Clec12a смекчава възпалението, като същевременно ограничава разширяването на колитогенния комменсал

РЕЗЮМЕ

Регулирането на микробиотата е от решаващо значение за здравето на червата, но механизмите, използвани от вродения имунитет, остават неясни. Тук показваме, че мишки с дефицит на С-тип-лектинов рецептор, Clec12a, развиват тежък колит, който зависи от микробиотата. Проучванията за трансплантация на фекална микробиота (FMT) при свободни от микроби мишки разкриха колитогенна микробиота, образувана в Clec12a-/- мишки, които бяха белязани от експанзията на грам-положителния организъм, гризачи Faecalibaculum. Лечението с F. rodentium е достатъчно за влошаване на колита при мишки от див тип. Макрофагите в червата експресират най-високите нива на Clec12a. Анализът на цитокини и секвениране в Clec12a-/- макрофагите разкри засилено възпаление, но значително намаляване на гените, свързани с фагоцитозата. Наистина, Clec12a-/- макрофагите са нарушени в способността си да поемат F. rodentium. Пречистеният Clec12a има по-високо свързване с грам-положителни организми като F. rodentium. По този начин нашите данни идентифицират Clec12a като вроден механизъм за имунен надзор за контролиране на разширяването на потенциално вредни коменсали без явно възпаление.

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

ВЪВЕДЕНИЕ

Съставът и функцията на микробиотата могат да имат дълбоко въздействие върху здравето и болестите на бозайниците (Fassarella et al., 2021). Това е добре документирано за възпалително заболяване на червата (IBD), където повечето миши модели на IBD са чувствителни към промени в състава на микробиотата (Gkouskou et al., 2014). Разбирането на факторите, които влияят и инструктират стабилността на микробиотата, ще бъде важно при разработването на терапии, базирани на микробиота (Sharma et al., 2020; Sorbara and Pamer, 2022). Микробиотата се влияе от множество параметри, включително диета, лекарства и имунна система. През последните години беше показано, че адаптивните имунни компоненти, особено IgA, влияят върху състава на микробиотата (Nakajima et al., 2018; Okai et al., 2016; Yang and Palm, 2020). Въпреки това, по-малко се знае за това как специфичните вродени имунни рецептори влияят върху състава на хомеостатичната микробиота.

Генетичните полиморфизми в гените, регулиращи микробното разпознаване и мукозния имунитет, са значими рискови алели за IBD, включително протеина на автофагията ATG16L1 (Cadwell et al., 2008; Liu et al., 2015; Rioux et al., 2007; Wellcome Trust Case Control, 2007 ). В скорошно проучване, изследващо промените в експресията на миелоидния ген при индивиди с полиморфизъм ATG16L1T300A, инхибиторният С-тип лектин рецептор (CLR), Clec12a, беше идентифициран като значително потиснат в тези клетки (Begun et al., 2015). Същото това проучване демонстрира, че Clec12a функционира в защита на патогенна инфекция чрез свързване с пътя на автофагията. Тези данни предполагат, че понижаването на Clec12a при индивиди с IBD може да повлияе на тежестта и/или развитието на заболяването. Въпреки тези доказателства, малко се знае за механизмите на имунната регулация, упражнявани от Clec12a по време на колит.

Лектините от С-тип са разнообразна група от разтворими или свързани с мембрана молекули, способни да свързват липиди, протеини и въглехидрати, получени както от гостоприемник, така и от микроби (Brown et al., 2018). Mincle (Clec4e) и Dectin-1 (Clec7a) са два CLR, които влияят на специфични членове на микробиотата, за да поддържат чревната хомеостаза (Iliev et al., 2012; Martinez-Lopez et al., 2019). Въпреки това, с над 1, 000 различни лектини от С-тип, остава много да се открие в това семейство протеини. Clec12a принадлежи към семейството на рецепторите на естествения убиец и е един от само двата С-тип лектини, които съдържат мотив за инхибиране на имунния тирозин (ITIM), способен да ограничава възпалителните сигнални пътища (Brown et al., 2018; Marshall et al., 2004) . Clec12a разпознава пикочната киселина, която е сигнал за клетъчно увреждане (Neumann et al., 2014). Clec12a е най-силно експресиран във вродени имунни клетки, а в неутрофилите той действа за намаляване на активирането и понижаване на производството на възпалителни цитокини при разпознаване на пикочната киселина (Neumann et al., 2014). Обратно, Clec12a насърчава възпалението, като позволява трансмиграция на мононуклеарни фагоцити (MNPs) през кръвно-мозъчната бариера по време на автоимунен модел на множествена склероза и потенциране на сигнализирането на интерферон тип I в отговор на вирусна инфекция (Li et al., 2019; Sagar et al. ., 2017). Clec12a също е способен да разпознава плазмодиалния продукт, хемозоин, за който е доказано, че увеличава CD8+ Т клетките в мозъка след инфекция с Plasmodium (Raulf et al., 2019). По този начин Clec12a представлява безразборен CLR с различни роли в имунитета и уникални сигнални способности, но ролята му в червата остава неизвестна.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

По-рано сме демонстрирали, че специфични чревни гъбички изострят колита чрез индуциране на пуриновия метаболит, пикочна киселина (Chiaro et al., 2017). Освен това метаболизмът на пурин наскоро беше свързан с чревно заболяване на човека (Zhu et al., 2019). Тези данни заедно предполагат, че откриването на пикочна киселина може да има отношение към IBD. Въз основа на това, ние се заехме да изследваме функцията на Clec12a в червата. Открихме, че животните с дефицит на Clec12a са силно податливи на колит, който зависи от състава на микробиотата, образуван в отсъствието на Clec12a. FMT на Clec12a-/- микробиота в WT свободни от зародиши животни беше достатъчна за обостряне на колит и образуването на колитогенна микробиота в Clec12a-/- животни е независимо от адаптивния имунитет. За да се идентифицират съответните микроби, които биха могли да обострят колита, животните Clec12a-/- бяха третирани с различни антибиотици, а тези, които бяха насочени към грам-положителни бактерии, облекчиха заболяването. Секвенирането на 16S rDNA идентифицира Faecalibaculum rodentium като значително по-изобилен при Clec12a-/- животни и пероралното приложение на F. rodentium е достатъчно за изостряне на болестната патология при WT животни. Имунното профилиране на Clec12a-/- животни разкрива значително намаляване на хомеостатичните миелоидни клетки в дебелото черво. РНК секвенирането на третирани с F. rodentium макрофаги разкри, че Clec12a насърчава фагоцитозата. Тъй като е доказано, че Clec12a свързва множество лиганди, ние попитахме дали Clec12a ще се свърже с различни членове на микробиотата. Използвайки слят протеин Clec12a-Fc, ние идентифицираме, че Clec12a се свързва най-силно с грам-положителните членове на микробиотата. Взети заедно, тези данни предполагат модел, при който Clec12a контролира колитогенните членове на микробиотата чрез директно свързване и фагоцитоза, като същевременно предотвратява възпалителните реакции. В сценарии, при които експресията на Clec12a е намалена, грам-положителните патобионти могат да се разширят и да стимулират възпаление. По този начин нашите проучвания идентифицират Clec12a като важен възпалителен супресор за осигуряване на хомеостаза и поддържане на здрава микробиота.

РЕЗУЛТАТИ

Clec12a-/- животните са силно податливи на колит, независимо от адаптивната имунна система

Съобщава се за намалена експресия на Clec12a при индивиди с IBD и ние показахме, че блокирането на производството на един от лигандите за Clec12a, пикочна киселина, може да облекчи колита (Begun et al., 2015; Chiaro et al., 2017; Liu et al. ., 2015). Clec12a обаче все още не е проучен при животински модели на колит. За тази цел WT и Clec12a-/- C57BL/6 мишки бяха заразени с остър DSS колит. Clec12a-/- животните загубиха значително повече тегло, показаха по-къси дебели черва и имаха значително увеличение на възпалителния маркер LCN2 във фекалиите в сравнение с WT животни, което показва влошено възпаление и заболяване (Фигура 1A-C). Подкрепяйки това, хистологичният анализ разкрива повишено увреждане на епитела, загуба на крипта и приток на имунни клетки в Clec12a-/- животни в сравнение с WT (Фигура 1D, E). В съответствие с резултатите в DSS модела на колит, трансфер на CD4+ CD45RBhi клетки в TCRb-/-; Clec12a-/- двойни нокаут мишки водят до по-малко наддаване на тегло с течение на времето и по-къси дебели черва в сравнение с Т клетките, прехвърлени в TCRb-/- мишки (Фигура 1F, G). Взети заедно, тези резултати показват, че загубата на Clec12a води до влошено чревно заболяване.

Съобщава се, че Clec12a се експресира до голяма степен във вродени имунни клетки с много ниска експресия, докладвана в CD8+ Т клетки. Следователно, за да се определи дали адаптивният имунитет е включен във влошената болест, наблюдавана при Clec12a-/- животни, Clec12a-/- животни бяха кръстосани с Rag-/- животни, за да се отстранят както Т, така и В клетките. Отново, Clec12a-/- животни развиват влошено заболяване в сравнение с WT животни, тъй като губят повече тегло и имат по-къси дебели черва от WT контроли (Фигура 1H, I). По подобен начин, Clec12a-/-; Rag-/- развива влошено чревно заболяване в сравнение с Rag-/- контролите и губи толкова тегло и има по-къси дебели черва от WT и Rag-/- като Clec12a-/- (Фигура 1H, I). По-рано сме съобщавали, че пероралното лечение със S. cerevisiae повишава нивата на пикочната киселина, за да влоши колита. Въпреки това, не са наблюдавани разлики в нивата на пикочна киселина в серума или изпражненията при WT спрямо Clec12a-/- животни, което предполага, че повишеното заболяване, наблюдавано в Clec12A-/-, не е резултат от повишена пикочна киселина (фиг. S1). По този начин влошеното развитие на колит, наблюдавано при Clec12a-/- животни, е независимо от адаптивната имунна система.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Влошаването на колита при Clec12a-/- животни зависи от микробиотата

Известно е, че колитът се задвижва отчасти от промени в състава на микробиотата (Kubinak et al., 2015; Ray and Dittel, 2015). За да се определи дали Clec12a-/- животните съдържат микробиота, която насърчава влошен колит, FMTs бяха извършени от WT или Clec12a-/- мишки в свободни от микроби WT животни. Четири седмици след трансплантацията, половината от животните бяха настанени заедно, докато другата половина останаха настанени отделно. След това във всяка група беше индуциран остър DSS колит (Фигура 2А). Животни, които са получили Clec12a-/- FMT и животни, настанени съвместно, са загубили значително повече тегло (Фигура 2B) и са имали значително по-къси дебели черва (Фигура 2C), отколкото животните, които са получили FMT от WT мишки. Освен това, хистологичният анализ разкри по-голямо увреждане на епитела и възпалителен приток след трансплантация с Clec12a-/- микробиота (Фигура 2D, E). Установените микробни общности се различават сред групите, както е определено чрез 16S rRNA генно секвениране с помощта на Bray-Curtis (PERMANOVA, p=0.0001), непретеглено (PERMANOVA, p=0.0062) и претеглено Unifrac разстояния (PERMANOVA, p=0.0001). Разликата в микробиотата в рамките на групата е най-голяма при съвместно настанени животни чрез същите показатели, показващи придобиването на микроби от всеки FMT генотип (Фигура 2 FH). Тези данни показват, че влошеният колит при Clec12a-/- животни се задвижва от специфични микроби, обогатени в отсъствието на Clec12a; и тези микроби станаха доминиращи двигатели на колитогенен фенотип, дори в присъствието на установена WT микробиота.

