Полизахаридите на Cistanche Deserticola облекчават когнитивния спад и подобряват паметта при застаряващи моделни мишки
Mar 30, 2022
Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com
Yuan Gao1,*, Bing Li1,*, Hong Liu1, Yajuan Tian2, Chao Gu1, Xiaoli Du1, Ren Bu1, Jie Gao1, Yang Liu1, Gang Li1
РЕЗЮМЕ
Скорошни доказателства сочат, че промените в оста чревна микробиота-мозък могат да доведат до когнитивно увреждане с остаряването. В настоящото изследване наблюдавахме, че продължителното прилагане на D-галактоза на мишки предизвиква когнитивен спад, чревна микробна дисбиоза, периферно възпаление и оксидативен стрес. В този модел на свързан с възрастта когнитивен спад, полизахаридите на Cistanche deserticola (CDPS) подобряват когнитивната функция при мишки, третирани с D галактоза, като възстановяват чревната микробна хомеостаза, като по този начин намаляват оксидативния стрес и периферното възпаление. Благоприятните ефекти на CDPS при тези стареещи моделни мишки бяха премахнати чрез аблация на чревната микробиота с антибиотици или имуносупресия с циклофосфамид. Серумното метаболомно профилиране показва, че нивата на креатинин, валин, L-метионин, о-толуидин, N-етиланилин, пикочна киселина и пролин са били изцяло променени в стареещия модел мишки, но са били възстановени от CDPS. Тези открития показват, че CDPS подобрява когнитивната функция в модел на стареене, предизвикан от D-галактоза при мишки, чрез възстановяване на хомеостазата на мозъчната ос на чревната микробиота, което облекчава аминокиселинен дисбаланс, периферно възпаление и оксидативен стрес. По този начин CDPS показва терапевтичен потенциал за пациенти с нарушения на паметта и ученето, особено тези, свързани с чревна микробна дисбиоза.
ВЪВЕДЕНИЕ
Продължителното приложение на D-галактоза (D-gal) и берилиеви соли предизвиква стареене в експериментални животински модели и in vitro първични клетъчни култури и се използва за идентифициране на механизми, лежащи в основата на естествения процес на стареене [1–4]. Предишни проучвания показват, че когнитивен спад при мишки модел на стареене, индуциран от D-галактоза, е свързан с намалени нива на протеин на нервния растежен фактор (NGF) и повишени реактивни кислородни видове (ROS) в мозъка, като и двете причиняват дегенерация на невроните на хипокампа и намаляват неврогенеза [3, 4]. Последните проучвания също така показаха, че съставът и броят на човешката чревна микробиота се променят значително по време на процеса на стареене [5].
Cistanche deserticola е билка, която расте главно в северозападния пустинен район на Китай и се използва в традиционната китайска медицина. Той е известен като "женшен на пустинята". Екстрактите от Cistanche deserticola съдържат няколко фармакологично активни съединения, включително фенилетаноидни гликозиди, иридоиди, лигноза, олигозахариди, полизахариди и аминокиселини; тези съединения са свързани с противовъзпалителни, антиоксидантни, антисенесцентни, невропротективни и имуномодулиращи свойства [6, 7]. Например, полизахаридите, извлечени от Cistanche deserticola, са били използвани в традиционната китайска медицина за лечение на колоректален рак [8]. Широка гама от слабо токсични полизахариди с полезна биоактивност е изолирана от няколко организма, като полизахарид Chuanqiong, полизахарид Ganoderma lucidum и полизахарид Lycium barbarum [9–11]. CDA 0.05 е галактоглюкан, изолиран от Cistanche deserticola, който насърчава растежа на няколко полезни чревни бактерии, включително няколко вида Bacteroides и Lactobacillus [12].
Основните механизми на нормалния процес на стареене също са замесени в няколко човешки заболявания като невродегенеративни разстройства, коронарна атеросклероза, диабет тип 2 (T2DM) и хипертония [13, 14]. Последните проучвания показват, че промените в чревната флора играят значителна роля в остаряването на човека [15]. Няколко проучвания показват, че продължителното прилагане на D-галактоза при експериментални мишки и плъхове имитира нормалния процес на стареене и е полезен модел за изследване на фенотипове, свързани със стареенето, като влошаване на когнитивните способности [16]. Освен това, индуцираното от D-галактоза модел на стареене мишки показва промени в състава на чревната микробиота [17]. Следователно, ние предположихме, че промените в състава на чревната микробиота могат да причинят когнитивен спад при D галактоза-индуциран модел на стареене на мишки и проучихме дали полизахаридите на Cistanche deserticola (CDPS) могат да облекчат когнитивния спад чрез възстановяване на дисбиозата на чревната микробиота.
