансери за гени, свързани с нефрогенеза. A и C) Панелите изобразяват карта на 1MB регион, заобикалящ интересен ген, с гени, кодиращи протеини, в зелено и предложеното взаимодействие енхансер/промотор като черна примка . B и D) Отгоре надолу панелите изобразяват обогатяване на гънките надостъпност на хроматинаизмерени в E14.5 и P0 проби, с IDR, подчертани в зелено (отваряне) и червено (затваряне), последвано от ChIP-seq измервания в тези региони, измерени от Guo et. ал. в първичен нефронов прогениторклетки(Guo et al., 2021). Третият панел изобразява генни анотации (сини) и прогнозирани регулаторни елементи от Enhancer Atlas 2.0 (червени), а четвъртият панел обозначава отпечатъци на транскрипционен фактор, идентифицирани в ATAC-seq данни. Петият панел изобразява нуклеозоми (сиви) и NFR (червени), а долният панел показва консервация. A) 1MB регион, съдържащ генното тяло за Eya1 и потенциален Eya1 енхансер приблизително 325 kb нагоре по веригата. B) 4,5 kb регион, съдържащ потенциалния Eya1 усилвател. C) 1MB регион, съдържащ Pax8 генния локус и предвиден енхансер. D) 4.5 kb регион, съдържащ предвидения усилвател и неговия припокриващ се DAR.

Топологично асоциираните домейни помагат да се идентифицират потенциални връзки между подобрител и miRNA

Топологично свързаните домейни (TADs) са мегабазови региони на хроматинова организация от по-висок порядък, които са резултат от опаковането на хроматина в ядрото в триизмерното пространство (Dixon et al., 2012), а взаимодействията енхансер-промотор обикновено са ограничени до елементи в рамките на един и същ TAD (Symmons et al., 2014). Ние сближихме TAD от предшественици на нефрони, използвайки анотации, генерирани от миши ембрионални стволови клетки (ESC) (Y. Wang et al., 2018). За да скринираме възможни цис-регулаторни региони на miPHK, ние корелирахме промените вдостъпност на хроматинас диференциално експресирана miRNA в рамките на един и същ TAD. Като цяло 42 778 уникални достъпни региона (около 92 процента) са разположени вътре в анотирани TAD и от тези 3 0 626 (около 72 процента) не се припокриват с известен промоутър. Това включва 2103 DAR, като съответно 1180 и 923 се отварят и затварят с течение на времето. Петнадесет отварящи DAR споделят TAD с една или повече miPHK с повишена експресия между E14.5 и P0, а девет затварящи DAR споделят TAD с една или повече miRNA с намалена експресия. Фигура 6 обобщава този подход и илюстрира разстоянията между DAR и тяхната съвпадаща miRNA, които варират от 27 kb до над 1 mb (средно: 447 kb). Таблица 1 описва набори от възможни връзки между DAR и miRNA, като един DAR е посочен за съвпадаща miRNA.

Сред анотираните двойки miRNA-енхансер, ние отбелязваме три от особен интерес. Първо, идентифициран е отварящ DAR 120 kb надолу по веригата на let-7c-5p и 73 kb надолу по веригата на miR-125b-5p, който е свързан със Six2 място на свързване в публикуван преди това E16.5 нефрон прогенитор ChIP-seq набор от данни (Фигура 7A) (Guo et al., 2021). Let-7c-5p е една от най-високо експресираните let-7 miPHK, които откриваме, и е известно, че семейството let-7 също потиска Lin28b транскриптите (Slack & Ruvkun, 1997; Zhu et al., 2011). Отбелязваме, че Hmga2 и Meis2 също са идентифицирани като потенциални нови мишени на семейството let-7 в нефронови прогенитори (Фигура 2). Доказано е също, че miR-125b-5p потиска транскриптите на Lin28 в миши хематопоетични и прогениторни клетъчни типове (Chaudhuri et al., 2012). Второ, miR-9-3p е обратното допълнение към miR-9-5p, miRNA, за която наскоро беше доказано, че предпазва отбъбрекфиброза чрез насочване към метаболитни пътища (Fierro-Fernández et al., 2020). Ние откриваме по-голямо от 10-кратно намаление на miR-9-3ptранкриптите между E14.5 и P0 нефронови прогенитори и идентифицирахме потенциален регулаторен елемент приблизително на 249 kb (Фигура 7B). Ние наблюдаваме отпечатъци на транскрипционен фактор за Snai1 и Snai2 в свързания DAR, за които е доказано, че насърчават преходите от епител към мезенхим (EMT) (Sundararajan et al., 2019). Накрая съпоставихме miR-181a-2-3p с възможен интергенен цис-регулаторен локус 131kb нагоре по веригата на хромозома 2, където отбелязваме отпечатък на транскрипционен фактор за транскрипционния фактор Wt1, ключов регулатор на нефронния прогенитор оцеляване (Kreidberg et al., 1993) и свързване на Six2 в публикуван набор от данни ChIP-seq за нефронов прогенитор E16.5 (Фигура 7C)) (Guo et al., 2021).

Таблица 1. Промени в експресията на miRNA, съответстващи на един или повече DAR в същия TAD.

