Изследване на най-добрия начин за приемане на екстракт от цистанче, здравна добавка, храна от цистанче

Автор:LI Yang, QIN Yadi, BUBIAJIAER Hayilati, YAO Jun, YUAN Jie, YOU Lin

（1. Факултет по фармация, Медицински университет Синдзян, Урумчи 830011;2. Синдзян Втори медицински колеж, Klamayi 834000;3. Hotan Dichen Pharmaceuticas & Biotech Co., Ltd., Hotan 848000）

Резюме:

Цел: Създаване на метод за идентифициране и определяне на четири фенилетанол гликозида (ехинакозид, тубулозид А, актеозид, изоактеозид) в парчета цистанш, неговите екстракти и свързани здравословни храни чрез TLC и QAMS.

Метод:

（1）TLC: Четири фенилетанол гликозида бяха идентифицирани чрез TLC с полиамиден филм като неподвижна фаза и хлороформ-метанол-оцетна киселина-вода （1,5∶2∶1∶7） като проявяващ се разтворител. Петното беше открито под ултравиолетова светлина при 365 nm.

（2）При използване на ехинакозид като вътрешна референция, относителните коригиращи фактори за тубулозид А, ацетонид и изоактеозид бяха използвани за изчисляване на съдържанието на всеки компонент. Резултатите от изчислението на метода QAMS бяха сравнени със стойностите на метода на външния стандарт.

Резултат: ТСХ петната от 4 фенилетанол гликозида （ехинакозид, тубулозид А, актеозид и изоактеозид） в парченца отвара от цистанче, екстракти и функционални храни бяха ясни с добро разделяне, силна специфична умерена Rf стойност. Възпроизводимостта на относителните коригиращи фактори на тубулозид А, актеозид и изоактеозид е добра и няма очевидна разлика между двата метода.

Заключение: Методът, установен в това проучване, е прост, точен и възпроизводим. Той може да предостави справка за контрол на качеството на ефективните компоненти на парчета отвара от цистанче, екстракти и функционални храни.

Ключови думи:цистанче; парченца отвара ; свързани продукти; гликозиди на фенетилов алкохол;TLC; QAMS

Cistanche deserticola YC Ma. е многогодишно паразитно тревисто растение от семейство Orobanchaceae. Използва се като лекарство със сухи месести стъбла с люспести листа. Cistanche е публикуван за първи път в "Shenlong Materia Medica" и е посочен като най-висок клас. Той е сладък на вкус, топъл по природа, солен и принадлежи към меридианите на бъбреците и дебелото черво. Има ефект на овлажняване на червата и лаксативи, ободряване на ян на бъбреците и благоприятно въздействие върху есенцията и кръвта. Произвежда се главно в Синдзян, Нинся, Вътрешна Монголия, Цинхай, Гансу и други сухи региони на северозападен Китай. Основните химични компоненти на Cistanche са фенилетаноидни гликозиди, иридоиди, лигнани, алкалоиди, монотерпени, захари, летливи масла и неорганични микроелементи. Сред тях фенилетаноидните гликозиди (Phys) са един от основните фармакологични компоненти, които имат фармакологична активност като антиоксидант, неврозащита, антивирусно, повишаване на имунитета, против умора и подобряване на паметта и повишаване на имунитета.

Предимства на екстракта от цистанче:

