Полизахаридите Cistanche подобряват абсорбцията на ехинакозид in vivo и влияят на чревната микробиота

Контакт: emily.li@wecistanche.com

Zhifei Fu и др

Резюме

Полизахаридите ифенилетаноидни гликозидиотCistanche deserticolaе доказано, че имат различни ползи за здравето, но интерактивният ефект между тези два вида съединения in vivo не е подробно известен. Целта на това проучване беше да се изследват синергичните действия на полизахаридите на цистанхе с фенилетаноиден гликозид и ефектите на полизахаридите върху чревната микробиота. Плъховете Sprague-Dawley бяха хранени с различни видове полизахариди от цистанхе в продължение на 20 дни, като в последния ден на всички плъхове беше приложенехинакозидпри 100 mg/kg. Резултатите бяха сравнени главно по разликата във фармакокинетичните параметри, състава на чревната микробиота и съдържанието на късоверижни мастни киселини. Резултатите показват, че всички полизахариди от цистанхе, включително суровите полизахариди, са с високо молекулно тегло.тегло полизахаридии полизахариди с ниско молекулно тегло, може да регулира разнообразието на чревната микробиота, да увеличи полезните бактерии и по-специално да засили растежа на Prevotella spp. както и подобряване на производството на късоверижни мастни киселини и усвояването на ехинакозид. Чрез изследване на синергичните действия на полизахаридите с малки молекули, тези открития предполагат, че полизахаридите от цистанхе, особено полизахаридите с ниско молекулно тегло, могат да се използват като манипулатор на чревната микробиота за промоция на здравето.

Ключови думи:ЦистанчеdeserticolaполизахаридЕхинакозидЧревна микробиота

Щракнете тук, за да получите повече информация за продуктите cistanche

1. Въведение

През последните години стана ясно, че полизахаридите модулират състава на чревната микробиота и че промените могат да медиират множество хранителни абсорбции [1], произвеждайки физиологична функция [2,3]. Доказано е, че полизахаридите от традиционната китайска медицина (TCM) са идеални кандидати за регулиране на чревната микробиота и показват пребиотични ефекти. В храносмилането контактът на полизахаридите и някои малки молекулни съединения неизбежно показва някои ефекти върху биологичните дейности [4]. Като един от видовете основна активна съставка в Panax ginseng, който е бил широко използван от хиляди години, полизахаридите показват добри резултати.подобрениевчревниметаболизъмиабсорбциянагинзенозидиin vivo [5]. Полизахаридите на Codonopsis pilosula показват промоционалния ефект на абсорбцията на сапонини при индуциран от декстран сулфат натрий колит мишки [6]. Установено е, че полизахаридите на Ganoderma lucidum, особено фракцията с високо молекулно тегло, иматпребиотикфункциипри модели на мишки с индуцирана от диета с високо съдържание на мазнини чревна дисбиоза [7]. Полизахаридите Longan регулират чревната микробиота и чревните метаболити (увеличавайки съдържанието на пируват и бутаноат), за да произведат имуномодулаторни дейности [8].

Cistanche deserticola, като традиционна китайска медицина, е широко използвана като хранителна добавка в Китай. Фармакологичните изследвания показват, че тя е проявявананеврозащитен, имуномодулиращо, хормоналнибалансиране, анти-умора, анти-възпалителен, хепатопротекция,анти-окислителен, анти-бактериална, анти-вирусен, ианти-туморефекти [9]. Химическият анализ показва, че фенилетаноидни гликозиди и полизахариди са основните активни съставки. Ехинакозидът, основният фенилетаноиден гликозид в C. deserticola, показва широки фармакологични действия, но неговата лекарствена способност е ограничена поради слабата бионаличност, бързия и екстензивен метаболизъм in vivo. Проучванията са потвърдили, че ехинакозидът може да се метаболизира от чревната микробиота in vitro [10,11]. Въпреки това, доказателствата in vivo не са изследвани. Както знаем, чревната микробиота играе важна роля в медиирането на метаболизиращата биоактивност на билковите лекарства. Следователно основната цел на тази работа беше да се изследва влиянието нацистанхе полизахаридивърху чревната микробиота и ефектите върху метаболизма на ехинакозида.

2. Материали и методи

2.1. Материали и химикали

Cistanche deserticola YC Ma е получен от Alashan, Вътрешна Монголия Mandela sand industry development Co., LTD, Китай. Те бяха удостоверени от професор Лиджуан Джан (Университет по традиционна китайска медицина в Тиендзин). Ваучер екземпляр беше депозиран в нашата лаборатория. Стандартното вещество като ехинакозид, актеозид и хлорогенна киселина е получено от Националния институт за контрол на фармацевтични и биологични продукти (Пекин, Китай). Чистотата на всеки стандарт беше по-голяма или равна на 98 процента. Ацетонитрил и метанол с хроматографски клас бяха закупени от Fisher Scientific (Pitts burgh, PA). Мравчената киселина беше закупена от Anaqua Chemical Supply Inc. (Wilmington, USA). Другите химически реагенти са с аналитичен клас и са закупени от Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Шанхай, Китай).