Съставът на микробиотата, образуван в Clec12a-/- животни, е независим от адаптивния имунитет

Имунната система е важна за диктуването на състава на микробиотата. Експериментът FMT показва, че Clec12a-/- води до промяна в състава на микробиотата, което насърчава влошено развитие на колит. Първо искахме да определим дали дефицитът на Clec12a-/- в рамките на имунното отделение е в състояние да промени чревната микробиота. За тази цел костен мозък от WT или Clec12a-/- мишки се прехвърля в смъртоносно облъчени WT SPF реципиентни мишки, за да се стандартизира микробиотата, последвано от 8-седмичен период на имунно възстановяване (Фигура 3А). През това време трансплантираните имунни системи имат време да се развият в рамките на реципиента, различно оформяйки състава на микробиотата. За да определим дали проколитогенните промени в микробиотата са резултат от това имунно скулптуриране, ние проведохме FMTs, използвайки изпражненията от WT или Clec12a-/- химерни мишки и индуциран DSS колит (Фигура 3А). Въпреки че няма значителни промени в загубата на тегло (Фигура 3B), дебелото черво от животни, получаващи FMT от Clec12a-/- химерни мишки, е значително по-късо в сравнение с животни, получаващи FMT от WT мишки (Фигура 3C), което показва влошено заболяване. Освен това, когато реципиентите на WT и Clec12a-/- FMT бяха настанени съвместно, дебелото черво беше значително по-късо в сравнение с животните, получаващи WT FMT (Фигура 3C). По този начин дефицитът на Clec12a-/- в хемопоетичното отделение води до образуването на доминираща колитогенна микробиота.

За по-нататъшна подкрепа, че адаптивната имунна система е необходима за образуването на колитогенна микробиота в Clec12a-/- животни, ние извършихме FMT, използвайки изпражнения от Rag-/- или Rag-/-; Clec12a-/- -, както е описано по-горе. Животни, получили Rag-/-; Clec12a-/- FMT загуби повече тегло и имаше значително по-къси дебели черва, отколкото животните, които са получили FMT от Rag-/- животни, освен това съвместно настанените животни също развиха влошено заболяване (Фигура 3D, E). Тези данни показват, че дефицитът на Clec12a в рамките на вродената имунна система е достатъчен, за да доведе до образуването на микробиота, способна да влоши колита.

Clec12a потиска експанзията на Faecalibaculum rodentium

Използвахме серия от различни антибиотици, за да идентифицираме съответните организми, които предизвикват заболяване в животните Clec12a-/-. Първо, лечението с мощен коктейл от широкоспектърни антибиотици, които включват еритромицин, ампицилин, неомицин и гентамицин, значително намалява тежестта на заболяването както при Clec12a-/-, така и при WT животни, което предполага, че бактериалната популация на микробиотата е от значение за заболяването ( Фигура 4A; Фигура S2). След това допълнително стеснихме кои бактериални популации са най-подходящи за заболяване, като използвахме различни антибиотици, насочени към уникални бактериални таксони. По-конкретно, ние избрахме гентамицин, аминогликозид, насочен към грам-отрицателни бактерии, и цефалотин, цефалоспорин, който е насочен предимно към грам-положителни бактерии. Тези лекарства се прилагат на Clec12a-/- животни по време на DSS колит. Въпреки че лечението с гентамицин няма разлика в тежестта на заболяването, животните, които са получавали цефалотин, поддържат теглото си и имат значително по-дълги дебели черва от фалшиво третирани животни (Фигура 4B, C), което показва, че грам-положителните организми, живеещи в Clec12a-/- микробиотата играят важна роля в обострянето на болестната патология.

След това извършихме 16S rRNA генно секвениране на SPF WT и Clec12a-/- изпражнения, за да профилираме композиционните промени в микробиотата. WT и Clec12a-/- животните са групирани значително по различен начин чрез нефилогенетични и филогенетични показатели, претеглени спрямо изобилието, съответно Bray-Curtis и претеглен UniFrac (Фигура S3A-C). Показателите за алфа разнообразие не разкриха значителни разлики в богатството (наблюдавани характеристики), което показва, че Clec12a-/- не съдържа повече видове (Фигура 4D). Въпреки това, равномерността и индексите на разнообразие на Шанън бяха увеличени в отсъствието на Clec12a, което показва, че пропорционалното разпределение на бактериите в Clec12a-/- мишки е променено (Фигура 4E, F) и допълнително подкрепя, че Clec12a е важен за регулиране на структурата на микробиотата в червата.

Анализът на състава на микробиомите (ANCOM) разкрива, че сред диференциално изобилните ASVs (варианти на последователност на ампликони), ASV, класифициран в рода Faecalibaculum (семейство Erysipelotrichaceae), е значително разширен в Clec12a-/- изпражненията в сравнение с WT (Фигура 4G, H). BLAST, използвайки представителната последователност на ASV от нашия анализ, показа 100% идентичност с последователности от бактерията Faecalibaculum rodentium. Тези данни предоставят доказателство, че грам-положителните бактерии в животното Clec12a-/- са отговорни за колитогенния фенотип и конкретно замесват грам-положителния организъм, F. rodentium, във влошено заболяване.

Въз основа на това тествахме хипотезата, че F. rodentium може да влоши колита. Предварително третирахме животни с WT SPF с 1 x 108 CFU жив или фиксиран F. rodentium чрез орална сонда и продължихме лечението всеки ден по време на острия модел на DSS, за да осигурим високи нива на колонизация с F. rodentium. Животните, които са получили както жив, така и фиксиран F. rodentium, са загубили повече тегло и са имали значително по-къси дебели черва, отколкото животните, третирани с носител (Фигура 4I, J), което показва, че повишените нива на F. rodentium могат да влошат заболяването.

Clec12a ограничава възпалителния отговор на макрофагите, като същевременно засилва фагоцитозата

За да дефинираме клетъчната експресия на Clec12a при липса на заболяване, ние профилирахме вродени и адаптивни имунни клетки в lamina propria (LP), използвайки многоцветна поточна цитометрия. В съответствие с предишни доклади, Clec12a е предимно ограничен до миелоидната линия с малко или никаква експресия върху лимфоцитите (Фигура 5А) (Han et al., 2004; Pyz et al., 2008; Sobanov et al., 2001). Чревните неутрофили, макрофагите и дендритните клетки показват подобни нива на експресия на Clec12a (Фигура S4A), докато макрофагите имат най-голям процент клетки в чревната тъкан, експресиращи Clec12a (Фигура 5А). Като се има предвид двойната роля на макрофагите за насърчаване на възпаление чрез класическо активиране, но също и за иницииране на репаративни механизми в отговор на тъканно увреждане, ние попитахме как Clec12a може да повлияе на тази дихотомия по време на колит. Докато макрофагите са доста разнообразни, те могат да бъдат разделени в общи линии на М1 възпалителни и М2 репаративни макрофаги чрез експресия съответно на CD38 и EGR2. Ние показваме, че Clec12a-/- животни имат увеличени M1 макрофаги и намалени M2 макрофаги в LP на дебелото черво по време на колит (Фигура 5 B, C, Фигура S4B). Тези данни показват, че Clec12a регулира реакциите на макрофагите в червата.

За да се разбере по-добре как Clec12a влияе върху биологията на макрофагите в отговор на микробни лиганди, макрофагите, получени от костен мозък (BMDM), изолирани от WT или Clec12a-/- животни, бяха третирани с различни общи микробни лиганди, включително LPS, Pam3CysK и Flagellin. Извършен е цитокинов анализ на всички тези проби. Много от тестваните цитокини не са били индуцирани при тези условия, но MCP-1, IL-27, IFN-b, TNF-a и IL-6 са последователно открити в тези култури ( Фигура 5D). Clec12a-/- BMDM имат значително по-висока експресия на тези цитокини в отговор на много от микробните лиганди и най-големите диференциални отговори се наблюдават в отговор на TLR2 агониста Pam3CysK. Тези данни са в съответствие с известната роля на Clec12a при смекчаване на възпалителните реакции по време на стерилно възпаление (Neumann et al., 2014).

растение цистанче, повишаващо имунната система

RNA-seq се извършва върху BMDM от WT или Clec12a-/-, третирани с F. rodentium, за да се определи как Clec12a регулира отговорите на тези клетки към този специфичен бактериален организъм. Ние оценихме диференциалния отговор чрез сравняване на Clec12a-/- BMDMs, изложени на F. rodentium над контролите на носителя, с този на WT BMDMs. Анализът на обогатяване на диференциално експресирани гени показа, че макрофагите с дефицит на Clec12a имат значително увеличение на гените, включени в контрола на клетъчния цикъл, когато са предизвикани с F. rodentium (Фигура S5A). Клетъчният цикъл е неразривно свързан с фагоцитозата и също така има значително намаляване на гените, свързани с фагоцитозата и възпалителния отговор (Фигура 5E) (Luo et al., 2005). В съответствие с едно скорошно проучване на Clec12a и Salmonella, тези данни предполагат, че фагоцитозата е дефектна в отсъствието на Clec12a в отговор на нормалния обитаващ червата F. rodentium (Begun et al., 2015). За да се тества това, перитонеалните макрофаги бяха събрани от WT и Clec12a-/- животни и съвместно култивирани с Sybr®-зелено белязан F. rodentium. Clec12a-/- макрофагите имат значително по-малко микроби на клетка (Фигура 5F, G; Фигура S5B), което показва, че дефицитът на Clec12a води до поглъщането на по-малко организми и е в съответствие с намалената фагоцитоза в набора от данни RNA-seq. Взети заедно, тези данни показват, че Clec12a играе двойната роля на смекчаване на откритите възпалителни реакции към обичайните микробни лиганди, като същевременно насърчава усвояването на макрофаги от бактерии.

Clec12a се свързва предимно с грам-положителни коменсали

Тъй като фагоцитозата се инициира от свързването на микроби, последвано от интернализация и убиване, ние предположихме, че Clec12a е в състояние да се свърже със специфични членове на микробиотата, като F. rodentium. За да се отговори на тази възможност, беше създаден слят протеин, съдържащ извънклетъчния свързващ домен на миши Clec12a и Fc частта на човешки IgG1 (Clec12a-Fc) (Фигура 6A) (Maglinao et al., 2014; Neumann et al., 2014; Raulf и др., 2019). Протеинът беше пречистен и скриниран за свързване към панел от различни грам-положителни и грам-отрицателни бактерии, за които е известно, че присъстват в хомеостатичните черва, включително F. rodentium, Roseburia spp., Bifidobacteria animalis, Akkermansia muciniphila, Bacteriodes uniformis, и гъбичната коменсална Candida albicans, чрез поточна цитометрия. Salmonella enterica също беше включена, тъй като предишни проучвания показват, че Clec12a може да се свърже с влизането на S. enterica в клетката (Begun et al., 2015). Clec12a се свързва в различна степен с няколко филогенетично различни бактерии, включително F. rodentium, но не и гъбите, C. albicans (Фигура 6B). Clec12a се свързва най-силно с грам-положителните организми F. rodentium и член на семейство Lachnospiraceae Roseburia sp. и взаимодейства най-малко с B. animalis, B. uniformis и S. enterica (Фигура 6B), което показва, че Clec12a може да се свързват със специфични членове на микробиотата с предпочитание към грам-положителни организми. Взети заедно, нашите данни идентифицират Clec12a като механизъм, използван от имунната система за изследване на чревната микробна общност и подрязване на микробиотата чрез директно свързване и фагоцитоза, като същевременно предотвратява явни възпалителни реакции към изобилие от грам-положителни микроби, което е от решаващо значение за поддържане на здравето на червата.

