Полизахаридите на Cistanche Deserticola имат невропротективен ефект

за повече информация:Ali.ma@wecistanche.com

Юе Лиу и др

Резюме:

Исхемичният инсулт е заболяване с висока заболеваемост и смъртност.Цистанчеdeserticolaполизахариди(CDP) притежават широк спектър от полезни ефекти, включително хепатопротекция и имунна хомеостаза. Доколкото ни е известно, защитният ефект на CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)върху неврони, увредени от лишаване/реперфузия на кислород-глюкоза (OGD/RP) не е изследвано. В това проучване OGD/RP уврежда PC12 клетъчен модел. Накратко, CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)({{0}}.05, 0,5 и 5 ug/ml) се прилага преди реперфузия. Защитният ефект на CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)след това беше оценен на базата на клетъчна жизнеспособност, изтичане на лактат дехидрогеназа (LDH), [Ca2 плюс] I, митохондриален мембранен потенциал (MMP) и клетъчна апоптоза, андрокс статус след реперфузия беше оценен чрез анализ на реактивни кислородни видове (ROS), каталаза ( CAT), глутатион пероксидаза (GSH-Px) и общ антиоксидантен капацитет. Въз основа на факта, че свързаният с болестта на Паркинсон протеин DJ-1 участва в ендогенното антиоксидантно действие и изпълняваневрозащитенефекти след исхемичен инсулт, ние изследвахме взаимодействието между CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)и DJ{{0}}. Експресията на DJ-1 беше открита чрез ELISA и Western blot анализ, а транслокацията на DJ-1 беше оценена чрез имунофлуоресценция. Резултатите показват, че CDP (0.05, 0.5 и 5 ug/ml) отслабва PC12 клетъчната смърт, запазва MMP и калциевата хомеостаза; инхибира оксидативния стрес и намалява клетъчната апоптоза. Освен това CDP (5 ug/ml) значително стимулира секрецията и експресията на DJ-1. Като цяло резултатите показват, че CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)упражнява аневрозащитенефект срещу OGD/RP-индуцирано нараняване чрез инхибиране на оксидативния стрес и регулиране на DJ-1 пътя

Ключови думи:Cistanche deserticola, полизахариди, неврозащита, лишаване от кислородна глюкоза/реперфузия, оксидативен стресDJ-1

Щракнете върху продуктите Cistanche UK

1. Въведение

Исхемичният инсулт е втората водеща причина за смъртност и основната причина за дълготрайна нетрудоспособност в световен мащаб [1]. Очаква се смъртността поради инсулт да нарасне до 7,8 милиона през 2030 г. [2]. В Китай 58 до 142 на 100 000 души умират от инсулт всяка година. По този начин трябва да се разработят ефективни стратегии, които обръщат исхемично-реперфузионното увреждане. Обширни доказателства подкрепят, че оксидативният стрес е основен фактор, който насърчава развитието и прогресирането на мозъчен инфаркт по време на реперфузия[3,4]. Следователно откриването на ефективнаневрозащитенагенти, способни да намалят ROS и да потиснат оксидативния стрес, привлече значителен интерес в изследванията. Свързаният с болестта на Паркинсон протеин DJ-1 медиира неврозащитата чрез стимулиране на антиапоптотична и антиоксидантна генна експресия [4,5]. DJ-1 може да се премести в митохондриите чрез оксидативен стрес и митогенна стимулация и може да се секретира в извънклетъчния матрикс при патологични състояния, като рак на гърдата, меланом и OGD/RP увреждане [6]. Освен това, DJ-1 е полезен при терапевтично насочване за исхемична невродегенерация поради критичната си роля в антиоксидацията [4,7]. През последните 10 години няколко групи потвърдиха, че DJ-1 го правиневрозащитенефекти върху in vivo фокални модели на мозъчна исхемия и in vitro OGD/RP модели [6–9]. Междувременно някои лекарства, включително циклоспорин А и натриев фенилбутират, отменят смъртта на невронни клетки чрез DJ-1 повишена регулация при исхемичен инсулт [9,10 ].

Цистанчеdeserticola, интегралното изсушено растение наЦистанчеdeserticolaYCMa и Cistanche tubulosa Wight се произвеждат главно в пустинните райони на северен и северозападен Китай [11]. C. deserticola е годна за консумация и е почитана като „Женшенът на пустините“. При предписване на акупунктура се използва като лечение на хронично бъбречно заболяване, сексуална импотентност, женско безплодие, левкорея, метрорагия и сенилен запек [12].C. deserticola полизахариди, основен активен компонент, изолиран отЦистанче deserticola. CDP модулира имунната функция и липидния баланс и осигурява защита срещу стареене, окисляване и увреждане на черния дроб. Освен това CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)предотвратява исхемично-реперфузионно увреждане на сърцето и черния дроб [13,14]. Последните проучвания съобщават, че CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)са нетоксични [12,15,16] и други фитохимикали, извлечени от C. Deserticola, включително ехинакозид, изоактеозид, актеозид и салидрозид, показватневрозащитенефекти [11,12]. Въпреки това, потенциалната употреба на CDP за подобряване на увреждането от исхемичен инсулт не е докладвана досега.

В настоящото изследване ние предполагаме, че CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)инхибира оксидативния стрес за невропротекция. Потенциалните защитни ефекти на CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)уврежданията от исхемичен инсулт бяха изследвани чрез използване на OGD/RP увредени PC12 клетки. След това бяха изследвани основните взаимодействия, свързани с DJ-1.

2. Методи

2.1. Клетъчна култура и OGD/RP модел

PC12 клетки се култивират в среда RPMI 1640, съдържаща 10 процента FBS при 37 градуса в нормоксичен инкубатор, съдържащ 5 процента СО2. Средата се сменя на всеки 48 часа. Изготвен е OGD/RP модел. Клетките PC12 бяха промити и изложени на балансиран солев разтвор на Earle. След това клетките се прехвърлят в анаеробна камера, съдържаща 5 процента CO2 и 95 процента N2 при 37 градуса за 4 часа и след това се оставят да претърпят реоксигенация. По време на тази стъпка към клетките се добавя същият обем културална среда. След реоксигениране клетките се поставят в нормоксичен инкубатор за 24 часа.

