Добавка при бъбречно заболяване като потенциален фактор за артериална хипертония

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Лиза-Марен Фишер и др

Резюме

Обективен:Отлагането на комплемент преобладава в бъбречните биопсии на пациенти с артериална хипертония и хипертонична нефропатия, но връзката между хипертония и отлагането на комплемент или участието на комплемента в патогенезата на хипертоничната нефропатия не е доказана досега.

Методи:В това проучване анализирахме отлагането на комплемент C1q и C3c в модел на претоварване и хипертония при плъх чрез субтотална нефректомия (SNX) и в архивни човешки бъбречни биопсии от 217 пациенти с известна хипертония и 91 контролни пациенти без анамнеза за хипертония, използвайки полуколичествено оценяване на C1q и C3c имунохистохимия и корелация с параметрите на бъбречната функция. За да се определи дали комплементът е само пасивно депозиран или активно експресиран от бъбречни клетки, експресията на C1q и C3 mRNA беше допълнително анализирана.

Резултати:Отлагането на гломерулни C1q и C3c комплемент е значително по-високо в бъбреците на хипертонични SNX плъхове и хипертоници в сравнение с нехипертензивни пациенти. Средното артериално кръвно налягане (BP) при плъхове SNX корелира добре с количеството на гломерулните C1q и C3c отлагания и с теглото на лявата камера, като индиректен параметър за високо BP. Количественият анализ на иРНК показа, че С3 не само се отлага, но също така активно се произвежда от гломерулни клетки на хипертензивни SNX плъхове и в човешки бъбречни биопсии. Трябва да се отбележи, че при пациенти стадият на ХБН корелира значително с интензивността на гломерулното оцветяване с C3c, но не и с това на C1q.

Заключение: Отлагането на бъбречен комплемент корелира с експериментална хипертония, както и с наличието на хипертония при различнибъбречназаболявания. За да се отговори на въпроса дали и как точно бъбречният комплемент е причинен за патогенезата на артериалната хипертония при мъжете, са необходими допълнителни изследвания.

Ключови думи:Бъбрек, отлагане на комплемент, хипертония,Бъбречназаболяване

Cistanche може да лекувабъбречназаболяване

Въведение

The complement system and its regulatory proteins are components of the innate immune system consisting of >20 разтворими фактора, играещи важна роля в (i) опсонизация, (ii) стимулиране на различни възпалителни пътища и (iii) осмотичен лизис на патогени и увредени клетки при множество заболявания, особено възпалителнибъбрекзаболяване[1]. Системата на комплемента се състои от 3 пътя: (i) класическият път, активиран от всяка структура, която се разпознава от C1q [2], (ii) лектиновият път, активиран, когато захаридните модели се разпознават от комплекси за разпознаване на образи [3], и (iii) алтернативният път, активиран чрез спонтанна хидролиза на C3 [4].

Последните 2 десетилетия засилиха познанията ни за системата на комплемента и нейната роля в патогенезата на различни системни ибъбречназаболяваниякато постинфекциозен гломерулонефрит (GN), IgA нефропатия (IgAN), лупусен нефрит (LN), мембранопролиферативен GN и C3 гломерулопатии [1, 5]. Важна роля на системата на комплемента и нейната дисфункция е известна и в патогенезата на тромботичните микроангиопатии, включително атипичния хемолитичен уремичен синдром [6], IgA васкулит (бивша пурпура на Henoch-Schönlein) [7] и злокачествена хипертония [8]. Докато патомеханизмите на тромботичната микроангиопатия вече са известни [6, 7], нашето познание за значението на системата на комплемента във връзка с хипертонията е все още сравнително неясно. По-голямата част от пациентите с ХБН имат повишено кръвно налягане (АН) [9], но точната патогенеза на хипертонията е неизвестна. Налични са няколко проучвания, описващи връзката между плазмения C3 и хипертонията [10, 11], докато друго проучване не може да потвърди тези наблюдения [12]. В модела на DOCA-солна хипертония при плъхове, гломерулното отлагане на C3 се увеличава при DOCA-солни плъхове и намалява от антихипертензивна терапия, тоест спиронолактон и тройна терапия с хидрохлоротиазид, резерпин и хидралазин [13]. Скорошни проучвания, използващи предклинични модели на хипертония, предполагат роля на комплемента в патогенезата на хипертонията [14], медиирана от различни имунни клетки като макрофаги и регулаторни Т-клетки (Tregs) [15–17] и активиране на системата ренин-ангиотензин, водеща до фенотипни промени в съдовите гладкомускулни клетки [18]. Подробната роля на отлагането на бъбречния комплемент в развитието на повишено BP все още е неясна. Следователно, в това проучване, ние изследвахме C1q, като продукт на разцепване на класическия, и C3c като общ маркер на всичките 3 пътя на активиране на комплемента в бъбречни биопсии от пациенти с хипертония и нормотензия, както и в установен модел на плъхове на претоварване и последващо хипертония чрез субтотална нефректомия (SNX).