Мъжки плъхове Sprague-Dawley (200–220 g) бяха доставени от Beijing HFK Bioscience CO., LTD (Пекин, Китай, лиценз № SCXK (Jing) 2014- 0004). Всички животни са отгледани и настанени при SPF условия в помещението за животни. Експериментът е извършен съгласно насоките, установени от грижата за животните и използва комитет на TJUTCM и е в съответствие с ръководството за грижа и използване на лабораторни животни, публикувано от Националния институт по здравеопазване на САЩ (публикация на NIH номер 85–23, ревизирана 1996 г. ). След 1 седмица период на аклиматизация, плъховете бяха разделени на случаен принцип в четири групи: контролна група, група с общи полизахариди, група с високомолекулни полизахариди и група с нискомолекулни полизахариди. Всяка група се състои от 6 плъха, които се отглеждат в една и съща клетка.

2.2. Приготвяне на полизахариди от Cistanche

3.0 kg Cistanche deserticola YC Ma беше почистено и изсушено при 40 градуса във сушилня за въздушно сушене, след което беше натрошено на груб прах. Сухият груб прах се екстрахира с 85 процента воден етанол (v/v) при 60 градуса два пъти и 2 h за всеки път. Съотношенията твърдо-течно вещество бяха съответно 1:12 и 1:10. Билковите остатъци се екстрахират с вода при 100 градуса още два пъти, времето за извличане и съотношенията твърдо-течно вещество са същите с 85 процента етанол. Водният разтвор се смесва и се концентрира при понижено налягане и след това се утаява в 80 процента етанол, престоявайки при 4 градуса за 24 часа. Утайката се изолира чрез центрофугиране при 8000 rpm за 10 минути при 4 градуса и след това се лиофилизира, за да се получат общите полизахариди (ZT). След това ZT се разтваря в дейонизирана вода и се филтрува върху 100 kDa ултрафилтрационна мембрана с кухи влакна, събират се задържащите инфилтрат високомолекулни полизахариди (НМ). Проникналият филтрат се филтрува с 6 kDa ултрафилтрационна мембрана. Бяха получени средномолекулните полизахариди със задържащ филтрат (ММ) и нискомолекулните полизахариди (LM) на проникналия филтрат.

2.3. Първична характеристика на полизахаридите от цистанх

Съдържанието на полизахариди се определя по метода на фенола на сярната киселина, като се използва глюкоза като стандарт [12]. Общото съдържание на протеин се определя по метода BCA [13]. Анализът на монозахаридния състав беше извършен чрез HPLC (система UltiMate 3000), оборудвана с колона SinoPak C18 (5 μm, 150 mm × 4.6 mm) и детектор с диодна матрица (VWD-3000). Хроматографското разделяне на производните на PMP (1-фенил-3- метил-5-пиразолон) преди колоната се извършва с помощта на 100 mM фосфатен буфер и ацетонитрил в съотношение 82:18 (v/v). , проценти) като подвижна фаза при скорост на потока от 1.0 mL/min. Инжектират се 10 μL от всяка проба и се използва време на анализ от 30 минути с откриване при 245 nm. Събирането и обработката на данни бяха извършени с помощта на Chromeleon Software 7.1 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA).

Молекулното тегло (Mw) се определя чрез високоефективна хроматография за изключване на размера (HPSEC, система UltiMate 30{{10}}0), оборудвана с TSK гел G3000 PWXL (7.8 × 300.0 mm, Tosoh, Япония) и TSK гел GMPWXL (7.8 × 300.0 mm, Tosoh, Япония) колона и RefractoMax521 детектор за индекс на пречупване (RID). Пробите се елуират с 0,1 mol/L Na2SO4 при скорост на потока 0,5 ml/min. Температурата на колоната се поддържа при 35 градуса. Декстранът като стандарти и стандартната крива се начертават според времето на елуиране, нанесено спрямо логаритъма на молекулното тегло.

2.4. Фармакокинетично изследване

Кръвни проби бяха взети от вътрешния кантус на {{0}} h, 0.083 h, 0.167 h, 0.25 h, 0.5 h, 0.75 h, 1.0 h, 2.0 h, 3.{{20}} h, 4.0 h, 6.0 h, 8.0 h, 10 h, 12 h и 24 h след прилагане на ехинакозид (100 mg/kg). Плазмените проби се получават чрез центрофугиране в продължение на 10 минути при 7500 pm. Към 100 μL от плазмената проба се добавят 10 μL разтвор на IS (хлорогенна киселина) и 500 μL метанол. След това сместа се разбърква на вортекс за 3 минути и се центрофугира при 14,000 rpm за 10 минути. Супернатантата беше събрана и изсушена в азот при стайна температура. Впоследствие остатъкът се разтваря в 100 μL 50 процента воден метанол, отново се центрофугира при 14, 000 rpm за 10 минути. Накрая, 3 μL от супернатанта се инжектират в LC-MS/MS системата за анализ. Пробите бяха анализирани с помощта на метода съгласно докладван по-рано. Подвижната фаза се състои от CH3CN (разтворител A) и H2O (съдържащ 0,1 процента HCOOH; разтворител B), като се използва следният градиент: 0–1 min, 10 процента A; 1–8 минути, 10–90 процента A; 8–9 минути, 90–10 процента A; 9–11 минути: 10 процента A. Пробата се отделя на колона ACQUITY HSS T3 (1,8 μm, 100 mm × 2,1 mm id). Скоростта на потока беше 0.3 mL/min и температурата на колоната беше настроена на 35 градуса. При MS анализа е използван режим на отрицателна йонизация със следните оптимизирани параметри: капилярно напрежение 2,5 kV; температура на десолватация, 450 градуса. Азотът се използва като десолватационен и конусен газ, при дебит съответно 900 L/h и 150 L/h. Така се извършва количествено определяне с помощта на MRM на преходите на m/z 785.29 → 623.26 за ехинакозид, m/z 353.06 → 191.07 за хлорогенова киселина (IS), m/z 623.24 → 161.09 за актеозид. Напрежението на конуса за ехинакозид, IS и актеозид е 100 V, 32 V и 74 V; енергия на сблъсък, 32 V, 14 V и 30 V.

