Етерични масла, съдържащи цитрал, като потенциални инхибитори на тирозиназата: Био-управляван подход на фракциониране

Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com

Резюме:

Прекомерното производство на меланин причинява сериозни дерматологични заболявания, както и малки естетични проблеми (напр. лунички и слънчево лентиго). Понижаването на тирозиназата е широко разпространен подход за лечение на такива разстройства и растителните екстракти често се оказват ценни източници натирозиназаинхибитори. Цитрал (смес от нерал и здравец) е важна ароматна съставка, която е показала антитирозиназен потенциал. Той е силно концентриран в етеричните масла (EO) на Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. и Verbenaofficinalis L. Въпреки това, само L. cubeba EO е изследван за използване като потенциален агент за избелване на кожата. Тази работа оценява in vitroтирозиназаинхибиторна активност на тези ЕО и проучвания, използващи фракциониране, ориентирано към биоанализ, дали техните различни химични състави влияят върху цялостната инхибиторна активност на ЕО чрез възможни синергични, адитивни и/или конкурентни взаимодействия между компонентите на ЕО. Инхибиторната активност на EO на C. schoenanthus и тази на EO на M. officinalis, с незначителни (плюс) количества на цитронелал, е в съответствие с тяхното съдържание на цитрал. От друга страна, EO на L. cubeba и V. officinalis са инхибиранитирозиназав значително по-голяма степен, тъй като съдържаха -мирцен, което допринесе за цялостната дейност по ЕО. Подобни наблюдения бяха направени за M. officinalis EO, който има високо (плюс) съдържание на цитронелал, което повишава цитралната активност.

Ключови думи:тирозиназаинхибиране; етерични масла; цитрал

cistanche има избелваща функция

Въведение

Тирозиназае ключовият ензим в биосинтезата на меланиновите пигменти в няколко бактерии, гъби, растения, животни и хора. При хората тирозиназата катализира ограничаващите скоростта стъпки в биосинтетичния път на меланин. Тази биосинтеза се характеризира с няколко ензимни и химични реакции, които водят до образуване на меланин от аминокиселината L-тирозин, като тирозиназата катализира нейното хидроксилиране до о-допахинон чрез неговите микофенолатни и дифенолни активности. Въпреки че има други ензими, включени в меланогенезата, само реакциите, катализирани от тирозиназа, не могат да възникнат спонтанно, докато останалите стъпки могат да продължат без ензимна активност при физиологично рН [1]. Поради тази причина понижаването на тирозиназата е много широко разпространен подход за намаляване на прекомерния меланин производството и използването на инхибитори на тирозиназа като агенти за избелване на кожата демонстрира значителна клинична и козметична значимост [2].

На пазара на ЕС,тирозиназаинхибиторите, които се използват като агенти за избелване на кожата, могат да бъдат групирани в две основни категории: тези, които са забранени съгласно козметичния регламент на ЕС 1223/2009 (т.е. хидрохинон и монобензилетер хидрохинон) поради тежките им странични ефекти, но които все още се използват за лечение на хиперпигментация по медицински надзор; и инхибитори на тирозиназата, които са разрешени за употреба в козметични продукти (т.е. арбутин, алоезин, коджикова киселина) [2,3]. Тази втора група обаче все още се характеризира с потенциално значими странични ефекти; клиничните проучвания върху коджиковата киселина наистина подчертават случаи на еритема, усещане за парене и контактна екзема след приложение. По подобен начин Европейският научен комитет по безопасност на потребителите изрази опасения относно употребата на арбутина като козметична съставка [2], поради потенциалната хидролиза на нейната гликозидна връзка, която освобождава хидрохинон. Следователно съществува необходимост от нови шаблони на молекули и/или смеси от биоактивни съединения за лечение на хиперпигментация.

Растенията са били ценни източници на агенти за избелване на кожата и три от пет от най-използваните агенти, както медицински, така и козметични, са специализирани за растенията метаболити (т.е. хидрохинон, -арбутин, алоезин). Към днешна дата фенолните съединения са основно изследвани като потенциалнитирозиназаинхибитори и те включват флавоноиди (напр. кверцетин [4]), стилбени (напр. ресвератрол [1]), фенилпропаноиди (напр. цинамалдехид [5] и евгенол [6]) и фенолни киселини (напр. анасонова киселина и бензоена киселина [7]). Интересът към фортерпеноидите е значително по-нисък и те са относително недостатъчно изследвани като антитирозиназни средства.

Цитралът е сред ограничения брой терпеноидни производни с антитирозиназни свойства, които са били изследвани. Това е смес от два изомера, цис- и транс-3, 7-диметил-2, 6-октадиенал (т.е. нерал и гераниал), за които е доказано, че блокират in vitro ензимната активност на гъбитетирозиназа[8]. В допълнение към значението си като миризлива съставка в напитки, храни и козметика, цитралът е показал обещаващи in vitro биологични активности, включително противогъбични, антибактериални, антиоксидантни и противовъзпалителни ефекти [9–11]. Освен това, последните проучвания показват подчертава, че цитралът има потенциално терапевтично значение като релаксатор на гладките мускули и локален анестетик, тъй като насърчава релаксацията в гладките мускули на трахеята, матката и аортата и инхибира нервната възбудимост при животински модели [12–15].

