Cistanche Tubulosa индуцира медиирана от реактивни кислородни видове апоптоза на първични и метастатични човешки ракови клетки на дебелото черво

ВЪВЕДЕНИЕ

Колоректалният рак е един от най-често срещаните ракови заболявания в света (Brennerи др., 2014), а честотата му непрекъснато нараства с приблизително 2,4 милиона случая през 2035 г., поради модерния начин на хранене и начин на живот, заедно с намалената физическа активност. Сегашните усилия не са достатъчни за борба с настоящата епидемия от колоректален рак и следователно са необходими нови подходи за ефективна превенция и лечение, включително промени в начина на живот в комбинация с по-безопасни алтернативни интервенции, като напр.Фитотерапия (Weidnerи др., 2015). Фитотерапията, използването на лечебни растения за лечение на болести, е неизбежна част от древната човешка история. Лечебните растения отдавна се използват като алтернативни източници за лечение на рак, представляващи повече от шестдесет процента от противораковите агенти, използвани в конвенционалната медицина (Balunas и Kinghorn, 2005; Saibuи др., 2015). Някои от най-известните примери включват екстракти отCatharanthus roseusГ. Дон. (Apocynaceae), Taxus baccata L. (Taxaceae) и Camptotheca acuminate Decne (Nyssaceae) (Cragg and Newman, 2005; da Rochaи др., 2001). Доказано е, че няколко билкови екстракта и фитохимикали упражняват антитуморни ефекти при колоректален рак, което се дължи на индуцирането на производството на реактивни кислородни видове (ROS) и свързаната с това апоптоза на ракови клетки, както в случая с екстракти отMelissa officinalis(Вайднери др., 2015)

Сред кандидатите за фитотерапия,Cistanche tubulosa, паразитно пустинно растение Orobanchaceae (Jiang et al., 2009), което е широко разпространено в сухи и полусухи региони на Африка, Азия и средиземноморския регион, е доказано, че има ценни лечебни свойства. Cistanche tubulosa се използва широко в традиционната медицина и се предполага, че има лечебни ефекти при бъбречна недостатъчност, болестна левкорея, метрорагия, женско безплодие и сенилен запек (Jiang et al., 2009). В допълнение към традиционните си медицински употреби, важен медицински Свойствата на Cistanche Tubulosa са интензивно изследвани през последното десетилетие, включително вазорелаксантни (Yoshikawa et al., 2006), хепатопротективни (Morikawa et al, 2010), антихипергликемични и хиполипидемични ефекти (Xiong et al., 2013). Cistanche Tubulosa също се предполага като мощен подобрител на имунната система, промотор на образуването на кости и средство против стареене и умора (Xu et al., 2014). Освен това е доказано, че екстрактът от Cistanche tubulosa блокира отлагането на амилоид в модела на болестта на Алцхаймер (Wu et al., 2015). Въпреки различните му терапевтични приложения, ефектът на Cistanche Tubulosa като потенциално противораково средство все още не е проучен.

В настоящата работа ние изследвахме противораковия ефект на Cistanche Tubulosa върху две първични и две метастатични клетъчни линии на рак на дебелото черво и потенциалните механизми, лежащи в основата на този ефект.

ЕСТЕСТВЕН CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОДОБРЯВАНЕ НА СЕКСУАЛНАТА ФУНКЦИЯ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Събиране и приготвяне на растителен екстракт

Пробите от Cistanche tubulosa са събрани от пустинните райони в Катар през 2014 г. и автентичността на растението е потвърдена от хербатолога. Пробите от ваучери се архивират в Токсикологичното и многофункционално отделение на ADLQ. Изсушените на слънце растителни проби бяха смлени с Retsch Knife Mill Grindomix GM300 на фин прах. Двадесет грама прах се екстрахират с 200 mL ултрачиста вода за една нощ при 37 градуса на ротационен шейкър при 200 rpm. СуровиятЕкстракти от Cistanche tubulosa (CTE)бяха центрофугирани за 3 0 минути при 8000 rpm за утаяване на неразтворими съединения, супернатантата беше събрана и лиофилизирана с помощта на Labconco Freezone 6 plus Freeze сушилня. Изсушеният екстракт беше възстановен в Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, SIGMA, Германия) до концентрация от 20 mg/mL и стерилно филтриран през 0.2-микронен мембранен филтър.