Фигура 6. Намиране на двойки кандидат-усилвател-мишена-миРНК. A) Диаграма, показваща как областите на достъпност са приоритизирани за възможно регулиране на експресията на miRNA. B) Геномни местоположения на всяка скринирана miRNA по отношение на техния кандидат-енхансер (оранжева вертикална ивица). Мащабът на тяхната log2 кратна промяна е показан на оста y, а miRNA с нарастваща или намаляваща експресия са подчертани съответно в зелено и червено.

Фигура 7. Четири двойки потенциални енхансер—целеви miPHK. TAD са маркирани в сиво, подравнени по начални точки и начертани в същия мащаб, за да илюстрират относителния размер. Известните гени от Ensembl са показани в лилаво, а по-тъмните области показват екзони. Относителната достъпност при E14.5 и P0 е показана като лентови графики над и под хоризонталната черна линия, съответно, както и във вмъкнати графики, илюстриращи pileup в определения DAR заедно с ChIP-seq данни, публикувани от Guo et . ал. (Guo et al., 2021). Отпечатъците на транскрипционния фактор, идентифицирани от HINT, са изброени в оранжеви банери. Стълбовидните диаграми в отделни панели вдясно показват експресия на miPHK (зелено) и нормализирани събития на вмъкване на Tn5 в предложените енхансерни региони (оранжево). A) Членът на семейството let-7 let-7c-5p е много силно изразен внефронни прогениторни клеткии е съпоставен с "peak_54636" на разстояние 119 kb в междугенен регион. B) miR-9-3p е съпоставен с DAR на разстояние 249kb. C) miR-181a 2-3p се намира на 131kb от "пик_5887", възможен междугенен енхансер.

Дискусия

В това проучване се опитахме едновременно да идентифицираме нова miRNA, която допринася за прекратяването на нефрогенезата, заедно с потенциални цис-регулаторни характеристики. Идентифицирахме 114 miPHK, които са диференциално експресирани в нефронни прогениторни клетки, както и 2,103 DARs, в E14.5 в сравнение с P0бъбреци. Ние наблюдаваме множество характеристики, които предсказват нови предполагаеми подобрители за гените Eya1 и Pax8 внефронни прогениторни клетки. И накрая, идентифицирахме последователнидостъпност на хроматинаи промени в експресията на miRNA за 33 двойки miPHK и DAR, включително let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p и miR-9-3p и представят предполагаеми целеви гени, експресирани в нефронни предшественици за диференциално експресирани miPHK. Заедно, нашите данни показват, че промените, присъщи на нефроновите прогенитори и зависещи от етапа на нефрогенезата, се отразяват в хроматиновата среда на прогениторната клетка и в нейния miRNA транскриптом.

Сред промените, които наблюдаваме в транскриптома на миРНК на предшественика на нефрона, отбелязваме широки увеличения на експресията в семейството let{{0}} с остаряването на прогениторите. Това е в съответствие с предишни доклади: Lin28b протеинът и let-7 семейството на miPHK са взаимно антагонистични и образуват бистабилен превключвател, който управлява експресията на let-7 при бозайници (Zhu et al., 2011), и в нефронни прогенитори, превключването към повишена експресия на let-7 пряко влияе върху времето на спиране на нефрогенезата (Yermalovich et al., 2019). Ние също така наблюдаваме повишена експресия на miR-125b-5p, за която също е известно, че потиска експресията на Lin28b в други клетъчни контексти (Chaudhuri et al., 2012; Potenza et al., 2017). Семейството let-7 и miR-125b-5p са сред 114 miRNA, които се експресират диференциално между E14.5 и P0 в прогениторите на нефрона, което предполага ролята на miRNAs в развитието на прогениторите на нефрона не се ограничава до let-7/Lin28b. Например, miPHK, които намаляват експресията, включват два члена от семейството miR-200, за които се съобщава, че играят роля в диференциацията на подоцитите (Z. Li et al., 2016): miR-200b -3p и miR-429-3p. По-нататък наблюдаваме намаляване на експресията на miR-126a 5p, за която е известно, че насърчава васкулогенезата (Schober et al., 2014; S. Wang et al., 2008). Това може да отразява общата мезенхимна линия на васкулогенни и нефронови прогенитори и ангажимента на подгрупа от тези клетки да станат нефронни прогенитори.

Анализите на пътя на прогнозираните генни мишени за промяна на miPHK с помощта на DIANA miRPath (Vlachos et al., 2015) показват обогатяване на MAPK и TGF-сигнализиране, и двата ключови регулатора на нефронови прогенитори (Hilliard et al., 2019; Ihermann-Hella et al., 2018 ). Няколко други пътя на KEGG също са свръхпредставени сред прогнозираните генни мишени на повишено регулирани miPHK, включително пътища, свързани с извънклетъчния матрикс, актинов цитоскелет и фокална адхезия: всички важни аспекти на клетъчната миграция, диференциация, разклоняване, прикрепване, поляризация и пролиферация (Rozario & Desimone, 2010). Свързаните с ECM гени са насочени към някои от най-силно експресираните и значително нарастващи miPHK, които откриваме, включително най-силно експресирания транскрипт, който откриваме: miR-196a-5p. Известно е, че miR-196a-5p е насочен към Col1a1, Col1a2 и Col3a1 – гени, които са регулирани нагоре в Pax2-нефронни прогенитори, които претърпяват трансдиференциация в бъбречната строма (Naiman et др., 2017). По този начин повишената експресия на miR-196a-5p може да има роля в укрепването на границите на родословието с напредване на възрастта на предшествениците. Освен това, ние идентифицираме нови потенциални целеви взаимодействия miRNA-mRNA, които могат да допринесат за спиране на нефрогенезата, включително регулирането нагоре на семейството let-7, което може да е насочено към Hmga2 и Meis2 (свързано с клетъчната пролиферация) (Abruzzese et al ., 2019; Fusco & Fedele, 2007; Lam et al., 2014; Mugford et al., 2009) с възрастта на прогениторите на нефрона. Hmga2 няма известна роля вбъбрекразвитие. Смята се обаче, че Meis2 има функционално припокриване със свързания транскрипционен фактор Meis1, за който е известно, че е необходим за развитието на бъбреците (Hisa et al., 2004). Ние също така наблюдаваме понижаване на miRs (miR-34b-5p, miR-983p и miR-200a-3p), които може да са насочени Jag1, за който е известно, че е регулиран нагоре и важен за диференциацията на нефрона (Chung et al., 2016).