стъбло цистанче
РЕЗУЛТАТИ
D-галактоза-индуциран модел на стареене мишки демонстрират когнитивен спад и чревна микробна дисбиоза
Ние анализирахме поведенческото представяне на мишки от див тип (WT) и тези, третирани със 150 mg D-gal на Kg телесно тегло в продължение на 2 месеца (модел или мод), използвайки тестове за разпознаване на нови обекти и воден лабиринт на Морис (MWM). Стойностите на преференциалния индекс в теста за разпознаване на нови обекти бяха значително намалени при мишките от групата Mod в сравнение с мишките от групата WT (Фигура 1A, 1B). Резултатите от теста MWM показаха, че латентното време на бягство след шестия ден е значително увеличено в групата Mod в сравнение с групата WT (Фигура 1C, 1D). Освен това пресичанията на целевата платформа и времето за плуване в целевия квадрант бяха значително намалени в групата Mod в сравнение с групата WT (Фигура 1E, 1F). Тези резултати демонстрират значителен спад в способностите за учене и памет на мишките с модел на стареене, предизвикано от Легал.
След това анализирахме разликите в изобилието и състава на чревните микробни фили, родове и видове във фекалните проби на Mod и WT групите мишки, използвайки данни за секвениране на 16S рибозомна РНК (rRNA) от фекални проби. Преобладаващата чревна флора в мишките от групата WT и Mod бяха Firmicutes и Bacteroides. Въпреки това, изобилието на Bacteroides беше значително намалено и изобилието на Firmicutes беше значително увеличено в групата Mod в сравнение с групата WT (Фигура 2A). След това проведохме линеен дискриминантен анализ (LDA), за да определим резултатите от размера на LDA ефекта (LEfSe), последвани от тестове на Kruskal-Wallis и Wilcoxon, за да оценим относителното изобилие на различни таксони в WT и Mod група мишки. Резултатите от LDA са показани на фигура 2B. Освен това, ние конструирахме кладограми, показващи диференциално обогатяване на различни родове и видове, принадлежащи към Bacteriodes и Firmicutes phyla в WT и моделни групи (Фигура 2C). Като цяло, нашите резултати демонстрираха нарушена когнитивна способност и чревна микробна дисбиоза при индуцираното от D-галактоза модел на стареене мишки.
ползи за здравето на cistanche: антиоксидация
Лечението с CDPS подобрява когнитивните способности при мишки с модел на стареене, предизвикано от D-gal
Ние анализирахме дали лечението с CDPS облекчава когнитивния спад при мишки модел на стареене, предизвикано от D-gal. През 2-те месеца на приложение телесното тегло се измерва през ден. Телесното тегло на модела и CDPS групите мишки са сходни (Фигура 3А). Провеждайте поведенчески експерименти след последната доза. Разпознаването на нови обекти и резултатите от теста за воден лабиринт на Морис показват, че краткосрочната памет е значително по-висока в CDPS групите мишки в сравнение с моделната група мишки; дългосрочната памет в CDPS групата мишки е по-висока, но статистически незначима в сравнение с моделната група мишки (Фигура 3B, 3C). Това предполага, че лечението с CDPS отменя загубата на памет за краткосрочно разпознаване на обекти при мишки, третирани с D-gal.
Пространственото учене и паметта на тези мишки бяха оценени чрез теста за воден лабиринт на Морис и резултатите показаха, че латентните времена на бягство на CDPS групата мишки са сравними с WT групата мишки и значително по-кратки от Mod групата мишки (Фигура 3D) . Освен това, времето за латентност на бягство беше значително по-ниско на шестия ден след прилагането на CDPS в сравнение с моделната група (Фигура 3E). Времето за плуване в рамките на целевия квадрант е значително по-високо в CH и CM групите в сравнение с моделната група. Групата CL е по-висока от моделната група, но няма статистическа значимост (Фигура 3F). Освен това броят на пресичанията на платформата е значително по-висок в групите CM и CL в сравнение с групата на модела. Групата CH обаче е по-висока от моделната група и няма статистическа значимост (Фигура 3G). Тези резултати показват, че лечението с CDPS подобрява пространственото учене и паметта при D-gal-индуцирано модел на стареене мишки.