Методи

Животински модел

За изследване на отлагане на бъбречен комплемент, бъбречно увреждане и сърдечни промени при животни с хипертония, ние използвахме модела на плъх, който се характеризира с гломерулна хиперфилтрация и претоварване поради намаляване на нефрона, фокална сегментна и глобална гломерулосклероза, тубулоинтерстициални белези и прогресираща ХБН със значително повишено BP. Плъховете бяха държани в специфично свободно от патогени съоръжение в среда с контролирана температура и светлина и имаха ad libitum достъп до стандартна храна (подушване Spezialdiäten GmbH, Soest, Германия) и вода. Плъховете са държани върху класическа постеля от трепетлика (подушване Spezialdiäten GmbH, Soest, Германия) в макролонови клетки тип IV (Tecniplast Deutschland GmbH, Hohenpeißenberg, Германия) с максимална популация от 3. За моделна индукция, 12 мъжки Dark Agouti (DA/ HanRj, Janvier, Le Genest-Saint-Isle, Франция) плъхове на възраст 12–14 седмици бяха SNX в протокол от 2 стъпки, започвайки с неинспирирана томия, последвана от стандартизирана по тегло резекция на горния и долния er полюс от останалия бъбрек 1 седмица по късно. За тази цел на животните се прилага Buprenovet (Bayer, Leverkusen, Германия) в доза 0.05 mg/kg телесно тегло подкожно преди операцията. След анестезия с изофлуран десният хълбок беше обръснат, дезинфекциран с тинктура KO-DAN forte (Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt, Германия), хълбокът беше отворен с 1,5 cm разрез и бъбрекът беше внимателно изваден и фиксиран с 2 стерилни тампони, последвани от лигиране на бъбречното кръвоснабдяване и уретера и отстраняване на бъбрека. Коремният разрез беше затворен с резорбируем шев и непрекъснат шев, както и кожата затворена с шевове с едно копче. Една седмица по-късно левият бъбрек беше изваден точно както е описано за десния бъбрек. След това бъбречната артерия беше захваната с атравматична скоба и горният и долният полюс на бъбрека бяха резектирани със скалпел и срязаната повърхност беше затворена с колагенова гъба (Resorba Medical GmbH, Nürnberg, Германия). Накрая останалият бъбрек се връща в първоначалното си положение и коремният разрез се затваря, както е описано по-горе. Постоперативната активност, приемът на течности, теглото, текстурата на козината и поведението на животните бяха оценени, но не показаха признаци на следоперативна болка. Въпреки това, аналгезията се поддържа поне повече от 3 дни след операцията. Контролите получиха фиктивна операция (фиктивно, n=11). В края на експеримента животните бяха настанени за 24 часа в метаболитни клетки за събиране на урина за измерване на протеинурия с помощта на Bio-Rad протеинов анализ (Bio-Rad Laboratories GmbH, Мюнхен, Германия). Адсорбцията се измерва в PBS-разредени проби от урина при 595 nm в четец на микроплаки и протеинурията се изчислява с помощта на стандартна крива от стандарти за говежди серумен албумин, вариращи от 0,15 до 2 mg (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). След 12 седмици плъховете бяха евтаназирани след интраартериално измерване на BP за 30 минути чрез вмъкване на катетър в A. carotid с помощта на AD instruments power lab system (ADInstruments Ltd., Oxford, UK). Накрая бъбреците и сърцата бяха събрани и разделени на 2 части, едната беше бързо замразена за РНК анализ, а втората част беше обработена за имунохистохимия. Беше събрана кръв за откриване на серумен креатинин с помощта на автоанализатор (Beck man Instruments, Brea, CA, USA).

Cistanche може да лекувабъбречна заболяване

Количествен иРНК анализ

Общата РНК от бъбреците на плъх се изолира с помощта на RNeasy Mini колони (Qiagen, Hilden, Германия). Реакциите на обратна транскрипция и PCR в реално време бяха извършени с помощта на Power SYBR Green на 7500 Fast Real-Time PCR система (и двете Applied Biosystems, Weiterstadt, Германия) съгласно инструкциите на производителя. PCR данните в реално време бяха анализирани с помощта на софтуера SDS v1.3 (Applied Biosystems) и относителната експресия на нивата на мРНК на целевия ген беше изчислена с помощта на сравнителния делта Ct метод [19]. Нормализацията беше проведена спрямо ендогенните нива на 18S rRNA, приложени към получените промени в относителната гънка. Използвани са следните праймери: 18 s (fw 5'TTGATTAAGTCCCTGC-CCTTTGT3'; rev 5'CGATCCGAGGGCCTCACTA3'); C3 (fw 5′ TGCGGCTGGAGAGTGAAG3′; rev 5′ TTACTGGCTGGAATC-TTGATGG3′) [20]; и C1qB (fw 5′TCATAGAACACGAGGAT TCCATACA3′; ревизия 5′GACCCAGTACAGCTGCTTTGG3′) [20].

Имунохистохимия

За имунохистохимични бъбречни биопсии или SNX и фалшив бъбрек на плъх, пробите се фиксират във формалин, поставят се в парафин и се нарязват на участъци от 1 μm и се оцветяват в оцветител Ventana Benchmark (Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Манхайм, Германия), като се използва следният протокол : извличането на антиген беше направено с използване на смилане с проназа Е за 40 минути при 37 градуса. След блокиране с Avidin-Biotin Block (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), нормален кози серум и блото (1:5) срезове се инкубират в продължение на 1 час при 37 градуса, като се използват следните антитела, разредени с 1% BSA в 50 mM Tris pH 7.4: C1q, заешко поликлонално антитяло срещу човешки C1q (A0126; DAKO Deutschland, Хамбург, Германия) и; C3c, заешко поликлонално антитяло срещу човешки C3c (A0062; DAKO Deutschland). След промиване с 50 mM Tris pH 7.4, свързаните първични антитела бяха открити с помощта на "ultra view Universal DAB Detection Kit" (Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Манхайм, Германия). Отрицателните контроли включват делеция или заместване на първичното антитяло с еквивалентни концентрации на нерелевантно мише моноклонално антитяло или преимунен заешки IgG.

Проби от човешка бъбречна тъкан

В първата стъпка неподбрана група от 308 последователни фиксирани във формалин парафин архивни биопсии на бъбрек (Катедра по нефропатология, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg [FAU]) беше анализирана за отлагане на бъбречен комплемент с помощта на имунохистохимия и сравняване на случаи с присъствие или липса на артериална хипертония според клиничните досиета, независимо от първичнатабъбречназаболяване. Включени са само биопсии от пациенти с хипертония и нехипертония с клинично добре документирано BP. В допълнение, 46 нулеви биопсии от алографти на бъбрек за трансплантация, дарени от нехипертензивни живи донори, послужиха като контроли.

Във втора стъпка се фокусирахме върху сравнението на избрани общи групи отбъбречназаболявания, а именно контроли (нулеви биопсии; n=46), IgAN (n=65), мембранен GN (MGN, n=18), LN (n=10), фокален сегментна гломерулосклероза (FSGS, n=17) и диабетна нефропатия (DN, n=28), което води до представителна подгрупа от 184 биопсии. В тази подгрупа е анализирана по-подробно връзката между артериалната хипертония и отлагането на комплемента в контекста на различни често срещани нефропатии. Основните характеристики на пациентите са описани в таблица 1.