Екстрактът от цистанче се прави от сухи ензимно-инактивирани таблетки от цистанче, които се екстрахират и отделят. Изнася се в Япония, Южна Корея, Малайзия и други отвъдморски пазари и се използва широко в продукти за здравеопазване, козметика и фармацевтична индустрия. Здравният продукт, преработен отЕкстракт от цистанчекато суровина има двойни функции за грижа за здраветооблекчаване на физическата умораиподобряване на имунитета. Понастоящем липсват съответни стандарти за контрол за оценка на качеството на активните съставки на екстракта от Cistanche и продуктите за здравеопазване и е трудно да се гарантира качеството и безопасността на обработката и продажбите на пазара. Ехинацеята и вербаскозидът са компонентите на индекса за идентификация и определяне на съдържанието по т. наCistanche Tubulosaв изданието на Китайската фармакопея от 2020 г. В допълнение,Cistanche Tubulosaсъдържа и други фенилетаноидни гликозиди, като туберозин А, салидрозид, изовербазин, цистанхеозид С, цистанхеозид D, аурирозид, 2'-ацетилвербазин и др.Различни степени на антиоксидантни и невропротективни ефекти.Трудно е изчерпателно и точно да се оцени качеството му, като се използват само ехинакозид и вербаскозид като индикатори за откриване. В литературата се съобщава, че съдържанието на дукталозид А и изаверазид в Cistanche и Cistanche също е по-високо, достигайки {{0}}.29 процента, 0.21 процента, 0 0,06 процента и 0,10 процента, съответно.

Щракнете тук, за да научите повече предимства на cistanche

В тази статия е установена TLC идентификация на 4 фенилетаноидни гликозида (ехинакозид, туберозид А, вербаскозид, изораскозид) в отвара от парчета Cistanche Tubulosa и свързани продукти (екстракти, здравни продукти) и високоефективна течна хроматография (HPLC). Методът за определяне на съдържанието на метода за оценка (HPLC-QAMS) предоставя референция за по-нататъшно подобряване на метода за оценка на качеството на Cistanche Tubulosa.

1 Материал и методи за избор на най-добрия начин за приемане на Cistanche

1.1 Инструменти и реактиви

Shimadzu LC-20AT високоефективен течен хроматограф; Shimadzu LC-20AB високоефективен течен хроматограф; Agilent1260 високоефективен течен хроматограф; Аналитичен баланс (AB135-S, Mettler Toledo1o Company); KQ-500DE Ултразвукова почистваща машина

(KQ-500DE, Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Ltd.); Полуавтоматичен спотинг инструмент (CAMAG, Швейцария).

(1) Налични в търговската мрежа парчета отвара от Cistanche (S1, S2: Cistanche deserticola, произход в Alxa, Xinjiang; S3, S4: CistancheTunulosa, произход Xinjiang): закупени отWecistanche Co. Ltd.; Алкохолна екстракция на ензимни сухи таблетки, S6: водна екстракция на ензимно-инактивирани сухи таблетки, S7: ензимно-инактивирани сухи таблетки, алкохолна екстракция със смола) и здравни продукти (S8) се предоставят от Xinjiang Hetian Dichen Biotechnology Co., Ltd.

(2) Ехинацея референтно вещество (партиден номер: S-003-01904003, чистота: по-голяма или равна на 98 процента), туберозин А (партиден номер: G-066-11812016, чистота: по-голяма или равна на 98 процента ), вербаскозид (партиден номер: По-голям или равен на 98 процента) M-011-02103019, чистота: По-голям или равен на 98 процента), изаверазид (партиден номер: Y-073-11803024, чистота: По-голяма от или равно на 98 процента): Beijing Yingleike Technology Development Co., Ltd.

(3) Метанолът, ацетонитрилът и мравчената киселина са хроматографски чисти; хлороформът и ледената оцетна киселина са аналитично чисти; водата беше свръхчиста вода;

1.2 Експериментален метод

1.2.1 Идентифициране чрез тънкослойна хроматография

1.2.1.1 Приготвяне на тестовия разтвор Вземете тестовия прах (0.5g парченца отвара от Cistanche, 0.2g екстракт от Cistanche, 0.5g здравословен продукт), добавете 20mL от 50 процента метанол, обработете го ултразвуково за 15 минути и филтрирайте.

Филтратът се концентрира до 2 mL, преминава през микропореста мембрана 0.45 μm и се използва като тестов разтвор.