Citral се получава от етеричните масла (EO) на няколко ботанически вида, включително Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. и Verbena officinalis L. До най-доброто от авторите знание, само L. cubeba EO е изследван за неговототирозиназаинхибиторна активност [16]. Следователно, това проучване има за цел да оцени тирозиназните инхибиторни активности на C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis и V. officinalis ЕО, като се използва in vitro колориметричен анализ, за ​​да се прецени дали различните химични състави влияят върху цялостната ЕО инхибиторна активност чрез всякакви възможни синергични, адитивни и/или конкурентни взаимодействия между техните компоненти. Това проучване използва фракциониращ подход, ръководен от биоанализ, за ​​цялостна оценка на съставките на ЕО и техните енантиомери, когато са хирални, които допринасят за инхибиторната активност на ЕО срещу гъбен източник на тирозиназа, което е добра моделна система за предварителен скрининг натирозиназаинхибитори [17].

2. Резултати и дискусия

2.1. Химичен състав и съдържание на цитрал в изследваното етерично масло

В нашия опит да характеризираме изчерпателно всички потенциални компоненти на ЕО, които допринасят за разглежданата биологична активност, изследваните ЕО бяха анализирани от GC, както с FID, така и с MS детекция. Нормализираните относителни проценти на изобилие (изчислени от абсолютните площи, нормализирани към вътрешния стандарт C13 чрез използване на фактори на реакция [18,19]) на всички открити съединения бяха определени и използвани за сравняване на EO състави. Фигура 1 представя GC-MS профила на изследваните EO, анализирани с конвенционална колона. Таблица 1 изброява, за всеки изследван ЕО, съединенията, които показват нормализирано процентно изобилие над 0.1, докато пълните химични състави на ЕО са докладвани в Допълнителните материали (Таблици S1–S5).

Всички изследвани ЕО са богати на нерал (цис{{0}},7-диметил-2,6-октадиенал) и гераниал (транс-3,{ {5}}диметил-2,6-октадиенал), които са най-разпространените съединения. Тенералното/гераниалното съотношение беше много сходно във всички изследвани ЕО и съответстваше на 0.74 ± 0.05. EO на C. schoenanthus и L. cubeba показват най-високо съдържание на нерал и гераниал, което представлява средно 60 процента от целия им състав на EO и което е 1{14}}пъти повече, отколкото в EO на V. officinalis и в трите EO на M. officinalis (т.е. проба 1, 2 и 3). Допълнителните оксигенирани съединения, които са общи за всички EO, са 6-метил-5-хептен-1-он, линалол и цитронелал. Последният е значително по-разпространен в M. officinalis EO 1, отколкото в другите изследвани EO, включително M. officinalis EO2 и 3.

Изобилието на въглеводородната фракция варира значително в различните EO.M. officinalis EO 1 съдържа само транс- -кариофилен и -хумулен като сесквитерпеневъглеводороди, които представляват съответно 2,7 процента и 0.13 процента от общото ЕО. EO на C.schoenanthus представлява малко по-богата въглеводородна фракция от EO 1 на M. officinalis (т.е. 7.0 процента), съдържащ и двата монотерпена (т.е. камфен, цис{{1{{20 }}}}оцимен, лимонен, -пинен, транс- -оцимен, -туен) и сесквитерпени (т.е. транс- -кариофилен, -кадинен, δ-кадинен, гермакрен D, -елемен) в умерени суми. В EO на L. cubeba и V. officinalis въглеводородната фракция представлява 20 процента от общия EO и лимоненът е най-разпространеното съединение (т.е. съответно 15,0 и 10,9 процента), следван от -пинен, пинен , сабинен, транс- -кариофилен, -мирцен, камфен и -копаен. И накрая, M.officinalis EO 2 и 3 се характеризират с най-високо съдържание на въглеводородна фракция (38,8 процента и 31,8 процента от общия EO, съответно). И в двете проби въглеводородната фракция съдържа главно сесквитерпени, а именно транс- -кариофилен (съответно 27,8 процента и 20,0 процента) и -хумулен (3,0 процента и 2,6 процента) и намалена монотерпенова фракция, която се характеризира главно с лимонен ( 4,2 процента и 3,2 процента, съответно).

Бяха изследвани три проби от L. cubeba, V. officinalis и C. schoenanthus Eos, произведени в различни години, както и три проби от M. officinalis EO от различни производители. GC-MS анализите на C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis и V. officinalis не разкриват значителни качествени и количествени разлики в химичния състав на трите проби от различни години на производство. Това може да се припише на оптимални условия на съхранение, т.е. в контейнер от кехлибарено стъкло при 4 ◦C на тъмно с незначително свободно пространство. От друга страна, GC-MS анализите показват значителни разлики в изобилието на цитронелал и транс{{4 }}кариофилен в трите изследвани ЕО на M. officinalis. Цитронелата възлиза на 19,6 процента, 0.26 процента и 0.31 процента в M. officinalis EO 1, 2 и 3, съответно. Напротив, както беше описано по-горе, транс- -кариофиленът е значително по-изобилен в M. officinalis EO 2 и 3, отколкото в M. officinalis EO 1. Тези резултати са в съгласие с констатациите, докладвани от Seidler-Lozykawska et al., които подчертаха значителни разлики в изобилието на цитрал, цитронелал и транс- -кариофилен в ЕО, получени от 22 избрани генотипа на M. officinalis, произхождащи от европейските ботанически градини [20].