Хистопатологична оценка

Диагностиката чрез бъбречна биопсия беше извършена от 3 много опитни, специализирани невропатолози по време на рутинна обработка с консенсусно обсъждане на всички двусмислени случаи (включително MBH и KA). Оценката на подробната морфология на човешки бъбречни биопсии беше извършена от един много опитен учен (CD), използвайки добре установен полуколичествен резултат за гломерулосклероза, резултат за тубулно увреждане и резултат за съдово увреждане (VSI) върху PAS-оцветени парафинови срезове, както е описано по-рано [21]. Интерстициалната фиброза/тубулна атрофия (IF/TA) се класифицира според класификацията на BANFF за биопсии на бъбречна трансплантация [22]

Оценка на ретроспекцията

Клинични данни Бяха събрани клинични параметри, които бяха налични по време на бъбречната биопсия. Следните параметри бяха включени за корелационен анализ с C1q- и C3c-резултати, локализация на комплемента и резултати от наранявания с помощта на софтуер SPSS: възраст на пациента, наличие или отсъствие на хипертония и диабет, протеинурия, серумен креатинин, серумна урея, серумен холестерол, серумен протеин и серумни фактори на комплемента C3 и C4. За съжаление, информация за продължителността набъбречназаболяванеand current medication was not consistently available and could therefore not be systematically analyzed. In renal patients, BP is measured regularly and particularly before performing a kidney biopsy. BP measurements and grading was done according to the KDIGO guidelines for renal patients [23]. Proteinuria was measured by analysis of a 24 h urine collection and significant proteinuria was defined as urinary protein excretion >300 mg/ден. В 2/3 от всички случаи протеинурията е дадена като g/24 h урина. Само някои пациенти са имали протеинурия, документирана чрез точкови измервания на урината, а за много малко пациенти няма налични данни за протеинурия. Тъй като стойностите на 24-часовата и спот протеинурия трудно могат да бъдат сравнени, ние включихме само пациенти с 24-часова колекция на урина за корелация на протеинурия с отлагане на комплемент. За да стандартизираме допълнително нашите констатации, ние също подразделихме пациентите според различни класове на ХБН, използвайки формулата на ХБН-EPI за изчисляване на GFR [24] и класовете на ХБН според класификацията на KDIGO 2012 [25].

Cistanche може да лекувабъбречна заболяване

Полуколичествена оценка на отлагането на комплемента в бъбречни биопсии

Оцветяването на комплемента чрез имунохистохимия в бъбречни биопсии се класифицира отделно в гломерулите и тубулоинтерстициалния компартмент. Полуколичествените резултати {{0}}–4 описват интензитета на наблюдаваните C3c или C1q в бъбречни биопсии при ×200 увеличение. Резултат 0 показва липса на отлагания, резултат 1: слабо оцветяване, засягащо до 25 процента от изследваното отделение. Резултат 2: умерено оцветяване, засягащо до 50 процента или силно оцветяване<25% of="" the="" compartment.="" score="" 3:="" substantial="" staining="" affecting="" up="" to="" 75%="" of="" the="" investigated="" compartment.="" score="" 4:="" highest="" staining="" intensity="" affecting="">75 процента от изследваното отделение.

C1q и C3 иРНК в човешки бъбречни биопсии

Данните за C1q и C3 в гломерулите и тубулоинтерстициума на човешки бъбречни биопсии с различни заболявания бяха оценени от базата данни Nephroseq, използвайки набора от данни за ХБН Ju [26].

Статистически анализи

След тестване за нормално разпределение на стойностите с помощта на теста на Колмогоров-Смирнов, данните бяха анализирани с помощта на теста на Mann-Whitney за сравнение на 2 групи и теста на Kruskal-Wallis с теста за множествено сравнение на Dunn като post hoc тест за сравнение на множество групи. Във всички тестове p < 0.05="" беше="" прието="" за="" статистически="" значимо.="" тестът="" на="" spearman="" беше="" използван="" за="" тестване="" на="" корелацията="" на="" отлагането="" на="" комплемента="" с="" резултатите="" от="" бъбречно="" увреждане="" и="" клиничните="" данни.="" статистическите="" анализи="" бяха="" извършени="" с="" помощта="" на="" spss="" за="" windows="" софтуер="" (версия="" 19.0="" spss,="" ibm,="" мюнхен,="" германия)="" или="" graphpad="" prism="" 8="" за="" windows="" софтуер="" (версия="" 8.3,="" graphpad="" software="" inc.,="" сан="" диего,="" калифорния,="">

Резултати

Отлагането на бъбречен комплемент C3c и C1q присъства в модел на стабилна ХБН при хипертоничен плъх и корелира с бъбречни и сърдечни промени

Отлагането на комплемента е изследвано в модел на ХБН при плъх с хипертония, т.е. субтотално нефректомирани (SNX) плъхове Dark Agouti, при които средното артериално BP 12 седмици след индукцията на модела е значително (p < 0.0="" 01)="" се="" е="" увеличил="" (175,7="" ±="" 21,0="" mm="" hg)="" в="" сравнение="" с="" фиктивно="" оперираните="" контроли="" (135,8="" ±="" 2,8="" mm="" hg)="" (фиг.="" 1a).="" протеинурията="" също="" е="" значително="" по-висока="" при="" snx="" в="" сравнение="" с="" фиктивно="" оперираните="" контроли="" (78,5="" ±="" 16,6="" срещу="" 8,9="" ±="" 0,8="" mg/24="" часа).="" този="" модел="" на="" претоварване="" на="" плъхове="" на="" хипертония="" и="" прогресивна="" бъбречна="" недостатъчност="" изглежда="" подходящ="" за="" изследване="" на="" свързаните="" с="" хипертонията="" промени="" в="" отлагането="" и="" експресията="" на="" бъбречния="" комплемент.="" отлагането="" на="" гломерулни="" c3c="" и="" c1q="" липсваше="" при="" нормотензивни,="" фиктивно="" оперирани="" контролни="" плъхове="" (фиг.="" 1b,="" c)="" и="" значително="" се="" увеличи="" при="" хипертензивни="" snx="" плъхове="" (фиг.="" 1d,="" e,="" g,="" h).="" при="" плъхове="" snx="" факторът="" c3c="" на="" комплемента="" не="" само="" се="" отлага="" в="" бъбречната="" тъкан,="" но="" също="" така="" значително="" се="" регулира="" нагоре="" на="" ниво="" mrna="" (фиг.="" 1f).="" бъбречната="" c1q="" mrna="" експресия="" показва="" тенденция="" към="" по-високи="" нива="" при="" snx="" плъхове="" в="" сравнение="" с="" контролите,="" но="" тази="" разлика="" не="" достига="" значимост="" (фиг.="" 1i).="" интересно="" е,="" че="" при="" плъхове="" както="" гломерулното="" отлагане="" на="" c3c,="" така="" и="" c1q="" корелира="" силно="" със="" средното="" артериално="" bp="" (фиг.="" 2a,="" d)="" и="" сърдечната="" хипертрофия,="" оценено="" чрез="" теглото="" на="" lv="" (фиг.="" 2b,="" e).="" освен="" това,="" в="" модела="" snx,="" отлагането="" на="" бъбречен="" комплемент="" е="" свързано="" с="" увреждане="" на="" бъбреците,="" както="" и="" с="" бъбречната="" функция.="" гломерулният="" c3c,="" както="" и="" отлагането="" на="" c1q,="" показват="" силна="" корелация="" със="" серумния="" креатинин="" (фиг.="" 2c,="" f)="" и="" протеинурията="" (фиг.="" 2g,="" h).="" корелацията="" както="" на="" серумния="" креатинин,="" така="" и="" на="" протеинурията="" с="" комплемента="" не="" е="" изненадваща,="" тъй="" като="" и="" двата="" параметъра="" също="" показват="" силна="" корелация="" един="" с="" друг="" в="" този="" модел="" на="" плъх="" (фиг.="" 2i).="" по="" този="" начин,="" нашите="" данни="" при="" плъх="" модел="" на="" хипертонична="" хбн="" поради="" намаляване="" на="" бъбречната="" маса="" и="" претоварване="" предполагат="" връзка="" между="" отлагане="" на="" бъбречен="" комплемент="" и="" хипертония.="" следователно,="" ние="" имахме="" за="" цел="" да="" потвърдим="" тези="" констатации="" в="" човешка="" кохорта="" от="" пациенти="" с="" хипертония="" срещу="" нормотензия,="" при="" които="" е="" извършена="" бъбречна="" биопсия="" по="" различни="">