Фигура 1. Продължителното прилагане на D-галактоза предизвиква учене и увреждане на паметта при мишки.
Фигура 2. Продължителното приложение на D-галактоза индуцира чревна микробна дисбиоза при мишки.
Лечението с CDPS възстановява хомеостазата на състава на чревната микробиота при мишки с модел на стареене на D-галактоза
Монозахаридите и полизахаридите са основните хранителни вещества, необходими за растежа на бактериите [18–21]. Също така се съобщава, че CDPS регулира състава на чревната микробиота [22]. Следователно, ние анализирахме дали лечението с CDPS облекчава чревната микробна дисбиоза в моделната група мишки чрез оценка на данните за секвениране на 16S rRNA на проби от фекалии от WT, модел и CDPS групи мишки.
Първо, изчислихме индексите на алфа разнообразие, за да оценим общото богатство на фекална микробиота и структурната разлика между тези групи. Ние анализирахме индекси на алфа разнообразие (-разнообразие), като наблюдавани видове, стойности на индекса Shannon, Chao 1, ACE и Simpson, за да определим промените в състава на различни бактериални видове в пробите от изпражнения на различни миши групи. Индексите на -разнообразието (наблюдавани видове, индекси на Шанън, Chao 1, ACE и Simpson) са по-високи в WT и CDPS групите мишки в сравнение с моделната група, но статистическата значимост се наблюдава само за стойностите на индекса Chao 1 между CM група и мод група. Той показва, че прилагането с CDPS увеличава богатството на микробиома (Фигура 4A–4E). След това анализирахме индексите на разнообразие, за да идентифицираме разликите в чревните микробни видове между WT, моделни и CDPS групи мишки, използвайки неметрично многомерно скалиране (NMDS), анализ на основните координати (PCoA) и анализ на основните компоненти (PCA) . PCA показа вариации в микробния състав на червата на моделната група мишки по време на процеса на стареене, включително намаляване на размерите и поддържане на модели и тенденции (Фигура 4F). Разликите във фекалната микробиота между групите WT, модел и CDPS бяха идентифицирани въз основа на PCoA на непретеглените UniFrac разстояния за 16S rRNA гените (Фигура 4G). Клъстерният анализ показа значителни разлики в NMDS между моделната група и WT и CDPS групите (Фигура 4H).
Ние оценихме топ 10 вида на чревната микробиота и открихме, че изобилието на вида Bacteroides е значително по-високо в групите CH, CM и CL в сравнение с моделната група (Фигура 4I). Това предполага, че CDPS възстановява хомеостазата на чревната микробиота при мишки, третирани с D-gal. Кладограмите показват различно обогатяване на различни родове и видове, принадлежащи към Bacteriodes и Firmicutes phyla в WT, модела и CDPS групите (Фигура 4J). Както е показано в топлинните карти, третирането с CDPS намалява относителното изобилие на Thermoplasmata, Bacilli, неидентифицирани Actinobacteria, Fusobacteriia и неидентифицирани Elusimicrobia и увеличава относителното изобилие на Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, неидентифицирани_Deferribacteres, Mollicutes, Nitrososphaeria, Anaerolineae ,Erysipelotrichia и неидентифицирани_цианобактерии в сравнение с моделната група (Фигура 4K). Тези резултати показват, че лечението с CDPS значително възстановява хомеостазата на чревната микробиота в D-gal-индуцираното стареене на модела на мишки.
Фигура 3. Лечението с CDPS подобрява ученето и паметта при мишки с модел на стареене на D-gal.
Лечението с CDPS облекчава невродегенерацията при D-gal-индуцираното стареене на мишки чрез намаляване на оксидативния стрес
След това анализирахме ефектите на CDPS върху възпалението, като анализирахме серумните нива на провъзпалителни цитокини (IL-2 и TNF-) и противовъзпалителни цитокини (IL-4 и IL-10 ) в различни групи мишки. Серумните нива на IL-2 и TNF- бяха значително по-ниски, а серумните нива на IL-4 и IL-10 бяха значително по-високи в групите CH, CM и CL в сравнение с модела група. Показано е, че CDPS има противовъзпалителни ефекти (Фигура 5A–5D).