Заедно с променящия се miPHK транскриптом, ние едновременно измервахме промените в хроматиновата среда на нефронната прогениторна клетка между E14.5 и P0. Ние описваме два предполагаеми нови енхансера за Eya1 и Pax8, въз основа на (i) тяхната близост до тези генни промотори, (ii) техните съответни промени вдостъпност на хроматинапо време на развитие в съответствие с псевдовременната генна експресия се променя по време на диференциация, (iii) отпечатъци набъбректранскрипционни фактори за развитие, (iv) запазване на последователността, (v) доказателство за усилваща функция в други тъкани/типове клетки от Enhancer Atlas2.0 (Gao & Qian, 2020) и (vi) ChIP-seq данни в E16 .5 нефронни предшественици за белег на активни енхансери (H3K27ac) и свързване на транскрипционен фактор на Ctnnb1, Lef1, Six2 и Tcf7. Наблюдаваме намаляване на достъпността на хроматина за усилвателя Eya1, което е в съответствие с ролята на Eya1 в насърчаването на мултипотентността на нефронните прогенитори и с докладите, че загубата на Eya1 води до ранна епителизация на прогениторната популация (J. Xu et al., 2014; PX Xu et al., 1999). Pax8 и неговият хомолог Pax2 допринасят за спецификацията на линията на нефронните прогенитори (Bouchard et al., 2002), а нефронните прогенитори без поне един от тези гени няма да бъдат подложени на MET (Narlis et al., 2007). Повишената достъпност на хроматин, която откриваме за предполагаемия усилвател на Pax8, е в съответствие с повишената експресия на Pax8 в бъбречния епител, тъй като нефроните се диференцират.

Анализът на обогатяване (McLean et al., 2010) на DARs разкри "Регулиране на епителната диференциация" като най-значително обогатения термин сред отварящите се хроматинови региони, което показва, че DARs, които откриваме, може да съдържат регулаторни характеристики, управляващи или отговарящи на сигнали за диференциация и развитие нанефронни прогениторни клеткив типове епителни клетки. Notch сигнализирането е сред най-значително обогатените GO термини, идентифицирани сред отварящите DAR, и в нефронните прогенитори е известно, че този път потиска Six2 експресията и насърчава диференциацията на нефронните прогениторни клетки (Chung et al., 2016). Сред замесените гени на този път е Jag1, ключов лиганд в сигнализирането на Notch, чиято експресия се съобщава, че е обратно корелирана с експресията на Six2 и Hes1 (Chung et al., 2016). Отбелязваме, че Jag1 е анотирана цел за три miPHK с нарастваща експресия (miR34b-5p, miR98-3p и miR200a-3p, Фигура 2). И накрая, наблюдаваме обогатяване на гени, свързани с ремоделиране на кръвоносни съдове и морфогенеза при отваряне на DAR, въпреки че това изглежда е следствие от гени, споделени между тези пътища на развитие и диференциация на епителните клетки, включително Jag1, Eya1, Hes1, Foxc1 и Hey2.

Промени вдостъпност на хроматинамеждунефронни прогениторни клеткиса измерени в предишни проучвания (Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019).

Като цяло резултатите ни са в съответствие с тези предишни проучвания, подчертавайки гените, свързани с Notchsignaling и Pax8-. За отбелязване е обаче, че има някои експериментални разлики в тези предишни проучвания в сравнение с този доклад. Изолирането на GFP-експресиращи нефронни прогенитори с помощта на флуоресцентно-активирана клетка от Six2-TGC трансгенна репортерна мишка е потенциално объркано от откритието, че този алел има отчетено намаление на броя на нефроните от приблизително 45 процента (Hilliard et al. , 2019; Volovelsky et al., 2018). Освен това е доказано, че култивирани нефронови прогенитори (отглеждани с ниска или висока доза CHIR) имат различни транскриптоми от първичните нефронни прогенитори, което предполага, че тяхната достъпност до хроматин също би била различна (Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019). Тъй като целта на нашето изследване беше да разберем как промените в пейзажа на хроматина влияят върху експресията на miPHK в ранните спрямо късните нефронови прогенитори, беше необходим анализ на първичните нефронови прогенитори.