2.2. Прилагане на лекарства

CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)е закупен от Yuanye Biological Technology Co., Шанхай, Китай (C23J7Y18405, > 98 процента чистота). Нимодипин, лекарство от първа линия за превенция на исхемичен инсулт, се използва като положителна контрола [17–19]. Инжектирането на нимодипин беше от Bayer Company. Клетките бяха разделени на случаен принцип в шест групи, а именно контрола, носител (OGD/RP), Nimo (5 ug/ml), CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)(0.05 ug/ml), CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)(0.5 ug/ml) и CDP (5 ug/ml). Нимодипин и CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)бяха добавени преди реперфузия. Контролната група се култивира в нормална среда и се инкубира при нормоксични условия.

2.3. Клетъчна жизнеспособност: MTT и NRU анализи

PC12 клетки (6 × 103 на ямка) се посяват в 96-плака за култура с ямки. Клетките се третират в съответствие с изискванията на всяка група. МТТ (Solarbio, Китай) се добавя към клетките в концентрация от 5 mg/ml и се инкубира в продължение на 4 часа при 37 градуса. Формазан е продукт на редукция на сукцинат дехидрогеназата в живи клетки [20]. DMSO се добавя за разтваряне на генерирания син формазан. Абсорбцията при дължина на вълната от 490 nm беше открита с Microplate Reader (Thermo, USA), след като клетките бяха разклатени в продължение на 10 минути при 25 градуса. Резултатите от клетъчната жизнеспособност се проявяват като процент от контролната група [21].

Тестът за неутрално поемане на червено (NRU) беше извършен съгласно предварително публикуван протокол [22]. Когато периодите на реперфузия са завършени, към клетките се добавя неутрално червено (Solarbio, Китай) при концентрация от 50 ug /ml. Сместа се инкубира в продължение на 3 часа. След това клетките се измиват бързо с разтвор, съдържащ 0,5% формалдехид и 1% калциев хлорид. След това клетките се добавят към смес, съдържаща 1% етилова киселина и 50% анхидроузетанол. Плаките се отчитат при 540 nm абсорбция, след като клетките се разклащат в продължение на 20 минути при 37 градуса. Резултатите от клетъчната жизнеспособност се проявяват като процент от контролната група.

Полизахариди от Cistanche deserticolaимаНевропротективен ефект

2.4. Оценка на цитотоксичността

LDH е цитоплазмен ензим, катализиращ окислението на лактат топируват. LDH се освобождава бързо в извънклетъчната течност, когато клетъчната мембрана е увредена. Следователно откриването на LDH обикновено се извършва за оценка на цитотоксичността. [23]. Експерименталната процедура следва инструкциите на търговския комплект, предоставен от комплекта за анализ на LDH (Jiancheng, Китай). Абсорбцията на всяка проба се открива при 440 nm с четец на микроплаки. Процентът на клетъчна смърт беше изчислен чрез използване на следната формула: Жизнеспособност (проценти)=(ОП Лечение − ODTтретиране празно)/(OD Максимална LDH активност − OD Макс LDH активност празно) × 100 процента.

2.5. Откриване на вътреклетъчна Ca2 плюс концентрация

Вътреклетъчната концентрация на Ca2 plus се измерва с Fluo-3/AM [15]. PC12 клетките се промиват с PBS три пъти и след това се инкубират с 2 μM Fluo-3/AM (Beyotime, Китай) в продължение на 30 минути при 37 градуса на тъмно. След това клетките се промиват с PBS три пъти за прочистване на извънклетъчното багрило. Интензитетът на флуоресценция на Fluo-3/AM се определя на лазерно сканиращ конфокален микроскоп (Olympus, Япония). Софтуерният пакет Olympus FV10-ASW 4.1 Viewer и ImageJ бяха използвани за изчисляване на стойности в сивата скала

2.6. Измерване на MMP

JC-1 (5,5',6,6'-тетрахлоро-1,1',3,3'-тетраетил-имидакарбоцианин; Beyotime, Китай) е удобна чувствителна към напрежение сонда, която обикновено се използва за оцветяване клетки и оценяване на ММР [24]. PC12 клетките се промиват два пъти със студен PBS и след това се инкубират със смес, съдържаща 50 процента среда и 50 процента работна течност за 15 минути при 37 градуса на тъмно. След това сместа се изхвърля и се заменя със свежа среда. Червени и зелени флуоресцентни изображения бяха заснети чрез лазерно сканираща конфокална микроскопия. Относителното съотношение на червените и зелените флуоресцентни сигнали беше използвано за измерване на MMP [25]. Софтуерният пакет Olympus FV10-ASW 4.1 Viewer и ImageJ бяха използвани за изчисляване на стойностите в сивата скала.

2.7. Анализ за откриване на апоптоза, Hoechest33342 и анализ на поточна цитометрия

Hoechst33342, ДНК свързващо багрило, се използва за изследване на клетъчна апоптоза [26]. След реперфузия, PC12 клетките се промиват с PBS три пъти и се инкубират с Hoechst33342 (Beyotime, Китай) при концентрация от 5 ug/ml за 15 минути при 37 градуса на тъмно. След това клетките се наблюдават под лазерно сканиращ конфокален микроскоп. Теапоптозните клетки показват интензивна синя флуоресценция и ядрена кондензация. За всеки експеримент с оцветяване бяха уловени и количествено определени три произволни полета. Olympus FV10-ASW 4.1 Viewer и ImageJ бяха използвани за изчисляване на стойностите в сивата скала. Процентите на апоптотичните клетки се изчисляват по следната формула: апоптотично количество/общо количество × 100 процента [27].

2.8. Измерване на генерирането на ROS

Флуоресцентната сонда 2',7'-дихлорофлуоресцеин-диацетат (DCFH-DA; Jiancheng, Китай) може да проникне през клетъчните мембрани и може да бъде хидролизирана до нефлуоресцентен DCFH. DCFH се окислява от вътреклетъчния ROS до флуоресцентен DCF [29]. След реперфузия, клетките се промиват два пъти с PBS и след това се инкубират с DCFH-DA при крайна концентрация от 10 μM за 45 минути при 37 градуса на тъмно. Флуоресценцията се наблюдава чрез афлуоресцентен спектрофотометър с дължина на вълната на възбуждане от 485 nm и дължина на вълната на излъчване от 535 nm.