Беше извършено истинско количествено определяне чрез външно стандартно калибриране, за да се оцени точно изобилието от потенциални биоактивни специализирани съединения (т.е. нерал, гераниал, лимонен, -мирцен и цитронелал. Таблици 2 и 3 докладват диагностичните йони (m/z), използвани за SIM- MS количествено определяне на изследваните маркерни съединения заедно с обхвата на калибриране, уравнението на калибрационната крива, корелационните стойности и регресионната стандартна грешка на всеки аналит и съответно резултатите от количественото определяне.

2.2. In vitro инхибиторна активност на изследваните етерични масла срещу тирозиназа от гъби

Както беше описано по-горе, ЕО на C. schoenanthus, M. officinalis, L. cubeba и V.officinalis представят високи нива на цитрал, който се характеризира с неконкурентна инхибиторна активност срещу гъбичен източник на тирозиназа [8,16,21] . Това проучване имаше за цел да изследва in vitroтирозиназаинхибиторни активности на тези ЕО, за да се изследва дали тяхната инхибиторна активност може да се припише само на съдържанието им на цитрал или има други биоактивни съединения, които влияят върху инхибиторните ефекти на ЕО.

Гъбатирозиназабеше приет тук поради високата си хомоложност с хуманна тирозиназа, относително ниската си цена и готова наличност, което я прави добра моделна система за предварителен скрининг на инхибитори на тирозиназа [17]. Прецизността на ин витротирозиназатестът за инхибиране беше оценен по отношение на повторяемост (чрез извършване на анализа за ензимно инхибиране пет пъти в същия ден) и междинна прецизност (чрез повтаряне на анализа за ензимно инхибиране пет пъти на всеки четири седмици за период от шест месеца). Таблица 4 представя коефициента на вариация (CV) за тестове за инхибиране, проведени с коджикова киселина, която беше използвана като положителна контрола, и с L. cubeba EO. Резултатите бяха задоволителни, тъй като CV никога не надвишава 7 процента за повторяемост и 10 процента за междинна точност. Таблица 4 представя коефициента на вариация за тестовете за инхибиране, проведени с койкова киселина, използвана като положителна контрола, и с L. cubeba EO. Подобни стойности на точност бяха получени за всички тествани ЕО.

Кривата концентрация-отговор на цитрал се изследва чрез начертаване на наблюдаваната инхибиторна активност като функция на неговата концентрация в реакционната смес. Всички ЕО бяха тествани при концентрация от 166,7 µg/mL, което осигури, независимо от ЕО, получена концентрация на цитрал в рамките на диапазона на линейността на кривата концентрация-отговор (y=0.3956x плюс 1.8094,R{{7} }.9951, регресионна грешка: 2,08448, диапазон на линейност: 6,7–166,7 µg/mL) и не генерира проблеми с разтворимостта в реакционната смес.

Кутийката, показана на Фигура 2, представя процента натирозиназаинхибиране за всеки EO. За ЕО на L. cubeba, V. officinalis и C. schoenanthus, резултатите, отчетени на Фигура 2, съответстват на инхибиторната активност на тирозиназата на гъбите на ЕО на 2020, тъй като анализът на дисперсията не разкрива статистически значими разлики между ЕО на различни години на производство (p > 0.05). По отношение на EO на L. cubeba и C. schoenanthus, тези резултати са в добро съгласие с резултатите, получени от количествените GCMS анализи, които разкриват почти идентично количество цитрал в EO от различни години на производство. Партида 2020 от V. officinalis EO съдържа малко по-високо количество цитрал от партидите 2019 и 2018. Въпреки това, според кривата концентрация-отговор на цитрал, излишъкът на цитрал в партида 2020 не е достатъчен, за да се определи статистически значимо по-висок процент на ензимно инхибиране, като се има предвид произволното грешка, свързана с измерванията. За допълнителни подробности вижте Фигура S1 в Допълнителния материал. От друга страна, анализът на дисперсията (ANOVA), последван от пост-хоктест на Tukey–Kramer, разкрива, че трите тествани ЕО на M. officinalis, предоставени от различни производители, инхибират гъбитетирозиназав различна степен, което ще бъде допълнително описано в следващите параграфи. Най-големите инхибиторни активности се наблюдават за ЕО на L.cubeba, M. officinalis 1 и V. officinalis, които инхибират 59 ± 6 процента, 55 ± 7 процента и 52 ± 6 процента оттирозиназаактивност, съответно, когато се тества при концентрация от 166,7 µg/mL. Статистически значими (p < 0.05)="" по-ниски="" активности="" се="" наблюдават="" за="" ео="" на="" c.="" schoenanthus="" и="" m.officinalis="" 2="" и="" 3,="" чиято="" ензимна="" инхибиторна="" активност="" е="" 42="" ±="" 5="" процента,="" 40="" ±="" 5="" процента="" и="" 38="" ±="" 6="" процента,="" съответно.="" таблица="" 5="" предоставя="" концентрацията="" на="" инхибитора,="" която="" намалява="" наполовина="" ензимната="" активност="" при="" дадените="" експериментални="" условия="" (ic50)="" за="" всеки="" изследван="" инхибитор="" (т.е.,="" ео,="" единични="" съединения="" и="" коджикова="" киселина).="" всички="" eo="" ефективно="" инхибираха="" тирозиназата="" на="" гъбите="" и="" показаха="" инхибиторна="" активност,="" която="" беше="" средно="" 100-пъти="" по-ниска="" от="" тази="" на="" коджикацид,="" който="" беше="" използван="" като="" положителна="">