Оксидативният стрес се причинява от повишеното производство на реактивни кислородни видове (ROS) и е един от основните фактори, които насърчават стареенето [23]. Ето защо, ние анализирахме ефектите на CDPS върху оксидативния стрес в миши модел на стареене, предизвикан от D-gal, чрез оценка на серумните нива на антиоксидантния ензим, SOD, и продукта на липидната пероксидация, малондиалдехид (MDA). Серумните нива на MDA са значително по-високи и серумните нива на SOD са значително намалени в Mod групата в сравнение с WT групата, но лечението с CDPS обръща тези ефекти (Фигура 5E, 5F). Тези резултати показват, че оксидативният стрес е повишен при D-gal-индуцираното стареене на мишки, но е намален чрез лечение с CDPS.
Освен това, ние оценихме нивата на оксидативен стрес в мозъчните тъкани, като анализирахме нивата на усъвършенствания окислен протеинов продукт (AOPP), директна липидна пероксидация (LPO) и MDA, както и активностите на антиоксидантни ензими като глутатион пероксидаза (GSH-Px ) и супероксид дисмутаза (SOD) в хомогенатите на мозъчната тъкан. Мозъците на мишки от група Mod показват значително намалени активности на SOD и GSH-PX и значително повишени нива на AOPP, LPO и MDA в сравнение с WT групата, но тези ефекти са обърнати в групата CH, CM и CL (Фигура 6A– 6E).
Освен това, ние извършихме хистологично оцветяване на мозъчни срезове с H&E и Nissl петна, за да оценим защитните ефекти на CDPS върху мозъците на D-gal индуцирано модел на стареене мишки. Мишките от групата Mod показаха значително намаляване на броя и обема на невроните, увеличена празнина между невроните, неравномерно подреждане на невроните и ядрена пикноза в областта CA1 на хипокампуса в сравнение с групата WT, но тези патологични промени бяха значително намалени от лечението с CDPS ( Фигура 6F). Тези резултати показват, че лечението с CDPS значително намалява оксидативния стрес и мозъчната патология при D gal-индуцирано модел на стареене мишки.
Фигура 4. Лечението с CDPS възстановява състава на микробите на червата в индуцираното от D-галактоза модел на стареене мишки.
Лечението с CDPS намалява периферното възпаление и оксидативния стрес чрез поддържане на чревната микробна хомеостаза в D-gal-индуцирани моделни мишки
След това анализирахме дали промените в състава на чревната микробиота са свързани с повишено периферно възпаление и оксидативен стрес по време на стареене. За тази цел използвахме троен антибиотичен коктейл (ABX група) или циклофосфамид (Cy група; вижте също Материали и методи), за да премахнете чревната микробиота или да индуцирате имуносупресия в моделите на стареене на мишки, третирани с CDPS. Антибиотичното лечение отмени благоприятните ефекти от лечението с CDPS при стареещите моделни мишки. Наблюдавахме нарушено учене и памет (Фигура 7A) и промени в състава на чревната микробиота (Фигура 7B, 7C) при мишки от групата ABX в сравнение с групата, третирана с CDPS. Горните резултати показват, че дори прилагането на CDPS не може да увеличи способността за учене и памет на мишки след промяна на чревната флора. Освен това, наблюдавахме повишени нива на провъзпалителни цитокини в мозъка и серума на мишки от групата ABX в сравнение с групата CDPS (Фигура 7D–7N). Резултатите от групата ABX и групата CY показват, че след като чревната флора и имунната функция са унищожени, дори прилагането на CDPS не може да подобри способността за учене и памет на мишките. Тези резултати предполагат, че лечението с CDPS намалява периферното възпаление, оксидативния стрес и когнитивния спад при мишките с модел на стареене, предизвикано от Legal, чрез предотвратяване на чревна дисбиоза.
След това използвахме имуносупресивното лекарство, циклофосфамид [24], за да определим ролята на възпалението в благоприятните ефекти на CDPS. Третираните с циклофосфамид CDPS мишки (Cy група) показват нарушена способност за учене и памет, промени в състава на чревната микробиота и анормални нива на про- и противовъзпалителни цитокини в мозъка и серума в сравнение с мишките от дивия тип и CDPS групата. Въпреки това, няма значение в сравнение с модела и групата ABX. (Фигура 7A–7N). Тези данни показват, че промените в състава на чревната микробиота увеличават периферното възпаление при D-gal-индуцирано модел на стареене мишки.