Клетъчни линии и поддръжка на клетки

Клетъчните линии на човешки карцином на дебелото черво CaCo2, SW620 и LoVo бяха получени от Cell Lines Service (CLS, Eppelheim, Германия), докато клетъчната линия HCT 116 беше любезен подарък от Отдела по биологични и екологични науки в Катарския университет. CaCo2 и HCT11 са получени от първичното място на карцином на дебелото черво, докато SW620 и LoVo са получени от метастатичното място. SW620, HCT116 и LoVo клетки се култивират и поддържат в DME среда, докато CaCo2 клетките се поддържат в Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM, SIGMA, Германия). Клетките се отглеждат като монослой, култивиран при 37 градуса в съответна среда, допълнена с 10% фетален волски серум (FBS, SIGMA, Германия) и 1% пеницилин/стрептомицин (SIGMA, Германия) във влажна атмосфера, съдържаща 5% въглероден диоксид.

Анализ на клетъчната жизнеспособност

Анализът {{0}}[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) беше използван за оценка на цитотоксичната активност на CTE подобно на описаното по-рано (Jaganjac et al., 2010). Плътността на посяване на CaCo2, HCT116, SW620 и LoVo клетки, култивирани в 96-плаки с ямки, беше 104 клетки на ямка. Клетките се посяват в съответната среда, допълнена с 10% FBS 24 часа преди третирането. След 24 часа средата се отстранява и клетките се третират с 0, 0.25, 0.5, 1 и 2 mg/mL CTE за 24, 48 и 72 часа при 37 градуса във влажна атмосфера, съдържаща 5% CO2. При третиране с CTE, средата се отстранява и към всяка ямка се добавят 40 uL разтвор на МТТ (0.5 mg/mL).

След 3 часа инкубация, МТТ разтворът се отстранява, формазановият продукт се разтваря в диметилсулфоксид (DMSO, SIGMA, Германия) и абсорбцията се измерва при 590 nm с четец на микроплаки (Infinite 200 PRO NanoQuant, Tecan Trading AG, Швейцария) .

Тест за апоптоза

Апоптозата в CaCo2, HCT116, SW620 и LoVo клетки беше открита с помощта на PE Анексин V комплект за откриване на апоптоза I с 7-амино-актиномицин D (7-AAD) като жизненоважно багрило (Becton Dickinson International, Белгия) съгласно инструкциите на производителя. Накратко, клетките се посяват в 24-плаки с ямки при плътност 5×104 клетки/ямка в съответна среда, допълнена с 10% FBS за 24 часа преди добавянето на CTE (0, 0,5 или 1 mg/mL). След 24 CTE инкубация, клетките бяха събрани, промити два пъти със студен фосфатно буфериран физиологичен разтвор и оцветени с Phycoerythrin (PE) Анексин V и 7-AAD за 15 минути при стайна температура на тъмно. Оцветените клетки бяха анализирани в рамките на 1 час чрез поточна цитометрия, използвайки FACS. Поточен цитометър Aria III и софтуер FACSDiva (Becton Dickinson) при ниска скорост на потока с минимум 104 клетки. Третиране на клетки в продължение на 4 часа с 6 цМ камптотецин (SIGMA) се използва като положителна контрола за анализа.