2.3. Идентифициране на допълнителни биоактивни компоненти, освен цитрал, чрез фракциониране, ръководено от биотест Хистограмата, показана на фигура 3, сравнява процента на експериментално измерените ензимни инхибиции със стойностите, които биха се очаквали, ако нерал и гераниал (считани за сума, т.е. цитрал) бяха само активни съединения в изследваните ЕО. Тези стойности бяха измерени чрез интерполация от кривата цитрална концентрация-отговор. Както може да се отбележи, C. schoenanthus, M. officinalis 2 и M. officinalis 3 показват инхибиторни активности, които са в съответствие с тяхното цитрално съдържание, докато L. cubeba, M. officinalis 1 и V. officinalis EO инхибират гъбите тирозиназа в по-голяма степен от очакваното. Беше приет био-насочван подход за идентифициране на допълнителните съединения, които допринасят за цитралната активност. Кислородните и въглеводородните фракции на ЕО на L. cubeba, M. officinalis 1 и V. officinalis бяха изолирани чрез флаш хроматография и индивидуално тествани за тяхната гъбатирозиназаинхибиторни дейности. Фракциите са фитохемично тествани за тяхната инхибиторна активност на гъбната тирозиназа. Фракциите, фитохемичните фракции бяха тествани при същата концентрация като тяхната получена концентрация при тестване на 166,7 µg/mL от съответния EO (вижте раздела Материали и методи в раздел 3.2). Таблица 6 отчита концентрацията на нерал, гераниал, цитронелал, лимонен, и -мирцен в кислородните и въглеводородни фракции на фракционираните ЕО.

Що се отнася до ЕО на L. cubeba и V. officinalis, както кислородната, така и въглеводородната фракция инхибират тирозиназата на гъбите, макар и в различна степен. Активностите на оксигенираните фракции (съответно 53 ± 3 процента и 44 ± 5) представляват по-голямата част от EOsanti-тирозиназапотенциал и са в съответствие със съответното съдържание на цитрал, което предполага, че съединенията, които допринасят за активността на цитрал, принадлежат към въглеводородните фракции. Лимонен (съответно 68,4 и 50.3 процента), транс- -кариофилен (съответно 12.0 и 7,8 процента), -пинен (съответно 1,7 и 7,5 процента), -пинен (съответно 2,5 и 12,9 процента), сабинен (съответно 2,7 и 3,8) и -мирцен (съответно 2,0 и 2,4 процента) са най-разпространените съединения в двете фракции и присъстват в доста сходни количества, с изключение на -пинен и -пинен, които преобладават във фракцията на въглеводородите на V. officinalis EO.

The chiral recognition revealed high enantiomeric purities in favor of the (-)-configured enantiomers for trans-β-caryophyllene (>99 процента в двата EO), лимонен (97 и 94 процента в L. cubeba и V. officinalis EO, съответно) и сабинен (87 процента в двата EO), докато различни енантиомерни излишъци са наблюдавани за -пинен ((-)- енантиомер: 38 процента в L. cubebaEO и 73 процента във V. officinalis EO) и -пинен ((-)-енантиомер: 67 процента в L. cubeba EO и 88 процента във V. officinalis EO). И в двата ЕО (-)-лимоненът представлява повече от 50 процента от цялата фракция. Въпреки това, въпреки че предишни проучвания съобщават за инхибиторна активност срещу гъбена тирозиназа поради голямото й изобилие [22,23], (-)-лимоненът тук не показва инхибиторна активност върху тирозиназата. Подобни резултати са получени за (плюс)-лимонен, рацемичната смес и съединенията (-)-транс- -кариофилен, (±)- -пинен и (±)- -пинен . Sabinene не е тестван, тъй като вече е доказано, че има незначително количество гъбитирозиназаинхибиторни ефекти [8]. В съгласие с предишни открития [8] мирценът намалява активността на тирозиназата на гъбите. Когато се тества при концентрацията, наблюдавана в 166,7 µg/mL на L. cubeba и V. officinalis EOs, -мирценовата активност преодолява разликата между очакваните инхибиторни ефекти на EOs, ако цитралът е единственото активно съединение, и експерименталните резултати. Противно на наблюденията на Matsuura et al. [8], -мирценът се оказа по-мощен инхибитор на гъбена тирозиназа от цитрал, тъй като неговият IC50 беше почти десет пъти по-нисък (13,3 µg/mL спрямо 121,8 µg/mL). Тази разлика може да се припише на различните използвани субстрати; Мацуура и др. изследват само дифенолазната активност на гъбична тирозиназа, тъй като те използват L-DOPA като субстрат, докато в това изследване е използван L-тирозин. Настоящите открития предполагат, че -мирценът може да бъде по-ефективен при инхибиране на монофенолазната активност на тирозиназата на гъбите, отколкото тази на дифенолазата.