Цистанче е по-добро за бъбреците

Чрез комбиниране на тези наблюдавани промени в хроматиновата среда със съответстващи промени в експресията на miRNA, ние включваме няколко нови предполагаеми двойки miRNA-енхансер в прекратяването на нефрогенезата за по-нататъшно изследване. МиРНК miR-125a-5p и let-7c-5p, например, виждат значително увеличение на експресията между E14.5 и P0 , и това е обобщено от нарастващата недостъпност на DAR (chr16:77,719,058 77,720,407) в същия TAD. Този DAR също е свързан с място за свързване на Six2 (Guo et al., 2021) и може да обозначава енхансер, който засяга експресията на miR-125a-5p и/или let{{18} }c-5p, което от своя страна може да насърчи диференциацията чрез потискане на Lin28b. По подобен начин наблюдаваме възможен енхансер за miR 181a, за който е известно, че модулира експресията на ренин при хора (Marques et al., 2015) и се счита за терапевтична цел за намаляване на нефротоксичността поради способността му да потиска BIRC6 и апоптозата (Liu et al. др., 2018). И накрая, наблюдаваме затварящ DAR, свързан с miR-9-3p, който има отпечатъци на транскрипционен фактор за реагиращите на Wnt сигнализиране протеини Snai1 и Snai2. обратния комплемент на miR-9-3p, miR-9-5p, Известно е, че предпазва отбъбрекфиброза (Fierro-Fernández et al., 2020), Snai1 и Snai2 са показали, че насърчават метастази на карцином в ракови клетки на кожата на мишка (Olmeda et al., 2008) и насърчават епителни към мезенхимни преходи (EMT) при пациенти с рак (Sundararajan et al., 2019), докато miR-9 е известно, че насърчава ангиогенезата и миграцията на туморни ендотелни клетки (Zhuang et al., 2012). Може да съществува механизъм, при който повишеното Wnt сигнализиране води до намалена експресия на Snai1 и Snai2, което от своя страна намалява експресията на miR-9-3p, за да подпомогне диференциацията на нефронния прогенитор.

Нашето проучване изчерпателно идентифицира промените в хроматиновия пейзаж и miPHK транскриптома на нефронови прогенитори по време на ембрионалното развитие и ние идентифицирахме кандидат цис-регулаторни региони и miRNA, които могат да играят роля в прекратяването на нефрогенезата. Анализите на обогатяване както за mRNA-seq, така и за ATAC-seq данни предоставят примамливи улики за механизмите, които могат да бъдат включени, като пътища, които регулират диференциацията на нефронните прогенитори, включително като Notch и TGF-. Ние също така съобщаваме за два нови предполагаеми регулаторни елемента за Eya1 и Pax8, гени, за които е известно, че са важни вбъбрекразвитие и потенциални регулаторни последователности за ключова miRNA, които са замесени в прекратяването на нефрогенезата.

Методи

Мишки щамове

Дивият тип CD-1 бременни женски са получени от Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA, RRID: MGI:5659424) ибъбрецибяха събрани от котила в ембрионален ден E14.5 или P0. Всички животни бяха настанени във вивариума в изследователския център Рангос към детската болница UPMC в Питсбърг (Питсбърг, Пенсилвания, САЩ) и всички експерименти с животни бяха проведени в съответствие с политиките на институционалния комитет за грижа и използване на животните към Университета на Питсбърг. Полът за всеки ембрион или кученце се идентифицира чрез извършване на PCR върху геномна ДНК, изолирана от изрезки от опашка, като се използват следните праймери за Y-хромозомния ген Sry: SryF 5′-GATGATTTGAGTGGAAATGTGAGGTA-3′ и SryR 5′-CTTATGTTTATAGGCATGCACCATGTA-3', като публикувани по-рано (McFarlane et al., 2013).

Секвениране и анализ на малка РНК

Общата РНК, изолирана отнефронни прогениторни клеткиостаналата след отстраняването на клетъчната фракция на ATAC-seq беше предоставена на ядрото за секвениране на здравните науки в детската болница UPMC в Питсбърг за подготовка на библиотека с помощта на комплекта за подготовка на библиотека QIAseq miRNA (Qiagen 3315{{10}}2). Едностранно секвениране на mRNA-seq библиотеки беше извършено на Illumina NextSeq500 и библиотеките бяха секвенирани до дълбочина от приблизително 50 милиона еднокрайни четения на библиотека. След това секвенираните показания бяха подравнени към мишия mm10 геном с помощта на пакета Rsubread (Liao et al., 2019) (версия 2.0.1) и анотирани към известна miRNA, посочена в miRBase (версия 22) (Kozomara & Griffiths-Jones, 2014) с функцията featureCounts на пакета Rsubread. Диференциалната експресия на известна miRNA се измерва с помощта на пакета DESeq2 R (версия 1.26.0) (Love et al., 2014). Фракцията от подравнени показания, анотирани към известна miPHK, както и фракцията на женските ембриони на проба бяха включени като кофактори в модела за тестване, представен на DESeq2. След това бяха идентифицирани диференциално експресирани miPHK, докато се контролираше степента на фалшиво откриване при 5 процента и тяхната посока на промяна (увеличаване срещу намаляване) беше определена въз основа на тяхната стойност на промяна на пъти ("увеличаване", показващо по-висока експресия при P0 в сравнение с E14.5) . Обогатяването на регулаторните пътища сред прогнозираните генни цели на miRNA със значително нарастваща и намаляваща експресия беше изчислено с помощта на инструменти на DIANA miRPath версия 3.0 (Vlachos et al., 2015). Предсказаните целеви транскрипти за miRNA бяха извлечени от хранилищата TargetScan (Agarwal et al., 2015) и miRDB (Y. Chen & Wang, 2020).