2.5. Изследване на късоверижни мастни киселини (SCFAs).

На мъжки плъхове Sprague-Dawley са прилагани орално ZT, HM и LM в продължение на 3 седмици. Определянето на SCFA (оцетна киселина, пропионова киселина, изомаслена киселина, маслена киселина, изовалерианова киселина, валерианова киселина и хексанова киселина) чрез газова хроматография (GC) се извършва, както е описано по-рано с няколко модификации [14]. Накратко, 0.5 g фекална проба се диспергира в 2,5 mL Milli-Q вода, разбърква се на вортекс за 10 min и 7,5 mL 1% разтвор на HCl/етанол, съдържащ вътрешни стандарти (маслена киселина 24,0 ug /mL и 2- етил хексанова киселина 1.32 ug/mL като вътрешни стандарти) бяха добавени. Смесите се хомогенизират за 5 минути и се центрофугират при 14,000 rpm за 10 минути при 4 градуса. Пет микролитра от супернатанта бяха инжектирани в разделен режим при съотношение 30:1. Газът носител беше N2 (99,999 процента) при 1 mL/min. Допълнителният газ (N2) беше 25 mL/min. Скоростта на потока на Н2 и въздуха е съответно 30 mL/min и 300 mL/min. Фекални проби бяха събрани на 20-ия ден от това изследване и незабавно съхранени при -80 градуса.

2.6. Събиране на изпражнения, екстракция на ДНК и 16S rRNA генно секвениране

Приблизително 200 mg от прясна фекална проба се събира в 1,5 mL стерилна Eppendorf епруветка от плъх и се съхранява при -80 градуса за по-късно приготвяне на ДНК. ДНК беше извлечена от изпражненията с помощта на QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN). Количеството на ДНК се определя с помощта на спектрофотометър NanoDrop (Thermo Electron Corporation); целостта и размерът се проверяват чрез електрофореза с 1,0% агарозен гел. Според концентрацията, ДНК се разрежда до 1 ng/μL с помощта на стерилна вода.

16S rRNA се амплифицира с помощта на специфичен праймер (V4: 515F-806R) с баркода. Всички PCR реакции бяха проведени с Phusion® High Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs). Смесете равен обем от 1 × зареждащ буфер (съдържащ SYB зелен) с PCR продукти и извършете електрофореза върху 2 процента агарозен гел за откриване. Ярките главни ивици между 400 и 450 bp бяха избрани за по-нататъшни експерименти. PCR продуктите се смесват в EU съотношения на плътност. След това смес от PCR продукти се пречиства с Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия).

Библиотеките за секвениране бяха конструирани с помощта на TruSeq® DNA PCR Free Sample Preparation Kit (Illumina, САЩ), следвайки препоръките на производителя и бяха добавени индексни кодове. Качеството на библиотеката беше оценено на Qubit® 2.0 Fluorometer (Thermo Scientific) и системата Agilent Bioanalyzer 2100. Библиотеката беше секвенирана на платформа Illumina HiSeq 2500 и бяха генерирани четения от 250 bp сдвоен край.

2.7. Биоинформатичен анализ

Прекъсването на последователността на баркода и праймера, сглобяването на последователността и филтрирането на данни според QIIME (V 1.7.0). Последователности с по-голямо или равно на 97 процента сходство бяха присвоени на едни и същи OTU. OTUs са анотирани като SILVA етикети. Индексите на алфа-разнообразието, оценяващи богатството на чревната микробна общност (метриките ACE и Chao1) и разнообразието на общността (метриките на Шанън и Симпсън) бяха изчислени с помощта на Qiime (Версия 1.9.1). Бета анализът на разнообразието беше използван за изследване на структурните вариации на микробните общности, използвайки UniFrac разстояние. Разликите между всички групи бяха тествани чрез теста на Tukey и теста на Wilcox. Анализът на основните координати (PCoA) беше приложен, за да се обяснят разликите в състава между четирите групи, използвайки R пакети. Методът за размер на ефекта на линейния дискриминантен анализ (LEfSe) е специално проектиран за откриване на биомаркери и обяснение на данни за секвениране. И линеен дискриминантен анализ (LDA) беше използван за изчисляване на размера на ефекта на всеки диференциран чревен микроб и характеристиките, свързани с всяка група плъхове. Корелационният анализ беше реализиран с помощта на R пакети gcorrplot (Версия 1.1.463).

Данните за SCFA бяха анализирани с помощта на ANOVA на SPSS 22.0.

3. Резултати и обсъждане

3.1. Получаване и химичен анализ на полизахариди от цистанх

Cistanches Herba се използва като храна и лекарство в Китай. Изолираните от него полизахариди са привлекли голямо внимание поради значителната си активност. В това изследване четирите части на полизахаридите на цистанх (ZT, HM, MM и LM) са получени чрез метода на водна екстракция, алкохолно утаяване и ултрафилтрация. Химическият състав на четири части полизахариди е показан в таблица 1.