M. officinalis EO 1 показва малка въглеводородна фракция, която представлява по-малко от 3 процента от общото количество и няма инхибиторна активност на тирозиназата. Въпреки това, оксигенираната фракция на M. officinalisEO 1 инхибира гъбената тирозиназа в по-голяма степен, отколкото би се очаквало от нейното цитрално съдържание (Фигура 3). Тази фракция съдържа значителни количества цитронелал в допълнение към нерал и гераниал и хиралният анализ разкрива висока хенантиомерна чистота на цитронелала в полза на (плюс) енантиомера (98,3 процента). Когато се тества независимо, при концентрация от 166,7 µg/mL, (плюс)-цитронелалът инхибира гъбичната тирозиназа в незначителна степен, въпреки че неговата активност е значително повишена, когато се тества в комбинация с цитрал. Тези резултати могат да обяснят разликите, наблюдавани в процентите на гъбитетирозиназаинхибиране в различните EO на M. officinalis. M.officinalis EO 2 и 3 представят много ниско съдържание на цитронелал, което може да е причината тяхната инхибиторна активност да е значително по-ниска от тази на M. officinalis EO 1.

3. Материали и методи

3.1. Реактиви

Диметилсулфоксид (DMSO), гъбена тирозиназа от Agaricus bisporus (JE Lange)Imbach, L-тирозин, коджикова киселина, цитрал, цитронелал, -мирцен, (плюс)-лимонен, (-)-лимонен, (±)-лимонен, ( ±)- и пинен са закупени от Merck Life Science Srl (Милано, Италия). Litsea cubeba, Verbena officinalis и Cymbopogon schoenanthus EOs бяха доставени от Erboristeria Magentina Srl (Poirino, Италия). За всяка бяха тествани три партиди от различни години (т.е. 2020, 2019, 2018). Изследвани са три проби от EO на Melissa officinalis; едната е предоставена от Agronatura (Spigno Monferrato, Alessandria), една от ErboristeriaMagentina Srl, докато последната е закупена от местен магазин и е от SpecchiasolS.rl (Bussolengo, Италия). В текста авторите наричат ​​различните ЕО на Melissaofficinalis съответно ЕО 1, 2 и 3 на M. officinalis. Предоставените ЕО са получени, като се следват процедурите, описани в Европейската фармакопея [24]. EO на Melissa officinalis и Verbena officinalis са произведени чрез хидродестилация съответно от листата и надземните части на растенията; по подобен начин ЕО на Litsea cubeba и Cymbopogon schoenanthus бяха получени чрез парна дестилация съответно на пресни плодове и пресни надземни части. Всеки EO беше индивидуално анализиран от GC-MS веднага щом беше закупен/предоставен от съответния производител, всяка година на съхранение и точно преди изследването на неговата инхибиторна активност върху гъбичната тирозиназа.