Вътреклетъчно производство на ROS

Вътреклетъчното производство на ROS беше изследвано с помощта на 2,7- дихлородихидрофлуоресцеин диацетат (DCFH-DA, SIGMA, Германия). DCFH-DA е нефлуоресцентна проба, която се окислява с вътреклетъчна ROS до флуоресцентното съединение 2, 7- дихлорофлуоресцеин (DCF) (Poljak-Blazi et al., 2011). DCFH DA анализът беше извършен по подобен начин, както описахме преди (Cindric et al, 2013; Poljak-Blazi et al., 2011). Накратко, плътността на посяване на CaCo2, HCT116, SW620 и LoVo клетки, култивирани в 96-черни плаки с ямки, беше 104 клетки на ямка. Клетките се посяват в съответната среда, допълнена с 10% FBS за 24 часа. Преди третиране клетките се инкубират с 10 цМ DCFH-DA при 37 градуса за 30 минути в 5% CO2 / 95% въздух. След това клетките се промиват и се третират с 0, 0.5 и 1 mg/mL CTE в средата без фенолно червено. Вътреклетъчното образуване на ROS се наблюдава непрекъснато в продължение на 25 часа при 37 градуса и 5% CO2, като се използва четец на микроплаки с горен модул за флуоресценция и контрол на газа (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Швейцария). Интензитетът на флуоресценция беше измерен с дължина на вълната на възбуждане от 500 nm и откриване на емисии при 529 nm. Произволните единици, относителни флуоресцентни единици (RFU), се основават директно на интензитета на флуоресценция.

НАТУРАЛНА CISTANCHE TUBULOSA ЗА ПОДОБРЯВАНЕ НА БЪБРЕЧНАТА ФУНКЦИЯ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Генериране на митохондриален супероксид

Способността на CTE да индуцира генериране на супероксид от митохондриите беше оценена с помощта на клетъчно пропусклива, насочена към митохондриите MitoSOX Red проба (Life Technologies) и Hoechst 33342 за ядрено оцветяване (Life Technologies). Клетките CaCo2, HCT116, SW620 и LoVo се посяват в 96-плаки с ямки при плътност от 104 клетки на ямка в съответна среда, допълнена с 10% FBS за 24 часа . След това клетките се зареждат с 4 µM MitoSOX и 2 µM Hoechst 33342 за 20 минути, излишното багрило се измива и ямките се третират с 0, 0,5 и 1 mg/mL CTE за 24 часа при 37 градуса и 5% CO2. Интензитетът на флуоресценция беше измерен с дължина на вълната на възбуждане от 510 nm и откриване на емисии при 580 nm за MitoSOX и дължина на вълната на възбуждане от 350 nm и откриване на емисии при 461 nm за Hoechst 33342, като се използва четец на микроплаки с най-висока флуоресценция (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Швейцария)

Статистически анализ

Описателната статистика беше показана като средно +/− SD. Значимостта на разликите между групите беше оценена с помощта на t-теста на Student и хи-квадрат теста. Когато бяха сравнени повече от две групи, ние използвахме едностранна ANOVA с подходящо post hoc тестване. Използван е SPSS 11.01 за Mircosoft Windows. Разликите с P по-малко от 0,05 се считат за статистически значими.