Полизахариди от Cistanche deserticolaимаНевропротективен ефект

2.9. Определяне на индикатори за оксидативен стрес: нива CAT, GSH-Px и T-AOC

Клетките бяха изстъргани и ресуспендирани в PBS. Получените клетъчни суспензии се обработват с ултразвук 45 пъти върху лед и се центрофугират при 1000 r/min за 10 минути при 4 градуса. Супернатантите бяха запазени и използвани за откриване [24]. Общото протеиново съдържание на клетъчния супернатант се измерва с комплект реагенти за анализ на протеин BCA (KeyGEN, Китай). Активностите на нивата на CAT, GSH-Px и T-AOC бяха измерени съгласно инструкциите на производителя (Jiancheng, Китай). Абсорбцията на всяка проба се открива с четец на микроплаки.

2.10. Измерване на извънклетъчната DJ-1 концентрация

PC12 клетки (6 × 103 на ямка) се посяват в 96-плаки за култивиране на ямки. След реперфузия клетъчният супернатант се събира и анализира от DJ-1/PARK-7 ELISA комплект (Raybio, САЩ ) съгласно инструкцията на производителя [9]. Абсорбцията на всяка проба се открива с четец на микроплаки при двойна дължина на вълната от 450 nm или 540 nm.

2.11. Western blot анализ

Клетъчните протеини се екстрахират с ледено студен лизисен буфер съгласно инструкциите на производителя (KeyGEN, Китай). Концентрацията на протеин се определя с комплект реактиви за анализ на протеин BCA. Равни количества протеинови лизати (20 ug) от всяка група се разделят в електрофореза с 12 процента натриев додецилсулфат-полиакриламиден гел и след това се прехвърлят върху нитроцелулозна мембрана. Мембраната се инкубира с PBS, съдържащ 5 процента обезмаслено мляко в продължение на 2 часа при стайна температура и след това се изследва с анти-PARK7/DJ-1 антитела (ab76008, Abcam; разреждане 1:1000) за една нощ при 4 градуса. След това мембраната се промива три пъти с PBST и се инкубира с вторично антитяло кози анти-заешки IgG (SA 00001-2, Proteintech Group; разреждане 1: 5000) при стайна температура в продължение на 2 часа. Антитялото анти- -тубулин (10759-1-AP, Proteintech Group; разреждане 1:1000) се счита за контрола. Протеиновите ленти се визуализират чрез реакционни реагенти на усилена хемилуминесценция (ECL). Плътностите на лентите бяха измерени със софтуер QuantityOne Analysis v.4.6.9.

2.12. Имуноцитохимичен анализ

PC12 клетките се фиксират в 4 процента параформалдехид за 15 минути при стайна температура след реперфузионното третиране [9]. След отстраняване на прекомерното количество параформалдехид, клетките се инкубират в PBS, съдържащ 0.3 процента Triton X-100 за 10 минути при стайна температура. След това клетките се промиват с PBS три пъти, преди да бъдат инкубирани с 5 процента нормален кози серум за 1 час. След това клетките се инкубират с моноклонална анти-ATP синтазна верига на заешка мишка (MABS1304, EMD Millipore, разреждане 1:200) за оцветяване на митохондриите и след това се инкубират с анти-PARK7/DJ-1 антитяло (разреждане 1: 100) за сондиране на протеин DJ-1. Клетките се промиват и инкубират с кози анти-заешки IgG-Alexa 488 (зелен; A11034, Invitrogen; разреждане 1:1000) и кози анти-миши IgG-Alexa 594 (червен; A11032; Invitrogen; разреждане 1:1000) за 90 мин. Накрая, клетките се промиват три пъти с PBS и се монтират върху предметни стъкла с монтажна среда, съдържаща DAPI. Имунофлуоресцентните изображения се визуализират с помощта на лазерно сканиращ конфокален микроскоп.

Полизахариди от Cistanche deserticolaимаНевропротективен ефект

2.13. Данни/статистически анализ

Всички стойности са показани като средно ± SD. Значимостта беше определена чрез еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA), последван от теста за множество сравнения на Dunnett. p <.05 се="" счита="" за="" статистическа="" значимост.="" експерименталните="" данни="" бяха="" анализирани="" с="" помощта="" на="" статистически="" софтуер="" spss="">

3. Резултати

3.1. CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)инхибира OGD/RP-индуцирано клетъчно увреждане

PC12 клетките, изложени на OGD/RP, показват значително намаляване на броя. Формата на клетката е променена и клетъчната мембрана е счупена. В МТТ анализа жизнеспособността на клетките в CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)групите ({{0}}.05, 0.5 и 5 ug/ml) са съответно 58.91 процента ± 5.40 процента, 61.13 процента ± 3.81 процента и 68.57 процента ± 3.24 процента, p < .05="" (фиг.="" 1a)="" ,="" а="" това="" с="" превозно="" средство="" имаше="" 51,68="" процента="" ±="" 3,89="" процента.="" тези="" стойности="" показват,="" че="">(Cistanchedeserticolaполизахариди)предпазва клетките от OGD/RP увреждане и намалява клетъчната смърт. Освен това жизнеспособността на клетките в групата на Nimo е 77,02 процента ± 5,22 процента, което е почти равно на това при 5 ug/ml CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)лекувана група.

В NRU анализа, жизнеспособността на клетките в CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)групите ({{0}}.05, 0,5 и 5 ug/ml) са съответно 52,03 процента ± 4,72 процента, 58,49 процента ± 2,50 процента и 69,17 процента ± 3,91 процента (фиг. 1B) и това с превозно средство имаше 47,14 процента ± 2,88 процента. Стойностите показват зависимия от концентрацията защитен ефект на CDP.

