Сравнението между QPCR и RNA‑seq разкрива предизвикателствата при количественото определяне на експресията на HLA, част 1

Резюме

Локусите на човешкия левкоцитен антиген (HLA) клас I и II са основни елементи на вродения и придобития имунитет. Техните функции включват представяне на антиген към Т клетките, което води до клетъчни и хуморални имунни отговори и модулиране на NK клетки. Изключителното им влияние върху резултатите от заболяването вече е изяснено от проучвания за асоцииране в целия геном. Екзоните, кодиращи пептид-свързващия жлеб, са били основният фокус за определяне на ефектите на HLA върху чувствителността/патогенезата на заболяването. Въпреки това, нивата на експресия на HLA също са замесени в резултатите от заболяването, добавяйки друго измерение към изключителното разнообразие на HLA, което влияе върху променливостта в имунните отговори на отделните индивиди.

Съществува тясна връзка между левкоцитните антигени и имунитета. Левкоцитният антиген се отнася до молекулата на повърхността на човешките бели кръвни клетки, която може да идентифицира и разграничава различни видове клетки и патогени. Той е важна част от човешката имунна система и важен регулатор на имунния отговор.

Разликите в левкоцитните антигени могат да доведат до различни имунни отговори и чувствителност към заболяване. Например, някои левкоцитни антигени са свързани с автоимунни заболявания, инфекциозни заболявания и тумори. Експресията на определени левкоцитни антигени също е свързана с функцията и количеството на имунните клетки.

Следователно, разбирането на молекулярните характеристики на повърхността на левкоцитите на индивида е от голямо значение за оценка на имунния статус на индивида и риска и прогнозата на заболяването. В същото време това е благоприятно и за формулиране на персонализирано лечение и превантивни мерки. От тази гледна точка трябва да подобрим имунитета. Цистанче има значителен ефект за подобряване на имунитета. Cistanche е богат на различни антиоксидантни вещества, като витамин С и каротеноиди. Тези съставки могат да поглъщат свободните радикали, да намалят оксидативния стрес и да подобрят устойчивостта на имунната система.

Щракнете върху прах от екстракт от Cistanche tubulosa

За да се оцени експресията на HLA, имуногенетичните изследвания традиционно разчитат на количествена PCR (qPCR). Възприемането на алтернативни високопроизводителни технологии като RNA-seq е възпрепятствано от технически проблеми поради екстремния полиморфизъм на HLA гените. Напоследък обаче бяха разработени множество биоинформационни методи за точна оценка на HLA експресията от RNA-seq данни. Това отваря вълнуваща възможност за количествено определяне на експресията на HLA в големи масиви от данни, но също така поставя въпроси дали резултатите от RNA-seq са сравними с тези от qPCR. В това изследване ние анализираме три класа данни за експресия за HLA клас I гени за съвпадащ набор от индивиди: (a) RNA-seq, (b) qPCR и (c) HLA-C експресия на клетъчна повърхност. Наблюдавахме умерена корелация между оценките на експресията от qPCR и RNA-seq за HLA-A, -B и -C ({{10}}.2 По-малко или равно на rho По-малко или равно на 0,53 ). Обсъждаме технически и биологични фактори, които трябва да се вземат предвид при сравняване на количествени показатели за различни молекулярни фенотипове или използване на различни техники.

Ключови думи

HLA · Експресия · PCR · RNA-seq.

Въведение

Генната експресия осигурява молекулярен фенотип, който се намира на междинна позиция между генетичната вариация и сложните фенотипове, като статус на болестта. Разбирането на генетичната основа на генната експресия може да бъде стратегическо за създаване на връзки между генетични вариации и сложни фенотипове (GTEx Consortium 2013; Lappalainen et al. 2013), включително чувствителност към автоимунни и инфекциозни заболявания. Въпреки че изследването на генетичните вариации в локусите на човешкия левкоцитен антиген (HLA) и като цяло в областта на основния комплекс за хистосъвместимост (MHC) е използвано за дисекция на генетичната основа на няколко сложни заболявания (Trowsdale and Knight 2013; Dendrou et al. 2018), включването на молекулярни фенотипове, по-специално тези, свързани с генната експресия, е сравнително скорошно (Apps et al. 2015; Vince et al. 2016; Ramsuran et al. 2018; Johansson et al. 2022).