Фигура 5. Лечението с CDPS модулира циркулиращите нива на про- и противовъзпалителни цитокини и фактори, свързани с оксидативния стрес, в модела на мишки на стареене, предизвикан от D-галактоза.
CDPS предотвратява стареенето, предизвикано от D-gal, като регулира метаболизма на аминокиселините
Имунната система на гостоприемника се влияе от метаболитите, генерирани от чревната микробиота [25]. Фекалните метаболити представляват функционално отчитане на чревния микробен метаболизъм и чревния микробен състав [26]. Освен това метаболитите на чревната микробиота навлизат в кръвообращението и оказват влияние върху метаболизма и здравето на гостоприемника [26, 27]. Общо 1058 метаболита бяха идентифицирани в серумни проби от FWT, Mod и CDPS мишки. След това анализирахме тези метаболити с помощта на BioCyc, Киото Енциклопедия на гените и геномите (KEGG) и базата данни на човешкия метаболом (HMDB) и открихме, че 65 метаболита са диференциално експресирани в групата Mod в сравнение с групата WT. Освен това открихме, че нивата на 8 метаболита (креатинин, валин, L-(-)-метионин, о-толуидин, N етиланилин, пикочна киселина, пролин и фенилаланин) значително се различават между групите WT, Mod и CDPS. Анализът на обогатяване на пътя на тези 8 метаболита с помощта на MetaboAnalyst [28, 29] показа, че тези метаболити са свързани с метаболизма на аргинин, хистидин, аргинин, пролин и пурин (Фигура 8A, 8B). 7 различни метаболита на MOD група и CDPS група в WT група.
След това анализирахме дали промените в метаболизма на аминокиселините са свързани с промени в състава на чревната микробиота. Ние наблюдавахме, че 7 различни метаболита на групите WT, Mod и CDPS (креатинин, валин, L-(-)-метионин, о-толуидин, N-етиланилин, пикочна киселина и пролин) бяха значително намалени в ABX, Cy, и Mod групи в сравнение с WT и CDPS групите. Освен това няма значение между групите ABX и Cy (Фигура 8C). И накрая, за да проучим, има връзка между диференциалния метаболизъм и други заболявания, свързани със стареенето. Ние анализирахме корелацията между тези седем диференциално експресирани метаболита и човешки заболявания, използвайки базата данни MetaboAnalyst и установихме, че тези метаболити са свързани с болестта на Алцхаймер (p=0.00173; Фигура 8D, 8E). Като цяло, тези данни предполагат, че CDPS предпазва от стареене, предизвикано от D-gal, като регулира метаболизма на аминокиселините.
Фигура 6. Лечението с CDPS намалява оксидативния стрес в мозъците на индуцирано от D-галактоза модел на стареене мишки
ДИСКУСИЯ
Прогресивното намаляване на когнитивните функции е характерна черта на стареенето. Предишни проучвания показват, че лечението с CDPS значително подобрява ученето и паметта при стареещите модели на мишки [30–33]. В това проучване ние демонстрирахме, че лечението с CDPS подобрява когнитивната функция чрез инхибиране на периферното възпаление и оксидативния стрес чрез възстановяване на чревната микробна хомеостаза в модела на мишки на стареене, индуциран от D-gal (Фигура 9). Плъхове Sprague-Dawley, хранени с полизахариди Cistanche, показват повишен растеж на полезни чревни бактерии и повишено чревно микробно разнообразие [34]. CDA-0.05, неутрален полизахарид от Cistanche, подобрява растежа на пробиотичните лактобацили [22]. Тези данни предполагат, че полизахаридите Cistanche подобряват хомеостазата на чревните бактерии.