Отлагането на комплемента е независимо от основното бъбречно заболяване

Тук използвахме подход от 2 стъпки: първо, включихме всички пациенти с отчетена стойност на BP, независимо от основнотобъбрекзаболяване(n=308, вижте таблица 1 за подробности). Трябва да се отбележи, че 217 от 308 пациенти (70,5 процента) са докладвани с хипертония. Второ, за по-нататъшен анализ се съсредоточихме върху подгрупи на най-разпространените форми на GN, т.е. IgAN, MGN и LN, и 2 неимунокомплексно медииранибъбречназаболяванияа именно DN и фокална сегментна гломерулосклероза (FSGS). 46 нулеви биопсии от алографти на бъбрек за трансплантация, дарени от нормотензивни живи донори, послужиха като контролна група (виж Таблица 1).

За да се изследва потенциалната връзка между хипертонията и бъбречния комплемент, отлагането на C1q и C3c в гломерулния и тубулоинтерстициалния компартмент се анализира чрез полуколичествено оценяване на имунохистологични оцветявания. Количеството и интензитетът на оцветяването с C1q и C3c варират значително в изследваните биопсии (за подробности вижте Фиг. 3). В тубулоинтерстициалния компартмент C3c се отлага по протежение на тубулните базални мембрани и в интерстициалния матрикс (Фиг. 3G), докато оцветяването с C1q обикновено е слабо и ограничено до интерстициума (Фиг. 3H).

Гломерулното отлагане на C3c е повишено при многобъбречназаболявания, включително IgAN, MGN, LN и FSGS, в сравнение с нормотензивни нулеви биопсии (фиг. 4А). Като цяло гломерулното отлагане на C1q е по-слабо от гломерулното C3c. Беше значително увеличен при IgAN, MGN, LN и DN, но не и FSGS в сравнение с контролите с нулева биопсия (фиг. 4B). Интересното е, че комплементът C3 и C1q не само се отлагат в болни бъбреци, но и местната бъбречна експресия на иРНК също се повишава. Данните от Nephroseq показват, че както C3, така и C1q mRNA експресията е значително повишена в IgAN, LN, DN и FSGS в сравнение с контролната група, тоест здрави живи донори (фиг. 4C, D). Експресията на C1q mRNA е по-ниска от експресията на C3. Тубулоинтерстициалното отлагане на C3c също е повишено в сравнение с нулеви биопсии в повечето случаибъбречназаболявания(Фиг. 4E), докато C1q не се различава значително от контролите с нулева биопсия (данните не са показани). В обобщение, изразеното отлагане на комплемент в бъбреците е често срещана находка при различнибъбрекзаболявания. След това изследвахме потенциалното значение на високото BP върху отлагането на бъбречен комплемент.

Фиг. 3. Отлагане на C3c и C1q в бъбречни биопсии. Човешки бъбречни биопсии бяха оцветени за C3c (A, C, E, G) и C1q (B, D, F, H), използвайки имунохистохимия (кафяво оцветяване). Представителни снимки на гломерулно и тубулоинтерстициално отлагане на C3c и C1q показват примери за различни резултати на отлагане на комплемента. Няма оцветяване за C3c при нулеви биопсии (A) и C1q при остра тубулна некроза (B). Примери за гломерулно отлагане на C3c при хипертонична/исхемична НП, резултат 1 (C) и C1q отлагане в клас II LN, резултат 2 (D). По-забележимо отлагане на C3c в IgAN, резултат 4 (E) и отлагане на C1q, резултат 4, в друг случай на клас II LN (F). Отлагане в тубулоинтерстициалния компартмент на C3c при интерстициален нефрит, оценка 4 (G) и отлагане на C1q, оценка 4 (H) в случай на постинфекциозен ГН. Скалите представляват 100 µm. LN, лупусен нефрит; GN, гломерулонефрит.