Общото съдържание на захар в пробите чрез използване на стандартна крива на глюкозата. Резултатът показа, че добивите на HM и LM са по-високи от MM. Полизахаридите показват различни фармакологични свойства, особено имунна активност. Проучванията показват, че съдържанието и вида на монозахаридите, молекулното тегло, вида на заместителната група играят важна роля в активността на полизахаридите [15]. Различните части на монозахаридния състав на полизахаридите на цистанх са сходни и манозата (Man), галактуроновата киселина (GalUA), глюкозата (Glc), галактозата (Gal) и арабинозата (Ara) са основните монозахариди.

Съдържанието обаче беше различно в четирите части. Глюкозата и арабинозата са основните компоненти на ZT и HM, докато глюкозата е основната захарна единица на LM, освен това малко рамноза и глюкуронова киселина (GlcUA) също са открити в тези фракции.

Относителните молекулни тегла на пробите бяха изследвани чрез високоефективна хроматография с изключване по размер (HPSEC). Съгласно стандартната крива на декстраните и времето на задържане в колоните, основните пикови молекулни тегла в ZT се наблюдават при 1,68 × 106 Da и 1,70 × 104 Da, в HM се определя като 1,54 × 106, 2,06 × 105 и 4.81 × 104, в MM и LM бяха определени съответно на 1.09 × 104 и 2.05 × 104. Добивите от тях са посочени в таблица 1, а добивът на ММ е нисък и недостатъчен за експеримента с животни. Предишни проучвания показват зависимите от структурата ефекти на полизахаридите на цистанх върху различни биоактивности [16]. Все още са необходими допълнителни експерименти, особено пречистване, Fifine структурен анализ трябва да се приложи за изследването структура-активност

3.2. Фармакокинетично изследване

Фармакокинетиката на ехинакозида е изследвана чрез ултра-високо ефективна течна хроматография с тройна квадруполна масспектрометрия (UPLC и Xevo TQ-S) след перорално приложение на ехинакозид. Профилите на средната плазмена концентрация-време на ехинакозид са показани на Фиг. 1. Според софтуера за лекарства и статистика (DAS, версия 2.0), фармакокинетиката на ехинакозид отговаря на модел с едно отделение, а другият параметрите в групите ZT, HM и LM бяха обобщени в таблица 2, включително времето за достигане на максималната концентрация (Tmax), максималната концентрация (Cmax), площта под кривата концентрация-време (AUC) и средното време на престой (MTR) ). Фармакокинетично проучване показа, че средната Cmax на ехинакозид в групите ZT, HM и LM е установено, че е 646,4 ng/mL, 732.0 ng/ml и 898,4 ng/mL, които са 1,6, 1,8 и 2,2 пъти в сравнение с контролната група (406,8 ng/ml), съответно. Чрез предварително третиране с полизахариди, AUC(0-24 h) на ехинакозид се повишава съответно с 6,6%, 36,7% и 63,6% в ZT, HM и LM групите в сравнение с контролната група, което доказва, че полизахаридите показват дейността за насърчаване на абсорбцията на малка молекула. Тези резултати бяха доста сходни с това, че хитоолигозахаридите подобряват бионаличността на фенилетаноидните гликозиди в екстракта от Fructus Forsythia [17], а полизахаридите от Polygonum multiflorum подобряват биофармацевтичните свойства на 2, 3, 5, 4'-тетрахидрокси-стилбен- 2- O- -D-глюкозид при нормални плъхове Sprague-Dawley [18]. Чревната микробиота съдържа различни ензими, свързани с метаболизирането на лекарствата, и механизмите на фармакокинетиката и фармакодинамиката на лекарството, оформящи микробиома, все още са неизвестни [19]. Полизахаридите могат да подхранват чревната микробиота чрез повишаване на имунната система, абсорбиране на хранителни вещества и намаляване на растежа на патогени [20,21]. Въпреки че в литературата се съобщава, че полизахаридите на цистанхе могат да увеличат метаболитите на ехинакозид (като актеозид) in vitro, ние не открихме, че съвместно съществуващите полизахариди са се възползвали от превръщането на ехинакозида в актеозид in vivo [10,11].

3.3. Съдържание на SCFA в изпражненията на плъхове

Чревната микробиота ферментира полизахариди, произвеждащи различни биоактивни полимери и метаболити, като SCFA [3]. Като основни метаболити на полизахаридите, SCFA са анализирани във фекалиите. Съобщено е, че SCFA, включително оцетна киселина, пропионова киселина и бутират, имат благоприятен ефект върху метаболизма на глюкозата, холестерола и липидите. Ацетатът е основният SCFA в дебелото черво и е важен субстрат за синтеза на холестерол, пропионатът е субстрат за глюконеогенезата в черния дроб, а бутиратът е предпочитаният енергиен субстрат на колоноцитите и има противовъзпалително действие в червата [22,23].

Нашите резултати показват, че ацетатът е основният SCFAs, образуван във фекалиите за всички групи, последван от бутират и пропионат, докато концентрацията на валерат и разклонени SCFAs (изомаслена киселина и изовалерианова киселина) е по-ниска. Доказано е, че ацетатът повишава ензимната активност в чернодробната тъкан, което води до по-добър контрол на кръвната захар [24]. На 20-ия ден (Фиг. 2) групата LM има значително по-високо ниво на ацетат (pb 0,05), делът на пропионата има тенденция да бъде намален, а делът на бутират има тенденция да се увеличи, въпреки че промяната е незначителна в изпражненията в сравнение с контролната група.