Изолиране на нефронов прогенитор

Бъбрецибяха дисектирани от котила на {{0}} E14.5 ембриони или P0 малки и всяко котило се считаше за една проба. Един бъбрек на проба беше използван за изолиране на тотална РНК, за да се използва като "цял бъбречен контрол" в следващите анализи (вижте по-долу). Общо три проби бяха събрани във всяка времева точка. След това кортикалните клетки бяха изолирани от всяка проба с помощта на магнитно-активирано клетъчно сортиране (MACS), както е публикувано по-рано (Brown et al., 2011). Накратко, бъбреците претърпяха частично смилане с 2 mM колагеназа A (Roche 11088793001) и 3,5 mM панкреатин (Sigma P1625) във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) за 15 минути при 37 градуса. Реакцията на смилане беше спряна с помощта на студен 100% фетален говежди серум (FBS) и клетъчната суспензия беше събрана и ресуспендирана в студен фосфатно буфериран физиологичен разтвор на Dulbecco (DPBS) с 1mM фенилметилсулфонил флуорид (PMSF) протеазен инхибитор (Sigma-Aldrich 10837091001). Клетките се промиват и ресуспендират в ледено студен буфер за изолиране, състоящ се от 2 процента FBS в PBS, след което се инкубират с магнитни перли (Dynabeads FlowComp Flexi комплект, ThermoFisher 11061D), биотинилирани до антитела за Integrin alpha 8 (Itg 8, R&D Systems AF4076) с помощта на комплекта за маркиране на биотин протеин DSB-X (ThermoFisher D-20655). Предшествениците на нефрон, свързани с тези зърна, бяха изолирани, както е публикувано по-рано (Hemker et al., 2020) и събрани през бъбреците за всяка проба. Аликвотна част от 50000 нефронни прогениторни клетки беше незабавно обработена прездостъпност на хроматинапротокол за приготвяне на библиотека (вижте по-долу) и общата РНК се екстрахира от останалата клетъчна суспензия с помощта на Qiagen miRNeasy Mini Kit (Qiagen 217004).

За потвърждаване на обогатяването нанефронни прогениторни клеткив сравнение с други типове клетки, общата РНК се изолира от предшественици на нефрон, както и от целибъбреци(контрол на цял бъбрек, вижте по-горе) и беше извършена количествена PCR с обратна транскрипция (qRT-PCR) за следните маркери: нефрон прогениторни маркери Six2 и Cited1 (L. Huang et al., 2016), и за Lhx1, Pdgfr, Pecan и Caleb, които маркират бъбречна везикула (Brunskill et al., 2014), бъбречна строма (S. Chen et al., 2015), ендотелна (Kobayashi et al., 2008) и уретерна пъпка (Cebrian et al., 2014a ) клетки, съответно; вижте също допълнителна фигура 1. Gapdh (Barber et al., 2005) беше използван като домакински ген и относителното количествено определяне беше изчислено чрез метода 2-ΔΔCt (Livak & Schmittgen, 2001). Праймерите за тези преписи са включени в таблица 2.

Таблица 2. RT-PCR праймери.

Достъпност на хроматинабиблиотечна подготовка

Приблизително 50,000нефронни прогениторни клеткибяха използвани за генериране на всяка секвенираща библиотека за ATAC-seq с помощта на Nextera DNA Flex Library Prep Kit (Illumina FC-121-1030) с модификации съгласно публикуван по-рано метод (Buenrostro et al., 2013). Накратко, клетките се суспендират в ледено студен нейонен лизисен буфер, състоящ се от 10 mM Tris, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 1 mM PMSF протеазен инхибитор и 0,05 обемни процента Triton X-100 за 10 минути, за да се лизират клетките мембрани, като оставя ядрените мембрани непокътнати. Интактните прогениторни ядра на нефрона се ресуспендират в буфер за транспониране, съдържащ ензима транспозаза, и се инкубират при 37 градуса за 30 минути. Свободната геномна ДНК, освободена от процеса на транспониране, беше пречистена с помощта на комплекта за пречистване MinElute PCR (Qiagen 28004) и след това индексирана с помощта на предни (i7) и обратни (i5) индексни праймери от индексния комплект Nextera (Illumina FC-121-1011). Индексното лигиране и амплификацията на фрагменти бяха постигнати с помощта на програмата за термичен цикъл на PCR амплификация.

За да се определи оптималният брой цикли на амплификация, необходими за библиотеката ATAC-seq, беше извършена qPCR странична реакция с помощта на SsoAdvanced SYBR Supermix (BioRad 1725274) и 96-ямков C100 Thermal Cycler (Bio-Rad) за изчисляване на нормализирания репортерна стойност (Rn) за всеки цикъл. Номерът на цикъла, при който реакцията достигна една трета от максималната си флуоресценция, беше идентифициран като оптимален брой оставащи цикли на амплификация, а оставащият обем на индексираната ATAC-seq транспозиционна реакция беше подложен на този брой допълнителни цикли в крайната амплификация програма. Крайните библиотеки бяха пречистени с помощта на Ampure XP магнитни перли (Beckman Coulter A63881).