За разлика от носител (44,73 процента ± 3,30 процента), освобождаването на LDH е значително намалено в CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)групи. В CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)групи ({{0}}.05, 0.5 и 5 ug/ml), нивата на изтичане на LDH са съответно 32.41 процента ± 3.70 процента, 27.13 ± 2.79 процента и 23.13 процента ± 4.59 процента, p < .01="" (фиг.="" 1c).="" освен="" това="" нивата="" на="" изтичане="" на="" ldh="" в="" групата="" на="" nimo="" са="" 21,99="" процента="" ±="" 4,02="" процента,="" което="" е="" почти="" равно="" на="" това="" в="" групата,="" лекувана="" с="" 5="" ug/ml="">

3.2. CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)атенюирано OGD/RP-индуцирано увеличение на [Ca2 плюс ]i

Вътреклетъчните нива на Са2 плюс в клетките PC12 бяха повишени до 4146,60 ± 195,97 след OGD/RP увреждане за разлика от контролната група (373,62 ± 75,69). CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)групи ({{0}}.05, 0.5 и 5ug/ml) могат да намалят в зависимост от дозата вътреклетъчното ниво на Ca2 плюс съответно до 2921.25 ± 222.19, 2015.85 ± 230.53 и 1768.43 ± 426.12 (Фиг. 2A и C ). Освен това, нивото на Са2 плюс в групата, лекувана с 5 ug/ml CDP, намалява до ниво, сравнимо с това в групата на Nimo (1591.19 ± 213.21).

3.3. CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)атенюирано OGD/RP-индуцирано разсейване на ММР

В сравнение с контролната група (1,67 ± 0.89), групата с носител (0.48 ± 0.10) показва повече зелена FL флуоресценция, отколкото червена FL флуоресценция (фиг. 2B и D). Съотношенията между червена и зелена FL флуоресценция бяха намалени до 1,11 ± 0.26 и 1,18 ± 0.16 в 0,5 и 5 ug/ml CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)третирани групи съответно, p <.01. зелената="" fl="" флуоресценция="" беше="" значително="">

3.4. CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)предотвратява OGD/RP-индуцирана клетъчна апоптоза

Клетки, показващи кондензирани хроматини или фрагментирани ядра, се оценяват като апоптотични клетки [30]. Резултатите от анализа на Hoechst33342 разкриха появата на кондензирани ядра след OGD/RP (фиг. 3A и C). Наблюдава се висок интензитет на флуоресценция на FL в ядрата в групата с носител. Интензитетът на флуоресценцията на FL на ядрата беше отслабен в 5 ug/ml CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)лекувана група. Ние анализирахме скоростта на апоптоза в PC12 клетките чрез друга цитометрия, използвайки двойно оцветяване с FITC-Annexin V/PI (фиг. 3B и D). Контролната група имаше 4,16 процента ± 0.24 процента процент на клетъчна апоптоза, докато групата с носител имаше 22,98 процента ± 0.66 процента. В групата, третирана с 5 ug/ml CDP, степента на клетъчна апоптоза е 7.{14}} процента ± 1,16 процента.

3.5. CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)атенюирано OGD/RP-индуцирано вътреклетъчно натрупване на ROS и запазен редокс статус

Ефектите на CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)върху оксидативния стрес са демонстрирани въз основа на генериране на ROS, GSH-Px, CAT активности и нива на T-AOC. Нивата на ROS в OGD/RP-увредените PC12 клетки се повишават и стават значително по-високи от тези в контролната група (p <.01). междувременно="" нивата="" на="" ros="" в="">(Cistanchedeserticolaполизахариди)групи ({{0}}.05, 0.5 и 5 ug/ml) намаляват в зависимост от дозата (p <.01; фиг.="" 4a).="" освен="" това,="" cdp="" също="" значително="" повишава="" нивата="" на="" t-aoc="" (p="">< .05;="" фиг.="" 4b),="" cat="" (p="">< .05;="" фиг.="" 4c)="" и="" gsh-px="" (p="">< .05;="" фиг.="" 4d)="" в="" сравнение="" с="" носителя="" група.="" дейностите="" на="" ендогенните="" антиоксиданти="" в="">(Cistanchedeserticolaполизахариди)групите се увеличиха.

3.6. CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)стимулира секрецията на DJ-1 и засилва експресията на DJ-1

Промените в концентрацията на DJ-1 в клетъчния супернатант бяха открити и разкриха възможната връзка между DJ-1 и CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди). Освобождаването на DJ-1 се наблюдава от OGD/RP-увредените PC12 клетки (фиг. 5). DJ-1 беше значително повишен при 5 ug/ml CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)-третираната група (38,66 ± 8,44 pg/ml) и се увеличи значително от това в групата с носител (18,33 ± 3,80 pg/ml, p < 0,01) и контролната група (9,67 ± 3,96 pg/ml, p < 0,01) .

За изследване на ефектите от CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)върху вътреклетъчната експресия на DJ-1, ние измерихме нивата на DJ-1 протеин чрез Western blotting. Нивата на експресия на DJ-1 протеин бяха значително повишени 24 часа след реперфузията. Обратно, последващото третиране с 5 ug/ml CDP значително повишава свръхекспресията на DJ-1 в сравнение с групата с носител (p < .01,="" фиг.="">

3.7. CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)подобрено DJ{0}} преместване в митохондриите

PC12 клетките бяха оцветени с анти-PARK7/DJ-1 и анти-АТР синтаза -верижни антитела (Фигури 7 и 8). Анти-ATP синтаза - веригата на антитялото се свързва с митохондриален комплекс I и свързващият антиген е локализиран във вътрешната мембрана на митохондриите. Резултатите разкриват, че DJ-1 се премества към вътрешната мембрана на митохондриите след инсулт от OGD/RP (фиг. 8). Междувременно резултатите от двойното оцветяване на DJ-1 и митохондриите разкриват, че CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)улеснена DJ{0}} митохондриална транслокация и съвместна локализация (фиг. 8). Тези резултати показват пряко взаимодействие между DJ-1 иневрозащитенефект на CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)(фиг. 9).

4. Обсъждане

В това проучване ние съобщихме от първа ръка, че CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)ефективно намалява OGD/RP-индуцираното PC12 клетъчно увреждане чрез регулиране нагоре на DJ-1 протеина. CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)подобрена клетъчна жизнеспособност, намалено увреждане на клетъчната мембрана, поддържана вътреклетъчна Ca2 плюс хомеостаза, предотвратена загуба на ММР, намалена клетъчна апоптоза, потиснат оксидативен стрес, повишена експресия на DJ-1 и подобрена DJ-1 транслокация в митохондриите. DJ-1 наскоро беше замесен в регулирането наневрозащитенефект и митохондриална цялост. Тези резултати предоставиха убедителни доказателства заневрозащитенефекти на CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)срещу исхемия. Освен това взаимодействието между CDP и DJ-1 играе aневрозащитенроля в OGD/RP-индуцирано увреждане на PC12 клетки. Горните резултати могат да развият нашето разбиране за благоприятния ефект на CDP и могат да предоставят полезна информация за терапията на инсулт в бъдеще.