В това проучване ние демонстрирахме, че CDPS има противовъзпалителни ефекти и подобрява когнитивната способност на стареещите моделни мишки чрез модулиране на изобилието от чревни бактериални родове като Bacteroidetes, Firmicutes и Proteobacteria. Следователно, CDPs могат да бъдат терапевтично полезни за заболявания, свързани със стареенето, като променят състава на чревната микробиота [35,36]. Освен това предишни проучвания показват, че нивата на възпалителни цитокини в серума и дебелото черво са свързани с относителното изобилие от бактериални родове като Bacteroidetes, Firmicutes и Proteobacteria [37, 38]. Освен това микробният състав на червата регулира мозъчната функция чрез модулиране на циркулиращите нива на няколко цитокини [39–43]. Нашите резултати показват, че лечението с CDPS намалява относителното изобилие на Thermoplasmata, Bacilli, неидентифицирани Actinobacteria, Fusobacteriia и неидентифицирани Elusimicrobia и увеличава относителното изобилие на Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, неидентифицирани _Deferribacteres, Mollicutes, Nitrososphaeria, Anaerolineae, Еризипелотрихия и неидентифицирани_цианобактерии.
Чревните микробни метаболити се освобождават в кръвния поток и регулират здравето и метаболизма на гостоприемника [26, 27]. Метаболитите на чревните микроби могат да бъдат оценени чрез оценка на фекалния метаболитен състав, който се променя с промени в състава на чревните микроби [44]. Последните проучвания показват, че плазмените нива на цитрулин, пролин, аргинин, аспарагин, фенилаланин и треонин са свързани с невродегенеративни разстройства, включително болестта на Алцхаймер [45, 46]. Нашето проучване показа, че серумните нива на креатинин, валин, L-метионин, о-толуидин, N-етиланилин, пикочна киселина и пролин са свързани с индуцираното от D-gal стареене при мишки.
Екстракт от цистанче: против болестта на Алцхаймер
Вродените и адаптивни рамена на имунната система играят значителна роля в поддържането на хомеостазата гостоприемник-микроб в чревната луминална повърхност [47]. Чревната микробиота също играе важна роля в регулирането на централната нервна система (ЦНС) и имунитета чрез освобождаване на цитокини и метаболити в кръвния поток [48, 49]. Провъзпалителните цитокини играят ключова роля в няколко невродегенеративни заболявания [50–52]. Например свързаната с възрастта дегенерация на макулата (AMD) и глаукомата са свързани с извънклетъчно натрупване на амилоид (A ) и вътреклетъчно отлагане на хиперфосфорилиран tau (p tau) и желязо в ганглиозните клетки на ретината (RGC) [44]. Освен това възпалението играе значителна роля в патогенезата, свързана с глаукома [53]. Зрителното увреждане е ранен симптом на болестта на Алцхаймер (БА) и се проявява преди началото на когнитивния спад [54]. Нашето проучване показа, че CDPS предпазва от когнитивен спад и периферно възпаление чрез поддържане на хомеостазата на чревната микробиота.
Има няколко ограничения за това проучване. Първо, връзката между метаболизма на аминокиселините и състава на чревната микробиота не е добре известна. Второ, съставът и молекулярната структура на CDPS не са известни. Следователно са необходими бъдещи проучвания за по-нататъшно изследване на регулаторната роля на CDPS за облекчаване на AD чрез оста на чревната микробиота-мозъчна сигнализация.
В заключение, нашето проучване показа, че CDPS подобрява когнитивната способност при D-gal-индуцирано стареене модел мишки чрез възстановяване на хомеостазата на чревната микробиота, като по този начин възстановява аминокиселинния дисбаланс, периферното възпаление и оксидативния стрес. Тези открития предполагат, че CDPS е потенциално терапевтично средство за пациенти с нарушения на ученето и паметта, особено тези, свързани с чревна дисбиоза.
МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
Изготвяне на CDPS
Около 1.0 Kg почистена Cistanche deserticola беше изсушена на въздух във фурната при 40 градуса C и пулверизирана на суров прах. Прахът се екстрахира в горещ етанол в продължение на 3 часа. Остатъкът се филтрува през марля, за да се отстрани филтратът и след това се разрежда с вода (8Х) и се кипи последователно за 2 часа, 1,5 часа и 1 час при 90 градуса С. Във всяка точка от време разтворът се центрофугира, за да се отдели супернатантата и комбиниран с кафяво-червения филтрат. След това филтратът се концентрира при понижено налягане, охлажда се до стайна температура, добавя се бавно към 95 процента етанол (3Х) и се оставя да престои при 4 градуса С в продължение на 24 часа. След това разтворът се центрофугира при 6000 r/min за 20 минути при 4 градуса С. Утайката се събира след повторение на екстракция с вода и утаяване с алкохол три пъти. Утайката беше възстановена във вода, депротеинизирана, диализирана и лиофилизирана, за да се получи суров полизахарид от Cistanche deserticola (CDP). Съдържанието на полизахарид е повече от 90 процента, както е оценено чрез ултравиолетова спектрофотометрия.