Достъпност на хроматинасеквениране

Секвенирането в сдвоен край на библиотеката ATAC-seq беше извършено на Illumina NextSeq500 от ядрото за секвениране на здравните науки в детската болница UPMC в Питсбърг, мултиплексирано с концентрации на библиотеката, които се очаква да дадат 90 милиона прочитания от сдвоен край на проба . Качеството на четенията беше подрязано с помощта на TrimGalore (BabrahamLab, 2014) (версия 0.4.3) в режим „--сдвоени“ и с други настройки по подразбиране. Четенията бяха подравнени към генома mm10 (Church et al., 2011) с помощта на Bowtie2 (Langmead et al., 2009) (версия 2.3.1) с настройките „--local -q -X 2000 -- м". Четенията в резултат на PCR дубликати на същия ДНК фрагмент бяха маркирани с помощта на функцията MarkDuplicates на Picard Tools (Broad Institute, 2016) (версия 2.10.9) с настройки по подразбиране. Четенията, които са картографирани нееднозначно на повече от едно място в генома, са произволно присвоени на едно от тези местоположения, ако има по-малко от четири възможности, и в противен случай са елиминирани (ENCODE, nd) (с помощта на скрипт на Python, достъпен на https://github. com/kundajelab/atac_dnase_тръбопроводи, (Lee, 2017) с настройките „--paired-end -k“). Samtools (H. Li et al., 2009) (версия 1.3.1) се използва за филтриране на дублирани, некартографирани, осиротели и митохондриални четения, както и за сортиране и индексиране на BAM файлове. Контролът на качеството на ATAC-seq данните следваше насоките за ATAC-seq на проекта ENCODE (ENCODE, nd) и примерните библиотеки бяха произволно намалени, за да съдържат 31 милиона четения от двоен край, за да се нормализират разликите в размерите на библиотеката.

Cistanche може да предотврати бъбречна инфекция

Идентифициране на достъпни хроматинови региони

BAM файлове, съдържащи филтрирани ATAC-seq четения, бяха преобразувани във формат BED с двоен край с помощта на Bedtools' (Quinlan & Hall, 201{{20}}) (версия 2.26.0) 'bombed ' функция с настройки "- bed pe -mate1". Регионите на достъпен хроматин бяха идентифицирани с помощта на моделно-базиран анализ на инструмента ChIP-seq (MACS2, версия 2.1.1.20160309) широк пиков извикващ алгоритъм (Zhang et al., 2008), с настройки „--формат BEDPE {{ 18}}g mm -p 0.01 --broad --shift 37 --text size 75 --keep-up all --model“. За идентифициране на достъпни региони с висока степен на сигурност бяха извършени сравнения по двойки (на всяка комбинация от реплики от даден момент от време) и процентът на невъзпроизводими открития (IDR) (Q. Li et al., 2011) беше изчислен с помощта на публично достъпен Реализация на Python (GitHub https://github.com/nboley/idr) (Boleu et al., 2015) с настройки „--input-file-type широк пик --rank p.value {{ 35}}soft-IDR-threshold 0.1 --ledge тип изходен файл". По-конкретно, за всяка времева точка беше подаден свързан BED файл на всички достъпни региони чрез аргумента "--peak-list" за всяко сравнение (например, когато се сравняват две E14.5 проби, всички E14.5 широки пикове между всичките три повторения се използват). Регионите на достъпност, които са последователни от IDR в поне две сравнения на реплики по двойки (с минимум 20 процента припокриване), бяха комбинирани в унифициран набор от достъпни региони с висока степен на сигурност („IDR региони“).

Промени в достъпните хроматинови региони

Достъпността на всеки IDR регион в рамките на дадена проба беше количествено определена чрез преброяване на броя на транспониращите събития, които се случват при нормализиране за GC-съдържание на последователност в пробите. Това беше постигнато с помощта на персонализиран скрипт (достъпен в придружаващото софтуерно хранилище, вижте допълнителни данни). След това промените в тази достъпност бяха определени чрез сравняване на тези стойности във времеви точки с помощта на софтуерния пакет Limma-voom (версия 3.42.2) (Ritchie et al., 2006). За да се отчете пола на ембриона, частта от женски ембриони във всяка проба беше включена като кофактор в линейни модели, използвани за диференциален анализ на достъпността, и беше премахната като партиден ефект във визуализации с помощта на функцията за премахване на партиден ефект на пакета Limma. Различно достъпните региони на хроматина (DARs) се считат за значително отварящи се (повишена достъпност между E14.5 и P0) или затваряне (намалена достъпност между E14.5 и P0) при контролиране на степента на фалшиво откриване при 10 процента . Анализите на функционалното обогатяване на отварящи и затварящи геномни региони бяха определени чрез подаване на съответните координати към инструмента за обогатяване на анотации на геномни региони (GREAT, достъпен на http://great.stanford.edu/public/html/) (McLean et al., 2010 ). Анотациите на известни и прогнозирани подобрители бяха извлечени от хранилищата FANTOM5 (Andersson et al., 2014), VISTA (Visel et al., 2007) и EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020).

