Анализ на абсорбирани компоненти в плазма на плъх след перорално приложение на квазиестрогенна фракция на Cistanche

Анализ на абсорбирани компоненти в плазма на плъх след перорално приложение на квазиестрогенна фракция на Cistanche

За повече информация: Ali.ma@wecistanche.com

Кликнете, за да видите ползите и страничните ефекти на cistanche

Резюме:

Да се ​​анализират и идентифицират съставките в плазмата на плъх след перорално приложение на активната фракция нацистанче, компонентите в плазмата на плъхове са открити чрез високоефективна течна хроматография-електроспрей йонизация-квадруполно време на полет-масспектрометрия (HPLC-Q-TOF MS)． Структурите на компонентите бяха изяснени чрез сравняване на техните времена на задържане и MS/MS спектри с тези на референтните съединения и отчетените данни в литературата. Идентифицирани са 13 химически състава, включително 6 прототипни компонента, като генипозидова киселина, салидрозид,Цистанозид А, Ехинакозид, Актеозид, Цистанозид D,7 метаболитни компоненти, като 3,4-дихидроксифенилетанол гликозиди, метилиращ актеозид, ацетилиран цистанозид G,3,4-дихидроксифенилетанол, ацетил тубулозид B, цистанозид B глюкурониден метаболит и метилиране-3,4 Дихидроксифенилетанол. Резултатите могат да предоставят съществени данни за осветляване на терапевтичната основа на квазиестрогенната регулаторна активност нацистанче．

Ключови думи:

цистанче; лекарство, съдържащо серум; квази естроген; високоефективна течна хроматография-електроспрей йонизация-квадруполно време на полета-масспектрометрия (HPLC-Q-TOFMS)

Cistanche deserticolaе паразитно растение в корените на пустинни дървета (като haloxylon ammodendron, tamarix и др.). Като вид подхранваща и силна скъпоценна китайска традиционна медицина, тя има различни фармакологични ефекти като подхранване на бъбреците Ян, регулиране на имунитета, забавяне на стареенето, анти-радиация и защита на централната нервна система. Известен е като "пустинен женшен". Понастоящем повечето изследвания върху дейността на c. deserticola у нас и в чужбина са ограничени до оценка на фармакологичната активност, докато основата на неговите фармакодинамични вещества не е изяснена, което сериозно възпрепятства рационалното разработване и приложение наCistanche deserticola.

Компонентите на традиционната китайска медицина са сложни и разнообразни и само след правилно приложение чрез абсорбция и метаболизъм в тялото, компонентите най-накрая могат да влязат в кръвта, за да бъдат фармакодинамичната субстанция в основата на традиционната китайска медицина. Тези активни съставки може да са прототип или метаболит на ТРАДИЦИОННАТА китайска медицина, или могат да бъдат нови съставки, образувани от взаимната реакция на различни компоненти в традиционната китайска медицина, или могат да бъдат ендогенни физиологични активни вещества, произведени от директното действие на лекарствата по тялото. Следователно, тези кръвни съставки могат да представляват основата на фармакодинамичната субстанция на традиционната китайска медицина и комбинираната медицина. Анализът на компонентите и метаболитите, които могат да навлязат в кръвта след перорално приложение и търсенето на правилата за взаимодействие на компонентите, може да осигури определена основа за основните изследвания на фармакодинамичните вещества.

Методът за увеличаване на теглото на матката на мишки и МТТ колориметрията бяха използвани за скрининг на естроген-подобните активни части и дозировката на cistanche deserticola. Предварителните експериментални резултати показват, че маточният коефициент на незрели мишки е значително увеличен чрез интрагастрално приложение на етанол (95 процента) екстракт от cistanche deserticola при 3 0 g / kg на ден, а серумът, съдържащ лекарството, насърчава пролиферацията на McF-7 клетки значително (P <0.01), което="" е="" активната="" част="" от="" естроген-подобния="" ефект="" на="" cistanche="">

В това проучване е използвана високоефективна течна хроматография-квадруполна времепролетна масспектрометрия (HPLC-Q-TOF MS) за анализиране и идентифициране на кръвните съставки, прототипните компоненти и метаболитите на активните части на цистанхе след прилагане на cistanche с естроген и да се спекулира метаболитният път, за да се осигури основа за основното изследване на фармакодинамичните вещества на cistanche с естроген.

1 Експериментална част

1.1 Инструменти и реактиви

Waters-600 Течен хроматограф: Waters Co., LTD., оборудван с градиентна помпа с четири елемента, автоматичен пробоотборник, машина за вакуумно дегазиране, температурна кутия на колоната, DAD детектор, химическа работна станция Empower;

Agilent-1290 6530 серия Q-TOF LC-MS масспектрометър: продукти на американската компания Agilent;

Xw-80вихров миксер: Shanghai Yugong Machinery Co., LTD.