Фиг. 4. Отлагане и експресия на бъбречен комплемент в различнибъбрекзаболявания. Полуколичествен анализ на гломерулно C3c (A) и C1q оцветяване (B) в избранибъбречназаболявания. IgAN, MGN, LN, DN, FSGS и биопсии от трансплантирани бъбречни алографти, дарени от нехипертензивни донори (0-биопсия) послужиха като контроли. Данните от базата данни Nephroseq показват гломерулна C3c (C) и C1q (D) mRNA експресия в различнибъбречназаболяванияи съответната контролна група, тоест HLD. В тубулоинтерстициалния компартмент основно C3c (E) се открива в бъбречни биопсии от пациенти с различни заболявания. Значимите разлики са маркирани със звездички: *p < 0.05;="" **p="">< 0.01="" и="" ***p="">< 0.001="" показват="" значителни="" разлики="" спрямо="" нулеви="" биопсии.="" gn,="" гломерулонефрит;="" mgn,="" мембранен="" gn;="" ln,="" лупусен="" нефрит;="" fsgs,="" фокална="" сегментна="" гломерулосклероза;="" dn,="" диабетна="" нефропатия;="" hld,="" донор="" на="" здрав="" живот;="" igan,="" iga="">

Отлагането на C3c и C1q в бъбреците е значително повишено при пациенти с хипертония в сравнение с нормотензивни пациенти

За да проучим дали наличието на високо АН при пациенти е свързано с отлагане на комплемент в бъбреците, ние анализирахме биопсии от нормотензивни и хипертонични пациенти с различни подлежащибъбрекзаболяванияи ги сравнява с отлагане на комплемент в нулеви биопсии от трансплантирани бъбречни алографти, дарени от нехипертензивни донори (нулеви биопсии). При IgAN, най-разпространеният GN в нашия регион [27], само биопсии от пациенти с хипертония имат значително по-високи гломерулни (фиг. 5A) и тубулоинтерстициални C3c (фиг. 5C), както и гломерулни отлагания на C1q (фиг. 5E), в сравнение с нулеви биопсии. Когато сравнихме C3c (фиг. 5B, D) и C1q отлагане (фиг. 5F) в бъбречни биопсии от цялата кохорта, както нормотензивните, така и хипертоничните проби показаха значително повишена реактивност в сравнение с контролите. Освен това, в биопсии на гломерулни и тубулоинтерстициални пациенти с хипертония, C3c е значително по-висок от нормотензивни пациенти (фиг. 5B, D). Тъй като тубулното отлагане на C1q беше ниско във всички изследвани биопсии, ние не наблюдавахме никакви разлики между групите нито в IgAN (фиг. 5G), нито в анализа на всички изследвани случаи (фиг. 5H). Следователно нашите данни предполагат, че по-специално отлагането на C3c изглежда е от значение при хипертониябъбречназаболявания.

Фиг. 5. Отлагане на бъбречен комплемент в бъбречни биопсии от пациенти с хипертония и нормотензия. Отлагането на C3c беше анализирано в биопсии от пациенти с IgAN (A, C) и всички изследвани биопсии сбъбречназаболявания(B, D), разделени при пациенти с нормално BP и високо BP в сравнение с биопсии от трансплантирани бъбречни алографти, дарени от нехипертензивни донори (нулеви биопсии) като контроли в гломерулното (A, B) и тубулоинтерстициалното (C, D) отделение. По подобен начин, отлагането на C1q също беше анализирано в биопсии от пациенти с IgAN (E, G) и всички изследвани биопсии сбъбрекзаболявания(F, H) в гломерулния (E, F) и тубулоинтерстициалния (G, H) отдел. Съществените разлики са маркирани със звездички: *p < {{0}}.05;="" **p=""><0,01 и="" ***p=""><0,001 показват="" значителни="" разлики.="" bp,="" кръвно="">

Отлагането на бъбречен комплемент е свързано с увреждане и функция на бъбреците

Оценката на хистопатологичните промени, оценени чрез гломерулосклероза (Фиг. 6A), оценка на тубулоинтерстициалното увреждане (Фиг. 6B) и VSI (Фиг. 6C), показва значително по-високо бъбречно увреждане при биопсии от пациенти с документирана хипертония, отколкото пациенти с нормално кръвно налягане. Степента на гломерулно отлагане на C3c корелира положително с гломерулосклероза (фиг. 6D) и тубулоинтерстициален C3c с тубулоинтерстициално увреждане (фиг. 6E) и VSI (фиг. 6F), което показва, че отлагането на комплемента е свързано с хронично бъбречно увреждане. В допълнение, интерстициалната фиброза/тубулна атрофия (IF/TA) е значително по-висока при бъбречни биопсии на пациенти с хипертония (Фигура 6G) и корелира добре със степента на тубулно отлагане на C3c (Фигура 6J). Бъбречната функция, оценена чрез серумен креатинин, също е значително по-ниска при пациенти с хипертония (Фиг. 6H) и корелира с гломерулното отлагане на C3c (Фиг. 6K). Не е открита значима разлика между нормотензивни и хипертензивни пациенти по отношение на протеинурията (фиг. 6I). Имаше обаче слаба корелация между протеинурията и гломерулния C3c (r=0.238; p=0.008; Фиг. 6L). Тези резултати потвърждават връзката между бъбречно увреждане, функция, отлагане на комплемент и хипертония.

И накрая, ние изследвахме степента, до която отлагането на комплемента зависи от стадия на ХБН. Както се очаква, средната възраст на пациентите се увеличава с по-висок стадий на ХБН (фиг. 7А). Обратно, делът на пациентите с хипертония не зависи от стадия на ХБН (фиг. 7B), което потвърждава нашите горни открития. Гломерулният (Фигура 7C) и тубуларният C3c (Фигура 7D) са значително по-ниски при ХБН етапи 1 и 2, отколкото по-високите стадии на ХБН, докато не се наблюдава такава връзка за C1q (Фигура 7E, F).

Фиг. 6. Бъбречно отлагане на комплемент в човешки биопсии, свързано с бъбречно увреждане и функция. Бъбречното увреждане, оценено чрез GSI (A), TSI (B) и VSI (C), е значително увеличено при пациенти с високо BP и GSI, корелирани с гломерулно отлагане на C3c (D), TSI, корелирано с тубулоинтерстициален C3c (E) и VSI корелира с тубулоинтерстициален C3c (F). IF/TA (G) и серумният креатинин (H) са повишени при пациенти с хипертония, докато протеинурията е сходна и в двете групи (I). Тубуларният C3c корелира с IF/TA (J) и гломеруларният C3c със серумен креатинин (K) и в по-слаба степен гломеруларен C3c с протеинурия (L). Значимите разлики са маркирани със звездички: **p < 0.01="" и="" ***p="">< 0,001="" показват="" значителни="" разлики="" между="" пациенти="" с="" нормално="" ан="" и="" високо="" ан="" или="" значителни="" корелации.="" bp,="" кръвно="" налягане;="" gsi,="" гломерулосклероза;="" tsi,="" тубулоинтерстициално="" увреждане;="" vsi,="" съдово="" увреждане;="" if/ta,="" интерстициална="" фиброза/тубулна="">