Отпечатъци на транскрипционен фактор

Отпечатъците на транскрипционния фактор бяха идентифицирани чрез обединяване на всички BAM файлове от една и съща времева точка, след което стартиране на Hmm-базирания софтуер за идентифициране на TF отпечатъци (HINT) на Regulatory Genomics Toolbox (версия 0.12.3), по-специално модела за отпечатъци за ATAC -seq данни (достъпни на www.regulatory-genomics.org ) (Z. Li et al., 2018). Този софтуер беше стартиран с настройки „десен намек за отпечатък --organism=mm10 --at-seq --paired-end“. След това отпечатъците бяха анотирани с известни мотиви за свързване на мишката от базата данни HOCOMOCO 11 (Kulakovskiy et al., 2018), използвайки функцията за съвпадение на мотив на HINT с настройките „анализ на десния мотив, съответстващ на --организъм=mm10“. Отпечатъци с HINT резултати под 10 бяха изключени. И накрая, диференциалните модели на активност сред отпечатъците, съвпадащи с мотиви, бяха измерени с помощта на диференциалната функция на програмата RGT-HINT, с настройки „десен намек диференциал --organism=mm10 --bc {{27} }NC 12 --изходни профили". Бяха идентифицирани значително променящи се нива на активност въз основа на гранична стойност на p-стойността от 0,05 (метод на Friedman-Nemeny).

Cistanche може да подобри бъбречната функция

Нуклеозомна конфигурация

Подравнените четения от една и съща времева точка бяха обединени в единичен BAM файл и пакетът NucleoATAC (версия 0.3.4) беше използван за идентифициране на модели в дължините на четене, предполагащи както свързани нуклеозомни диади, така и региони без нуклеозоми ( NFR) (Schep et al., 2015). Този софтуер е изпълнен с настройки по подразбиране. Нуклеозомите бяха анотирани като област от 146 bp, центрирана около всяка, наречена нуклеозомна диада.

Експресия на едноклетъчна РНК

Данните за едноклетъчна генна експресия бяха обработени за предишен ръкопис (BioRxiv https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.16.300293v1) (Bais et al., 2020) и бяха извлечени от Gene Expression Omnibus (GEOID GSE158166). Обработените данни, включени в допълнителна фигура 7, включват клетъчни типове, нива на генна експресия, нискоразмерни (tSNE) вграждания и анотации за псевдовреме по отношение на траекторията, установена между клъстери от пролифериращи и диференциращи нефронни предшественици. Данните бяха достъпни и организирани с помощта на пакета SingleCellExperiment R (Lun & Risso, 2019).

Взаимодействия miRNA-mRNA при стареене и диференциация на прогениторни клетки на нефрона

Гени с променяща се експресия между самообновяване, праймиране и диференцираненефронни прогениторни клеткиса получени от допълнителни таблици 3 и 4, публикувани от Bais et al.. (FDR< 0.1="" for="" all="" genes,="" 99="" genes="" total).="" mirtarbase="" v8.0="" for="" the="" mouse="" was="" downloaded="" (https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/~mirtarbase/mirtarbase_2022/cache/download/8.0/mmu_mt="" i.xls)="" while="" mirdb="" version="" 6.0="" predictions="" were="" obtained="" from="" the="" mid="" b="" website="" (y.="" chen="" &="" wang,="" 2020);="" high-quality="" mirna-to-target-gene="" predicted="" interactions="" with="" a="" minimum="" score="" of="" 90="" were="" considered.="" annotated="" mir="" target="" genes="" and="" differentially="" expressed="" genes="" were="" then="" intersected="" using="" the="" r="" programming="" environment="" to="" generate="" figure="" 2="" and="" supplemental="" table="">

Секвениране на имунопреципитация на хроматин в първични нефронни прогенитори

Данните за секвениране на имунопреципитация на хроматин (ChIP-seq) за свързване на -catenin, Lef1, Six2 и Tcf7 в първични нефронни предшественици бяха извлечени от файлове на BedGraph в GEO хранилището (GSE131119) за Guo et al., 2021. Стойностите на сигнала за кратно обогатяване бяха осреднени в повторни проби.

Скрининг за регулаторни елементи, засягащи експресията на miRNA

За да скринираме за потенциални подобрители на miPHK, ние анотирахме miRNA и DARs с топологично свързаните домейни (TADs), в които се намират въз основа на mm10 анотации от миши ембрионални стволови клетки, изтеглени от 3D Genome Browser (достъпен на http://3dgenome .fsm.northwestern.edu/) (Y. Wang et al., 2018). Региони надостъпност на хроматинаи miPHK се считат за кандидат-енхансери - miRNA двойки, ако заемат същия TAD и показват последователни промени в достъпността и експресията (увеличаване на достъпността с увеличаване на експресията на miRNA и обратно). DAR се считат само за възможни "регулаторни характеристики", ако не се припокриват с известен промотор или край на екзон. Потенциалните двойки miPHK и предполагаеми регулаторни елементи бяха приоритизирани, ако те 1) попадат в рамките на един и същ TAD и 2) претърпяха значителни промени между E14.5 и P0 (увеличаване на експресията на miRNA и увеличаване на достъпността на IDR региона и обратно) .

Благодарности

Шелби Хемкер и Абха Байс допринесоха за експерименталния дизайн. Секвенирането за ATAC-seq и mRNA-seq беше извършено от ядрото за секвениране на здравните науки в детската болница UPMC в Питсбърг.