Исхемичният инсулт се приписва на сложна поредица от биохимични и молекулярни механизми, включително ексцитотоксичност, претоварване с калций и оксидативен стрес [31]. OGD/RP се използва широко като in vitro модел на исхемия-реперфузия и се използва за изследване на неврологични и биохимични промени. Клетъчната линия PC12 е чувствителна към OGD/RP увреждане [2]. Той проявява редица свойства и характеристики на симпатиковите неврони [32] и по този начин широко използвани невронни клетъчни линии за изследвания, свързани с механизмите на неврологично увреждане, дължащо се на инсулт [33,34]. Многобройни проучвания показват, че оксидативният стрес играе жизненоважна роля при инсулт и увреждане на мозъчната исхемия [35–37]. Свързаният с болестта на Паркинсон протеин DJ-1 може да инхибира исхемичната невродегенерация и поведенческата дисфункция чрез намаляване на ROS-медиираното невронално увреждане [7]. Затова използвахме клетъчния модел на OGD/RP-нараняване PC12, за да изследваменеврозащитенефект на CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди).

Степента на увреждане в PC12 клетките, индуцирана от OGD/RP, беше оценена чрез анализи за освобождаване на MTT, NRU и LDH. Администриране на CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)({{0}}.05, 0,5 и 5 ug/ml) подобрява преживяемостта на клетките и намалява освобождаването на LDH. Благоприятните ефекти от лечението с CDP също включват намаляване на вътреклетъчното претоварване с калций и запазване на MMP. Аномалиите на вътреклетъчната Ca2 плюс концентрация, особено митохондриалното претоварване с калций, са свързани с невронална апоптоза и смърт, предизвикана от исхемичен инсулт [38]. MMP може да отразява ефективността на електронната транспортна верига и е посочен като индекс на патологично разстройство на тази система [39]. Както повишаването на вътреклетъчната Ca2 плюс концентрация, така и загубата на ММР могат да доведат до дестабилизиране на невронната структура и в крайна сметка да доведат до клетъчно увреждане или клетъчна смърт [21,40]. В това проучване резултатите показват, че CDP значително инхибира вътреклетъчния Са2 плюс претоварване и повишава нивата на ММР в OGD/RP-наранени PC12 клетки. Апоптозата играе жизненоважна роля в сложната патофизиология на церебрална исхемия-реперфузионно увреждане. Нарастващите данни предполагат, че апоптозата е замесена в митохондриалната дисфункция; разсейването на ММР е ранно събитие, водещо до клетъчна апоптоза [8,39]. Апоптозата е процес на енергийно зависима програмирана клетъчна смърт за изхвърляне на излишните клетки. Много неврони в исхемичния инсулт ще претърпят апоптоза [41]. В това проучване извършихме оцветяване с Hoechst33342 и Annexin V-FITC/PI, за да изследваме ефекта на CDP върху апоптозата [23,28]. Резултатите показват, че CDP поддържа целостта на ядрото и намалява скоростта на клетъчна апоптоза. Всички тези резултати показват, че антиапоптотичната активност на CDP допринася за благоприятния ефект при невронално увреждане в PC12 клетки.

Клетки, подложени на исхемично увреждане, причинено от прекомерно натрупване на ROS, което може да доведе до липидна пероксидация, увреждане на клетъчната мембрана, претоварване с калций и митохондриална дисфункция, което в крайна сметка води до клетъчна апоптоза и смърт [42]. Консумацията на ендогенни антиоксиданти, като SOD, CAT и GSH-Px, също показва появата на Фиг. 9. Възможни механизми за защитните ефекти на CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)срещу OGD/RP-индуцирано PC12 клетъчно увреждане. Лечението на CDP потиска оксидативния стрес, стабилизира Ca2 плюс концентрацията и MMP, подобрява експресията на DJ-1 и локализацията в митохондриите. Y. Liu и др. Biomedicine & Pharmacotherapy 99 (2018) 671–680 678на оксидативен стрес по време на исхемия-реперфузия. В това проучване групата на OGD/RP показва значително увеличение на ROS и намаление на CAT, GSH-Px и T-AOC в сравнение с групата, лекувана с 5 ug/ml CDP. Въпреки това, ние наблюдавахме значително намаляване на нивата на генериране на ROS и консумация на ендогенни антиоксиданти (CAT, GSH-Px и T-AOC) в групите на CDP. Благоприятните ефекти в групата с 5 ug/ml CDP бяха близки до тези в групата на Nimo. Резултатите предполагат, че CDP инхибира генерирането на ROS и възстановява ензимната антиоксидантна защита.

DJ-1 е ключов редокс-реактивенневрозащитенпротеин, замесен в регулирането на оксидативния стрес при инсулт. Благоприятните ефекти от свръхекспресията на DJ-1 включват клетъчно оцеляване от исхемия-реперфузия и запазване на функцията и морфологията на митохондриите, като ускоряване на пропускливостта на митохондриите при преходно отваряне на порите [39,43]. Предишни проучвания показват, че защитният ефект на DJ-1 в клетките, изложени на OGD/RP, е свързан с неговите антиоксидантни свойства и митохондриална транслокация [43–45]. DJ-1 извършва ефективна ендогенна невропротекция при смекчаване на митохондриалните дефекти чрез транслокация [46]. Няколко проучвания показват, че транслокацията на DJ-1 може да има ефект върху движението на митохондриите, да подобри взаимодействието между клетките и да насърчи други процеси за оцеляване на клетките.