Въпреки това, HM групата има значително по-нисък дял на бутират от контролната група (pb 0.05). Съдържанието на общи SCFAs между LM и HM е противоположна тенденция в сравнение с контролната група и само групата LM има значителна разлика.

Много фактори влияят върху нивото на SCFA в изпражненията, включително състава и количеството на чревната микробиота, хранителния източник и времето, необходимо на храната да премине през храносмилателния тракт [22]. Натрупващите се проучвания показват, че структурата на полизахаридите, включително състава на монозахаридните остатъци, степента на полимеризация, и двете могат да повлияят на ферментационните свойства и производството на SCFA [25]. От нашите резултати можем да заключим, че полизахаридите на цистанхе модулират производството на SCFA и полизахаридите с различна структура имат различни ефекти.

3.4. Полизахаридите Cistanche предизвикват основни промени в състава и разнообразието на чревната микробиота

Бактериалният състав на фекалните проби (n=4) беше изследван с помощта на техника за секвениране с висока производителност на Illumina. Библиотеката беше секвенирана на платформа Illumina HiSeq2500 и бяха получени четения от 250 bp сдвоен край. Те бяха обработени за таксономична идентификация и анализ на разнообразието. Кривите на разреждане (фиг. 3а) показват, че за всяка проба богатството на бактериални видове се изравнява с увеличаване на дълбочината на вземане на проби, което показва, че усилието за секвениране е достатъчно и че общото разнообразие в пробата е уловено. Кривата на Шанън (фиг. 3b) показва, че броят на уникалните бактериални видове се увеличава с нарастването на броя на идентифицираните последователности. Наситеността на кривите на Шанън означава, че данните за последователността са достатъчни, за да покрият всички видове бактерии.

Алфа анализът на разнообразието се използва за измерване на разнообразието в рамките на проба. Индексите на разнообразие на Chao1, ACE, Shannon и Simpson бяха изчислени чрез теста на Tukey, за да се опише алфа разнообразието. Анализът на разнообразието, базиран на индексите ACE и Chao 1, разкри общностното богатство на чревната микробиота на ниво OTU. Индексите ACE и Chao 1 са значително по-ниски във фекалните проби от LM групата в сравнение с контролната група (pb 0.05) (Фиг. 4a, b), което означава, че видовото богатство на чревната микробиота е намалено чрез LM хранене. Анализът на разнообразието, базиран на индексите на Шанън и Симпсън, разкри общностното разнообразие на чревната микробиота. Няма очевидна промяна в индексите на разнообразие на Шанън и Симпсън, когато са третирани с полизахариди от цистанхе в сравнение с контролната група.

Полизахаридите Cistanche предизвикват големи промени в таксоните. Освен това, в четири групи N98 процента от OTUs са свързани с вида Bacteroidetes, Firmicutes и Proteobacteria. Най-преобладаващият тип беше Bacteroidetes, допринасящ за 55.09 процента, 57,89 процента, 52,72 процента и 69.{{20}}4 процента от фекалната микробиота в контрола, ZT, HM и LM групи, съответно, следвани от Firmicutes, допринасящи съответно 41,39 процента, 38.03 процента, 42,15 процента и 28,15 процента (фиг. 5a, b). В сравнение с контролната група, ZT групата показва, че води до слаби ефекти върху относителното изобилие на основния тип, с изключение на това, че ниското изобилие на Actinobacteria е значително увеличено (MetaStat, pb 0,05). В HM групата Proteobacteria беше значително повишена (pb 0,01). Това показва, че полизахаридът HM Cistanche може да насърчи обогатяването на протеобактерии, за да повлияе на метаболизма на веществата при плъхове. В групата LM, изобилието на Bacteroidetes, чийто основен принос са Prevotellaceae и Prevotellaceae_UCG-001, се е увеличило значително (pb 0,05), а изобилието на Firmicutes, включително Peptococcaceae, е намаляло значително (pb 0,01) . Членовете на Prevotella и Bacteroides бяха описани по-рано като разградители на диетични фибри [26], произвеждащи метаболитни крайни продукти като сукцинат и ацетат [27]. Такива констатации потвърждават предишни проучвания, показващи, че някои Prevotella spp. може да разгради сложни растителни полизахариди. Предишни доклади също показаха, че двете доминиращи бактериални подразделения, повишеното съотношение на филата Firmicutes/Bacteroidetes са свързани със затлъстяването [28]. По-малкото изобилие на първото и по-високото изобилие на последното в групата на LM предполага, че LM може да помогне за свалянето на килограми.