3.2. In vitro тест за инхибиране на тирозиназата

Theтирозиназаинхибиторните активности на ЕО и изолираните съединения са изследвани in vitro с помощта на колориметричен ензимен анализ, базиран на отчитане, оптимизиран от Zengh et al. [25], с леки модификации. Тирозиназните инхибиторни активности на ЕО, както и техните съответни въглеводородни и кислородни фракции и чисти съединения бяха изследвани in vitro с помощта на колориметричен ензимен анализ, който беше оптимизиран от Zengh et al. [25], с леки модификации: анализът се провежда при стайна температура итирозиназаинхибирането се измерва, като се има предвид контролната абсорбция и абсорбцията на пробата след 6 минути инкубация, а не след 20 минути, така че да се работи при линейната част на ензимната реакция, което осигурява по-точни резултати за инхибиране [26,27]. Гъба тирозиназа от Agaricus bisporus (JE Lange) Imbach беше избрана за това изследване. L-тирозинът беше използван като субстрат, което означава, че цялостната инхибиторна активност на тирозиназата беше изследвана, без да се прави разлика между активността на тирозиназа монофенолаза и дифенолаза. Фотометричните измервания при 475 nm бяха извършени на Thermo spectronic Genesys6 и коджиковата киселина беше използвана като инхибитор на положителна контрола. Разтворите на изследваните потенциални инхибитори (EOs, EO изолирани фракции, EO индивидуални съединения и коджикацид) бяха приготвени в DMSO. Таблица 7 представя тестваните концентрации за всеки изследван потенциален инхибитор. Гъбататирозиназаразтвор 200 U/mL (27,9 µg/mL) се приготвя в натриев фосфатен буфер (pH 6,8) и аликвотни части от 9 mL се съхраняват при -18 ◦C и се размразяват точно преди експериментите. Разтвор на тирозин 0.1 mg/mL се приготвя в натриев фосфатен буфер (рН 6,8) и се подновява ежедневно. Компонентите на реакционната смес се поставят във флакона в следния ред: 1 mL разтвор на гъбена тирозиназа 200 U/mL; 1 mL буферен разтвор на натриев фосфат; 10 µL разтвор на ЕО/единично съединение/койкова киселина; и накрая 1 mL разтвор на тирозин 0,1 mg/mL. Крайният процент на DMSO в реакционната смес беше 0.3 процента. Анализът се извършва в запечатан флакон от 4 mL, за да се избегне загубата на каквито и да е EO компоненти в заобикалящата среда и да се сведе до минимум тяхното освобождаване в пространството над реакционната смес. Реакционната смес се инкубира в термостатна водна баня при 25 ◦C за 6 минути. Впоследствие беше регистрирана абсорбцията при 475 nm, тъй като тази дължина на вълната позволява идентифицирането на допахром. Абсорбцията, съответстваща на 100 процента от активността на тирозиназата, се измерва чрез заместване на EOs/индивидуално съединение/разтвор на койкова киселина с 10 µL чист DMSO. Празните разтвори се приготвят, както следва: 2 mL буферен разтвор на натриев фосфат, 10 µL EO/индивидуално съединение /койкова киселина/DMSO разтвор и 1 mL разтвор на тирозин 0,1 mg/mL. Процентът на инхибиране на тирозиназата се измерва съгласно уравнението по-долу: процент на инхибиране=∆A (контрола) − ∆A (проба) / ∆A (контрола) × 100, ∆A (контрола) или (проба) {{ 33}} A475 (Контрола) или (Проба) − A475 (Празна контрола) или (Празна проба).

3.3. Флаш колонна хроматография

EO фракционирането се извършва на флаш колонна хроматографска система PuriFlash450 от Sepachrom (Rho, Милано, Италия), оборудвана с UV и ELSD детектори. Количество фракциониран ЕО: 900.0 mg. Стационарна фаза: сферични частици от силикагел, 50 цт, 25 mg (Purezza®-Sphera Cartridge Stationary) е от Sepachrom; подвижна фаза: петролетер (А) и етилацетат (В); дебит 25 mL/min. Елуирането с линеен градиент беше прието от 100 процента от А до 80 процента от А и 20 процента от В за 20 минути.

3.4. Условия за анализ

Разтворите на ЕО и тези на съответните им фракции се приготвят в циклохексан при концентрация от 5.0 mg/mL и се анализират чрез GC-MS. Цитралът, цитронелалът, -мирценът и лимоненът се определят количествено във всеки EO и съответните изолирани фракции, като се използва методът за външно стандартно калибриране. Подходящите нива на калибриране се приготвят в циклохексан и се анализират чрез GC-MS. Тридекан (C13) 1.0 mg/mL се използва като вътрешен стандарт за нормализиране на аналитични сигнали. Таблица 2 обобщава разглеждания обхват на концентрация за всяко количествено определено съединение.

GC-MS анализите бяха извършени с помощта на многофункционален пробоотборник Gerstel MPS-2 (Mülheim an der Ruhr, Германия), инсталиран на Agilent 6890 N GC, свързан с 5975 MSD и оборудван с ChemStation версия E. 02.02.1431 система за обработка на данни (AgilentTechnologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ). GC условия: температура на инжектора: 250 ◦C; режим на инжектиране: разделен; съотношение: 1/20; газ носител: хелий; постоянен дебит: 1 mL/min; колони: Mega5 (95 процента полидиметилсилоксан, 5 процента фенил) df 0.25 µm, dc 0.25 mm, дължина 25 m, от MEGA (Legnano, Италия). Температурна програма: 50 ◦C//3 ◦C/мин//180 ◦C//10 ◦C/мин//250 ◦C(5 мин.). MSD условия: MS работи в режим EI (70 eV); обхват на сканиране: 35 до 350 amu; време на престой 40 ms; температура на източника на йони: 230 ◦C; квадруполна температура: 150 ◦C; температура на трансферната линия: 280 ◦C. EO маркерите бяха идентифицирани чрез сравняване както на техните индекси на линейно задържане (ITs), изчислени спрямо C9-C25 въглеводородна смес, така и на техните масспектри или спрямо тези на автентични проби, или от наличните в търговската мрежа масспектрални библиотеки (Adams, 2007). EO хиралните анализи бяха извършени чрез приемане на същите условия за анализ на 2,3-ди-О-метил-6-Ot-бутилдиметилсилил- -CD (2,3DM6TBDMS -CD) df 0.25 µm, dc 0,25мм, дължина 25м от МЕГА. Температурни програми: 40 ◦C(1 мин)//2 ◦C/мин//220 ◦C (5 мин).

GC-FID анализите бяха извършени на същия инструмент. GC условия: температура на инжектора: 250 ◦C; режим на впръскване: разделен; съотношение: 1/20; газ носител: водород; скорост на потока: 1 mL/min. Температурни програми: 40 ◦C (1 мин.)//2 ◦C/мин//220 ◦C (5 мин.).