DJ-1 засяга няколко процеса, като клетъчна миграция и адхезия, хемотаксис, пролиферация и апоптоза, както в in vitro, така и в in vivo модели [6,9,47,48]. Използвайки модела на инсулт с увредени PC12 клетки OGD/RP, ние изследвахме потенциална връзка между CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)и DJ-1. Свръхекспресията на DJ- 1 беше идентифицирана чрез ELISA и Western blotting. Заедно с тази функция, основна находка в експериментите демонстрира, че значителната свръхекспресия на DJ-1 възниква, когато CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)(5 ug/ml) се прилага преди реперфузия. Това предполагаше възможноневрозащитенефект във връзката между CDP и DJ-1. Освен това наблюдавахме, че DJ-1, разположен в митохондриите при условия на OGD/RP и обилна експресия на DJ-1, намалява клетъчната чувствителност към ROS и инхибира оксидативния стрес [45]. Резултатите предполагат, че CDP регулира и подобрява DJ-1, който действа като молекулярна връзка между митохондриалната дисфункция и оксидативния стрес и осигурява прогресия на вторичната клетъчна смърт, присъща на инсулт [5,47,49–51]. В тандем със стабилизирането на DJ-1 в митохондриите, CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)лечението повишава преживяемостта на клетките, стабилизира Ca2 плюс хомеостазата, подобрява разсейването на MMP и предотвратява свързаната с митохондриите апоптоза [43]. Като цяло, нашите резултати показват, че CDP упражнява новаторствоневрозащитенмеханизъм за лечение на исхемичен инсулт.

5. Заключение

Нашите резултати показват, че CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)предпазва клетките PC12 от увреждане, предизвикано от OGD/RP, чрез своите антиоксидантни ефекти, които частично се приписват на медиирания път на DJ-1. Тези ефекти включват намаляване на степента на увреждане на клетъчната мембрана, запазване на [Ca2 плюс] I хомеостазата, подобряване на разсейването на MMP, инхибиране на клетъчната апоптоза, отслабване на вътреклетъчния ROS и модулиране на нивата на DJ-1. Резултатите също така показват, че взаимодействията между CDP и DJ-1 усилват неврозащитата и поддържат митохондриалната цялост. Следователно, уязвимите неврони могат да бъдат защитени от CDP(Cistanchedeserticolaполизахариди)чрез усилване на експресията на DJ-1 по време на исхемичен инсулт.

Благодарности

Това проучване беше подкрепено от Националната природонаучна фондация на Китай (безвъзмездна помощ 81360649), Националната ключова програма за наука и технологии (безвъзмездна помощ 2015BAK45B01) и Програмата за подкрепа на науката и технологиите на автономен регион Нинся Хуей (безвъзмездна помощ 2016BZ07).

Полизахариди от Cistanche deserticolaима Невропротективен ефект

Препратки

[1] HD Tsai, JS Wu, MH Kao, JJ Chen, GY Sun, WY Ong, TN Lin, Clinacanthus nutans защитава кортикалните неврони срещу индуцирана от хипоксия токсичност чрез понижаване на HDAC1/6, Neuromol. Med. 18 (2016) 274–282.

[2] J. Zhao, R. Liu, Инсулт 1-2-0: програма за бързо реагиране при инсулт в Китай, Lancet Neurol. 16 (2017) 27–28.

[3] PM George, GK Steinberg, Нова терапия на инсулт: разкриване на патофизиологията на инсулта и нейното въздействие върху клиничните лечения, Neuron 87 (2015) 297–309.

[4] H. Yao, T. Ago, T. Kitazono, T. Nabika, патофизиология, свързана с NADPH оксидаза в експериментални модели на инсулт, Int. J. Mol. Sci. (2017) 18.

[5] J. Cao, M. Ying, N. Xie, G. Lin, R. Dong, J. Zhang, H. Yan, X. Yang, Q. He, B. Yang, Състоянията на окисление на DJ{{ 1}} диктуват клетъчната съдба в отговор на оксидативен стрес, предизвикан от 4-hpr: автофагия или апоптоза? Антиоксид Редокс знак. 21 (2014) 1443–1459.

[6] Y. Kaneko, H. Shojo, J. Burns, M. Staples, N. Tajiri, CV Borlongan, DJ-1 подобрява исхемичната клетъчна смърт in vitro, вероятно чрез митохондриалния път, Neurobiol, Dis. 62 (2014) 56–61.

[7] D. Yanagisawa, Y. Kitamura, M. Indian, K. Takata, T. Taniguchi, S. Morikawa, M. Morita, T. Inubushi, I. Tooyama, T. Taira и др., DJ{{ 1}} предпазва от невродегенерация, причинена от фокална церебрална исхемия и реперфузия при плъхове, J. Cereb. Кръвотечение. Мет. 28 (2008) 563–578.

[8] Y. Kaneko, N. Tajiri, H. Shojo, CV Borlongan, Лишените от кислород първични нервни клетки на плъх показват DJ-1 транслокация в здрави митохондрии: мощна терапевтична цел при инсулт, CNS Neurosci. Там. 20 (2014) 275–281.

[9] N. Tajiri, CV Borlongan, Y. Kaneko, Лечението с циклоспорин А отменя индуцираната от исхемия невронна клетъчна смърт чрез запазване на целостта на митохондриите чрез регулиране на свързания с болестта на Паркинсон протеин DJ-1, CNS Neurosci. Там. 22 (2016) 602–610.

[10] RX Yang, J. Lei, BD Wang, DY Feng, L. Huang, YQ Li, T. Li, G. Zhu, C. Li, FF Lu и др., Предварително лечение с натриев фенилбутират облекчава церебралната исхемия/ реперфузионно увреждане чрез регулиране на DJ-1 протеин, отпред. неврол. 8 (2017) 256.

[11] C. Gu, X. Yang, L. Huang, Cistanches Herba. Неврофармакологичен преглед, Front. Pharmacol. 7 (2016) 289.

[12] Z. Li, H. Lin, L. Gu, J. Gao, CM Tzeng, Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): Един от най-добрите фармацевтични подаръци на традиционната китайска медицина, отпред. Pharmacol. 7 (2016) 41.

[13] Q. Liu, J. Li, J. Wang, J. Li, JS Janicki, D. Fan, Ефекти и механизми на китайската билкова медицина при облекчаване на миокардно исхемично-реперфузионно увреждане, Evid.- Based Compl. Alt. (2013) (2013) 925625.