Фигура 7. Бъбречно отлагане на C3 в човешки биопсии, но не и хипертония, корелира със стадия на ХБН. Средната възраст на пациентите с ХБН нараства с нарастване на ХБН стадий (А), докато процентът на пациентите с хипертония не е свързан с ХБН стадий (В). C3c (C, D), но не и C1q (E, F), корелира добре с различни стадии на ХБН. Гломеруларен C3c (C), тубуларен C3c (D), гломеруларен C1q (E) и тубуларен C1q (F). Значимите разлики са маркирани със звездички: *p < 0.{{10}}5;="" **р=""><0,01; и="" ***p=""><0.001 показват="" значителни="" разлики="" между="" групите,="" свързани="" със="">

Дискусия

Прогресия набъбречназаболяване, особено тубулоинтерстициалното увреждане, е показано, че се медиира, поне отчасти, от активиране на комплемента [28], но ролята на отлагането на комплемента при хипертония и бъбречно увреждане все още е неясна. В нашето проучване открихме повишено отлагане на фактори на комплемента в бъбреците, особено на C3c, което силно корелира с повишено увреждане на бъбреците и по-ниска бъбречна функция. Освен това много честобъбрекзаболяванесе свързва с появата на хипертония, която сама по себе си е свързана с повишен риск от сърдечно-съдови заболявания и прогресия на ХБН [9]. Тук показахме по-високо бъбречно отлагане на продукти на разцепване на комплемента C1q, като маркер на класическия път на активиране, и C3c, компонент на всичките 3 пътя на активиране, в бъбреците от пациенти с хипертония с различнибъбречназаболяванияотколкото нормотензивни пациенти. Има някои доказателства, че комплементът играе важна роля в развитието и влошаването на хипертонията, но ролята на отлагането на комплемент в бъбреците в този процес е неизвестна. В човешки бъбречни биопсии и нашия модел на плъх с хипертонично претоварване стана ясно, че C3c се открива по-често от C1q, което предполага, че класическият път не е изключително отговорен за активирането на комплемента вбъбречна заболяване. Въпреки това беше установено, че C1q е критично включен в хипертоничното артериално ремоделиране чрез активиране на -катенин сигнализация [29]. Въпросът дали комплементът индуцира хипертония или хипертонията активира комплемента остава неясен до момента. В това проучване наблюдавахме силна корелация на отлагането на бъбречен комплемент, особено на фактор C3c, със степента на бъбречно увреждане и функция. Най-вероятно хипертонията води до по-нататъшно активиране на системата на комплемента, но има някои доклади, подкрепящи хипотезата, че комплементът е не само вторичен, но и причинен за хипертонията. В лонгитудинално проучване с проследяване от 15 години, честотата на хипертонията е значително по-висока при пациенти с повишени плазмени нива на комплемент С3 на изходно ниво, което предполага роля на плазмения С3 в патогенезата на хипертонията [10]. В допълнение, пациентите с резистентна на терапия артериална хипертония имат значително по-високи плазмени нива на C3 в сравнение с пациенти с контролирана хипертония [11]. За разлика от това, в популационно кохортно проучване, повишеният плазмен C3 се свързва с повишена честота на първата хоспитализация поради ХБН, но независимо от BP [12]. Въпреки това, последното проучване беше ограничено до изследване на плазмените нива на С3, докато локалната експресия на фактори на комплемента и активирането на комплемента не бяха изследвани. Продуктите на C3 разцепване, т.е. C3c, не само бяха пасивно отложени, но C3 mRNA също беше локално експресирана в болни бъбреци от пациенти с хипертония и SNX плъхове. Ние обаче не определихме източника на бъбречен C3, но има съобщения, че освен в черния дроб, по-голямата част от C3 mRNA се експресира в моноцити и макрофаги [30]. Освен това се съобщава също, че фибробластите, епителните и ендотелните клетки са потенциални екстрахепатални C3-източници [31]. Активиране на комплемента също се наблюдава при модел на индуцирана от ангиотензин II хипертония при мишки. При плъхове със спонтанна хипертония дефицитът на С3 може да премахне чувствителната към сол хипертония [18], което показва, че С3 е критично включен в пътищата, предизвикващи хипертония. Въпреки това, тези ефекти могат също да бъдат медиирани по-надолу по веригата в каскадата на комплемента. Използвайки мишки с дефицит на C5a рецептор (C5aR), Zhang et al. [32] демонстрира, че C5aR-сигнализирането играе патологична роля при сърдечно възпаление и ремоделиране. Въпреки че инхибирането на C5aR не повлиява повишеното BP, индуцирано от ангиотензин II, сърдечните увреждания, оценени чрез сърдечна хипертрофия, възпаление и периваскуларна фиброза, могат да бъдат намалени [33]. В нашия модел на хипертония при плъх SNX ние потвърдихме, че отлагането на бъбречен комплемент корелира добре с бъбречно увреждане, но също и със сърдечна хипертрофия и BP. Индуцираната от комплемента хипертония се медиира чрез комплементни рецептори за C3a и C5a. Регулаторните Tregs могат да инхибират активирането на ефекторните Tregs и упражняват противовъзпалителни ефекти. В индуцирания от ангиотензин II модел на хипертония, Tregs е доказано, че е важен модулатор на BP и предотвратяване на увреждане на крайните органи [15, 34]. Лечението с ангиотензин II стимулира експресията на C3a и C5a рецептор върху Tregs, което води до намален брой Tregs при мишки от див тип, но не и при мишки с двоен нокаут на C3a и C5a рецептор [35]. В допълнение, тези двойно нокаутирани мишки развиват притъпена хипертония и по-малко бъбречна фиброза и гломерулно увреждане [35]. Асоциацията на активирането на комплемента и гломерулното увреждане и бъбречната фиброза, оценена чрез гломерулосклероза и IF/TA, също беше потвърдена в нашето изследване с биопсия. Механично повишаването на АН се индуцира от C3-медиирано активиране на системата ренин-ангиотензин в гладкомускулните клетки на съдовете с молекули надолу по веригата като TGF-ß/PDGF-A и чрез промяна на фенотипа на мезенхимните клетки и индуциране на епителни -към-мезенхимален преход [31]. Сигнализирането на комплемента също е насочено към други хипертонични заболявания. При нормална бременност е налице активиране на комплемента, но е прекомерно при хипертонични разстройства на бременността и генетичните полиморфизми на комплементните протеини изглежда предразполагат към прееклампсия [36]. Инхибирането на сигнализирането на комплемента чрез лечение с разтворим рецептор на комплемента 1 води до атенюирана хипертония в модел на плацентарна исхемия на прееклампсия [37].