От 72 открити семейства, таксоните top10 бяха изолирани и анализирани (фиг. 5c, d). Lachnospiraceae и Ruminococcaceae са две от най-разпространените семейства, открити в чревната среда на бозайниците, и са свързани с поддържането на здравето на червата [29]. В настоящото проучване, семействата Bacteroidales_S24-7_group (39,11 ± 6,04 процента, 36,88 ± 4,44 процента, 28,37 ± 4,01 процента, 35,81 ± 7,91 процента), Prevotellaceae (10,66 ± 3,84 процента, 15,14 ± 5,50) percent , 19.65 ± 8.97 percent , 21.05 ± 8.39 percent ), Lachnospiraceae (18.21 ± 5.20 percent , 15.09 ± 3.29 percent , 12.13 ± 7.14 percent , 13.12 ± 6.82 percent ), and Ruminococcaceae (9.64 ± 0.88 percent , 10.44 ± 2.45 percent , 11.27 ± 4,70 процента, 8,19 ± 1,72 процента) са доминиращи във всяка група. Съобщава се, че семейство S24-7 съдържа изобилие от ензими, разграждащи въглехидратите [30]. Prevotellaceae показаха нарастване, а Lachnospiraceae показаха тенденция към намаляване в групата на полизахаридите в сравнение с контролната група [31]. Предполага се, че няма съответните активни ензими на полизахариди на цистанхе в групата на Bacteroidales_S24-7_ и Lachnospiraceae или въглехидратно-свързващи модули на бактерии при полизахариди. Родовете Prevotella са докладвани във връзка с локуси за използване на полизахариди и въглехидратно-активни ензими [32]. За да се намери връзката между бактериите и SCFA, беше приложен корелационен анализ на Spearman. Някои родове като Bacteroides, Prevotella и Lactobacillus в чревната микробиота играят важна роля в хидролизата на полизахаридите в SCFA [33]. Нашите резултати също така показаха, че Bacteroidaceae корелира положително и доминираната микробиота произвежда повече бутират [34], докато Prevotellaceae корелира положително и доминираната микробиота произвежда повече ацетат. Доминираната от Lactobacillaceae и Ruminococcaceae микробиота произвежда повече пропионат (фиг. 6).

Бета анализът на разнообразието беше използван за изследване на структурните вариации на чревната микробиота в пробите, използвайки показатели за разстояние UniFrac. Разликите в разстоянията на Unifrac бяха анализирани чрез теста на Tukey и Wilcox (фиг. 7). Използвайки непретегления анализ на uniFrac, ние открихме, че мишките с храна за LM се групират далеч от други групи. Явен модел на групиране беше идентифициран за контролни, ZT, HM и LM групи.

Изобилието от тези микроби беше различно модулирано с полизахаридни обработки. За да се идентифицират специфичните бактериални таксони във всяка група, съставът на микробиотата от контролните, ZT, HM и LM групите бяха сравнени чрез метода на линейния дискриминантен анализ на размера на ефекта (LEfSe). Линейният дискриминантен анализ (LDA) се използва за изчисляване на размера на ефекта на всяка диференциално изобилна характеристика. Прагът на резултатите на LDA е по-висок от списъка с 4, което показва по-високо относително изобилие на общността в съответната група, отколкото в други групи. Използвайки този метод, открихме, че 19 OTU са значително различни във всички групи, а именно 6 OTU в контролната група са по-високи, само 1 OTU в ZT групата е по-висока, 10 OTU в HM групата са по-високи и 2 OTUS в групата LM са по-високи от другите групи (фиг. 8). Изобилието на g_Prevotellaceae_ UCG_001 в LM е увеличено значително (8,47 ± 1,9 процента в LM, 0.40 ± {{21 }}.09 процента в контролната група, pb 0,01). Резултатът е в съответствие с доклада, че полизахаридите на Porphyra haitanensis и Ulva prolifera очевидно могат да стимулират пролиферацията на Prevotellaceae UGC-001 (pb 0,05) и Rikenellaceae RC9 (pb 0,01) [35].

4. Изводи

Ясно е, че има връзка между химическите съставки на TCM, чревната микробиота и определени метаболити, произтичащи от чревни микроби. Нашите настоящи открития предоставиха метод за изследване на синергиите на метаболизма на ехинакозид с различни видове полизахариди на базата на чревна микробиота. Чревната микробиота може да метаболизира TCM и TCM може да повлияе на растежа на чревната микробиота. От една страна, след перорално приложение на полизахаридите в червата, разнообразие от чревна микробиота кодира метаболитни ензими, играещи важна роля в разграждането на полизахаридите и за производството на биоактивни метаболити. От друга страна, приносът на полизахаридите има известно влияние върху баланса на чревната микросреда в процеса. Чрез сравнение на с или без полизахариди открихме, че полизахаридите, макар и неусвоени директно от гостоприемника, потенциално действат като пребиотици, което води до благоприятни промени в чревната микробиота чрез насърчаване на растежа на пробиотици. Полизахаридите Cistanche регулират разнообразието на чревната микробиота, увеличават полезните бактерии и особено нискомолекулните полизахариди засилват растежа на Prevotella spp. Освен това, подобрената чревна микробиота след това подобрява абсорбцията на ехинакозид в Cistanche deserticola. Но причината не е напълно ясна, може да е резултат от комбинираните дефекти на чревната микробиота, SCFA и имунитета и са необходими допълнителни изследвания за модел на заболяването. Трудно е да се докажат ефектите на пребиотиците в здрави животински модели, чиято общност от микробиоти е стабилна и устойчива. Полизахаридите на Cistanche deserticola могат да бъдат разработени като пробиотични продукти за регулиране на чревната микробиота и могат да бъдат приложени към синергичния метаболизъм на малки молекули в бъдеще. Тези данни ще ни помогнат да проектираме интервенции, за да попречим на уязвимите групи хора да подобрят здравето си.

Декларация за конкурентен интерес

Авторите декларират, че няма конфликт на интереси по отношение на публикуването на тази статия.