Човешкият MHC регион на хромозома 6p21 показва висока генна плътност, с уникални модели на неравновесие на връзката (LD) и екстремен полиморфизъм (de Bakker et al. 2006; Radwan et al. 2020). MHC регионът съдържа HLA клас I и II локуси, които кодират молекули, участващи в задействането и модулирането на имунния отговор. HLA клас I молекули се експресират от повечето ядрени клетки и обикновено представят вътреклетъчни пептиди на CD8 плюс Т клетки. Обратно, HLA клас II молекули се експресират основно от професионални антиген-представящи клетки и представят на CD4 плюс Т клетки екзогенни антигени, които са интернализирани чрез ендоцитоза. Молекулите от клас I също се разпознават от рецепторите на клетките естествени убийци (NK), имуноглобулиноподобните рецептори на клетките убийци (KIRs), които влияят както на образованието, така и на активирането на NK клетки (Colonna и Samaridis 1995; Goodson-Gregg et al. 2020 г.). Сдвояването на различни HLA клас I алотипове и специфични KIR молекули влияе върху активността на NK клетките (и подгрупа от CD8 плюс Т клетки), което води до различни рискове за рак, инфекциозни заболявания и автоимунитет (прегледано в Kulkarni et al. 2008).

Асоциациите на HLA заболяване се приписват основно на алел-специфични разлики в представянето на антигена, поради обширните полиморфизми в пептид-свързващия жлеб. Въпреки това нивата на експресия на HLA допринасят за някои от асоциациите, наблюдавани между HLA полиморфизмите и резултатите от заболяването. Нивото на експресия на HLA е важен модификатор на автоимунитета и на силата на HLA-медиирания имунен отговор към рак и инфекции (прегледано в René et al. 2016).

Има множество примери за асоциации между нивата на експресия на HLA и резултатите от вирусна инфекция. Добре документирано е, например, че по-високите нива на експресия на HLA-C, както на нивото на иРНК, така и на протеина на клетъчната повърхност, са свързани с по-добър контрол на HIV -1 (Thomas et al. 2009; Kulkarni et al. др., 2011 г.; Apps и др., 2013 г.; Parolini и др., 2018 г.; Bachtel и др., 2018 г.), докато повишената експресия на HLA-A се свързва с нарушен контрол на ХИВ (Ramsuran et al., 2018 г.). SARS-CoV-2 инфекцията регулира надолу експресията на HLA-C ген (Loi et al. 2022) и експресията на HLA клас I върху клетъчната повърхност (Zhang et al. 2021; Arshad et al. 2023), както и HLA клас II генна експресия, включително HLA-DPA1, -DPB1, -DRA и -DRB1 (Wilk et al. 2020).

Освен това съществуват връзки между нивата на експресия на HLA-DPA1 (Ou et al. 2019) и HLA-DPB1 (Thomas et al. 2012; Ou et al. 2021) с клирънса на HBV; Експресия на HLA-DRA с чувствителност към инфекция от вируси на инфлуенца А при прилепи в човешки клетъчни линии (Karakus et al. 2019); и широки асоциации между регулаторните варианти и нивата на експресия при HLA клас II гени, включително HLA-DQA1, -DQB1, -DQB2, -DRB1 и -DRB5 с отговор на антитела срещу множество преобладаващи вируси (Kachuri et al. 2020).

Нивата на експресия на HLA локусите също са свързани с автоимунитета (вижте Johansson et al. 2022 за преглед). Нивата на експресия на HLA-C на клетъчната повърхност (Apps et al. 2013; Kulkarni et al. 2013), както и нивата на HLA-G на клетъчната повърхност и в плазмата (da Costa Ferreira et al. 2021), са свързани с риск от възпалително заболяване на червата. Повишена експресия на HLA-B27 върху клетъчната повърхност се наблюдава при пациенти с анкилозиращ спондилит (Cauli et al. 2002), както и цялостната експресия на HLA клас I сред пациенти с болест на Грейвс (Weider et al. 2021). Нивата на експресия на HLA клас II също влияят върху риска от автоимунни състояния.