ДИСКУСИЯ

Хомеостазата в червата изисква механизми за ограничаване на коменсалните микроби, без да се инициира увреждащо възпаление (Macpherson et al., 2000). През последните години IgA се очертава като един от критичните начини, по които чревният имунитет може да упражнява контрол върху микробиотата (Pabst and Slack, 2020). В действителност, IgA е в състояние директно да се свързва с микробите и/или техните продукти и да ги елиминира от червата без индуциране на прототипично възпаление. Други имунни молекули, които притежават тези двойни свойства, не са изследвани досега. С-тип лектините включват разнообразен клас протеини, които могат да разпознават различни протеинови, въглехидратни и липидни молекули от микробни и гостоприемни продукти (Brown et al., 2018; Drouin et al., 2020). Въпреки това, малко са изследвани в контекста на чревния имунитет и микробиотата (Iliev et al., 2012; Martinez-Lopez et al., 2019). По този начин, доколкото ни е известно, това е първата демонстрация, че дефицитът на Clec12a променя състава на микробиотата, която води до тежестта на заболяването.

Cistanche ползи - укрепва имунната система

Clec12a е до голяма степен изследван в контекста на разпознаването на мононатриев урат (MSU) или пикочна киселина, което често е индикация за клетъчна смърт (Kono et al., 2010; Neumann et al., 2014). Пикочната киселина е способна да активира възпалителни реакции чрез NLRP3 инфламазома, следователно, за да се предотврати разрушаването на тъканите по време на клетъчна смърт, това възпаление трябва да се контролира (Martinon et al., 2006). Показано е, че Clec12a балансира този възпалителен отговор чрез понижаване на регулацията на Syk сигнализация (Marshall et al., 2004). В съответствие с това, делецията на Clec12a в модел на стерилно възпаление и автовъзпалителен модел на артрит причинява засилено активиране на неутрофили и влошено заболяване, което прави Clec12a важна възпалителна спирачка (Redelinghuys et al., 2016). Съвсем наскоро обаче беше доказано, че Clec12a подобрява сигнализирането на интерферон тип I в отговор на вирусна инфекция и медиира усвояването на Salmonella чрез пътя на антибактериалната автофагия (Begun et al., 2015; Li et al., 2019). Това показва, че Clec12a не функционира само за ограничаване на възпалението, по-скоро може да играе различни роли в зависимост от контекста. Червата са различни по това, че има голям брой имунни клетки дори при липса на заболяване. Това се дължи на наличието на микробиота, която играе важна роля в инструктирането на имунното развитие и предотвратяването на колонизацията на патогенни организми. Микробиотата притежава същите повърхностни модели, открити от TLR, които също разпознават патогени, и следователно чревната имунна система трябва да има строги регулаторни механизми, за да ограничи възпалението на тези чужди организми (Blander et al., 2017).

Първоначално се заинтересувахме от Clec12a, защото установихме, че чревната гъбичка Saccharomyces cerevisiae индуцира пикочната киселина да влоши колита (Chiaro et al., 2017). Освен това, други проучвания са установили, че микробиотата може да повлияе на чревното заболяване чрез индуциране на метаболизма на пурини, чийто краен продукт при бозайниците е пикочна киселина (Zhu et al., 2019). Тези данни предполагат, че механизмите за усещане на пикочна киселина, като Clec12a, могат да повлияят на чревната хомеостаза. Въпреки това, ние не наблюдавахме промени в нивата на пикочна киселина в серума или изпражненията, което показва, че повишената тежест на заболяването при Clec12a-/- животно не се дължи на повишена пикочна киселина. Въпреки това, повишената тежест на колита в Clec12a-/- се дължи на състава на микробиотата. По този начин, въз основа на нашите данни, намалената експресия на Clec12a-/- може да повлияе на състава на микробиотата при пациенти с IBD (Jason L. Kubinak, 2015; Rehman et al., 2011; Vijay Kumar et al., 2010). Интересното е, че открихме, че антибиотиците, насочени към грам-положителни организми, са в състояние да облекчат тежестта на колита при Clec12a-/- животни. Това е в контраст с няколко доклада, които са идентифицирали разширени грам-отрицателни Enterobacteriaceae по време на чревно възпаление, следователно това е едно от малкото проучвания, които са идентифицирали разширяване на грам-положителните организми, които са свързани с развитието на колит. Въпреки че вероятно не е единственият организъм, който влияе върху тежестта на колита в този модел, се наблюдава драматична експанзия на F. rodentium при Clec12a-/- животни. F. rodentium е грам-положителен, оксидаза и каталаза-отрицателен член на тип Firmicutes (Bacillota) (Chang et al., 2015). Въвеждането на F. rodentium ежедневно дори на WT мишки засилва колита, подкрепяйки, че увеличените нива на F. rodentium в червата са вредни и вероятно предизвикват тежестта на колита в Clec12a-/-. Неотдавнашен доклад показа, че F. rodentium може да увеличи оборота на епитела и да потисне експресията на ензими в епитела, които регулират надолу възпалителните реакции и по този начин е в съответствие с влошената болест, която наблюдаваме, когато F. rodentium се разпространи в червата (Cao et al., 2022). Тъй като хората са колонизирани с организъм, подобен на F. rodentium (Zagato et al., 2020), допълнителни проучвания трябва да изяснят влиянието на тези подобни на F. rodentium бактерии върху аспекти на човешката физиология, свързани с колита.

Подкрепяйки ролята на Clec12a сред вродените имунни клетки, ние наблюдавахме, че колитогенната микробиота все още се формира в Clec12a-/- животни, които нямат адаптивна имунна система. Най-високият процент клетки в червата, които експресират Clec12a, са макрофаги, което ни накара да се съсредоточим върху функцията на Clec12a в тези клетки. Предишни проучвания показват, че Clec12a е важен медиатор на производството на интерферон тип I в отговор на вирусна инфекция (Li et al., 2019). Въпреки това, как Clec12a влияе върху отговорите на широк спектър от бактериални лиганди, не е оценено; това е много важно в червата, където съществува изобилие от TLR лиганди. Тук показваме, че Clec12a служи за смекчаване на реакциите на макрофагите в червата и вероятно функционира за осигуряване на хомеостаза в отговор на микробиотата. RNA-seq на макрофаги, инкубирани с F. rodentium, подчертава, че дефицитът на Clec12a води до дефекти в клетъчния цикъл и фагоцитозата в отговор на тези комменсални бактерии. Скорошно проучване показа, че Clec12a-/- макрофагите са намалили аутофагията в отговор на Salmonella (Begun et al., 2015). Нашите данни допълват и разширяват тези констатации, за да включват, че Clec12a функционира и за контролиране на неинвазивни коменсални организми. F. rodentium е доказано от други, че влияе върху епителната биология, което предполага, че F. rodentium се намира в непосредствена близост до гостоприемника и следователно трябва да бъде строго контролиран от имунната система. Нашите данни подкрепят, че Clec12a контролира F. rodentium чрез регулиране на фагоцитозата. Фагоцитозата се инициира от физическото свързване на лиганд или микроб, а С-тип лектините могат да се асоциират с множество лиганди, което ни накара да тестваме дали Clec12a може да се асоциира директно с бактерии, живеещи в червата. Интересното е, че Clec12a се свързва най-силно с грам-положителните организми F. rodentium и Roseburia и много по-малко с грам-отрицателните организми A. muciniphila и B. uniformis и изобщо не с C. albicans. Тези данни показват, че Clec12a има склонност да свързва специфични членове на микробиотата. Това ни позволява да изградим модел, чрез който ангажирането на Clec12a и последващата фагоцитоза може да контролира определени членове на микробиотата и да предотврати потенциално вредните ефекти от тяхното разширяване. Това подчертава двойната функция на Clec12a, която може да ограничи възпалението срещу микробни лиганди, като същевременно разпознава и контролира специфични членове на микробиотата. По този начин Clec12a представлява уникален начин, по който вродената имунна система използва, за да осигури хомеостаза в стомашно-чревния тракт.

ФИГУРНИ ЛЕГЕНДИ

Фигура 1. Clec12a ограничава чревното заболяване независимо от адаптивната имунна система

(A) За да се оцени тежестта на колита WT или Clec12a-/- C57BL/6 мишки без специфични патогени (SPF) бяха третирани с 2,5% декстран натриев сулфат (DSS) ad libitum за 7 дни в питейна вода. Процентната загуба на тегло се оценява ежедневно. Средно +/- SEM, данните са обединени от три независими експеримента с помощта на двупосочен ANOVA и теста за множествено сравнение на Śídák.

(B) Дължината на дебелото черво (cm) на посочените животни се измерва при умъртвяване. Диаграмата на разсейване е средната стойност +/- SEM, данните са обединени от три независими експеримента с помощта на несдвоен t-тест. Всяка точка представлява една мишка

(C) Фекален липокалин-2 (ng/mL) на посочените животни беше измерен като показание за възпаление. Стълбовата графика е средната стойност +/- SEM, данните са обединени от два независими експеримента с помощта на несдвоен t-тест. Всяка точка представлява една мишка

(D) Представителни срезове на дебелото черво, оцветени с H&E, от посочени животни след индуциран от DSS колит.

(E) Хистологичните резултати за посочените животни са генерирани от срезове на дебелото черво в

(Д). Стълбовата графика е средната стойност +/- SEM, сравнена с помощта на несдвоен t-тест. Всяка точка представлява една мишка.

(F) Т клетъчен трансферен модел на колит беше извършен за оценка на хроничен колит. Теглото на TCRb-/- и Clec12a-/-; TCRb-/- животни се измерва всяка седмица. Графиката изобразява процентната загуба на тегло на посочените животни по време на експеримента. Средно +/- SEM, в сравнение с 2-way ANOVA.

(G) Дължината на колонията на посочените животни от (I) се измерва при умъртвяване. Стълбовата графика е средната стойност +/- SEM, сравнена с помощта на несдвоен t-тест. Всяка точка представлява една мишка.

(H) WT, Clec12a-/-, Rag-/- или Rag-/-; Clec12a-/- C57BL/6 SPF мишки бяха оценени за остър колит. На посочените животни се дава 2.5% DSS ad libitum за 7 дни. Процентната загуба на тегло се оценява ежедневно. Средно +/- SEM, данните са представителни за два независими експеримента. Двупосочен ANOVA и тест за множествено сравнение на Śídák.

(I) Дължината на дебелото черво (cm) на посочените животни се измерва при умъртвяване. Стълбовата графика е средната +/- SEM, данните са представителни за два независими експеримента, използващи несдвоени t-тестове. Всяка точка представлява една мишка * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0,0001

Фигура 2. Микробиотата, образувана в Clec12a-/- животни, причинява влошен колит

A) Трансплантации на фекална микробиота (FMT) бяха извършени чрез прехвърляне на фекални супернатанти от WT или Clec12a животни в свободни от зародиши WT мишки. Микробиотите бяха оставени да се хомогенизират в продължение на четири седмици, след което половината от мишките WTFMT и половината от мишките Clec12a-/-FMT бяха настанени съвместно и бяха оставени още четири седмици да се смесят. След това всички групи получиха 2,5% DSS ad libitum в питейната си вода и бяха умъртвени на 7-ия ден.

B) Процентната загуба на тегло на посочените животни се оценява ежедневно. Графиката изобразява средна стойност +/- SEM, данните са обединени от два независими експеримента с помощта на двупосочен ANOVA и теста за множествено сравнение на Śídák.