РЕЗУЛТАТИ

Ефектът на CTE върху пролиферацията на човешки клетъчни линии на рак на дебелото черво е показан на Фигура 1. Всички тествани концентрации на CTE показват силен инхибиторен ефект върху CaCo2 клетъчната линия по начин, зависим от концентрацията и времето (Фигура 1A). Седемдесет и два часа лечение с CTE инхибира растежа на CaCo2 клетки с повече от 60% в сравнение с контролата (p < 0.05 за всички концентрации). Значително въздействие на лечението с CTE върху растежа на клетките HCT116 също беше открито в точки за всички времена при двете най-високи концентрации (1 mg/mL и 2 mg/mL), достигайки повече от 70% намаление при последната концентрация (Фигура 1В, р <0.05). Въпреки че двете по-ниски концентрации на CTE (0,25 и 0,5 mg/mL) значително намаляват растежа на HCT116 на клетки след 24 часа (p<0.05), they had no significant effect following 72 hours of treatment compared to control (p>{{0}}.{{10}}5). Зависещото от времето и концентрацията инхибиране на пролиферация с CTE беше допълнително потвърдено в LoVo клетки с повече от 60% при най-висока концентрация (p < 0.05) (Фигура 1C), и всичките четири тествани CTE концентрации намаляват растежа на SW620 клетки след 48 часа (Фигура 1D, p < 0.05 за всички). След 72 часа лечение, същият ефект се наблюдава само за двете най-високи концентрации (p <0,05), докато концентрациите от 0,25 и 0,5 mg/mL не показват значим ефект в сравнение с контролата (p > 0,05). Въздействието на лечението с 0,5 и 1 mg/ml CTE върху индуцирането на апоптоза беше допълнително тествано във всичките четири клетъчни линии (Фигура 2). Увеличен брой клетки в ранна апоптоза беше открит в HCT116 и LoVo след 24-часово третиране с 0,5 mg/mL (p<0.05, Figure 2B and 2C) and in all cell lines at 1 mg/mL (p<0.05). A significant increase in necrotic or late apoptotic cell number was further observed in CaCo2 and SW620 cell lines (p<0.05, Figure 2A and 2D). The ability of CTE to induce intracellular ROS production is demonstrated in Figure 3. Three hours following CTE treatment there was a strong increase in intracellular ROS production in all cell lines (p<0.05). The intracellular ROS production increased progressively throughout the 25 hours of treatment in a time and concentration-dependent manner. Furthermore, the staining of cells with a mitochondria-targeted probe revealed a strong impact of CTE on mitochondrial superoxide production in a concentration-dependent manner (Figure 4). The highest increase in superoxide production by mitochondria was observed in HCT116 (69%, Figure 4B) and LoVo cells (82%, Figure 4C) following 24-hour treatment with 1 mg/mL of CTE.

Фиг. 1:Ефект наCistanche tubulosaвърху жизнеспособността на клетъчните линии на рак на дебелото черво. Клетъчната жизнеспособност, измерена чрез МТТ анализ на (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo и (D) SW620 клетки, е представена като процент от контролната нелекувана клетъчна линия на рак на дебелото черво. Дадени са средни стойности (±SD) за 5 повторения на представителния експеримент: (*) значимост p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Фигура 2: Воден екстракт от Cistanche tubulosa индуцира апоптоза в човешки ракови клетки на дебелото черво. Annexin-V-FITC поточни цитометрични анализи на (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo и (D) SW620 клетки са представени като процент от контролната нелекувана клетъчна линия от рак на дебелото черво. Дадени са средни стойности (±SD) за 3 повторения на представителния експеримент: (*) значимост p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Фигура 3: Воден екстракт от Cistanche tubulosa индуцира вътреклетъчно производство на ROS в зависимост от времето и дозата. Производството на ROS, измерено чрез DCFH-DA анализ в (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo и (D) SW620 клетки, е представено като средни RFU стойности (±SD) за съответните 5-реплики на представителен експеримент. (*) Значение стр<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells. 

Фигура 4: Водният екстракт от Cistanche tubulosa индуцира производството на митохондриален супероксид в човешки ракови клетки на дебелото черво. Интензитетът на флуоресценция на насочена към митохондриите MitoSOX червена проба в A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo и (D) SW620 клетки са представени като процент от контролната нетретирана клетъчна линия на рак на дебелото черво. Дадени са средни стойности (±SD) за 5 повторения на представителния експеримент: (*) значимост p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells.

ДИСКУСИЯ

Въпреки че по-ранни проучвания съобщават за множество лечебни свойства на Cistanche tubulosa, това е първият доклад за неговия антипролиферативен ефект върху злокачествените клетки. Биоактивните съединения на Cistanche tubulosa, екстрахирани с вода, силно полярен разтворител, показват силна противоракова биоактивност. По-рано сравнявахме ефективността на Cistanche tubulosa, разтворен във вода срещу други разтворители като метанол и етил ацетат, но водните екстракти показват най-обещаващите противоракови действия (данните не са показани).