Конкуриращи се интереси

Няма декларирани конкурентни интереси

Финансиране

AC беше подкрепен от грантове от Националния институт по диабет и храносмилателни иБъбрекЗаболявания по Националния здравен институт (T32DK061296-17). DK беше подкрепен от грантове от Националния институт по общи медицински науки към Националния институт по здравеопазване (R01GM115836). JH беше подкрепен от грантове от Националния институт по диабет и храносмилателни и бъбречни заболявания към Националния здравен институт (R01DK103776 и 125015). DMC беше подкрепен от наградата за кариерно развитие на мрежата за изследване на нефротичния синдром (NEPTUNE) и постдокторантската стипендия на Консултативния изследователски съвет на детската болница в Питсбърг. YP беше подкрепен от безвъзмездни средства от детската болница UPMC в Питсбърг и Консорциума за митохондриални заболявания на Северна Америка.

Наличност на данни

Предсказаните подобрители на мишката бяха извлечени от FANTOM5 (DOI: 10.1038/nature12787; файлът е наличен тук), Vista (DOI: 10.1093/var/gkl822; файлът е наличен тук) и EnhancerAtlas (DOI: 10.1093/var/gkz980; файловете на мишката са достъпни тук) бази данни. Геномът mm10 на мишката и неговите анотации бяха изтеглени чрез проекта за геноми на Illumina (достъпен тук). Верижният файл за повдигане на координатите mm9 до mm10 беше извлечен от браузъра на генома на UCSC (DOI: 10.1101/gr.229102; файлът е достъпен тук). TAD анотации от миши ембрионални стволови клетки бяха извлечени от 3D Genome Browser (DOI: 10.1186/s13059-018-1519-9; файлът е достъпен тук). Предсказаните мишени на транскрипт на miRNA бяха извлечени от TargetScan (DOI: 10.7554/eLife.05005, файлът е достъпен тук) и от miRDB версия 6 (DOI: 10.1093/var/gkz757, файлът е достъпен тук). ATAC-seq данни, включително IDR/DAR местоположения, анотации и резултати от диференциално обогатяване, са налични на GEO (GSE168339), както и mRNA-seq данни, включително анотации и резултати от диференциална експресия (GSE168342). Компютърният код, използван за обработка и анализ на данни и за генериране на цифри, е достъпен на https://bitbucket.org/clugstonA/mirna_enhancers

Библиография

Abruzzese, MP, Bilotta, MT, Fionda, C., Zingoni, A., Soriani, A., Petrucci, MT, Ricciardi, MR, Molfetta, R., Paolini, R., Santoni, A., & Cippitelli, M (2019). Хомеобокс транскрипционният фактор MEIS2 е регулатор на преживяемостта на раковите клетки и активността на IMiDs при множествена миелома: модулация от инхибитори на бромодомен и екстратерминален (BET) протеин. Клетъчна смърт и болести, 10 (4). https://doi.org/10.1038/s41419-019-1562-9

Agarwal, V., Bell, GW, Nam, JW, & Bartel, DP (2015). Прогнозиране на ефективни микроРНК целеви места в иРНК на бозайници. ELife. https://doi.org/10.7554/eLife.05005

Andersson, R., Gebhard, C., Miguel-Escalada, I., Hoof, I., Bornholdt, J., Boyd, M., Chen, Y., Zhao, X., Schmidl, C., Suzuki, T ., Ntini, E., Arner, E., Valen, E., Li, K., Schwarzfischer, L., Glatz, D., Raithel, J., Lilje, B., Rapin, N., … Санделин, А. (2014). Атлас на активни подобрители в типове човешки клетки и тъкани. Природа, 507 (7493), 455–461. https://doi.org/10.1038/nature12787

BabrahamLab. (2014 г.). Подстригване в изобилие. В биоинформатиката. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_изобилие

Bais, AS, Cerqueira, DM, Clugston, AS, Ho, J., & Kostka, D. (2020). Едноклетъчно РНК секвениране разкрива диференциална активност на клетъчния цикъл в ключови клетъчни популации по време на нефрогенеза. BioRxiv. https://doi.org/https://doi.org/10.1101/2020.09.16.300293

Barber, RD, Harmer, DW, Coleman, RA, & Clark, BJ (2005). GAPDH като домакински ген: Анализ на GAPDH mRNA експресия в панел от 72 човешки тъкани. Физиологична геномика. https://doi.org/10.1152/physiolgenomics.00025.2005

Бартел, DP (2009). МикроРНК разпознаване на мишени и регулаторни функции. Клетка, 136 (2), 215–233. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.01.002.MicroRNA

Bertram, JF, Douglas-Denton, RN, Diouf, B., Hughson, MD, & Hoy, WE (2011). Брой човешки нефрон: Последици за здравето и болестта. Педиатрична нефрология, 26 (9), 1529–1533. https://doi.org/10.1007/s00467-011-1843-8

Boleu, N., Kundaje, A., Bickel, PJ, & Li, Q. (2015). Процент на невъзпроизводими открития (2.0.3). https://github.com/nboley/idr

Bouchard, M., Souabni, A., Mandler, M., Neubüser, A., & Busslinger, M. (2002). Спецификация на нефричната линия от Pax2 и Pax8. Гени и развитие. https://doi.org/10.1101/gad.240102

..............

От: Journal Pre-proof

2021 г. Публикувано от Elsevier Inc.