Dk-80 Електрическа термостатна водна баня: Shanghai Yiheng Technology Co., LTD.

Алк-110. 4 Аналитична везна: Shanghai Renhe Scientific Instrument Co., LTD.

H66MC ултразвуков осцилатор: Ohaus Technology Co., LTD.

Cistanche deserticola: закупен от пазара за лечебни билки San Ke Shu, идентифициран като Cistanche deserticola от професор Zhang Delian от Харбинския търговски университет.;

Лопен (партида № 111530-200505), ехинозид (партида № 111670-200503), салидрозид (партида № 110736-200628): всички предоставени от Китайския национален институт за контрол на фармацевтични и биологични продукти ;

Етилен стилбестрол: Guangzhou Hampden Pharmaceutical Co., LTD. Метанол и ацетонитрил: клас HPLC, продукти на Shandong Yuwang Reagent Co., LTD. Другите реактиви са аналитично чисти.

Експериментална вода: чиста вода.

Женски плъхове Wistar: Партиден номер SCXK-(JI) 2003 -- 2004, тегло (220 ± 20) g, предоставено от Центъра за експериментални животни на Националната база за биологична индустрия в Чанчун.

1.2 Приготвяне на интрагастрален лекарствен разтвор

Суровият прах от cistanche deserticola се екстрахира чрез екстракция с обратен хладник с 95 процента етанол и след това се екстрахира последователно с 8 пъти разтворител за 150 минути, 6 пъти разтворител за 75 минути и 6 пъти разтворител за 75 минути. След това трите екстракта се комбинират и кондензират под налягане, за да се получи екстрактът, който се съхранява в хладилник за по-късна употреба. Преди употреба се използва дестилирана вода за приготвяне на интрагастрален разтвор с концентрация 1,5 g/mL.

1.3 Приготвяне на сравнителен разтвор

Беше взето точно количество лопен, салидрозид и ехинакозид и напълно разтворено в метанол, за да се приготви 1 mL смесен контрастен разтвор, всеки съдържащ 0.2 mg от трите референтни вещества. Прекарайте разтвора на референтното вещество през 0.45 μm филтърна мембрана и оставете настрана.

1.4 Приготвяне на медикаментозен серум и празен серум

Приготвяне на серум, съдържащ лекарство: претеглете женски плъхове Wistar, дайте им съответно 1 mL /100 g на ден, дайте им дестилирана вода и разтвор за сонда два пъти сутрин и вечер, в продължение на 3 последователни дни, 60 минути след последната доза, анестезирайте с 2 ml/kg 10 процента хлоралхидрат чрез интраперитонеална инжекция. Взема се кръв от чернодробна портална вена и се центрофугира при 3 000 r /min за 10 минути след пълно съсирване. Тогава супернатантата беше серум, съдържащ лекарство.

Приготвяне на празен серум: плъховете са интрагастрални с равен обем дестилирана вода всеки ден, а другите методи за приготвяне са същите като при серум, съдържащ лекарство.

Взет е mL серум, съдържащ лекарство, добавено е 5 пъти количеството метанол и е извършено завихряне в центрофужната епруветка за 10 min. Центрофугирането се извършва при 14 000 r /min за 10 min, и супернатантата се абсорбира и разтворителят се изсушава. 0.5 mL метанол се добавят с микропипета за разтваряне на остатъка. Остатъкът се филтрува през 0.22 цт микропореста мембрана и се анализира чрез хроматография.

1.5 Експериментални условия

Хроматографски условия: колона Waters Symmetry ShieldTM RP18 (4,6 mm × 250 mm × 5 μm); Пред колона: Nova - PakC18 Guard - PakTM; Скорост на потока: 0.5 mL/min; Инжекционен обем: 10 μL; Подвижна фаза: ацетонитрил-0.2 процента воден разтвор на мравчена киселина; Условия на градиент: 0-35 мин., 5 процента -34 процента ацетонитрил, 35-65 мин., 24 процента -26 процента ацетонитрил; Температура на колоната: 30 градуса; Дължина на вълната на детекция: 254 nm.

Условен йонен източник за масспектрометрия: източник на йонизация с електроразпръскване при атмосферно налягане (ESI); Скорост на потока: {{0}}.5 mL/min; Налягане на пулверизиращ газ: 0.2 MPa; Дебит на сух газ: 8. 0 л/мин; Температура на сушене: 30 градуса; Капилярно напрежение: 3,5 kV; Дебит на обвивния газ: 12.0 L/min; Температура на ножницата: 400 градуса. Избран е режим на сканиране на положителни и отрицателни йони и обхватът на масово сканиране е m/z 100 ~ 3 000.