1.2.1.2 Приготвяне на разтвор на референтно вещество Претеглете точно 10 mg ехинакозид, вазозид А, вербаскозид и изораскозид референтно вещество, добавете 50 процента метанол за разтваряне и разредете до обем от 10 ml

бутилка, като референтен стандартен стандартен изходен разтвор. Измерете точно около 2 mL от единичния стандартен изходен разтвор на всяко референтно вещество, добавете 50 процента метанол към същата мерителна колба от 10 ml и прекарайте през 0,45 μm микропореста мембрана като смесен референтен разтвор.

1.2.1.3 Приготвяне на разтвор на отрицателна проба Претеглете други медицински материали, различни от Cistanche, според предписанието на здравния продукт и действайте съгласно същия метод за приготвяне на разтвора за тестване, за да подготвите разтвора на отрицателната проба.

1.2.2 Определяне на съдържанието чрез метода на един тест и множество оценки

1.2.2.1 Хроматографски условия Колона: INERTSIL ODS-3 (250mm×4.6mm, 5μm); подвижна фаза: ацетонитрил (A) -0.1% разтвор на мравчена киселина (B), градиентно елуиране (0 ~ 12 минути, 17 процента ~ 20 процента A; 12 ~ 30 минути, 20 процента ~ 22 процента A ; 30~35 минути, 22 процента ~17 процента A); Дължина на вълната на детекция: 330nm; Скорост на потока: 1,0 ml · min-1; Температура на колоната: 30 градуса; Инжекционен обем: 10 μL.

1.2.2.2 Приготвяне на разтвор на референтно вещество Вземете около 10 mg ехинакозид, туберозин А, вербаскозид и изораскозид референтно вещество всяко, претеглете ги точно и ги поставете съответно в 10 ml мерителни колби, като използвате 50 процента

Разтворете метанола и долейте до марката, разклатете добре, за да получите единичния стандартен основен разтвор на референтното вещество с концентрации съответно 1.008, 1,011, 1,012 и 1,012 mg·mL-1. Измерете точно подходящо количество от единичния стандартен изходен разтвор на всяко референтно вещество, поставете го в същата мерителна колба от 10 ml, добавете 50 процента метанол до марката, разклатете добре и пригответе смес с концентрация 201,60, 50,55, 101,20 , 50,60 ug·mL-1 Референтният разтвор се прекарва през 0,45 μm микропореста мембрана.

1.2.2.3 Приготвяне на разтвора за изпитване

① Разтвор за тестване на парченца отвара от цистанче: претеглете около 1.0g прах от парченца отвара от цистанче (прекарани през сито № 4), претеглете точно, добавете точно 25 ml 50 процента метанол, разклатете добре , претеглете и ултразвуково (мощност 250w, честота 35kHz) 40 минути, оставете да изстине, претеглете отново, добавете намаленото тегло с 50 процента метанол, разклатете добре, филтрирайте през филтърна хартия и прекарайте филтрата да премине през 0,45 μm микропореста мембрана .

②Разтворът на екстракт от Cistanche за тестване: вземете праха от екстракт от Cistanche (S5: екстрахирани с алкохол ензимно-инактивирани сухи люспи, S6: екстрахирани с вода ензимно-инактивирани сухи люспи, S7: екстрахирани с алкохол ензимно-инактивирани сухи люспи със смола) около 0.2 g. Претеглете прецизно и пригответе тестовия разтвор на екстракт от Cistanche съгласно метода под "①". ③Разтвор за тестване на здравни продукти: Вземете 10 здравни продукти, претеглете ги точно, смилайте ги фино, изчислете средното тегло на таблетката, претеглете точно 1 таблетка (около 0,5 g) и пригответе здравните продукти според метод под "①". Тестово решение.

2 Резултати и анализ на избора на най-добрия Cistanche

1.1 Инструменти и реактиви

2.1 Идентифициране чрез тънкослойна хроматография

Съгласно теста за тънкослойна хроматография (Общо правило 0502), изтеглете съответно 2 μL от единичен стандартен разтвор на референтното вещество, смесен разтвор на референтно вещество, тестов разтвор и отрицателен разтвор на проба и ги насочете към същия разтвор на полиакриламид.