Благодарности

Авторите изказват своята благодарност на Националната природонаучна фондация на Китай (грант № 81830112 и 81904058)

Препратки
[1] I. Khangwal, P. Shukla, Потенциални пребиотици и техните механизми на предаване: скорошни подходи, J. Food Drug Anal. 27 (3) (2019) 649–656.
[2] XF Xu, PP Xu, CW Ma, J. Tang, XW Zhang, Чревна микробиота, здраве на гостоприемника и полизахариди, Biotechnol. адв. 31 (2) (2013) 318–337.
[3] NT Porter, EC Martens, Критичните роли на полизахаридите в чревната микробна екология и физиология, Annu. Rev. Microbiol. 71 (2017) 349–369.
[4] QW Guo, QQ Ma, ZH Xue, XD Gao, HX Chen, Изследвания върху характеристиките на свързване на три полизахарида с различно молекулно тегло и флавоноиди от царевична коприна (Maydis stigma), Carbohyd. Polym. 198 (2018) 581–588.
[5] SS Zhou, J. Xu, H. Zhu, J. Wu, JD Xu, R. Yan, XY Li, HH Liu, SM Duan, Z. Wang, HB Chen, H. Shen, SL Li, Чревна микробиота -включени механизми за повишаване на системната експозиция на гинзенозиди чрез съвместно съществуващи полизахариди в отвара от женшен, Sci. Rep. 6 (2016), 22474.
[6] YP Jing, AP Li, ZR Liu, PR Yang, JS Wei, XJ Chen, T. Zhao, YR Bai, LJ Zha, CJ Zhang, Абсорбцията на сапонини от Codonopsis pilosula чрез съвместно съществуващи полизахариди облекчава чревната микробна дисбиоза с натриев декстран сулфат -индуциран колит при моделни мишки, Biomed. Рез. Вътр. 2018 (2018), 1781036 (18 страници).
[7] CJ Chang, CS Lin, CC Lu, J. Martel, YF Ko, DM Ojcius, SF Tseng, TR Wu, YYM
Chen, JD Young, HC Lai, Ganoderma Lucidum намалява затлъстяването при мишки чрез модулиране на състава на чревната микробиота, Nat. Общ. 6 (2015) 7489.
[8] JC Zhang, GM Yang, YZ Wen, SX Liu, CF Li, RL Yang, W. Li, Чревната микробиота участва в имуномодулаторните дейности на лонган полизахарид, Mol. Nutr. Food Res. 61 (11) (2017), 1700466.
[9] T. Wang, XY Zhang, WY Xie, Cistanche deserticola YC Ma, „Пустинен женшен“: преглед, Am. Дж. Чин. Med. 40 (6) (2012) 1123–1141.
[10] Y. Li, GS Zhou, SH Xing, PF Tu, XB Li, Идентифициране на ехинакозидни метаболити, произведени от човешки чревни бактерии с помощта на ултрапроизводителна течност
хроматография–квадруполна времепролетна масспектрометрия, J. Agr. Food Chem. 63 (30) (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, Y. Peng, MY Wang, PF Tu, XB Li, Човешки стомашно-чревен метаболизъм на воден екстракт от Cistanches Herba in vitro: изясняване на метаболитния профил въз основа на цялостна идентификация на метаболитите в стомашния сок, чревния сок, човешките черва бактерии и чревни микрозоми, J. Agric. Food Chem. 65 (34)
(2017) 7447–7456.
[12] M. Dubois, K. Gilles, JK Hamilton, PA Rebers, F. Smith, Колориметричен метод за определяне на захари и сродни вещества, Anal. Chem. 168 (4265) (1956) 167.
[13] NH Cho, SY Seong, KH Chun, YH Kim, IC Kwon, BY Ahn, SY Jeong, Нова мукозна имунизация с конюгати на полизахарид-протеин, уловени в алгинатни микросфери, J. Control. Издание 53 (1–3) (1998) 215–224.
[14] XY Zhao, ZZ Jiang, F. Yang, Y. Wang, XM Gao, YF Wang, X. Chai, GX Pan, Y. Zhu, Чувствително и опростено откриване на влиянието на антибиотиците върху динамичните и многостранни промени на фекално късо -верижни мастни киселини, PLoS One 11 (12) (2016), e167032.
[15] SJ Li, QP Xiong, XP Lai, X. Li, MJ Wan, JN Zhang, YJ Yan, M. Cao, L. Lu, JM Guan, DY Zhang, Y. Lin, Молекулярна модификация на полизахариди и произтичащи от това биоактивности , Compr. Рев. Храна. Sci. Ф. 15 (2) (2016) 237–250.
[16] ZF Fu, X. Fan, XY Wang, XM Gao, Cistanches Herba: преглед на неговите химични, фармакологични и фармакокинетични свойства, J. ​​Ethnopharmacol. 219 (2018) 233–247.
[17] W. Zhou, XB Tan, JJ Shan, T. Liu, BC Cai, LQ Di, Ефект на хитоолигозахаридите върху
чревната абсорбция на фенилетаноидни гликозиди в екстракт от Fructus Forsythia, Phytomedicine 21 (12) (2014) 1549–1558.