C) Дължината на дебелото черво (cm) от посочените животни се измерва при умъртвяване. Диаграмата на разсейване е средната +/- SEM, сравнена с помощта на обикновена еднопосочна ANOVA с тест за множество сравнения на Dunnett. Всяка точка представлява една мишка.

D) Представителни срезове на дебелото черво, оцветени с H&E, на посочените животни след индуциран от FMT и DSS колит.

E) Хистологичните резултати са генерирани от срезове на дебелото черво в (D). Стълбовата графика е средната стойност +/- SEM, сравнена с помощта на несдвоен t-тест. Всяка точка представлява една мишка.

F) Претеглени Unifrac разстояния от 16S rRNA генно секвениране на WTFMT, Clec12a-/- FMT или животни, настанени съвместно. Графики на кутия и мустаци, показващи всички точки (сравнение на разстояния по двойки) и сравнени с помощта на тест на Kruskal-Wallis.

G) Непретеглени Unifrac разстояния от 16S rRNA генно секвениране на WTFMT, Clec12a-/- FMT или животни, настанени съвместно. Графики на кутия и мустаци, показващи всички точки (сравнение на разстояния по двойки) и сравнени с помощта на тест на Kruskal-Wallis.

H) Разстояния на Bray-Curtis от 16S rRNA генно секвениране на WTFMT, Clec12a-/- FMT или животни, настанени съвместно. Графики на кутия и мустаци, показващи всички точки (сравнение на разстояния по двойки) и сравнени с помощта на тест на Kruskal-Wallis.

Фигура 3: Съставът на микробиотата, образуван в Clec12a-/- животни, е независим от адаптивния имунитет

A) Схематична диаграма, показваща възстановяване на костен мозък с последваща FMT. C57Bl/6 WT мишки бяха смъртоносно облъчени и възстановени с WT или Clec12a-/- костен мозък. След 8 седмици изпражненията бяха взети от тези мишки и прехвърлени в мишки без микроби WT, както е обяснено в (A). Първоначално възстановените химерни животни след това получават 2.5% DSS ad libitum в тяхната вода за пиене.

B) Процентната загуба на тегло на FMT мишки от (F) се оценява ежедневно. Средна стойност +/- SEM, използвайки двупосочен ANOVA и тест за множествено сравнение на Tukey.

C) Дължината на дебелото черво (cm) от посочените животни се измерва при умъртвяване. Диаграмата на разсейване е средната +/- SEM, несдвоен t-тест. Всяка точка представлява една мишка

D) FMTs за оценка на ролята на адаптивната имунна система върху микробното оформяне и тежестта на колита бяха извършени чрез прехвърляне на фекални супернатанти от Rag-/- или Rag-/-; Clec12a-/- SPF животни в WT свободни от микроби мишки, както е описано в (A). Мишките бяха третирани с 2.5% DSS в продължение на 7 дни. Процентната загуба на тегло се оценява ежедневно. Графиката е средната стойност +/- SEM, използвайки двупосочен ANOVA и тест за множествено сравнение на Tukey.

E) Дължината на дебелото черво (cm) от посочените животни в (F) се измерва при умъртвяване. Средно +/-, SEM сравнено с помощта на обикновен еднопосочен ANOVA и тест за множествено сравнение на Dunnet. Всяка точка представлява една мишка. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0,0001

Фигура 4. Clec12a ограничава експанзията на гризачи Faecalibaculum, микроб, който влошава колита

A) WT или Clec12a-/- C57BL/6 SPF мишки получават антибиотичен коктейл (A) (неомицин, гентамицин, ампицилин, еритромицин), цефалотин или гентамицин (B, C) в концентрация 0. 5g/L за четиринадесет дни. След седем дни животните получават 2,5% DSS в тяхната вода за пиене до умъртвяването. Дължината на дебелото черво (cm) от посочените животни се измерва при умъртвяване. Диаграмата на разсейване е средната +/- SEM, несдвоен t-тест. Всяка точка представлява една мишка.

B) Процентната загуба на тегло на посочените животни се оценява ежедневно. Графиката е средната стойност +/- SEM, използвайки двупосочен ANOVA и тест за множествено сравнение на Tukey

C) Дължина на дебелото черво (cm) на посочените животни, измерена при умъртвяване. Диаграмата на разсейване е средната +/- SEM, несдвоен t-тест. Всяка точка представлява една мишка.

D) Наблюдавани характеристики от WT или Clec12a-/- изпражнения, 16S rRNA секвениране алфа разнообразие. Средно +/- SEM, сравнено с помощта на теста на Mann-Whitney.

E) Равномерност на Pielou от WT или Clec12a-/- изпражнения, 16S rRNA секвениране на алфа разнообразие. Средно +/- SEM, сравнено с помощта на теста на Mann-Whitney.

F) Средна ентропия на Шанън +/- SEM, сравнена с помощта на теста на Ман-Уитни.

G) ANCOM анализ от WT и Clec12a-/- изпражнения. Таксономичните имена са най-добрите класификации на ASV, използвайки базата данни за геномна таксономия (GTDB).

H) Относително изобилие на Faecalibaculum rodentium ASV. В сравнение с Mann Whitney * p < {{0}}.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0,0001

I) C57Bl/6 WT SPF мишки бяха предварително третирани с 1x108 CFU от F. rodentium чрез орална сонда за три дни. След това животните получават 2,5% DSS в питейната си вода в продължение на 7 дни, докато продължават да получават ежедневно сонда на F. rodentium. Процентната загуба на тегло се оценява ежедневно. Средно +/- SEM, Данните са обединени от четири отделни експеримента с помощта на двупосочен ANOVA и тест за множествено сравнение на Tukey.

J) Дължината на дебелото черво (cm) на посочените животни се измерва при умъртвяване. Стълбовата графика е средната стойност +/- SEM. Данните са събрани от четири отделни експеримента, сравнени с помощта на обикновена еднопосочна ANOVA с тест за множествена корекция на Dunnet. Всяка точка представлява една мишка. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0,0001

Фигура 5. Clec12a ограничава възпалението и насърчава фагоцитозата в макрофагите.

A) Имунофенотипизирането се извършва чрез поточна цитометрия върху клетки, изолирани от lamina propria на дебелото черво (cLP) върху WT и Clec12a-/- животни. Heatmap показва честотата на експресия на Clec12a върху вродени и адаптивни имунни клетки

B) Стълбовидната графика показва честотата на предварителни, CD38+ клетки (M1 макрофаги) от cLP на посочените животни. Средно +/- SEM, сравнено с помощта на несдвоен t-тест. Всяка точка представлява една мишка.

C) Стълбовидната графика показва честотата на предварителни, EGR2+ клетки (M2 макрофаги) от cLP на посочените животни. Средно +/- SEM, сравнено с помощта на несдвоен t-тест. Всяка точка представлява една мишка.

D) BMDMs бяха събрани от WT и Clec12a-/- дълги кости и култивирани в присъствието на M-CSF (20 ng/mL) в продължение на 7 дни. На ден 8 BMDMs бяха пулсирани с LPS (100 ng/mL), MDP (10 mg/mL), Pam3cysk (1 mg/mL) или Flagellin (1 mg/mL) за 24 часа. Средата беше събрана и анализирана за производство на цитокини. Топлинната карта показва Log2 кратната промяна на посочените цитокини от Clec12a-/- спрямо WT.

E) BMDM от WT и Clec12a-/- мишки се изолират и култивират както в (A) и след това се култивират съвместно с F. rodentium при MOI от 10 за 24 часа. След като BMDM бяха промити, РНК беше събрана и подготвена за секвениране на РНК. Топ 10 опростени категории термини на GO (биологичен процес), обогатени сред Clec12a-/- регулирани надолу

F) Перитонеалните макрофаги бяха изолирани от WT и Clec12a-/- мишки и след това съвместно култивирани с Sybr зелено оцветен F. rodentium, за да се оцени фагоцитозата. Вляво: WT макрофаги. Вдясно: Clec12a-/- макрофаги. Изобразяват се представителни изображения от ярко поле (леви колони), флуоресценция (средни колони) и обединени (десни колони). Жълтите върхове на стрелки обозначават примери за клетки на F. rodentium, погълнати от макрофаги. мащабна лента=20 µm. Изображенията са представителни за два отделни експеримента.

G) Стълбовата графика показва организми на клетка, както се вижда в (F). 250 WT клетки и 269 Clec12a-/- клетки бяха преброени, за да се определи количествено количеството F. rodentium на клетка.

Фигура 6: Clec12a се свързва директно със специфични членове на микробиотата.

A) Схематична диаграма, изобразяваща Clec12a-човешки IgG1-Fc слят протеин или празен вектор (само Fc част) B) Хистограми на поточен цитометричен анализ, представящ диференциално свързване на Clec12a-Fc с различни бактерии или C. albicans.

ДОПЪЛНИТЕЛНИ ЛЕГЕНДИ ЗА ФИГУРИ

Допълнителна фигура 1. Липсата на Clec12a не нарушава нивата на пикочната киселина.

A) Серумна пикочна киселина (µM) на посочените животни беше измерена за оценка на метаболизма на пурин между WT и Clec12a-/- C57Bl/6 мишки. Диаграмата на разсейване е средната +/- SEM, данните са обединени от три независими експеримента, използвайки несдвоен t-тест. Всяка точка представлява една мишка.

B) Фекална пикочна киселина (µM) на посочените животни беше измерена за оценка на чревната екскреция на пикочна киселина между WT и Clec12a-/- C57Bl/6 мишки. Диаграмата на разсейване е средната +/- SEM, данните са обединени от три независими експеримента, използвайки несдвоен t-тест. Всяка точка представлява една мишка.

Допълнителна фигура 2. WT и Clec12a-/- микробиотите водят до диференциално заболяване

Процентна загуба на тегло на WT и Clec12a-/- животни, третирани с антибиотичен коктейл, състоящ се от неомицин, гентамицин, ампицилин и еритромицин.

Допълнителна фигура 3. Съставът на микробиотата се влияе от Clec12a.

A) Графики на PCoA на първите 3 оси, базирани на разстоянията на Брей-Къртис, показващи цялостните връзки между микробиотите и съответните графики на кутии и мустаци, определящи количествено различията във всяка група и сравнени с теста на Ман-Уитни.

B) Графики на PCoA, базирани на претеглени разстояния на Unifrac и съответните графики на кутия и мустаци, определящи количествено различията в рамките на групата, сравнени с помощта на несдвоен тест на Mann-Whitney.

C) Таблица, показваща резултатите от теста PERMANOVA за WT спрямо Clec12a-/- фекална микробиота с Bray-Curtis и претеглени Unifrac разстояния.

Допълнителна фигура 4: Clec12a в макрофагите ограничава възпалението.

A) Графиките на цигулка изобразяват средната геометрична флуоресцентна интензивност (MFI) на имунните клетки, показани в (A). Средна стойност +/- SEM, тест на Kruskal-Wallis с корекция на Dunn за множество сравнения. Буквите означават групи, които са значително различни.

B) Представителни диаграми на поточна цитометрия на M1 и M2 макрофаги от cLP на WT или Clec12a-/- мишки след DSS колит. Клетките са предварително контролирани на живо, CD45+, Ly6C-, CD11b+, MHCII+ и CD64+. От Фигура 5А

Допълнителна фигура 5. Clec12a стабилизира контрола на клетъчния цикъл и регулира фагоцитозата в макрофагите.

A) Топ 10 опростени GO термин (биологичен процес) категории, обогатени сред Clec12a-/- регулирани нагоре гени в сравнение с WT в отговор на F. rodentium. BMDM от WT и Clec12a-/- мишки, култивирани съвместно с F. rodentium, бяха изолирани и анализирани, както е показано на Фигура 7А.