Ние демонстрирахме способността на CTE при 1 mg/mL и 2 mg/mL да инхибира 60% от растежа както на първични, така и на метастатични клетъчни линии на рак на дебелото черво, разкривайки потенциално важна роля наCistanche tubulosaкато лечение на рак на дебелото черво. В сравнение с нормалните клетки, раковите клетки обикновено се характеризират с нарушение в редокс хомеостазата и общата стратегия на настоящите противоракови терапии е да се увеличи клетъчният оксидативен стрес (Yang et al, 2013). Въпреки че физиологично ниските нива на ROS имат важна роля като сигнални молекули, прекомерното производство на ROS може да допринесе за нестабилност и злокачествено заболяване на рака (Liou and Storz, 2010). Парадоксално, този дисбаланс в клетъчната редокс хомеостаза прави раковите клетки по-уязвими към ROS-индуцирана клетъчна смърт (Jaganjac et al., 2008; Nogueira and Hay, 2013). Антипролиферативният ефект на CTE, докладван в това проучване, може да бъде медииран от различни извън- и вътреклетъчни механизми на известни и неизвестни съединения в екстракта, насочени към множество пътища, които играят съществена роля в апоптозата. За да разграничим различните начини на клетъчна смърт, ние изследвахме потенциалния механизъм, отговорен за наблюдаваната CTE-индуцирана цитотоксичност.

ЕКСТРАКТ ОТ CISTANCHE TUBULOSA Против Алцхермер PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Нашите данни показват, че CTE увеличава вътреклетъчното производство на ROS и следователно ROS-индуцирана клетъчна смърт. Редокс състоянието на клетката също играе решаваща роля в регулирането на апоптозата и митохондриалната електротранспортна верига е едно от основните места за клетъчно генериране на ROS (Trachootham et al., 2008). Освен това, вътреклетъчната ROS може да причини клетъчна апоптоза както чрез зависими от митохондриите, така и чрез независими пътища (Sinha et al., 2013). Наистина, нашите данни също показват, че CTE-индуцираната екстернализация на фосфатидилсерин е често срещан ефект при апоптоза, както в първични, така и в метастатични ракови клетъчни линии, което предполага, че механизмът на CTE-индуцирана смърт е медииран от апоптоза, а не от некроза. Активирането на апоптозата в раковите клетки е коригираща стратегия и много противоракови лекарства могат да упражнят апоптотични ефекти в раковите клетки.

Следователно съединения или екстракти с проапоптотична активност в раковите клетки са потенциално полезни при изследванията на противоракови лекарства (Wong, 2011). За да определим дали индуцираният от CTE проапоптотичен ефект е медииран от ROS механизъм, индуциран от митохондриите, ние измерихме производството на супероксид, използвайки флуоресцентна сонда, насочена към митохондриите, в клетки, третирани с CTE. Нашите данни ясно показват, че CTE стимулира производството на митохондриален супероксид, което предполага, че противораковата активност на Cistanche tubulosa е поне отчасти медиирана чрез ROS механизъм, индуциран от митохондриите.

ИЗВОДИ

В заключение, нашите данни показват, че водният екстракт от пустинното растение Cistanche tubulosa може да представлява обещаващ кандидат за противораков подход в комбинация с други конвенционални терапии за превенция и лечение на рак на дебелото черво. Ние също така демонстрираме, че токсичността на растителния екстракт срещу раковите клетки се медиира от повишено вътреклетъчно производство на ROS и, поне отчасти, от митохондриално-зависима апоптоза. Продължават допълнителни проучвания за изолиране и характеризиране на отделните биологично активни съставки, отговорни за противораковата активност.

Необходими са повече изследвания, за да се оцени потенциалната употреба на този екстракт като ефективен химиопревантивен агент и да се разберат механизмите на действие върху раковите клетки на дебелото черво на молекулярно ниво. Необходими са допълнителни предклинични и клинични проучвания, за да се потвърдят наблюдаваните благоприятни ефекти върху здравето наCistanche tubulosa за профилактика на рака.

 CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE COFFE ПОДОБРЯВА ПАМЕТТА ПРОТИВ УМОРА PHGS75% ECH 30% ACT 12%