Генната експресия на HLA-DQA1 и -DRB1 и експресията на DQ и DR молекулите върху клетъчната повърхност се увеличават в моноцитите на периферната кръв на пациенти с витилиго (Cavalli et al. 2016); регулаторни варианти, свързани с по-висока генна експресия на HLA-DQA1, -DQB1 и -DRB1 и експресия на DQ и DR на клетъчната повърхност, са свързани с риск от системен лупус еритематозус (Raj et al. 2016); Генната експресия на HLA-DRB5 е по-висока при пациенти със склеродермия и интерстициална белодробна болест (Odani et al. 2012); специфичните HLA-DRB1 алели са силно експресирани при пациенти с ревматоиден артрит (Houtman et al. 2021); и по-висока експресия на DRB1*15:01 се свързва с риск от множествена склероза (Alcina et al. 2012). Следователно, разбирането на вариациите на експресията на HLA сред индивидите и механизмите, регулиращи нивата на експресия на HLA, ще бъде от ключово значение за разкриването на генетичната основа на фенотипите на заболяването.

Традиционно експресията на HLA се оценява чрез базирани на антитела техники за нивата на експресия на клетъчната повърхност (Thomas et al. 2012; Apps et al. 2013) или чрез количествена PCR (qPCR или RT-PCR) за нивата на транскрипция на иРНК (Bettens et al. др., 2014 г.; Рамсуран и др., 2015 г., 2017 г.). Предизвикателство е да се сравняват резултатите от различни проучвания или дори да се сравняват отделни HLA локуси в рамките на едно и също проучване, тъй като се използват различни експериментални процедури за всеки анализ и за всеки HLA локус, което може да доведе до различна ефективност на амплификация в qPCR или афинитет на антитяло в поточна цитометрия.

Технологии с висока пропускателна способност като RNA-seq предоставят оценки на експресията за всички гени в генома, включително HLA гени, като по този начин позволяват оценка на HLA експресията в контекст на целия геном. Въпреки това, тези технологии носят много предизвикателства, когато се използват за оценка на нивата на експресия на HLA гените. В допълнение към добре документираните отклонения, свързани с RNA-seq анализи (напр. партидни ефекти, подготовка на библиотека, съдържание на GC ('t Hoen et al. 2013), трудността при оценяване на нивата на експресия за HLA гени е резултат от факта, че количественото определяне включва подравняване на кратки четения към референтен геном, което не осигурява пълно представяне на HLA алелното разнообразие.

Следователно, някои показания може да не успеят да се приведат в съответствие поради голям брой разлики по отношение на референтния геном (Brandt et al. 2015). В допълнение, HLA гените са част от генно семейство, образувано след последователни кръгове на дублиране и често съдържат сегменти, които са много сходни между паралозите, което води до кръстосано подреждане между гените и предубедено количествено определяне на нивата на експресия. Тези трудности мотивираха разработването на изчислителни канали (вижте Johansson et al. 2022 за преглед), които отчитат известното разнообразие на HLA в стъпката на подравняване и е доказано, че осигуряват точни нива на експресия за HLA гени (Boegel et al. 2012; Lee et др., 2018 г.; Aguiar и др., 2019 г.; Gutierrez-Arcelus и др., 2020 г.; Дарби и др., 2020 г.).

Докато подходите на RNA-seq и qPCR оценяват експресията на HLA чрез количествено определяне на изобилието от транскрипти, методите включват различни експериментални и биоинформационни процедури за обработка. Доколкото ни е известно, не е извършено количествено сравнение на резултатите от RNA-seq с тези, получени от qPCR за HLA гени. В това проучване се опитахме да сравним различни техники и молекулярни фенотипове за количествено определяне на експресията на HLA клас I, като имаме предвид, че нито една техника не може да се счита за златен стандарт. За да намалим ефекта от техническите и биологични вариации при сравнението на различни проучвания, ние проведохме RNA-seq анализ на група от 96 индивида, за които бяха налични оценки на експресията на qPCR (за HLA-A, -B, -C) и за подгрупа от които HLA-C антитяло-базирана клетъчна повърхностна експресия също е налична. Количественото определяне на RNA-seq беше извършено с HLA-съобразен тръбопровод, който позволява точна оценка на експресията, минимизирайки отклонението на стандартните подходи, разчитащи на един референтен геном.