2 Резултати и дискусия

2.1 HPLC-ESI-Q-TOF MS/MS анализ на химичните съставки в серума на естроген активните части на Cistanche deserticola

Беше извършен качествен анализ на съдържащите лекарство серумни проби от плъхове в естроген-активната част на Cistanche deserticola чрез ESI-MS детектор. Режимът на положителни йони и режимът на отрицателни йони бяха използвани съответно за сканиране и резултатите са показани на Фигура 1. Чрез сравняване на диаграмите на общия йонен поток от първо ниво на масовата спектрометрия на двата режима на сканиране на Фигура 1 беше установено, че общият йон потокът, получен в режим на отрицателни йони, имаше силни характеристики и висока чувствителност, така че сканирането в режим на отрицателни йони беше избрано в този експеримент.

В режим на отрицателни йони, esI-MS детектор беше използван за провеждане на качествен анализ на серум на плъх след прилагане на естрогенна активна част от Cistanche deserticola. Чрез сравнителен анализ на диаграма на общия йонен поток от първо ниво на сканиране на празен серум и серум за приложение бяха маркирани общо 13 пика на молекулни йони, както е показано на Фигура 2. Пикове 2, 3, 5, 7, 9 и 10 бяха приети за са прототипни компоненти, а пикове 1, 4, 6, 8, 11, 12 и 13 се приемат за метаболитни компоненти.

Според пиковете на молекулните йони, открити от всеки хроматографски пик в режим на отрицателни йони и относителното молекулно тегло, дадено от съответния характерен фрагмент, бяха отбелязани общо 13 ms пикове. Химическите съставки на 13 пика бяха идентифицирани чрез сравняване на UV-MS информацията за всяко стандартно вещество и позоваване на компонентите, докладвани в литературата, които бяха изброени в таблица 1.

Шест прототипни компонента са генипозид, салидрозид, Cistanche гликозид a, Echinacea гликозид, Mullein гликозид и Cistanche гликозид D;

Седем метаболитни компонента са 3,4-дихидрокси фенил етанол гликозид, метилиран Mullein гликозид, ацетилиран Cistanche гликозид g, 3,4-дихидрокси фенил етанол, ацетил тубулозид B, Cistanche гликозид B метаболит на глюкуронова киселина и метилиран{{ 4}},4-дихидрокси фенил етанол. Сред седемте метаболита се предполага, че пик 1 (3,4-дихидроксифенилетанол), пик 8 (3,4-дихидроксифенилетанол) и пик 13 (метилиран 3,4-дихидроксифенилетанол гликозид) са хидролитичните фрагменти на фенилетанол гликозиди в Cistanche deserticola; Пик 4 (метилиран лопен гликозид) е метаболитът на лопен гликозид; Пик 6 (ацетилиран Cistanche гликозид g) е метаболитът на Cistanche гликозид G; Пик 11 (ацетил гуанозин b) е метаболитът на гуанозин B; Пик 12 (метаболит на глюконовата киселина на Cistanche гликозид b) е метаболитът на Cistanche гликозид B.

Китайски йероглифи разширяват обяснението:

质谱信息 представлява информация за масовия спектър.

相对分子质量 представлява относителна молекулна маса

化合物推测结果 представлява резултати от спекулации на съставни части

代谢 представлява метаболитни компоненти

原型 представлява прототипни компоненти

2.2 Дискусия

В този експеримент hplc-q-tof MS се използва за идентифициране на 13 основни хроматографски пика в серума след прилагане на естроген-подобната активна част на Cistanche deserticola. Това може да са директно действащите вещества на Cistanche deserticola in vivo. В същото време той също така отразява, че ефикасността на традиционната китайска медицина е резултат от многокомпонентна координация, допълване или ограничение. Чрез анализ на 13 преходни компонента в кръвта е доказано, че фенилетанол гликозидите са основните активни компоненти на Cistanche deserticola. В последващото проучване ще бъде установена съответната връзка на ефекта на спектъра, за да се проучи корелацията на лекарствения ефект, така че да се изясни допълнително материалната основа на лекарствения ефект и да се установи връзката на дозата, времето и ефекта на многокомпонентните в различно време точки в тялото, така че да разкрие метаболитния път и метаболитния режим на Cistanche deserticola.

3 Изводи

В този експеримент беше използвана hplc-esi-q-tof MS / MS технология за анализ на кръвните компоненти на естроген като активни части на Cistanche deserticola и бяха идентифицирани 13 химични компонента, което е от голямо значение за изясняване на фармакодинамичната материална основа на естроген-подобните активни компоненти на Cistanche deserticola и може също да осигури надеждна основа за по-нататъшни изследвания и клинично лечение на Cistanche deserticola.