Върху плочата с аминен филм използвайте хлороформ-метанол-ледена оцетна киселина-вода (1,5:2:1:7) като проявяващ агент, проявете, извадете, изсушете и проверете под ултравиолетова светлина (365 nm). Резултати Тестваното вещество показа флуоресцентни петна от същия цвят на съответната позиция на хроматограмата на референтното вещество и нямаше интерференция, когато беше отрицателен, както е показано на фигура 1.

Фигура 1 TLC хроматограми на парченца цистанш, екстракт, здравословни продукти

Забележка: Отляво надясно са ехинакозид, туберозид А, вербаскозид, изаверазид, смесена референтна субстанция, отвара от цистанче (S1 ~ S4), екстракт от цистанче (S5 ~ S7), продукти за здравеопазване (S8), отрицателни здравни проби продукти (S8)

2.2 Определяне на съдържанието чрез метода на един тест и множество оценки

2.2.1 Тест за специфичност

Вземете 10 μL от всеки смесен референтен разтвор и тестовия разтвор, инжектирайте и анализирайте в съответствие с хроматографските условия съгласно 1.2.2.1. Разделителната способност между целевия пик и съседните компоненти в референтния разтвор и тестовия разтвор е по-голяма от 1,5 и специфичността е добра. , а хроматограмата е показана на фигура 2.

2.2.2 Изследване на линейната връзка

Начертайте точно 0.5, 1, 2,5, 5 и 10 mL от смесения референтен разтвор под "1.2.1.2", поставете ги в мерителни колби от 10 mL, долейте до марката с 50 процента метанол и разклатете добре, за да получите серия от концентрирани смеси.

Комбинирайте референтния разтвор, прецизно пипетирайте съответно 10 μL и инжектирайте проби в съответствие с хроматографските условия в "1.2.2.1", за да измерите площта на пика. за

Седнете вертикално, начертайте регресионна крива и изчислете линейна регресия. Резултатите показват, че всички r са по-големи от 0.9993 и четирите фенетил гликозида показват добра линейна връзка с площта на пика в рамките на съответния линеен диапазон, както е показано в таблица 1.

Фигура 2 HPLC спектър на референтно вещество и вещество на пробата

1. ехинакозид;2. Тубулозид А;3. актеозид;4. Изоактеозид

Забележка:

A. Хроматограма на смесено референтно вещество;

B. Хроматограма на парчета Cistanche Docation;

C. Хроматограма на екстракт от Cistanche;

D. Хроматограма на здравна добавка

Таблица 1 Резултати от линейна връзка на 4 компонента

2.2.3 Тест за точност

Прецизно пипетирайте 1{{10}} μL от смесения референтен разтвор в "1.2.1.2", инжектирайте и измервайте 6 пъти непрекъснато в съответствие с хроматографските условия в "1.2.2.1", запишете площта на пика и изчислете си RSD. Резултати RSDs на пиковите площи на ехинакозид, туберозин А, вербаскозид и изовераскозид бяха съответно 0.79 процента, 1,24 процента, 0,59 процента и 0,42 процента (n=6), което показва, че прецизността на инструмента беше добра.

2.2.4 Тест за повторяемост

Вземете 6 копия от същата партида тестови прахове (S3, S6, S8), претеглете ги точно, пригответе тестовия разтвор съгласно "1.2.1.3", измерете според хроматографските условия в "1.2.2.1" и запишете пик площ, съдържанието на 4-те компонента и техните RSD бяха изчислени. Резултатите са показани в таблица 2, което показва, че методът има добра възпроизводимост.

Таблица 2 Повтарящи се тестове

2.2.5 Тест за стабилност

Изтеглете точно 10 μL от тестовия разтвор (S3, S6, S8), измерете в съответствие с хроматографските условия в "1.2.2.1" и инжектирайте проби в 0, 2, 4, 6, 8, 12 и 24 часа съответно за измерване. Резултати RSDs (n=7) на пиковите площи на ехинакозид, аналозид А, вераскозид и изаверазид в проба (S3) са съответно 1,28 процента, 1,82 процента, 1,52 процента и 1,56 процента. RSDs (n=7) на пиковите площи на четирите компонента в пробата (S8) са съответно 1,38 процента, 1,57 процента, 1,73 процента и 2,49 процента, а RSDs (n=7) от площите на пика на четирите компонента в пробата (S8) са 1,63 процента, 0,92 процента, 1,85 процента и 2,24 процента, което показва, че тестовият разтвор е стабилен в рамките на 24 часа.