4. Изводи

Целите на това изследване бяха (1) да се изследва изчерпателно in vitro гъбататирозиназаинхибиторни активности на ЕО на Cymbopogon schoenanthus, Litsea cubeba, Melissa officinalis и Verbena officinalis и (2) за определяне дали тяхната биологична активност се приписва само на цитралното им съдържание или има допълнителни биоактивни монотерпени, които допринасят за изследваната биологична активност чрез използване на фракциониращ подход, ръководен от биоанализ. Това проучване установи, че в L. cubeba и V. officinalis EOs, -мирценът допринася за инхибиторната активност на EOs въпреки малкото си количество и е доказано, че има по-голяма инхибираща сила спрямо цитрала. Второто основно откритие беше, че (плюс) цитронелалната цитрална гъбатирозиназаинхибираща сила, потенциално виасинергично взаимодействие, тъй като не проявява активност самостоятелно. Последното откритие обяснява защо в ЕО на M. officinalis, които съдържат незначителни (плюс)-цитронелални количества, инхибиторните активности са в съответствие с тяхното цитрално съдържание, докато обратното е вярно за ЕО на M. officinalis с относително високо (плюс)-цитронелал изобилие. Дори въпреки че все още са необходими допълнителни проучвания за точно определяне на типа взаимодействия, които се случват между -мирцен и цитрал и между цитронелал и цитрал, и за оценка на инхибиторните активности на тези ЕО и отделни съединения върху човекатирозиназа, резултатите от това проучване могат да помогнат за рационално проектиране на смеси от ЕО или обогатени ЕО, които подобряват тяхната биологична ефикасност и повишават потенциала им като адюванти при лечението на хиперпигментация.

Препратки

1. Пилаяр, Т.; Маниккам, М.; Namasivayam, V. Средства за избелване на кожата: Перспектива на медицинската химия на тирозиназните инхибитори.J. Ензим. инхиб. Med. Chem. 2017, 32, 403–425. [CrossRef]

2. Десмед, Б.; Courselle, P.; De Beer, JO; Rogiers, V.; Grosber, M.; Deconinck, E.; De Paepe, K. Преглед на агентите за избелване на кожата с поглед върху незаконния козметичен пазар в Европа. J. Eur. акад. Dermatol. Venereol. 2016, 30, 943–950. [CrossRef] [PubMed]

3. Desmedt, B.; Van Hoeck, E.; Rogiers, V.; Courselle, P.; De Beer, JO; De Paepe, K.; Deconinck, E. Характеризиране на предполагаема нелегална козметика за избелване на кожата. J. Pharm. Biomed. анален 2014, 90, 85–91. [CrossRef] [PubMed]

4. Кубо, И.; Ikuyo, KH Флавоноли от цвете на шафран: инхибираща активност на тирозиназата и механизъм на инхибиране. J. Agric. Food Chem.1999, 47, 4121–4125. [CrossRef]

5. Chang, C.-TT; Chang, W.-LL; Hsu, J.-CC; Shih, Y.; Chou, S.-TT Химичен състав и инхибиторна активност на тирозиназата на етеричното масло от касия на Cinnamomum. Бот. Stud. 2013, 54, 2–8. [CrossRef]

6. Гарсия-Молина, MDM; Muñoz-Muñoz, JL; Гарсия-Молина, Ф.; Гарсия-Руис, Пенсилвания; Garcia-Canovas, F. Действие на тирозиназни онортно-заместени феноли: Възможно влияние върху покафеняването и меланогенезата. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 6447–6453. [CrossRef]

7. Кубо, И.; Kinst-Hori, I. Тирозиназни инхибитори от кимион. J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 5338–5341. [CrossRef]

8. Мацуура, Р.; Ukeda, H.; Sawamura, M. Тирозиназа инхибиторна активност на цитрусови етерични масла. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 2309–2313. [CrossRef]

9. Lertsatitthanakorn, P.; Taweechaisupapong, S.; Aromdee, C.; Khunkitti, W. In vitro биоактивности на етерични масла, използвани за контрол на акне. Вътр. J. Aromather. 2006, 16, 43–49. [CrossRef]

10. Bouzenna, H.; Hfaiedh, N.; Giroux-Metges, M.-A.; Елфеки, А.; Talarmin, H. Биологични свойства на цитрал и неговите потенциални защитни ефекти срещу цитотоксичност, причинена от аспирин в IEC-6 клетките. Biomed. Pharmacother. 2017, 87, 653–660. [CrossRef]

11. Лий, Х. Дж.; Jeong, HS; Ким, DJ; Не, YH; Юк, DY; Hong, JT Инхибиторен ефект на цитрал върху производството на NO чрез потискане на експресията на iNOS и активиране на NF-κB в клетки RAW264.7. арх. Pharm. Рез. 2008, 31, 342–349. [CrossRef]