[14] HS Wong, KM Ko, Herba Cistanches стимулира редокс цикъла на клетъчния глутатион от реактивни кислородни видове, генерирани от митохондриално дишане в H9c2 кардиомиоцити, Pharm. Biol. 51 (2013) 64–73.

[15] T. Wang, X. Zhang, W. Xie,Цистанчеdeserticola YC Ma, "Пустинен женшен": преглед, Am. Дж. Чин. Med. 40 (2012) 1123–1141.

[16] L. Gu, WT Xiong, C. Wang, HX Sun, GF Li, X. Liu,Цистанчеdeserticolaотвара облекчава токсичността на тестисите, предизвикана от хидроксиурея при мъжки мишки, азиатски J. Androl. 15 (2013) 838–840.

[17] E. Herzfeld, C. Strauss, S. Simmermacher, K. Bork, R. Horstkorte, F. Dehghani, C. Scheller, Изследване наневрозащитенвъздействие на нимодипин върху Neuro2a клетки чрез подобен на операция модел на стрес, Int. J. Mol. Sci. 15 (2014) 18453–18465.

[18] G. Vahabzadeh, N. Rahbar-Roshandel, SA Ebrahimi, M. Mahmoudian,Невропротективенефект на носкапин върху церебрално увреждане на кислородно-глюкозна депривация, Pharmacol. Rep. 67 (2015) 281–288.

[19] CP Wang, LZ Zhang, GC Li, YW Shi, JL Li, XC Zhang, ZW Wang, F. Ding, XM Liang, Mulberroside A предпазва от исхемично увреждане в първичната култура на кортикални неврони на плъх след последващо лишаване от кислород и глюкоза чрез реперфузия, J. Neurosci. Рез. 92 (2014) 944–954.

[20] X. Qi, R. Zhou, Y. Liu, J. Wang, WN Zhang, HR Tan, Y. Niu, T. Sun, YX Li, JQ Yu, Транс-цинамалдехид защитени PC12 клетки срещу лишаване от кислород и глюкоза /реперфузия (OGD/R)-индуцирано увреждане чрез антиапоптоза и антиоксидативен стрес, Mol. Cell Biochem. 421 (2016) 67–74.

[21] R. Chang, R. Zhou, X. Qi, J. Wang, F. Wu, W. Yang, W. Zhang, T. Sun, Y. Li, J. Yu, Защитни ефекти на алоина върху кислорода и увреждане, предизвикано от лишаване от глюкоза в PC12 клетки, Brain Res. Бик. 121 (2016) 75–83.

[22] M. Agrawal, V. Kumar, AK Singh, MP Kashyap, VK Khanna, MA Siddiqui, AB Pant, Транс-ресвератролът защитава исхемичните PC12 клетки чрез инхибиране на свързаните с хипоксия транскрипционни фактори и повишаване на нивата на антиоксидантни защитни ензими, ACS Chem. Neurosci. 4 (2013) 285–294.

[23] KW Zeng, LX Liao, MB Zhao, FJ Song, Q. Yu, Y. Jiang, PF Tu, Protosappanin B защитава PC12 клетките срещу индуцирана от лишаване от кислород-глюкоза невронална смърт чрез поддържане на митохондриална хомеостаза чрез индуциране на убиквитин-зависима p53 протеиново разграждане, Eur. J. Pharmacol. 751 (2015) 13–23.

[24] NT Ma, R. Zhou, RY Chang, YJ Hao, L. Ma, SJ Jin, J. Du, J. Zheng, CJ Zhao, Y. Niu и др., Защитни ефекти на алоперина върху неонатални първични плъхове култивирани неврони на хипокампа, увредени от лишаване от кислород-глюкоза и реперфузия, J. Nat. Med. 69 (2015) 575–583.

[25] Y. Wang, W. Ma, A. Jia, Q. Guo, Парекоксиб защитава миши кортикални неврони срещу индуцирана от OGD/R невротоксичност чрез регулиране нагоре на Bcl-2, Neurochem. Рез. 40 (2015) 1294–1302.

[26] MP Ponnusamy, P. Seshacharyulu, A. Vaz, P. Dey, SK Batra, MUC4 стабилизира експресията на HER2 и поддържа популацията от ракови стволови клетки в ракови клетки на яйчниците, J. Ovarian Res. 4 (2011) 7.

[27] R. Wang, L. Peng, J. Zhao, L. Zhang, C. Guo, W. Zheng, H. Chen, A. Gardenamide, Защитава RGC-5 клетки от H(2)O( 2) инсулти, предизвикани от оксидативен стрес чрез активиране на PI3K/Akt/eNOS сигнален път, Int. J. Mol. Sci. 16 (2015) 22350–22367.

[28] LP Sun, X. Xu, HH Hwang, X. Wang, KY Su, YL Chen, Дихлорметановите екстракти от прополис предпазват клетката от оксидативен стрес, предизвикан от лишаване от кислород-глюкоза Y. Liu et al. Biomedicine & Pharmacotherapy 99 (2018) 671–680 679чрез намаляване на апоптозата, Food Nutr. Рез. 60 (2016) 30081.

[29] L. Wang, Y. Zhang, T. Asakawa, W. Li, S. Han, Q. Li, B. Xiao, H. Namba, C. Lu, Q. Dong,Невропротективенефект на невросерпин в астроцити на плъх, третирани с лишаване от кислород-глюкоза и реоксигенация in vitro, PLoS One. 10 (2015) e0123932.

[30] Z. Zhiwen, W. Haitao, S. Fu, Z. Lihua, JL Peter, Q. Remi, Z. Wenhua, Литиевите йони намаляват индуцираната от лишаване от серум апоптоза в PC12 клетки чрез регулиране на сигнализирането Akt/FoxO1 пътища, Психофармакология (Berl) 12 (2015) 625–633.

[31] EJB Dariush Mozaffffarian, S. Alan, et al., Резюме на статистиката за сърдечни заболявания и инсулт, актуализация за 2016 г. Доклад от American Heart Association, Circulation 133 (2016) 447–454.

[32] JE Jumblatt, TA, Регулиране на местата за свързване на мускаринов лиганд чрез нервен растежен фактор в PC12 феохромоцитомни клетки, Nature 297 (1982) 152–154.