B) Peritoneal macrophages were prepared as described and co-cultured with Sybr®-green stained F. rodentium. Bacteria cells were counted inside macrophages. >Бяха преброени 200 макрофага. Стълбовата графика показва средния брой F. rodentium от 4 отделни ямки, за да покаже последователност на преброяването и ефекта в ямките. Средно +/- SEM, сравнено с помощта на несдвоен t-тест.

БЛАГОДАРНОСТИ

Бихме искали да благодарим на Гордън Браун за предоставянето на животните Clec12a-/- за този проект. Тази работа беше подкрепена от Фондация Хелън Хей Уитни (KSO), Грант за обучение по микробна патогенеза T32 на Университета на Юта (KSO), награда за старши научни изследвания на CCFA (JLR), NIDDK R01DK124336, NIDDK R01124317 и NCCAM R01AT011423 (JLR), Едуард Малинкрод Jr. Foundation (JLR), награда за КАРИЕРА на NSF (IOS-1253278) (JLR), стипендия Packard в областта на науката и инженерството (JLR), награда за добре дошли изследователи в патогенезата на Бъроуз (JLR), Американска фондация за астма (JLR), Марголис фондация (JLR), безвъзмездна помощ от MS Society Center (JLR) и фондация WM Keck (JLR) Награда за нов иноватор на NIH DP2GM111099-01 (RMO), NHLBI R00HL102228-05 ( RMO), грант за изследване на Американското общество за борба с рака (RMO), награда Kimmel Scholar (RMO), R01AG047956 (RMO) и NIAID R01AI141202 (ASI). Тази работа беше подкрепена от Центъра за проточна цитометрия на Университета на Юта в допълнение към Националния институт по рака чрез награда номер 5P30CA042014-24. Подкрепата и ресурсите от Центъра за високопроизводителни изчисления към Университета на Юта са благодарни.

АВТОРСКИ ПРИНОС

TRC помогна за зачеването на изследването, извърши повечето от експериментите с мишки и имунологията, събра данните в цифри и помогна за написването на ръкописа. RB организира експерименти без микроби и поддържа всички животни без микроби. ESV помогна с експериментите с имунологията на червата lamina propria. KSO помогна с реколтата от мишки и предостави представа и насока. KMB помогна при събирането на мишки и поточната цитометрия. MCN помогна с реколтата от мишки. WV предостави помощ при изграждането на конструкцията за слетия протеин и пречистването. TJ предостави помощ при анализи на фагоцитоза. JH анализира фагоцитоза микроскопски слайдове. MH предостави помощ при пречистването и използването на слетия протеин. KAK осигурява бактериални изолати. ROC предостави имунологична експертиза и прозрение. WZS помогна за зачеването на проучването, извърши биоинформатични анализи, помогна с подготовката на фигурата и статистиката и помогна за написването на ръкописа. JLR помогна за замислянето и насочването на изследването, наблюдаваше експерименталния дизайн и резултатите, организира сътрудници и реактиви, събра финансиране за проучването и помогна за написването на ръкописа.

МЕТОДИ

Мишки щамове

Всички използвани тук линии на мишка бяха на фон C57BL/6. Clec12a-/- мишките бяха любезно предоставени от Гордън Браун (Център за медицинска микология на Съвета за медицински изследвания, Университет на Ексетър) и бяха генотипирани съгласно описания по-рано протокол (Redelinghuys, et al. 2016). Rag2-/- и TCRb-/- (Jackson Laboratories, 002118) бяха получени от Jackson Laboratories и поддържани в нашата мишка колония в продължение на няколко поколения. За всички in vivo експерименти с колит са използвани 8 до 12-седмични мишки със съвпадащ пол. Използвани са както мъжки, така и женски мишки. Мишките се поддържат в специфични условия без патогени.

Бактериални и гъбични щамове

Следните организми са получени от DSMZ-German Collection of Microorganism and Cell Cultures GmbH: Faecalibaculum rodentium (DSM# 103405); Akkermansia mucinophilia DSMZ (DSM# 26127); Bifidobacterium animalis DSMZ (DSM# 26074). Bacteroides uniformis е получен от Американската колекция от типови култури (ATCC® 8492™). Roseburia sp (означение на щам JLR.KK002) се изолира върху агар на Schaedler от C57BL/6 мишки, съдържащи обогатена със спори микробиота. Обогатяването със спори беше извършено, както е описано по-горе, и мишките бяха поддържани в продължение на няколко поколения с тази микробиота в нашето гнотобиотично съоръжение, преди JLR.KK002 да бъде изолиран от изпражненията (Browne et al., 2016). Ние PCR-амплифициране и Sanger секвенираха 16S rRNA гена и след това го класифицираха с услугата SILVA ACT и SILVA база данни (Pruesse et al., 2012). Използван е щам Salmonella typhimurimum ST2. Използван е щам Candida albicans sc5314. Бактериалните щамове, използвани в синтетичната общност на PhyLo11b, са описани по-долу.

DSS-индуциран експериментален колит

Колитът се индуцира с добавяне на 2,5% или 3% (w/v) 36,000-50,000MW декстран натриев сулфат (DSS) (MP Biomedicals) в питейната вода в продължение на 7 дни. Тежестта на колита се наблюдава ежедневно чрез промени в телесното тегло, консистенция на изпражненията и фекална кръв. За експеримента за спасяване на моноцити всички мишки получиха 2,5% DSS за 5 дни, след което беше дадена редовна вода; наблюдението на теглото продължава до ден 10, когато животните са събрани. Като праг на сериозност бяха наложени граници на сериозност от повече от 20% загуба на тегло. В експерименталните крайни точки MLN и дебелото черво бяха отстранени. Дебелото черво се измерва от сляпото черво до ректума, за да се определи дължината. След това тъканите се обработват за хистология, екстракция на РНК или поточен цитометричен анализ.

Хистология на дебелото черво и оценка

Colons were fixed within histology cassettes O/N at RT in 10% buffered formalin phosphate solution after removal of fecal contents and then transferred to 70% EtOH at 4 C until staining. Sectioning and H&E staining were done at the HCI Biorepository and Molecular Pathology Resource core in the ARUP-operated Research Histology division. Colon scoring was done in a blinded manner with the following rubric scales: percentage of colon crypt loss (0.5 (5%) - 7 (>75%)), crypt loss severity (1 (partial loss) – 5 (full loss)) and inflammatory aggregates (1 (1-3) – 3 (>7)).

Липокалин-2 (LCN-2) ELISA

Протоколът беше извършен съгласно протокола на производителя (Fischer Scientific DY1857-05). Накратко, изпражненията бяха събрани, претеглени и смачкани в HBSS 1X при концентрация от 100 mg/mL. След това пробите се въртят при 50 xg за 5 минути, за да се отстранят големи остатъци. След това супернатантата се отстранява и се поставя в нова епруветка и се върти при 8000 xg за 5 минути, за да се утаят бактериите. Този супернатант след това се разрежда в зависимост от заболяването на животните, но обикновено варира от 1:100- 500 (здрави) – 1:500-1000 (третирани с DSS). Измерване на пикочна киселина Концентрацията на пикочна киселина беше извършена съгласно инструкциите на производителя (Invitrogen™ Amplex™ Red Uric/Uricase actsay kit, cat# A22181). Накратко, кръвта беше събрана от WT или Clec12a-/- мишки чрез сърдечна пункция в епруветки за разделяне на серум със златен горен край. Епруветките се оставят да се съсирят за 30 минути и след това се въртят при 1300 xg за 10 минути. Серумът беше отстранен и поставен в епруветки от 1,5 ml Eppendorf, бързо замразени и съхранявани при -80 градуса по Целзий до тестването. Фекална пикочна киселина се извършва чрез получаване на пресни фекални пелети от WT и Clec12-/- мишки. Пелетите се претеглят и записват и след това се смачкват в 1 mL от 1x реакционен буфер. След физическо смесване, епруветките се въртят при 50 xg за 5 минути, за да се отстранят големи остатъци. Останалата фекална каша се анализира за пикочна киселина.

Експериментален колит с Т-клетъчен трансфер

WT далаците се изолират и се смачкват в RPMI, съдържащ 10% фетален говежди серум, пеницилин и стрептомицин. Клетките се въртят при 367 xg за изолиране на клетки. След това получената пелета се суспендира в 1x RBC лизисен буфер за 5 минути, на тъмно, при стайна температура. След това получените бели кръвни клетки бяха прекарани през Miltenyi CD4+ MACS колона за изолиране на CD4+ Т-клетки. След това Т-клетките се оцветяват с CD4 и CDRB и се сортират на FACS Aria Fusion (BD Biosciences). CD4+ CDRBhi клетки бяха събрани и приложени към TCRb-/- или TCRb-/-; Clec12a-/- мишки интраперитонеално (IP). Всяка мишка получава 5 х 105 клетки. Тежестта и развитието на колита се наблюдават ежеседмично чрез оценка на загубата на тегло. В експерименталната крайна точка MLN и дебелото черво бяха отстранени и дебелото черво беше измерено от цекума до ректума, за да се оцени тежестта на заболяването.

Изолиране на левкоцити от lamina propria на дебелото черво

Миши дебели черва с прикрепена цека бяха събрани и поставени в 1X PBS в 6-ямкови плаки върху лед. Всички видимо останали мазнини и съединителна тъкан бяха отстранени и цекумът беше изрязан от дебелото черво. Дебелите черва бяха разтворени и слузта и изпражненията бяха внимателно отстранени от дебелото черво, преди да бъдат поставени обратно в 6-плочката с ямки. След като всички дебели черва бяха разпръснати и изстъргани, всяко дебело черво беше нарязано на кубчета върху капак на петриево блюдо с помощта на бръснач и поставено в отделна епруветка от 50 mL. 10 mL предварително загрят разтвор за дисоциация (1X HBSS без Ca+ и Mg+, 1,5 mM DTT, 10 mM HEPES и 30 mM EDTA) се добавят и епруветките се разбъркват за кратко. Колоните се инкубират за приблизително 25 минути. при 37 градуса с разклащане при 150 rpm, докато разтворите станат мътни от IEC разделяне. Пробите се разклащат 3Х и се разбъркват за 15 секунди, след което се изсипват върху 100 mM филтър върху 50 ml коничен, за да се отстранят неимунни клетки като IECs, и филтрите се изплакват за кратко с 2 mL ледено студен 1X PBS. Останалата тъкан се събира върху филтъра с форцепс и се премества в нов 50 ml коничен съд. 15 mL предварително затоплен разтвор за смилане (1X HBSS с Ca+ и Mg, 5% FBS, 50 U/ml Dispase II [Millipore-Sigma, кат. # 4942078001], 0,5 mg/ml ДНКаза I [Worthington Biochemical, кат. # LS002139] и 0,5 mg/mL колагеназа D [Millipore-Sigma, cat # 11088866001]) се добавят, пробите се разбъркват за кратко и след това се инкубират за 45 минути. при 37 градуса с разклащане при 150 rpm, или докато разтворът стане мътен. След това пробите се разклащат 3 пъти и се разбъркват за 15 секунди. За да се съберат останалите имунни cLP клетки, смляната тъкан след това се излива върху 40 mM филтър върху 50 mL конична епруветка, съдържаща 10 mL 1X PBS. След това пробите се изплакват и филтруват с 2 mL леденостуден 1X PBS и се въртят при 800 xg за 10 минути при 4 градуса. След това супернатантата беше отстранена и изхвърлена с вакуум. След това клетките се ресуспендират в 500 ml пълен RPMI и се преброяват с изключване на трипаново синьо.