Материали и методи

Мостри

Бяха взети кръвни проби от 96 здрави кръводарители, включени в програмата за доброволни донори в Националната лаборатория за изследване на рака на Фредерик (FNLCR). Беше получено писмено информирано съгласие от всички субекти и пробите бяха анонимизирани чрез одобрени от IRB процедури на Националния институт по рака. РНК се екстрахира от прясно изолирани мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMC), като се използва RNeasy Universal kit (Qiagen). РНК се третира с ДНКаза без РНКаза за отстраняване на геномна ДНК. Общата РНК, извлечена от PBMCs, се определя количествено с помощта на HT RNA Lab Chip (Caliper, Life Sciences). Всички проби, които показват качествен резултат на РНК над 8, бяха използвани в анализите на генната експресия.

HLA типизиране

HLA алелите се определят чрез секвениране на Sanger. Освен това проведохме HLApers (Aguiar et al. 2019) и Kourami (Lee and Kingsford 2018), за да направим извод за HLA алели директно от RNAseq и проверихме за съответствие с извикванията, базирани на последователността на Sanger. Ако разгледаме последователни обаждания между HLApers и Kourami, наблюдавахме само 10 несъответствия с обажданията на Sanger от 288 сравнения (3 локуса × 96 индивида). Повечето от тях (n=5) показаха подкрепа от RNA-seq за алел, много близък до този, определен от секвенирането на Sanger, поради което избрахме да запазим базираните на RNA-seq разговори. За 3 генотипа наблюдаваме хомозиготни повиквания от RNA-seq, вероятно защото един алел не е експресиран и ние запазихме повикванията от секвенирането на Sanger. Това не оказва влияние върху оценката на експресията, тъй като нито едно четене не се подравнява към алела, който не е открит чрез RNA-seq. За един генотип наблюдавахме добра подкрепа за хетерозиготен разговор, докато секвенирането на Sanger беше наречено хомозиготно. В този случай ние запазихме повикването, базирано на RNA-seq, тъй като по-добре обясняваше наблюдаваните показания. За едно повикване на алел, ние разгледахме грешка на повикванията, базирани на RNA-seq, поради недостатъчно покритие на четене.

Количествен PCR (qPCR)

Нивата на транскрипция на HLA иРНК за HLA-A, -B и -C бяха измерени чрез qPCR в анализ, който гарантира безпристрастна амплификация на общите алели във всеки локус, като същевременно се избягва амплификацията на всички други локуси. Използваните праймери са: HLA-A (F, GCTCCCACTCCATGAGGTAT; R, AGTCTG TGACTGGGCCTTCA); HLA-B (F, ACTGAGCTTGTG GAGACCAGA; R, GCAGCCCCTCATGCTGT); HLA-C (F, CTGGCCCTGACCGAGACCTG; R, CGCTTGTAC TTCTGTGTCTCC). Обратната транскрипция беше извършена с помощта на комплекта RNA-to-cDNA с голям капацитет (Applied Biosystems). Амплификацията на HLA и кДНК на микроглобулина на домакинския ген 2 (B2M) беше извършена с помощта на Power SYBR зелена основна смес (Applied Biosystems), на машина ABI 7900HT. Праймерните последователности за B2M са описани в Таблица S4 на Kulkarni et al. (2013). Средното ниво на експресия на всеки HLA ген се нормализира до това на B2M и се изчислява с помощта на метода 2-∆∆Ct (където Ct е праговият цикъл).

Средните алел-специфични нива на експресия на общите HLA алели бяха оценени чрез линеен модел, както е описано в Ramsuran et al. (2015). По-конкретно, моделирахме експресията като линейна функция на двата алела, носени от всеки индивид, и извлякохме ефектите на всеки алел върху генната експресия. Изпълнихме тази стъпка в R (вижте раздел Наличност на код).

Повърхностен израз

HLA-C клетъчната повърхностна експресия се измерва върху CD3 плюс клетки от прясно изолирани PBMC чрез поточна цитометрия, използвайки HLA-C-специфично моноклонално антитяло DT9 (Apps et al. 2013). За HLA-A анализа в подгрупа от индивиди, носещи A*03 и A*11, ние оцветихме клетки с антитялото 0554HA (One Lambda, Inc.).