12. Карвальо, PMM; Macêdo, CAF; Рибейро, TF; Силва, АА; Да Силва, RER; de Morais, LP; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Barbosa, R. Ефект на етеричното масло Lippia alba (Mill.) NE Brown и неговите основни съставки, цитрал и лимонен, върху трахеалните гладки мускули на плъхове. Биотехнология. Rep. 2018, 17, 31–34. [CrossRef] [PubMed]

13. Pereira-de-Morais, L.; Силва, AdA; да Силва, RER; Коста, RHSd; Монтейро, Á.B.; Барбоза, CRdS; Аморим, TdS; деМенезес, ИРА; Kerntopf, MR; Barbosa, R. Токолитична активност на етеричното масло от Lippia alba и неговите основни съставки, цитрал и лимонен, върху изолираната матка на плъхове. Chem. Biol. Взаимодействайте. 2019, 297, 155–159. [CrossRef]

14. Да Силва, RER; de Morais, LP; Силва, АА; Бастос, CMS; Перейра-Гонсалвеш, А.; Kerntopf, MR; Менезес, ИРА; Leal-Cardoso, JH; Barbosa, R. Вазорелаксиращ ефект на етеричното масло от Lippia alba и неговата основна съставка, цитрал, върху контрактилитета на аортата на изолиран плъх. Biomed. Pharmacother. 2018, 108, 792–798. [CrossRef] [PubMed]

15. Sousa, DG; Соуса, SDG; Силва, RER; Силва-Алвес, Канзас; Ферейра-да-Силва, FW; Kerntopf, MR; Менезес, ИРА; Leal-Cardoso, JH; Barbosa, R. Етеричното масло от Lippia alba и неговата основна съставка цитрал блокират възбудимостта на седалищните нерви на плъхове. Браз. J. Med.Biol. Рез. 2015, 48, 697–702. [CrossRef] [PubMed]

16. Хуанг, X.-W.; Feng, Y.-C.; Huang, Y.; Ли, Х.-Л. Потенциално козметично приложение на етерично масло, извлечено от плодове Litsea cubeba от Китай. J. Essent. Oil Res. 2013, 25, 112–119. [CrossRef]

17. Золгадри, С.; Бахрами, А.; Хасан Хан, Монтана; Munoz-Munoz, J.; Гарсия-Молина, Ф.; Гарсия-Кановас, Ф.; Saboury, AA Изчерпателен преглед на инхибиторите на тирозиназата. J. Enzym. инхиб. Med. Chem. 2019, 34, 279–309. [CrossRef]

18. Bicchi, C.; Liberto, E.; Матеодо, М.; Сгорбини, Б.; Мондело, Л.; Zellner, Bd; Коста, Р.; Rubiolo, P. Количествен анализ на етерични масла: сложна задача. Вкус Fragr. J. 2008, 23, 382–391. [CrossRef]

19. Рубиоло, П.; Сгорбини, Б.; Liberto, E.; Cordero, C.; Bicchi, C. Етерични масла и летливи вещества: Подготовка и анализ на проби. Рецензия. Вкус Fragr. J. 2010, 25, 282–290. [CrossRef]

20. Seidler-Łozykowska, K.; Bocianowski, J.; Król, D. Оценката на променливостта на морфологичните и химичните черти на тези избрани генотипове на маточина (Melissa officinalis L.). Производство на промишлени култури 2013, 49, 515–520. [CrossRef]

21. Кубо, И.; Kinst-Hori, I. Инхибиторна активност на тирозиназата на ароматните съединения на зехтина. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 4574–4578 [CrossRef] [PubMed]

22. Фиоко, Д.; Arciuli, М.; Арена, депутат; Бенвенути, С.; Gallone, A. Химичен състав и антимеланогенен потенциал на различни етерични масла. Вкус Fragr. J. 2016, 31, 255–261. [CrossRef]

23. Ху, JJ; Ли, X.; Liu, XH; Zhang, WP Инхибиторен ефект на етерично масло от лимон върху активността на тирозиназата на гъби in vitro. мод. FoodSci. техн. 2015, 31, 97–105. [CrossRef]

24. Съвет на Европа. Европейска фармакопея, 10-то издание; Съвет на Европа: Страсбург, Франция, 2020 г.; ISBN 978-92-871-8921-9.

25. Джън, ЗП; Тан, HY; Чен, Дж.; Wang, M. Характеризиране на инхибиторите на тирозиназата в клонките на Cudrania tricuspidata и тяхното изследване на връзката структура-активност. Fitoterapia 2013, 84, 242–247. [CrossRef] [PubMed]

26. Уилямс, KP; Scott, JE Проектиране на ензимен анализ за скрининг с висока производителност. При скрининг с висока производителност. Методи в молекулярната биология (методи и протоколи); Janzen, WP, Paul, B., Eds.; Humana Press: Clifton, NJ, САЩ, 2009 г.; том 565, стр. 107–126.

27. Брукс, HB; Geeganage, S.; Kahl, SD; Montrose, C.; Ситтампалам, С.; Смит, MC; Weidner, JR Основи на ензимните анализи за HTS. В Ръководството за насоки за анализ; Маркосян, С., Ситтампалам, С., Гросман, А., Ред.; Eli Lilly & Company и Националният център за развитие на транслационните науки: Бетезда, MD, САЩ, 2004 г.