Поточна цитометрия

Левкоцитите, изолирани от cLP, се оцветяват за жизнеспособност, като се използва зомби багрило 510 (AmCyan) в продължение на 10 минути при RT на тъмно. След това пробите бяха блокирани на Fc рецептор с CD-16/32 за 20 минути при 4 градуса на тъмно. След центрофугиране при 367 х g за 5 минути декантираните клетки се оцветяват за 30 минути на тъмно при 4 градуса. Всички антитела бяха използвани в разреждане 1:250, освен ако не е отбелязано друго. Миелоидният панел се състоеше от CD45-BV421, CD11b-PerCpCy5.5, MHCII-BV605, CD64-BV711, CX3CR1-BV785, Ly6C-FITC, CD38-PE- Cy7, Ly6G-CF-594, Clec12a-PE (1:500), EGR2-APC (вътреклетъчно, 1:50). Т-клетките се отличават с: Zombie dye 510 (AmCyan), CD45-BV421, CD3e-BV711, CD4-FITC, Foxp3-APC (вътреклетъчно 1:50), IL{{ 50}}PE (вътреклетъчно 1:50), IFN-g (BV605) (вътреклетъчно 1:50), RORgt-PE610 (вътреклетъчно 1:50), IL-17A-BV785 (вътреклетъчно 1:50). След оцветяването, клетките се промиват 2 пъти за 5 минути всяка с колонен буфер (1X HBSS без Ca2+, Mg2+ и HEPES, EDTA, FBS). Клетките се фиксират O/N с 2% PFA, ако не е необходимо вътреклетъчно оцветяване и след това се промиват в колонен буфер 2X, преди да се пуснат на поточния цитометър. Ако е необходимо вътреклетъчно оцветяване, се следват комплектът FoxP3 / буфер за оцветяване на транскрипционен фактор (Tonbo Biosciences) и протоколът. След това всички проби бяха ресуспендирани в 300 ul колонен буфер и пуснати на BD LSR Fortessa след компенсиране с UltraComp eBeads (ThermoFisher Scientific) и използване на контроли за единично оцветяване.

IgA оцветяващи бактерии

Бактериите бяха изолирани от фекални пелети чрез смесване в HBSS w/ Ca2+ и Mg2+, при концентрация от 100 mg изпражнения на mL HBSS. След това намачканите изпражнения се въртят при 50 х g за 5 минути, за да се отстранят големите остатъци. Супернатантът се отстранява и се поставя в нова епруветка. След това се върти при 8000 xg за 5 минути, за да се утаят бактерии. Супернатантата се отстранява и пелетите се промиват с HBSS w/ Ca2+ и Mg2+. Накрая, пелетите се ресуспендират в HBSS при концентрация от 100 mg/mL и 10uL от това се поставят в 96-плака с ямки и се блокират с HBSS w/ Ca2+ и Mg2+, съдържащ 10% FBS за 20 минути при RT. След това 100 uL анти-IgA (РЕ) се добавят директно към пробата и се инкубират за 30 минути при 4°С на тъмно. След това клетките се промиват в HBSS+FBS разтвор 2x и накрая се ресуспендират в HBSS+1x Sybr®-green и се оставят да се инкубират в продължение на 20 минути на тъмно при RT. След това пробите се отчитат директно на поточния цитометър.

Изолиране на костен мозък

Костният мозък се изолира, както е описано по-горе. Накратко, дълги кости от C57Bl/6 див тип или Clec12a-/- животни бяха извлечени и почистени с хартиена кърпа чрез леко триене. Чистите кости се държат върху лед, докато животните се обработват. Краищата на костите бяха леко подрязани, за да се разкрие костният мозък. Костта беше вкарана (откритият край обърнат надолу) в 0.5mL епруветка Eppendorf, която беше пробита с 18g игла. След това тази епруветка на Епендорф от 0.5 ml се поставя в епруветка на Eppendorf от 1,5 ml и се върти при 13,000 x g за 1 минута. Превъртането през костен мозък след това се лизира с RBC, като се използва буфер за RBC-лизис (Biolegend) съгласно препоръките на производителя. След лизис на RBC, клетките бяха ресуспендирани в пълна Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), съдържаща: 10% FBS, 1 mg/mL Pen/Strep, HEPES 10 mM, 1x неесенциална аминокиселина, натриев пируват 1 mM. След това клетките се въртят при 367 х g за пет минути, за да се утаят клетките. След това изолираните клетки се използват за разработване на BMDMs или за по-нататъшно изолиране на моноцити.

Макрофаги, получени от костен мозък

Левкоцитите се изолират от изолация на костен мозък, суспендират се в пълна DMEM и се преброяват чрез оцветяване с трипаново синьо на хемоцитометър. Клетките се посяват върху третирани с тъканна култура 10 cm панички при концентрация от 5-8 x 106 клетки/плака в 10 mL пълна среда + M-CSF (20 ng/mL). Нова среда, включително M-CSF, беше добавена към съществуващата среда на дни 4 и дни 7. Напълно диференцирани BMDM бяха използвани за експериментална употреба между дните 7-9.

Изолиране на моноцити

Костен мозък се събира от WT и Clec12a-/- животни, както е описано по-горе. Моноцитите се изолират с комплекта за изолиране на моноцити (BM), мишка (Miltenyi Biotec) и LS MACS колона съгласно инструкциите на производителя.

F. rodentium BMDM съвместна култура и RNAseq

Културите на F. rodentium се определят количествено чрез OD 600 nm (като се използва 1 OD 600 nm=1 x 10^8 клетки/mL), промиват се 2 пъти в стерилен PBS и се култивират съвместно с 1 x 106 клетки/mL напълно диференцирани BMDMs при MOI от 10 в 6-ямковите плаки за тъканни култури. След 24 часа съвместно култивиране, средата беше събрана и съхранена при -20 C до следваща употреба. BMDMs се промиват със студен, стерилен PBS, 2x. Qiazol (Qiagen cat# 79306) РНК-стабилизиращ реагент след това се добавя директно към всяка ямка. Ямките бяха изстъргани с клетъчен скрепер, събрани в 1,5 Eppendorf епруветки и замразени при -20 градуса до екстракция на РНК. Екстракцията на РНК беше извършена с помощта на Direct-zol RNA минипреп комплект (Zymo Research cat# R2070) съгласно инструкциите на производителя и библиотеките за секвениране бяха подготвени от основното съоръжение на Huntsman Cancer Institute High-throughput Genomics. Общата РНК първо беше хибридизирана с NEBNext rRNA Depletion kit v2 (NEB, cat# E7400), за да се намали рРНК от пробите. Библиотеките за секвениране на усукана РНК бяха подготвени с помощта на NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit за Illumina (NEB, кат. # E7760L). Пречистените библиотеки бяха квалифицирани на Agilent Technologies 4150 TapeStation с помощта на анализ D1000 ScreenTape (Agilent, cat# 5067-5582 и 5067-5583). Моларността на модифицираните с адаптер молекули се определя чрез количествена PCR, като се използва Kapa Biosystems Kapa Library Quant Kit (Roche, cat#07960140001). Индивидуалните библиотеки бяха нормализирани до 5 nM в подготовка за анализ на последователност на Illumina и секвенирани на NovaSeq 6000 с цикъл на секвениране в 150-цикъл в двоен край.

Анализ на цитокини

BMDM се изолират и отглеждат, както е описано по-горе. Напълно диференцирани BMDMs се поставят при 1 х 105 клетки/ямка в 12-плаки за тъканна култура на гнезда. BMDM бяха стимулирани със 100 ng/mL LPS; 1 ug/mL Pam3Cysk; или 1 ug/mL флагелин. Клетките бяха стимулирани в продължение на 24 часа, средата беше събрана и запазена при -20 С за анализ. Цитокините бяха анализирани с LEGENDplex™ Mouse Inflammation Panel (13-plex) (Biolegend, кат. № 740150). Данните бяха анализирани с помощта на софтуера за анализ на данни LEGENDplex™.

16s rRNA генно секвениране

Фекални пелети или съдържание на илеума се събират от отделни мишки и веднага се замразяват при {{0}} градуса в 2 ml епруветки с винтова капачка, съдържащи 250 mg 0,15 mm гранатови перли (MoBio, кат. № {{5) }}). ДНК се екстрахира с помощта на Power Fecal DNA Isolation Kit (MoBio или QIAGEN), за инструкции за комплект, и включва 2 цикъла от 1 минута разбиване на перли при 4 градуса на Mini-Bead-Beater 16 (BioSpec Products). V3 и V4 регионите на 16S rRNA гена бяха амплифицирани с един цикъл на PCR, използвайки праймери, които съдържаха (описани 3' до 5') V3/4 регион 16S rRNA генна насочваща последователност, последвана 2-нуклеотидна подложка от праймерните последователности на Illumina, 8- нуклеотидна индексна последователност и останалата адапторна последователност на Illumina. V3/4 16S-насочените последователности са взети от Takahashi (Takahashi et al., 2014), а индексите са взети от Kozich (Kozich et al., 2013). Използваните пълни олигонуклеотидни последователности бяха (индекси, обозначени с Xs): Prok16SV34_За: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCTACACGACGCTC TTCCGATCTTGCCTACGGGNBGCASCAG; Prok16SV34_Рев.: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC GATCTGCGACTACNVGGGTATCTAATCC. Условията на PCR цикъл бяха както следва: 98 градуса първоначална денатурация за 2 минути; 26 цикъла от 20 секунди 98 градуса денатурация, 20 секунди 51,5 градуса отгряване, 20 секунди 72 градуса удължаване; и едно последно удължаване на 72 градуса за 2 минути. Всяка PCR (извършена в три екземпляра за всяка проба) се извършва в обем от 25 ul, като се използва Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (NEB, кат. # M0492L), 5 pmol от всеки праймер и 50 ng матрична ДНК. След амплификацията, трикратни PCRs от всяка проба бяха събрани, 5 ul бяха пуснати върху агарозен гел за потвърждаване на амплификацията и останалият обем беше почистен с помощта на Axygen AxyPrep MAG PCR очистващи перли (Corning, кат.# MAG-PCR-CL{{53) }}), разреден до 62,5% във вода, за да се отстрани ефективно всеки димер на праймера, който би бил преференциално секвениран. Бяха добавени разредени зърна при 1.8Х обем на PCR реакциите, почистени според указанията на производителя и почистените ампликони се елуираха с 25 ul 10 mM Tris-Cl, рН 8.0. След това ампликоните бяха количествено определени с pico green dsDNA анализ (ThermoFisher, cat #P11495) на четец на микроплаки и след това почистените и индексирани индивидуални библиотеки за секвениране бяха равномерно мултиплексирани (чрез ng ДНК) и секвенирани на инструмент Illumina MiSeq в сдвоен край Режим на 300 цикъла в съоръжението за споделени ресурси на High-Throughput Genomics на Huntsman Cancer Institute.

Биоинформатична обработка на данни за последователности

Необработените четения на 16S rRNA ген бяха демултиплексирани, позволявайки 0 несъответствия в индексите, след което обработени и анализирани в рамката на QIIME2 (Bolyen et al., 2019), както описахме по-рано (Stephens et al., 2021). Накратко, демултиплексираните и качествено филтрираните последователности първо бяха подрязани от праймерни и линкерни последователности с плъгина Cutadapt, след което бяха премахнати с DADA2 (Callahan et al., 2016; Martin, 2011). След това таксономиите бяха присвоени на ASV с метода classifysklearn в плъгина за класификатор на функции, спрямо референтния набор на GTDB (release89), подрязан до амплифицирания регион V3/4 и обучен с метода fit-classifier-naive-bayes (Bokulich et al. , 2018; Parks et al., 2018; Pedregosa et al., 2011). Показателите за разнообразие, разстоянията и статистическата значимост на групирането на бета разнообразие от permanova бяха изчислени в рамките на QIIME2 (Anderson, 2001).