Ограничения на изследването

Въпреки че се опитахме да подсилим нашите открития в човешки бъбречни биопсии на различнибъбречназаболяваниясъс и без артериална хипертония чрез включването на подходящ животински модел за доказване на връзка между отлагането на комплемента в бъбречната тъкан и хипертонията, трябва да признаем няколко ограничения и пристрастия при селекцията. В изследването при хора се сблъскваме с ограничението на променлива кохорта с множество различни объркващи фактори, които не могат да бъдат ясно идентифицирани или изключени. За да разгледаме този аспект и да хармонизираме проучвателната група, ние също анализирахме корелацията на комплемента с бъбречната фиброза (IF/TA) като сурогатен маркер за загуба на нефрон и прогресия на подлежащатабъбречназаболяванекакто и със стадии на ХБН, където бихме могли да покажем подобни находки. Освен това данните за продължителността на съответните заболявания или текущото медицинско лечение не са систематично налични, оставяйки тези аспекти като друг потенциален объркващ фактор, който трябва да споменем. Тъй като ние официално изключихме тези няколко пациенти без клинично добре документирано BP, вероятно е тези пациенти да нямат хипертония или да имат контролирана хипертония до такава степен, че да стигнат до редовно проследяване, което потенциално може да причини пристрастност при избора. За разлика от експеримента с животни в нашата човешка кохорта, протеинурията по време на бъбречната биопсия не е докладвана последователно за всички пациенти, така че можем да включим само 2/3 от всички пациенти за съответните анализи, което може да повлияе на някои от резултатите. Трябва да се отбележи, че протеинурията не е значително по-висока при бъбречни пациенти със и без високо АН, което прави малко вероятно значително отклонение на протеинурията.

Заключение

Взети заедно, нашето проучване подчертава силна връзка на отлагането на комплемента с хипертонията, но също така и бъбречно увреждане при хора и експерименталнибъбречназаболяване. Въпреки че не можахме да отговорим на въпроса дали отлагането на комплемента е причина за развитието на хипертония, данните подкрепят участието на активирането на комплемента в патогенезата или прогресията на хипертонията при различнибъбрек заболявания, което предполага потенциална роля за стратегии за инхибиране на комплемента за бъдещо управление на рефрактерни на терапия случаи на хипертония ибъбречназаболяване. Въпреки това са необходими допълнителни изследвания, за да се определи точната роля на комплемента в патогенезата на хипертоничните заболявания.

Cistanche може да лекувабъбречно заболяване

От: „Допълнете вБъбречнаболесткато потенциален фактор за артериална хипертония“ отЛиза-Марен Фишер и др

---Бъбречна кръвна преса Res 2021; 46: 362–376

Препратки

1 Couser WG. Основни и преводни концепции за имуномедиирани гломерулни заболявания. J Am Soc Nephrol. 2012 март;23(3):381–99.

2 Kojouharova M, Reid K, Gadjeva M. Нови прозрения за молекулярните механизми на класическото активиране на комплемента. Mol Immunol. 2010 август;47(13):2154–60.

3 Dobo J, Pal G, Cervenak L, Gal P. Нововъзникващите роли на маноза-свързващи лектин-асоциирани серинови протеази (MASPs) в лектиновия път на комплемента и извън него. Immunol Rev. 2016 ноември; 274 (1): 98–111.

4 Pangburn MK, Schreiber RD, Muller-Eber hard HJ. Образуване на началната C3 конвертаза на алтернативния път на комплемента. Придобиване на C3b-подобни активности чрез спонтанна хидролиза на предполагаемия тиоестер в естествения C3. J Exp Med. 1981 г. 1 септември; 154 (3): 856–67.

5 Ricklin D, Hajishengallis G, Yang K, Lambris JD. Допълнение: ключова система за имунен надзор и хомеостаза. Nat Immunol. 2010 септември; 11 (9): 785–97.

6 Nozal P, Lopez-Trascasa M. Автоантитела срещу алтернативни протеини на пътя на комплемента при бъбречни патологии. Нефрология. 2016 септември-октомври;36(5):489–95. 7 Lau KK, Suzuki H, Novak J, Wyatt RJ. Патогенезис на пурпурен фрит на Henoch-Schönlein. Педиатр Нефрол. 2010 януари;25(1):19–26.

8 Wenzel U, Turner JE, Krebs C, Kurts C, Har rison DG, Ehmke H. Имунни механизми при артериална хипертония. J Am Soc Nephrol. 2016 март;27(3):677–86.

9 Drawz PE, Beddhu S, Kramer HJ, Rakotz M, Rocco MV, Whelton PK. Измерване на кръвното налягане: гледна точка на KDOQI. Am J Kidney Dis. 2020 март;75(3):426–34.

10 Engstrom G, Hedblad B, Berglund G, Janzon L, Lindgarde F. Плазмените нива на комплемента C3 са свързани с развитието на хипертония: надлъжно кохортно проучване. J Hum Hypertens. 2007 април;21(4):276–82.

11 Magen E, Mishal J, Paskin J, Glick Z, Yosefy C, Kidon M, et al. Резистентната артериална хипертония е свързана с по-високи кръвни нива на комплемент С3 и С-реактивен протеин. J Clin Hypertens. 2008 септември; 10 (9): 677–83.

12 Bao X, Borne Y, Muhammad IF, Schulz CA, Persson M, Orho-Melander M, et al. Допълнете C3 и инцидентна хоспитализация поради хроничнабъбрекзаболяване: кохортно проучване, базирано на населението. BMC Nephrol. 21 февруари 2019 г.; 20(1):61.

13 Klanke B, Cordasic N, Hartner A, Schmieder RE, Veelken R, Hilgers KF. Кръвно налягане срещу директни минералкортикоидни ефекти върху бъбречно възпаление и фиброза при DOCA-солна хипертония. Трансплантация на Nephrol Dial. 2008 ноември; 23 (11): 3456–63.