[33] S. Afrazi, S. Esmaeili-Mahani, V. Sheibani, M. Abbasnejad, Neurosteroid allopregnanolone намалява индуцираната от висока глюкоза апоптоза и предотвратява експериментална диабетна невропатична болка: in vitro и in vivo проучвания, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 139 (2014) 98–103.

[34] X. Liu, X. Zhu, M. Chen, Q. Ge, Y. Shen, S. Pan, Resveratrol защитава PC12 клетките срещу OGD/R-индуцирана апоптоза чрез митохондриално-медиирания сигнален път, Acta Biochem Biophys Sin . 48 (2016) 342–353.

[35] PW Kleikers, K. Wingler, JJ Hermans, I. Diebold, S. Altenhofer, KA Radermacher, B. Janssen, A. Gorlach, HH Schmidt, NADPH оксидазите като източник на оксидативен стрес и молекулярна цел при исхемия/реперфузия нараняване, J. Mol. Med. (Berl) 90 (2012) 1391–1406.

[36] FC Liu, HI Tsai, HP Yu, Органопротективни ефекти на екстракт от червено вино, ресвератрол, при медиирано от оксидативен стрес реперфузионно увреждане, Oxid. Med. Cell Longev. (2015) 568634.

[37] LK Seidlmayer, VV Juettner, S. Kettlewell, EV Pavlov, LA Blatter, EN Dedkova, Различни механизми за активиране на mPTP при исхемия-реперфузия: принос на Ca2 plus plus, ROS, pH и неорганичен полифосфат, Cardiovasc. Рез. 106 (2015) 237–248.

[38] F. Su, AC Guo, WW Li, YL Zhao, ZY Qu, YJ Wang, Q. Wang, YL Zhu, Предварителното кондициониране с ниска доза етанол предпазва от лишаване от кислород-глюкоза/индуцирано от реоксигениране невронално увреждане чрез активиране на висока проводимост , Ca2 плюс плюс -активирани K плюс плюс канали In Vitro, Neurosci. Бик. 33 (2017) 28–40.

[39] Y. Li, M. Wang, S. Wang, Ефект от инхибирането на митохондриалното делене върху енергийния метаболизъм в невроните на хипокампа на плъх по време на исхемия/реперфузионно увреждане, Neurol. Рез. (2016) 1–8.

[40] C. Rui, L. Yuxiang, H. Yinju, Z. Qingluan, W. Yang, Z. Qipeng, W. Hao, M. Lin, L. Juan, Z. Chengjun и др., Защитни ефекти на Полизахарид на Lycium barbarum върху първично култивирани хипокампални неврони на новородени плъхове, увредени от лишаване от кислород-глюкоза и реперфузия, J. Mol. Histol. 43 (2012) 535–542.

[41] BR Broughton, DC Reutens, CG Sobey, Апоптотични механизми след церебрална исхемия, инсулт 40 (2009) e331–339.

[42] Jordan M. Willcox, AJS Summerlee, Relaxin предпазва астроцитите от хипоксия in vitro, PLoS One. 9 (3) (2014) e90864.

[43] X. Zhang, D. Yuan, Q. Sun, L. Xu, E. Lee, AJ Lewis, BS Zuckerbraun, MR Rosengart, Калций/калмодулин-зависимата протеин киназа регулира PINK1/Parkin и DJ{{3} } пътища на митофагия по време на сепсис, FASEB J. 31 (2017) 4382–4395.

[44] S. Vasseur, S. Afzal, J. Tardivel-Lacombe, DS Park, JL Iovanna, TW Mak, DJ-1/ PARK7 е важен медиатор на индуцирани от хипоксия клетъчни отговори, Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 106 (2009) 1111–1116.

[45] Z. Xianghong, Y. Du, S. Qian, X. Li, L. Emma, ​​J. Anthony, Brian Lewis, S. Zuckerbraun, Matthew R. Rosengart, Calcium/calmodulin-dependent protein kinase regulira PINK1/ Паркин и DJ-1 пътища на митофагия по време на сепсис, FASEB J. (2017). [

46] MS Choi, T. Nakamura, SJ Cho, X. Han, EA Holland, J. Qu, GA Petsko, JR Yates 3rd, RC Liddington, SA Lipton, Transnitrosylation from DJ-1 to PTEN attenuates neuronal cell death в модели на болестта на Паркинсон, J. Neurosci. 34 (2014) 15123–15131.

[47] RK Dongworth, UA Mukherjee, AR Hall, R. Astin, SB Ong, Z. Yao, A. Dyson, G. Szabadkai, SM Davidson, DM Yellon, DJ Hausenloy, DJ-1 предпазва от клетъчна смърт след остра сърдечна исхемия-реперфузионно увреждане, Cell Death Dis. 5 (2014) e1082.

[48] ​​A. Di Cello, M. Di Sanzo, FM Perrone, G. Santamaria, E. Rania, E. Angotti, R. Venturella, S. Mancuso, F. Zullo, G. Cuda, F. Costanzo, DJ{ {1}} е надежден серумен биомаркер за разграничаване на високорисков рак на ендометриума, Tumor Biol. 39 (2017) 1010428317705746.

[49] H. Aleyasin, MW Rousseaux, PC Marcogliese, SJ Hewitt, I. Irrcher, AP Joselin, M. Parsanejad, RH Kim, P. Rizzo, SM Callaghan и др., DJ-1 защитава нигростриата ос от невротоксина MPTP чрез модулиране на AKT пътя, Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 107 (2010) 3186–3191.

[50] RM Canet-Aviles, MA Wilson, DW Miller, R. Ahmad, C. McLendon, S. Bandyopadhyay, MJ Baptista, D. Ringe, GA Petsko, MR Cookson, Протеинът на болестта на Паркинсон DJ-1 еневрозащитенпоради митохондриална локализация, управлявана от цистеин-сулфинова киселина, Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 101 (2004) 9103–9108.

[51] M. Liu, B. Zhou, ZY Xia, B. Zhao, SQ Lei, QJ Yang, R. Xue, Y. Leng, JJ Xu, Z. Xia, Индуцирано от хипергликемия инхибиране на DJ-1 експресията компрометира ефективността на исхемичната посткондиционираща кардиопротекция при плъхове, Oxid. Med. Cell Longev. (2013) (2013) 564902.