За RNA-seq на BMDMs, необработените показания бяха първокачествени и подрязани чрез адаптер с помощта на трим в изобилие, след което броят на транскриптите беше количествено определен с помощта на Salmon срещу транскриптома от сглобката GRCm38 (mm10) (Patro et al., 2{{ 16}}17). Количествените показатели на нивото на транскрипта бяха прочетени в R с помощта на времевия пакет и обобщени до преброяване на нивото на гена преди анализ на диференциалната експресия с DESeq2, използвайки формулата за проектиране „~ Генотип + Лечение + Генотип: Лечение“ (Love et al., 2014; Love et al., 2020 г.). Диференциалните отговори към F. rodentium представляват разликата между отговора на всеки генотип към третиране с жив F. rodentium спрямо клетки, третирани с контролен носител. Значително диференциално експресираните гени се определят като тези с коригирана p-стойност <0,05 и log2 кратна промяна > |0,58| (1,5 пъти промяна). След това бяха използвани значително регулирани надолу и регулирани нагоре генни списъци за тестване за обогатяване на термините на генната онтология (GO) с помощта на пакета clusterProfiler, включително функцията за опростяване за намаляване на излишъка на термини GO и идентифициране на ключови биологични процеси (S, 2020; Wu et al ., 2021).

F. rodentium DSS предизвикателство

F. rodentium се отглежда, както е описано по-горе, и се определя количествено до 1 х 109 CFU/mL в стерилен PBS. F. rodentium се фиксира чрез първо промиване 2 пъти в стерилен PBS и след това ресуспендиране в 1 mL 10% Fomalin-PBS за 10 минути. След това клетките се промиват още два пъти в 10 mL стерилен PBS, за да се подготвят за орално дозиране. Нефиксираните се промиват като фиксираните клетки и се държат върху лед до поставяне в сонда. WT C57BL/6 SPF мишки бяха измервани орално със 100uL разтвор, съдържащ или PBS самостоятелно (носител), F. rodentium (жив) или F. rodentium (фиксиран) от дни -3 до 10. На животните бяха дадени 3,0% DSS в дни 0-7; прясната DSS вода се сменя през ден. Като праг на сериозност бяха наложени граници на сериозност от повече от 20% загуба на тегло. В експерименталните крайни точки MLN и дебелото черво бяха отстранени. Дебелото черво се измерва от сляпото черво до ректума, за да се определи дължината. След това тъканите се обработват за хистология, екстракция на РНК или поточен цитометричен анализ.

Анализ на фагоцитоза

Перитонеалните макрофаги се изолират чрез инжектиране на 5 mL стерилен PBS в перитонеалната кухина. PBS се разбърква леко, докато е в кухината на всеки няколко секунди. След 2 минути, PBS се изтегля с помощта на игла 28 калибър и се разпределя в студен пълен DMEM. Клетките се въртят при 367 х g и се промиват в пълна среда. След това клетките се преброяват с хемоцитометър и се поставят в 12-плаки за тъканна култура с концентрация от 2,5 х 105 клетки/mL. Клетките се оставят да се залепят за една нощ. На следващия ден ямките бяха внимателно смесени чрез завъртане и средата беше аспирирана. След това прилепналите клетки се промиват два пъти с 500uL студен, стерилен PBS. Предварително затоплен пълен DMEM, съдържащ F. rodentium при MOI от 10, след това се добавя към адхерента (макрофаги). След това плаките се въртят внимателно при 200 xg, при стайна температура в продължение на три минути и след това се инкубират при стандартни условия на клетъчна култура (37°С, 5% CO2) в продължение на 90 минути. F. rodentium се приготвя, както е описано за съвместно култивиране на BMDMs само за секвениране на РНК, след промиване, клетките се ресуспендират в 1x Sybr® зелено (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3), при RT за 20 минути. След това бактериалните клетки се пелетират при 4000 rpm за 5 min, ресуспендират се с пълна DMEM и предварително се затоплят за перитонеални макрофаги. След 90 минути съвместно култивиране, средата се аспирира и клетките се промиват два пъти със студен, стерилен PBS. Прилепналите клетки, съдържащи Sybr® зелено оцветени F. rodentium, се фиксират с 2% параформалдехид (PFA) за 10 минути. PFA се аспирира и върху клетките се поставя стерилен PBS. След това клетките бяха изобразени за фагоцитоза на F. rodentium

Анализ на изображения на макрофаги

Ярко поле и флуоресцентни изображения на макрофагови култури, третирани с F. rodentium, бяха направени с помощта на EVOS m7000 Imaging System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Бяха направени три до пет отделни рандомизирани изображения за всяка култура, които бяха извършени в три екземпляра.

Images were blinded and quantified using the software Fiji (Schindelin et al., 2012). Individual bacteria and macrophages were easily distinguished based on size. The total number of bacteria that were associated with (touching or overlapping with) single macrophages was quantified for a randomized subset of cells within the image. Equal numbers of cells were quantified between genotypes (n>200).

Конструкция на CLEC12A-Fc слят протеин aи пречистванеНа

cDNAs, кодиращи извънклетъчните домени на миши Clec12a, бяха амплифицирани чрез PCR от бели кръвни клетки, изолирани от C57Bl/6 WT SPF костен мозък и потвърдени чрез секвениране. cDNA бяха слети към С края на човешки IgG1-Fc в експресионния вектор pFuse-hIgG1- Fc2 (InvivoGen). Конструкти, съдържащи Clec12a или празен вектор, бяха трансфектирани в Lx293 клетки, култивирани с DMEM +10% FBS и Pen/strep (1 mg/mL). Секретираните слети протеини бяха събрани от средата 24-48 след трансфекцията. Средата се върти при 367 xg в продължение на 5 минути, за да се отстранят остатъци/мъртви клетки, и супернатантата се замразява при -20 С до употреба. Слети протеини Clec12a-Fc или само Fc бяха изолирани с Pierce™ Classic Magnetic IP/Co-IP Kit (Thermo Fisher Scientific, каталожен номер: 88804), количествено определени с Pierce™ BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific каталожен номер: 23227) и потвърдено чрез Western blot с използване на антитяло antiClec12a (Novus Biologicals NBP2-27346SS).

Clec12a-Fc-свързващ анализ

Пречистените конструкции се разреждат до 0.4 mg/mL в HBSS w/ Ca2+ и Mg2+. Бактериите се отглеждат в съответните им среди и аеробни условия и се нормализират чрез OD 600 nm. Бактериите се промиват с HBSS w/ Ca2+ и Mg2+ и се блокират с HBSS w/ Ca2+ и Mg2+ +10% FBS за 20 минути при RT. Всички процедури на оцветяване се провеждат при атмосферни условия. 1 x 107 бактериални клетки бяха поставени в облодънна 96-плака с гнезда, въртяха се при 3,000 xg и се декантираха. 50uL конструкти се поставят върху бактериални клетки, внимателно се смесват и се инкубират при 4°С за 1 час. Бактериалните клетки се промиват с HBSS w/ Ca2+ и Mg2+ + 10% FBS, 2x. 50uL кози античовешки Fc (PE) (ebioscience Catalog # 12-4998-82) се добавят към клетките и се инкубират при 4°C за 1 час, на тъмно. След това клетките се промиват както преди и се поставят в HBSS w/ Ca2+ и Mg2+, съдържащи 1x Sybr® зелено (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3). Клетките се инкубират при стайна температура в продължение на 20 минути на тъмно и веднага се отчитат на поточен цитометър BD LSR Fortessa.

Облъчване и възстановяване на костен мозък

Костен мозък се събира от WT и Clec12a-/- животни, както е описано по-горе. Получените мишки реципиенти бяха смъртоносно облъчени с 500 Rads на ден -1, последвани от 400 Rads на ден 0. Четири часа след последното облъчване мишките реципиенти бяха поставени под упойка с изофлуран и 100uL изолиран клетки от костен мозък, суспендирани в стерилен PBS (1 х 108 клетки/mL), се доставят чрез игла 28.5 калибър в ретро-орбиталното пространство. Ние се интересувахме от микробиотата, така че животните не бяха поставени на антибиотици и след 8 седмици бяха събрани фекални пелети за трансфер на микробиота в GF животни.

ПРЕПРАТКИ

Андерсън, MJ (2001). Нов метод за непараметричен многовариантен дисперсионен анализ. Austral Ecol. 26, 32-46. DOI 10.1111/j.1442-9993.2001.01070.pp.x.

Begun, J., Lassen, KG, Jijon, HB, Baxt, LA, Goel, G., Heath, RJ, Ng, A., Tam, JM, Kuo, SY, Villablanca, EJ и др. (2015). Интегрирана геномика на рисковия вариант на болестта на Crohn

идентифицира ролята на CLEC12A в антибактериалната аутофагия. Представител на клетка 11, 1905-1918. 10.1016/j.celrep.2015.05.045.

Blander, JM, Longman, RS, Илиев, ID, Sonnenberg, GF и Artis, D. (2017). Регулиране на възпалението чрез взаимодействия на микробиотата с гостоприемника. Нац. Immunol. 18, 851-860. 10.1038/ni.3780.

Bokulich, NA, Kaehler, BD, Rideout, JR, Dillon, M., Bolyen, E., Knight, R., Huttley, GA и Caporaso, JG (2018). Оптимизиране на таксономичната класификация на последователности на ампликони на маркерен ген с QIIME 2 ''sq2-feature-classifier плъгин. Микробиома 6. ARTN 90 10.1186/s40168-018-0470-z.

Bolyen, E., Rideout, JR, Dillon, MR, Bokulich, N., Abnet, CC, Al-Ghalith, GA, Alexander, H., Alm, EJ, Arumugam, M., Asnicar, F., et al. (2019 г.). Възпроизводима, интерактивна, мащабируема и разширяема наука за микробиомни данни с помощта на QIIME 2. Nat. Биотехнология. 37, 852-857. 10.1038/s41587-019-0209-9.

Brown, GD, Willment, JA и Whitehead, L. (2018). С-тип лектини в имунитета и хомеостазата. Нац. Rev. Immunol. 18, 374-389. 10,1038/s41577-018-0004-8.

Browne, HP, Forster, SC, Anonye, ​​BO, Kumar, N., Neville, BA, Stares, MD, Goulding, D. и Lawley, TD (2016). Култивирането на „некултивируема“ човешка микробиота разкрива нови таксони и обширна спорулация. Nature 533, 543-+. 10.1038/nature17645.

Cadwell, K., Liu, JY, Brown, SL, Miyoshi, H., Loh, J., Lennerz, JK, Kishi, C., Kc, W., Carrero, JA, Hunt, S., et al. (2008). Ключова роля за автофагията и гена за автофагия Atg16l1 в миши и човешки чревни клетки на Панет. Nature 456, 259-263. 10.1038/nature07416.

Callahan, BJ, McMurdie, PJ, Rosen, MJ, Han, AW, Johnson, AJA и Holmes, SP (2016). DADA2: Примерен извод с висока разделителна способност от данни за ампликони на Illumina. Нац. Методи 13, 581-+. 10.1038/Nmeth.3869.