RNA-seq

Приготвяне на РНК

RNA-seq се извършва върху RNA, съхранявана при -80 градуса. Общата РНК се определя количествено с помощта на Qubit RNA HS анализ (Thermo Fisher). Качеството на РНК беше оценено с помощта на инструмент 2100 Bioanalyzer и комплект Agilent 6000 RNA Pico (Agilent Technologies). За всяка проба, 500 ng обща РНК се използва като вход за подготовката на библиотеки, изчерпани с рРНК на целия транскриптом. Библиотека, лигирана с адаптер, беше подготвена с KAPA HyperPrep Kit (KAPA Biosystems, Wilmington, MA), използвайки Bioo Scientific NEXTfex™ ДНК баркодирани адаптери (BioScientifc, Austin, TX, USA) съгласно предоставения от KAPA протокол.

Изчерпване на рРНК с помощта на RiboErase

Рибозомната РНК се изчерпва чрез инкубиране на обща РНК със сонди, комплементарни на rRNA последователности. След хибридизация, РНКаза Н се използва за ензимно разграждане на рРНК. Почистването и разграждането на DNase се извършват с помощта на Kapa Pure Beads и DNase съгласно протокола Kapa.

Фрагментация, cDNA синтез и изграждане на библиотека

Пробите с изчерпване на рРНК се фрагментират при 85 градуса за 4,5 минути в присъствието на магнезий преди синтез на 1-ва и 2-ра верига и реакции на A-Tailing. NEXTfex ДНК баркодирани адаптери (1,5 uM) бяха лигирани към A-tailed cDNA с уникален баркод за всяка проба. Продуктите бяха пречистени с Kapa Pure Beads и бяха извършени 8 цикъла на Library Amplification. След амплификацията беше извършено окончателно почистване на библиотеката и количественото определяне на библиотеката и QC бяха оценени с помощта на Qubit DNA HS Assay (Thermo Fisher) и Agilent DNA HS kit на инструмента 2100 Bioanalyzer.

Секвениране

Получените мултиплексирани библиотеки за секвениране бяха използвани при формиране на клъстери на Illumina cBOT (Illumina, Сан Диего, Калифорния, САЩ) и секвенирането беше извършено с помощта на Illumina HiSeq 2500, следвайки предоставените от Illumina протоколи за 2 × 126 bp сдвоено крайно секвениране. Всеки транскриптом беше секвениран до целева дълбочина от 40–50 милиона прочитания.

RNA-seq върху свежи проби от 11 индивида

За да проучим възможността за разграждане на проба от материал, съхраняван при -80 градуса преди секвенирането на РНК, потенциален източник на несъгласие с оценките на qPCR, ние преначертахме кръв от 11 донора и извършихме RNA-seq на новите проби. Експериментът беше проведен със същата подготовка на библиотеката и методи, както преди, но секвениран с помощта на Illumina NextSeq с 2 × 150 pb четения.

Количествено определяне на експресията за RNA-seq

Референтен транскриптом

Използвахме Salmon (Patro et al. 2017), за да оценим нивата на експресия за всички транскрипти, анотирани в базата данни Gencode v37. Използвахме всички опции за корекция на отклонението на Salmon (GC отклонение, позиционно отклонение и специфично за последователността отклонение).

Персонализирани

Същото като "референтния транскриптом", но с персонализирани HLA транскрипти според HLA-A, -B и -C генотипите, носени от всеки индивид. Персонализирането беше извършено чрез подравняване на последователността за HLA алела на референтния геном към генома, за да се получат координатите. След това, използвайки подравняването на множество последователности на алела, присъстващ в референтния геном, с всички останали алели (достъпни от IPD-IMGT/HLA версия 3.43.0 (Robinson et al. 2020)), ние приписахме геномни позиции към всички HLA алели. И накрая, ние конструирахме персонализиран транскрипт въз основа на комбинацията от информация за координатите на транскрипта и последователността на HLA алела. Тази процедура беше извършена в R (R Core Team 2020), използвайки пакета Biostrings (Pagès et al. 2020) и метапакета tidyverse (Wickham et al. 2019).

For more information:1950477648nn@gmail.com