2.2.6 Тест за възстановяване

Претеглят се 9 праха от тестовия продукт (S3, S6, S8) с известно съдържание, претеглят се точно и се приготвя тестовият разтвор съгласно метода в "1.2.2.3". Добавете пропорционално определено количество от референтния разтвор на четирите компонента, инжектирайте и измерете в съответствие с хроматографските условия в "1.2.2.1", запишете площта на пика, изчислете степента на възстановяване и неговия RSD и резултатите са показани в таблица 3 .

Таблица 3 Резултати от нивата на възстановяване на пробите（n=3）

2.2.7 Изчисляване на относителен корекционен фактор

Относителният корекционен фактор се изчислява чрез метода на многоточкова корекция, съгласно формулата fi/s=fi/fs=(Wi×AS)/(WS×Ai), където fi/s е относителният корекционен коефициент между тествания компонент и вътрешния еталон, Ai, AS са пиковите площи на компонента, който се измерва, и вътрешния еталон, съответно, и Wi и WS са количествата на компонента, който трябва да бъде измерен и вътрешната справка, респ.

Като използвате ехинакозид като вътрешен еталон, вземете 1, 2, 5, 10, 15, 20 и 30 μL от смесения референтен разтвор, за да го преобразувате в инжекционния обем, инжектирайте и измерете в съответствие с хроматографските условия под "1.2.2.1" . Измерете относителния корекционен фактор (fi/s) на дуктозид A (B), вербаскозид (C), изаверазид (D) и вътрешен референтен ехинакозид (A) и вземете средната стойност като относителна корекция за количествено определяне RSD на относителния беше изследван корекционен фактор, изчислен на 7 точки. Резултатите показват, че RSD на относителния коригиращ фактор на трите тествани компонента и вътрешния референтен ехинакозид са по-малко от 3 процента, както е показано в таблица 4.

Таблица 4 Относителни коригиращи фактори (fi/s) на 3 компонента и вътрешна референция на ехинакозид

Забележка: A: Ехинацея, B: Туберозид A, C: Вербазин, D: Изаверазид

2.2.8 Възпроизводимост на относителните коригиращи фактори

Бяха изследвани съответно три високоефективни течни хроматографа, Shimadzu LC-20AT, Shimadzu LC-20AB, Agilent1260 и INERTSILODS-3 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), XBridgeC18.

Ефектите на три хроматографски колони (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) и Agilent C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) върху относителния корекционен фактор и изчисляването на RSD, всички резултати са по-малко от 3 процента, което показва, че установеното относително корекционен фактор в различни високоефективни течности. Фазовият хроматограф и различните хроматографски колони са възпроизводими, резултатите са показани в таблица 5

Таблица 5 Относителни корекционни коефициенти（fi/s）от 3 компонента и ехинакозид чрез различни инструменти и различни HPLC колони

Забележка: A: Ехинацея, B: Туберозид A, C: Вербазин, D: Изаверазид

2.2.9 Позициониране на хроматографските пикове на компонентите за измерване

Съгласно времето на задържане, получено в „2.2.8“, изчислете относителната стойност на задържане на компонента, който ще се изпитва, и вътрешния референтен ехинакозид (ri/s= tRi/tRs, където tRi и tRs са времето на задържане ) и неговия RSD. Резултати RSDs на относителните стойности на задържане на компонентите, които трябва да бъдат тествани, бяха по-малко от 5 процента, което показва, че относителните стойности на задържане са стабилни и могат да бъдат използвани за местоположението на хроматографските пикове на компонентите, които трябва да бъдат тествани. Резултатите са показани в Таблица 6.