Cao, YG, Bae, S., Villarreal, J., Moy, M., Chun, E., Michaud, M., Lang, JK, Glickman, JN, Lobel, L. и Garrett, WS (2022). Faecalibaculum rodentium ремоделира сигнализирането на ретиноевата киселина, за да управлява зависимата от еозинофилите чревна епителна хомеостаза. Клетка гостоприемник и микроб 30, 1295- 1310 e1298. 10.1016/j.chom.2022.07.015.

Chang, DH, Rhee, MS, Ahn, S., Bang, BH, Oh, JE, Lee, HK и Kim, BC (2015). Faecalibaculum rodentium gen. нов., сп. nov., изолиран от изпражненията на лабораторна мишка. Антони Ван Льовенхук 108, 1309-1318. 10.1007/s10482-015-0583-3.

Chiaro, TR, Soto, R., Stephens, WZ, Kubinak, JL, Petersen, C., Gogokhia, L., Bell, R., Delgado, JC, Cox, J., Voth, W., et al. (2017). Член на чревната микобиота модулира пуриновия метаболизъм на гостоприемника, изостряйки колит при мишки. Sci. Превод Med. 9, .

Drouin, M., Saenz, J. и Chiffoleau, E. (2020). С-тип лектиноподобни рецептори: Глава или опашка в имунитета към клетъчна смърт. Преден. Immunol. 11. ARTN 251 10.3389/fimmu.2020.00251.

Fassarella, M., Blaak, EE, Penders, J., Nauta, A., Smidt, H. и Zoetendal, EG (2021). Стабилност и устойчивост на чревния микробиом: изясняване на реакцията на смущения, за да се модулира здравето на червата. Черво 70, 595-605. 10.1136/gutjnl-2020-321747.

Gkouskou, KK, Deligianni, C., Tsatsanis, C. и Eliopoulos, AG (2014). Чревната микробиота в миши модели на възпалително заболяване на червата. Граници в клетъчната и инфекциозната микробиология 4. ARTN 28 10.3389/fcimb.2014.00028.

Han, YM, Zhang, MH, Li, N., Chen, TY, Zhang, Y., Wan, T. и Cao, XT (2004). KLRL1, нов лектиноподобен рецептор на клетки убийци, инхибира цитотоксичността на естествените клетки убийци. Кръв 104, 2858-2866. DOI 10.1182/кръв-2004-03-0878.

Илиев, ID, Funari, VA, Taylor, KD, Nguyen, Q., Reyes, CN, Strom, SP, Brown, J., Becker, CA, Fleshner, PR, Dubinsky, M., et al. (2012). Взаимодействията между коменсалните гъбички и С-тип лектиновия рецептор Dectin-1 влияят върху колита. Наука 336, 1314-1317. 10.1126/наука.1221789.

Jason L. Kubinak, WZS, Ray Soto, Charisse Petersen, Tyson Chiaro, Lasha Gogokhia, Rickesha Bel1, Nadim J. Ajami, Joseph F. Petrosino, Linda Morrison4, Wayne K. Potts, Peter E. Jensen, Ryan M. O' Конъл и Джун Л. кръг (2015). MHC вариацията извайва индивидуализирани микробни общности, които контролират чувствителността към чревна инфекция. Общуване с природата. 0,1038/ncomms9642.

Kono, H., Chen, CJ, Ontiveros, F. и Rock, KL (2010). Пикочната киселина насърчава остър възпалителен отговор на стерилна клетъчна смърт при мишки. J. Clin. Инвестирам. 120, 1939-1949. 10.1172/Jci40124.

Kozich, JJ, Westcott, SL, Baxter, NT, Highlander, SK, and Schloss, PD (2013). Разработване на стратегия за секвениране с двоен индекс и тръбопровод за куриране за анализиране на данни за последователност на ампликони на платформата за секвениране MiSeq Illumina. Приложна и екологична микробиология 79, 5112-5120. 10.1128/Aem.01043-13.

Kubinak, JL, Petersen, C., Stephens, WZ, Soto, R., Bake, E., O'Connell, RM и Round, JL (2015). Сигнализацията на MyD88 в Т клетките насочва IgA-медиирания контрол на микробиотата за насърчаване на здравето. Клетъчен гостоприемник микроб 17, 153-163. 10.1016/j.chom.2014.12.009.

Li, K., Neumann, K., Duhan, V., Namineni, S., Hansen, AL, Wartewig, T., Kurgyis, Z., Holm, CK, Heikenwalder, M., Lang, KS и Ruland, J. (2019). Рецепторът на кристалите на пикочната киселина Clec12A потенцира отговорите на интерферон тип I. Proc Natl Acad Sci USA 116, 18544-18549. 10.1073/pnas.1821351116.

Liu, JZ, van Sommeren, S., Huang, H., Ng, SC, Alberts, R., Takahashi, A., Ripke, S., Lee, JC, Jostins, L., Shah, T. и др. . (2015). Анализите на асоциацията идентифицират 38 локуса на чувствителност към възпалително заболяване на червата и подчертават споделения генетичен риск сред популациите. Нац. Женет. 47, 979-986. 10.1038/ng.3359.

Love, MI, Huber, W. и Anders, S. (2014). Модерирана оценка на промяната на гънките и дисперсията за RNA-seq данни с DESeq2. Genome Biol. 15. ARTN 550 10.1186/s13059-014-0550-8.

Love, MI, Soneson, C., Hickey, PF, Johnson, LK, Pierce, NT, Shepherd, L., Morgan, M. и Patro, R. (2020). Tximeta: Контролни суми на референтна последователност за идентифициране на произхода в RNA-seq. Plos Computational Biology 16. ARTN e1007664 10.1371/journal.pcbi.1007664.

Luo, Y., Tucker, SC и Casadevall, A. (2005). Активирането на Fc- и комплементния рецептор стимулира прогресията на клетъчния цикъл на клетките на макрофагите от G1 към SJ Immunol. 174, 7226- 7233. 10.4049/jimmunol.174.11.7226.

Macpherson, AJ, Gatto, D., Sainsbury, E., Harriman, GR, Hengartner, H. и Zinkernagel, RM (2000). Примитивен Т-клетъчно независим механизъм на IgA отговори на чревната лигавица към коменсални бактерии. Наука 288, 2222-+. DOI 10.1126/наука.288.5474.2222.

Maglinao, M., Eriksson, M., Schlegel, MK, Zimmermann, S., Johannssen, T., Gotze, S., Seeberger, PH и Lepenies, B. (2014). Платформа за скрининг на C-тип лектинови рецепторни свързващи въглехидрати и техния потенциал за клетъчно-специфично насочване и имунна модулация. Journal of Controlled Release 175, 36-42. 10.1016/j.jconrel.2013.12.011.

Маршал, ASJ, Willment, JA, Lin, HH, Williams, DL, Gordon, S. и Brown, GD (2004). Идентифициране и характеризиране на нов човешки миелоиден инхибиторен c-тип лектин-подобен рецептор (MICL), който се експресира предимно върху гранулоцити и моноцити. J. Biol. Chem. 279, 14792-14802. 10.1074/jbc.M313127200.

Мартин, М. (2011). Cutadapt премахва последователностите на адаптера от четенията за последователност с висока пропускателна способност. EMBNet.journal 17. Martinez-Lopez, M., Iborra, S., Conde-Garrosa, R., Mastrangelo, A., Danne, C., Mann, ER, Reid, DM, Gaboriau-Routhiau, V., Chaparro , M., Lorenzo, MP, et al. (2019 г.). Отчитането на микробиотата чрез оста Mincle-Syk в дендритни клетки регулира производството на интерлевкин-17 и -22 и насърчава целостта на чревната бариера. Имунитет 50, 446-461 e449. 10.1016/j.immuni.2018.12.020.

Martinon, F., Petrilli, V., Mayor, A., Tardivel, A. и Tschopp, J. (2006). Кристалите на пикочната киселина, свързани с подаграта, активират инфламазомата NALP3. Nature 440, 237-241. 10.1038/nature04516.

Накаджима, А., Фогелзанг, А., Маруя, М., Мияджима, М., Мурата, М., Сон, А., Кувахара, Т., Цуруяма, Т., Ямада, С., Мацуура, М., et al. (2018). IgA регулира състава и метаболитната функция на чревната микробиота чрез насърчаване на симбиозата между бактериите. J. Exp. Med. 215, 2019-2034. 10.1084/jem.20180427.

Neumann, K., Castineiras-Vilarino, M., Hockendorf, U., Hannesschlager, N., Lemeer, S., Kupka, D., Meyermann, S., Lech, M., Anders, HJ, Kuster, B. , et al. (2014 г.). Clec12a е инхибиторен рецептор за кристали на пикочна киселина, който регулира възпалението в отговор на клетъчна смърт. Имунитет 40, 389-399. 10.1016/j.immuni.2013.12.015.

Окай, С., Усуи, Ф., Йокота, С., Хори, И.Й., Хасегава, М., Накамура, Т., Куросава, М., Окада, С., Ямамото, К., Нишияма, Е., и др. ал. (2016). Моноклоналният IgA с висок афинитет регулира чревната микробиота и предотвратява колит при мишки. Nat Microbiol 1, 16103. 10.1038/nmicrobiol.2016.103.

Пабст, О. и Слак, Е. (2020). IgA и чревната микробиота: значението на специфичността. Мукозен имунол. 13, 12-21. 10.1038/s41385-019-0227-4.

Parks, DH, Chuvochina, M., Waite, DW, Rinke, C., Skarshewski, A., Chaumeil, PA, и Hugenholtz, P. (2018). Стандартизирана бактериална таксономия, базирана на филогенеза на генома, съществено преразглежда дървото на живота. Нац. Биотехнология. 36, 996-+. 10.1038/nbt.4229.

Patro, R., Duggal, G., Love, MI, Irizarry, RA, and Kingsford, C. (2017). Salmon осигурява бързо и съобразено с пристрастия количествено определяне на експресията на транскрипт. Нац. Методи 14, 417-+. 10.1038/nmeth.4197.

Pedregosa, F., Varoquaux, G., Gramfort, A., Michel, V., Thirion, B., Grisel, O., Blondel, M., Prettenhofer, P., Weiss, R., Dubourg, V., et al. (2011). Scikit-learn: Машинно обучение в Python. J Mach Learn Res 12, 2825-2830.

Pyz, E., Huysamen, C., Marshall, AS, Gordon, S., Taylor, PR, и Brown, GD (2008). Характеризиране на миши MICL (CLEC12A) и доказателства за ендогенен лиганд. Евро. J. Immunol. 38, 1157-1163. 10.1002/eji.200738057.

Raulf, MK, Johannssen, T., Matthiesen, S., Neumann, K., Hachenberg, S., Mayer-Lambertz, S., Steinbeis, F., Hegermann, J., Seeberger, PH, Baumgartner, W., et al. (2019 г.). С-тип лектинов рецептор CLEC12A разпознава плазмодиален хемозоин и допринася за развитието на церебрална малария. Cell Rep. 28, 30-38 e35. 10.1016/j.celrep.2019.06.015.

Ray, A. и Dittel, BN (2015). Взаимовръзка между дисбиозата в чревната микробиота поради имунодефицит и пенетрация на колит. Имунология 146, 359-368. 10.1111/имм.12511.

Redelinghuys, P., Whitehead, L., Augello, A., Drummond, RA, Levesque, JM, Vautier, S., Reid, DM, Kerscher, B., Taylor, JA, Nigrovic, PA, et al. (2016). MICL контролира възпалението при ревматоиден артрит. Ан. Rheum. дис. 75, 1386-1391. 10.1136/annrheumdis-2014-206644.