екстракт от цистанче
Групиране на животни и лечение
Осемседмични мъжки мишки Kunming (SCXK лиценз №.2019-0010) бяха закупени от SPF Biotechnology Co. Ltd (Пекин, Китай), настанени в стая с контролирана светлина и температура и хранени с храна и вода. Всички експерименти с животни бяха проведени съгласно протоколи, одобрени от Комитета за институционална грижа и използване на животните на Медицинския университет на Вътрешна Монголия. Експериментите са проведени в съответствие с ръководството на Националния институт по здравеопазване (NIH) за грижа и използване на лабораторни животни.
След 1 седмица адаптиране към новата среда, 120 мишки бяха разделени на следните 7 групи: (1) див тип контрола (WT); моделна група (150 mg/Kg/ден D-gal; Mod); (3) CH: D-gal плюс 100 mg/kg CDPS; (4) CM: D-gal плюс 50 mg/kg CDPS; (5) CL: D-gal плюс 25 mg/kg CDPS; (6) АВХ група: антибиотици плюс D-gal плюс 50 mg/Kg CDPS; (7) Cy група: циклофосфамид плюс D-gal плюс 50 mg/kg CDPS.
Мишките от моделните, ABX, Cy и CDPS групите получават подкожни инжекции с разтворен във физиологичен разтвор 150 mg/kg D-gal всеки ден в продължение на 2 месеца. WT групата беше инжектирана подкожно с равен обем физиологичен разтвор в продължение на 2 месеца. Мишките от групата CDPS също се прилагат ежедневно с интрагастрални инжекции, съдържащи 100 mg/kg, 50 mg/Kg или 25 mg/Kg CDPS в продължение на 2 месеца. Мишките от групата ABX получават питейна вода с 0.1 mg/mL ампицилин и 0,5 mg/mL стрептомицин в продължение на 2 месеца в допълнение към D-gal и CDPS инжекции. Преди прилагането на D-gal, мишките получават инжекции, съдържащи 0,1 mg/mL ампицилин, 0,5 mg/mL стрептомицин и 0,1 mg/mL колистин в продължение на 7 дни в ABX групата. Мишките от групата Cy получават интраперитонеални инжекции от 20 mg/Kg циклофосфамид през ден (qod) в продължение на 2 месеца в допълнение към ежедневните инжекции на D-gal и CDPS.
Тест за разпознаване на нов обект
Провеждайте поведенчески експерименти след последната доза. Тестът за разпознаване на обект включва етапи на запознаване, обучение и тестване. По време на етапа на запознаване мишките се привикват в празна тестова камера за 10 минути в продължение на два дни. След това, на третия ден (ден на обучение), два обекта с еднакъв размер, форма и цвят (A1 и A2) бяха поставени в противоположните краища на камерата. След това на всяка мишка бяха дадени 10 минути, за да изследва двата подобни обекта. След 1- час (на третия ден) и 24- час (на четвъртия ден) интервали от обучение до тестване, един от подобните обекти (A1 или A2) беше заменен с B или C обект, който е различен по размер, цвят и форма в деня на тестването. По време на етапа на тестване всяка мишка беше тествана за 5 минути и преференциалният индекс беше изчислен, за да се определи паметта за разпознаване на нов обект (B или C), като се използва следната формула: Преференциален индекс=Време на обект B или C/ (Време на обект B или C плюс време на обект A) × 100 процента.
Тест с воден лабиринт на Морис
Тестът с воден лабиринт на Морис беше извършен в кръгъл басейн с дълбочина 45 cm и диаметър 90 cm. Протоколът, описан от Ruediger S, et al. (2011) [55] и Wood RA, et al. (2018) [56] е нает тук. Дълбочината на водата в басейна беше 30 cm, а температурата на водата беше 20±1 градуса C. Платформата беше с диаметър 6 cm и 1 cm под водата. Времето за обучение и тестване беше по 60 s. За обучение проведохме четири опита от по 60 s всеки със скрита платформа всеки ден в продължение на пет последователни дни. Ако платформата не беше открита от мишките за 60 s, те бяха насочени към платформата и поставени на платформата за 5 s. По време на етапа на тестване бяха записани и анализирани закъснението за достигане на скритата платформа в тренировъчни и пробни сесии за сонда, броят на пресичанията над местоположението на премахната платформа и времето, прекарано в целевия (платформен) квадрант.