2.2.10 Сравнение на резултатите от измерването между един тест и метод на множество оценки и външен стандартен метод

Претеглете прецизно всяка партида от проби, пригответе тестовия разтвор съгласно точка "1.2.1.3", изтеглете точно 10 μL от смесения референтен разтвор и тестовия разтвор и инжектирайте пробите в съответствие с хроматографските условия под "1.2.2.1". , запишете пиковите площи на четирите компонента и използвайте външния стандартен метод и установения метод за оценка с едно измерване и множество (Wi=fi/s×Ws×Ai/As), за да изчислите съдържанието на съответно четири компонента. Резултатите са показани в таблица 7. Софтуерът SPSS 26.0 беше използван за анализиране на резултатите от двата метода чрез t тест, P > 0,05, което показва, че няма значителна разлика между съдържанието, измерено от външния стандарт метод и съдържанието, изчислено чрез метода на един тест, многократна оценка, което показва, че методът на едно измерване и многократна оценка може да се използва за парчета отварка от Cistanche deserticola, изследвания за контрол на качеството на активни съставки в екстракти и здравни продукти.

Таблица 6 Относителни стойности на задържане（ri/s）от 3 компонента и ехинакозид чрез различни инструменти и различни HPLC колони

Забележка: A: Ехинацея, B: Туберозид A, C: Вербазин, D: Изаверазид

3 Заключение от изборанай-добрият начин за приемане на Cistanche

За да се подобри ефективността на идентификацията и разнообразието от методи за идентификация, този тест добави два компонента, дуктозид А и изаверазид, на базата на идентификационния тест под елемента Cistanche deserticola в изданието от 2020 г. на Китайската фармакопея. Използвани са условията за развитие на фармакопеята: метанол. - Ледена оцетна киселина - вода=2:1:7, беше установено, че степента на разделяне на ехинакозид и туберозид А не може да отговори на изискванията и беше извършен скрининговият тест съответно на стационарната фаза и проявяващия агент.

Използване на плоча от полиамиден филм, тънкослойна плоча от силикагел G, тънкослойна плоча от силикагел H като неподвижна фаза, ацетон-метанол-ледена оцетна киселина-вода=1:2:1:7, метанол-ледена оцетна киселина -вода=4:1: 5. Етилацетат:етанол=6:4, n-бутанол-етанол-вода=4:1:5, трихлорометан-метанол-ледена оцетна киселина-вода =1.5:2:1:7 Резултати При използване на полиамидна филмова плака като неподвижна фаза, хлороформ-метанол-ледена оцетна киселина-вода=1.5∶2∶1∶7, петната бяха ясни , разделянето беше добро, Rf стойността беше умерена и повторяемостта беше добра. Бързо и точно характеризиране на съставките. Методът с едно измерване и множество оценки е многоиндексен синхронен метод за контрол на качеството, който се използва главно при определянето на подобни структурни компоненти в една традиционна китайска медицина. Четирите компонента, измерени в този експеримент, имат сходни структури и сходни максимални дължини на вълната на поглъщане (гликозиди на ехинацея при 330 nm, туберозид A331 nm, вербаскозид 330 nm, изораскозид 327 nm), така че този метод може да се използва. Използвайки ехинакозид като вътрешна референция, установеният коефициент на калибриране има добра възпроизводимост в различни хроматографски системи и хроматографски колони и няма значителна разлика между резултатите от съдържанието на метода с едно измерване с множество оценки и метода на външния стандарт, което показва, че методът е осъществим и точен и може да се използва в референтното вещество. Ако е трудно за получаване или скъпо, може да постигне множество показатели за Cistanche deserticola

Съставките се определят едновременно.

Таблица 7 Съдържание на всеки компонент（процента,n=3）

В заключение, създаването на метод за идентифициране на четири фенилетаноидни гликозида в Cistanche отTLCи определянето на съдържанието в един тест с множество оценки е точно, надеждно, просто, бързо и много осъществимо. Има практическо научно значение и приложна стойност.