[18] LL Sun, M. Wang, HJ Zhang, GJ You, YN Liu, XL Ren, YR Deng, Влиянието на полизахаридите от Ophiopogon japonicus върху 2,3,5,4′-тетрахидрокси-стилбен-2- З. Fu и др. / Международен журнал за биологични макромолекули 149 (2020) 732–740 739 O- -d-глюкозид относно биофармацевтичните свойства in vitro и фармакокинетиката in vivo, Int. J. Biol. Macromol. 119 (2018) 677–682.
[19] KN Lam, M. Alexander, PJ Turnbaugh, Precision medicine goes microscopic: инженерство на микробиома за подобряване на лекарствените резултати, Cell Host Microbe 26 (1) (2019) 22–34.
[20] I. Khangwal, P. Shukla, Търсене на пребиотици, иновативни методи за оценка и техните здравни приложения: преглед, 3 Biotech. 9 (5) (2019) 187.
[21] GR Gibson, R. Hutkins, ME Sanders, SL Prescott, RA Reimer, SJ Salminen, K. Scott, C. Stanton, KS Swanson, PD Cani, K. Verbeke, G. Reid, Международната научна асоциация за пробиотици и пребиотици (ISAPP) консенсусно изявление относно определението и обхвата на пребиотиците, Nat. преп. Гастро. Hepat. 14 (8) (2017) 491–502.
[22] JMW Wong, R. de Souza, CWC Kendall, A. Emam, DJA Jenkins, Здраве на дебелото черво: ферментация и късоверижни мастни киселини, J. Clin. Гастроентерол. 40 (3) (2006) 235–243.
[23] С. И. Кук, Дж. Х. Селин, рецензия на статия: късоверижни мастни киселини в здравето и болестта, Хранене. Pharm. Там. 12 (6) (1998) 499–507.
[24] H. Yamashita, K. Fujisawa, E. Ito, S. Idei, N. Kawaguchi, M. Kimoto, M. Hinamori, H. Tsuji, Подобряване на затлъстяването и глюкозния толеранс от ацетат при диабет тип 2 Otsuka Long- Evans Tokushima Fatty (OLETF) плъхове, Biosci. Биотехнология. Biochem. 71 (5) (2007) 1236–1243.
[25] AL Ho, O. Kosik, A. Lovegrove, D. Charalampopoulos, RA Rastall, In vitro ферментируемост на ксилоолигозахариди и ксило-полизахаридни фракции с различно молекулно тегло от човешки фекални бактерии, Carbohyd. Polym. 179 (2018) 50–58.
[26] TT Chen, WM Long, CH Zhang, S. Liu, LP Zhao, BR Hamaker, Капацитетът за използване на фибри варира в чревната микробиота, доминирана от Prevotella срещу Bacteroides, Sci. Rep. 7 (1) (2017) 2594.
[27] M. Sakamoto, M. Ohkuma, Bacteroides sartorii е по-ранен хетеротипен синоним на Bacteroides chinchilla и има приоритет, Int. J. Syst. Еволюция Микр. 62 (6) (2012) 1241–1244.
[28] PJ Turnbaugh, RE Ley, MA Mahowald, V. Magrini, ER Mardis, JI Gordon, Чревен микробиом, свързан със затлъстяването, с повишен капацитет за събиране на енергия, Nature 444 (7122) (2006) 1027–1131.
[29] LF Gomez-Arango, HL Barrett, HD McIntyre, LK Callaway, M. Morrison, NM Dekker, Връзки между микробиома на червата и метаболитните хормони в ранна бременност при жени с наднормено тегло и затлъстяване, Диабет 65 (8) (2016) 2214 –2223.
[30] KL Ormerod, DL Wood, N. Lachner, SL Gellatly, JN Daly, JD Parsons, CG Dal Molin, RW Palfreyman, LK Nielsen, MA Cooper, M. Morrison, PM Hansbro, P. Hugenholtz, Геномна характеристика на некултивирано семейство Bacteroidales S24-7, обитаващо червата на хомеотермични животни, микробиом. 4 (1) (2016) 36.
[31] JD Zhang, LJ Song, YJ Wang, C. Liu, L. Zhang, SW Zhu, SJ Liu, LP Duan, Благоприятен ефект на Lachnospiraceae, произвеждащи бутират, върху индуцирана от стрес висцерална свръхчувствителност при плъхове, J. Gastro. Hepatol. 34 (8) (2019) 1368–1376.
[32] T. Accetto, G. Avguštin, Разнообразните и екстензивни апарати за разграждане на растителни полизахариди на вида Prevotella в търбуха и задните черва: фактор за тяхното повсеместно разпространение? Syst. Приложение Microbiol. 42 (2) (2019) 107–116.
[33] KE Bach Knudsen, MS Hedemann, HN Lærke, Ролята на въглехидратите в чревното здраве на свинете, Anim. Храна. Sci. техн. 173 (1–2) (2012) 41–53.
[34] SA Parker, A. Geirnaert, L. Berchtold, A. Greppi, L. Krych, RE Steinert, T. de Wouters, C. Lacroix, Разбиране на пребиотичния потенциал на различни диетични фибри с помощта на in vitro непрекъснат модел на ферментация за възрастни (PolyFermS), Sci. Доп. 8 (1) (2018) 4318.
[35] ZS Zhang, XM Wang, SW Han, CD Liu, F. Liu, Ефект на два полизахарида от морски водорасли върху чревната микробиота при мишки, оценени чрез секвениране на Illumina PE250, Int. J. Biol. Macromol. 112 (2018) 796–802.