ELISA анализи
Серумните нива на провъзпалителни цитокини като IL-2(), IL-4, IL-10 и TNF- бяха анализирани за всяка група мишки с помощта на комплекти ELISA, закупени от Shanghai Yi Li Biological Technology Co., Ltd. (Шанхай, Китай) съгласно инструкциите на производителя. Активността на антиоксидантния ензим, супероксид дисмутаза (SOD) и нивата на продукт на липидна пероксидация, малондиалдехид (MDA), в серума на всяка група мишки се анализира чрез комплекти за анализ, закупени от Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Китай) . Нивата на протеинови продукти на напреднало окисление (AOPP) в пробите от миши хипокампус бяха оценени с помощта на комплект ELISA от Shanghai Yi Li Biological Technology Co. Ltd. (Шанхай, Китай) съгласно инструкциите на производителя.
Оценка на оксидативния стрес в миши мозъци
Ние хомогенизирахме 100 mg тъкан от хипокампус с 0,9 ml ледено охладен физиологичен разтвор и хомогенатът беше центрофугиран при 12000 rpm за 30 минути при 4 градуса C. Съдържанието на протеин в супернатантата беше анализирано с помощта на BCA Protein Assay Kit ( Beyotime Biotechnology, Шанхай, Китай). Нивата на липидна пероксидация (LPO) и малондиалдехид (MDA) и активностите на GSH-Px и SOD в пробите от хипокампуса бяха анализирани чрез колориметрия с помощта на комплекти от Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Китай) съгласно инструкциите на производителя.
Добавка Cistanche: подобрява паметта
Състав на чревната микробиота
Фекални проби бяха събрани от всички мишки и незабавно съхранени при -80 градуса C. V3 плюс V4 областта на 16S rRNA гена беше секвенирана с помощта на Illumina MiSeq (Beijing Novogene Co. Ltd., Пекин, Китай) и анализирана с помощта на QIIME отворена платформа за определяне на профилите на чревната микробиота.
LC/MS анализ на серумни метаболити
Серумните проби се инкубират за 10 минути с предварително охладен метанол в съотношение 1:3 за утаяване на протеините. Пробите се центрофугират при 12000r/min за 15 минути при 4 градуса C. Супернатантите се анализират чрез Thermo Scientific Dionex UltiMate3000 Rapid Resolution Liquid Chromatography и QExactive мас спектър. Хроматографските условия са показани в таблица 1. Аналитите се разделят в хроматографска колона XBridge BEH Amide (2,1 × 100 mm; Waters Co., Milford, MA, USA), използвайки 0,1 процента мравчена киселина и ацетонитрил като подвижни фази А и В , съответно. Скоростта на потока беше настроена на 0.4 ml/min, обемът на инжектиране беше 5 ul, а температурата на колоната беше настроена на 25 градуса С (Таблица 1). Сигналите на масовия спектър бяха получени с помощта на режимите на сканиране на положителни и отрицателни йони. Напрежението на йонното разпръскване и други специфични MS параметри са показани в таблица 2.
Статистически анализ
Statistical analysis was performed using the SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). The data plots were generated using GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). Partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) of SIMCA-P+13.0 (Umetrics, AB, Umeå, Sweden) and Principal Components Analysis (PCA) were used to assess normalized GC-MS spectral data. Variable Influence on Projection (VIP) values were used to identify significant variables with VIP values >1.0 и стр< 0.05.="" these="" significant="" variables="" were="" used="" to="" identify="" the="" spectral="" peaks.="" the="" student's="" t-test="" was="" used="" to="" analyze="" the="" differences="" between="" two="" groups="" of="" data.="" the="" taxonomic="" rank="" differential="" between="" groups="" was="" determined="" using="" student's="" test="" (v3.1.2;="" r="" programming="" language).="" the="" correlation="" between="" genera="" abundance="" and="" mouse="" behavior="" was="" calculated="" using="" spearman="" correlation="" coefficients="" (r="" language).="" p="" <="" 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" the="" data="" are="" presented="" as="">