14 Chen L, Fukuda N, Shimizu S, Kobayashi H, Tanaka S, Nakamura Y, et al. Роля на комплемент 3 в генерирането на ренин по време на диференциацията на мезенхимни стволови клетки до гладкомускулни клетки. Am J Physiol Cell Physiol. 1 май 2020 г.; 318 (5): C981–C990.

15 Kvakan H, Kleinewietfeld M, Qadri F, Park JK, Fischer R, Schwarz I, et al. Регулаторните Т клетки подобряват индуцираното от ангиотензин II увреждане на автомобила. Тираж. 2009 9 юни; 119 (22): 2904–12.

16 Ruan CC, Ge Q, Li Y, Li XD, Chen DR, Ji KD и др. Медиираната от комплемента макрофагова поляризация в периваскуларната мастна тъкан допринася за съдово увреждане при мишки с дезоксикортикостерон ацетат-сол. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2015 март;35(3):598–606.

17 Карни Е.Ф. Хипертония: роля на C3aR и C5aR в Treg клетки. Nat Rev Nephrol. 2018 април; 14(4):214.

18 Негиши Е, Фукуда Н, Оцуки Т, Катакава М, Комацу К, Чен Л и др. Участие на комплемент 3 в сол-чувствителна хипертония чрез активиране на бъбречната система ренин-ангиотензин при спонтанно хипертензивни плъхове. Am J Physiol Renal Physiol. 1 декември 2018 г.; 315 (6): F1747–F1758.

19 Dimmler A, Haas CS, Cho S, Hattler M, Forster C, Peters H, et al. Микродисекция с лазерно улавяне и PCR в реално време за анализ на експресия на ген на гломерулен ендотелин-1 при мезангиолиза на плъши анти-Thy 1.1 и гломерулонефрит от Habu от змийска отрова при мишки. Диагноза Мол Патол. 2003 юни; 12 (2): 108–17.

20 Diez M, Abdelmagid N, Harnesk K, Strom M, Lidman O, Swanberg M, et al. Идентифициране на генни региони, регулиращи възпалителен микроглиален отговор в ЦНС на плъх след увреждане на нерв. J Neuroimmunol. 2009 25 юли; 212 (1– 2): 82–92.

21 Hainz N, Thomas S, Neubert K, Meister S, Benz K, Rauh M, et al. Протеазомният инхибитор бортезомиб предотвратява лупусния нефрит в модела на мишка NZB/W F1 чрез запазване на гломерулната и тубулоинтерстициалната архитектура. Нефрон Експ Нефрол. 2012 г.; 120(2):e47–58.

22 Solez K, Racusen LC. Класификацията на Банф е преразгледана. Kidney Int. 2013 февруари; 83 (2): 201–6.

23 Насоки за клинична практика на KDIGO за управление на кръвното налягане при хроничнибъбрекзаболяване. Kidney Int Suppl. 2012 декември; 2(5):343.

24 Levey AS, Stevens LA, Schmid CH, Zhang YL, Castro AF 3rd, Feldman HI, et al. Ново уравнение за оценка на скоростта на гломерулна филтрация. Ann Intern Med. 5 май 2009 г.; 150 (9): 604–12.

25 Група KCW. Насоки за клинична практика на KDIGO 2012 за оценка и управление на хроничнибъбрекзаболяване. Kidney Int Suppl. 2013; 3: 1–150.

26 Ju W, Greene CS, Eichinger F, Nair V, Hodgin JB, Bitzer M, et al. Определяне на специфичността на клетъчния тип на транскрипционно ниво при човешко заболяване. Genome Res. 2013 ноември; 23 (11): 1862–73.

27 Barratt J, Feehally J, Smith AC. Патогенеза на IgA нефропатия. Семин Нефрол. 2004 май; 24 (3): 197–217.

28 Hsu SI, Couser WG. Хронична прогресия на тубулоинтерстициално увреждане при протеинуриябъбречназаболяванесе медиира от активиране на комплемента: терапевтична роля за инхибиторите на комплемента? J Am Soc Nephrol. 2003 юли; 14 (7 допълнение 2): S186–91.

29 Sumida T, Naito AT, Nomura S, Nakagawa A, Higo T, Hashimoto A, et al. Индуцираното от комплемент C1q активиране на -катенин сигнализация причинява хипертонично артериално ремоделиране. Nat Commun. 2015; 6: 6241.

30 de Bruijn MH, Fey GH. Компонент на човешки комплемент C3: cDNA кодираща последователност и получена първична структура. Proc Natl Acad Sci US A. 1985 февруари;82(3):708–12.

31 Chen L, Fukuda N, Matsumoto T, Abe M. Роля на комплемент 3 в патогенезата на хипертонията. Hypertens Res. 2020 април; 43 (4): 255–62.

32 Zhang C, Li Y, Wang C, Wu Y, Cui W, Miwa T и др. Рецепторът на комплемент 5а медиира индуцираното от ангиотензин II сърдечно възпаление и ремоделиране. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2014 юни;34(6):1240–8.

33 Zhang C, Li Y, Wang C, Wu Y, Du J. Антагонистът на C5aR предотвратява сърдечното ремоделиране при индуцирана от ангиотензин II хипертония. Am J Hypertens. 2014 юни; 27 (6): 857–64.

34 Barhoumi T, Kasal DA, Li MW, Shbat L, Lau rant P, Neves MF, et al. Т регулаторните лимфоцити предотвратяват индуцирана от ангиотензин II хипертония и съдово увреждане. Хипертония. 2011 март;57(3):469–76.

35 Chen XH, Ruan CC, Ge Q, Ma Y, Xu JZ, Zhang ZB и др. Дефицитът на комплемент C3a и C5a рецепторите предотвратява индуцираната от ангиотензин II хипертония чрез регулаторни Т клетки. Circ Res. 2018 30 март; 122 (7): 970–83.

36 Regal JF, Burwick RM, Fleming SD. Системата на комплемента и прееклампсия. Curr Hypertens Rep. 2017 октомври 18;19(11):87.

37 Regal JF, Lund JM, Wing CR, Root KM, Mc Cutcheon L, Bemis LT и др. Взаимодействия между системите на комплемента и ендотелина при нормална бременност и след плацентарна исхемия. Mol Immunol. 2019 октомври; 114: 10–8.