Мелатонинът предотвратява инфилтрацията на Т-лимфоцитите в бъбреците на плъхове с хипертония, предизвикана от диета с високо съдържание на сол, чрез предотвратяване на експресията на CXCR3 лигандни хемокини

За повече информация:ali.ma@wecistanche.com

Ариел Биер¹, Раван Хашаб², Йехонатан Шараби^1,2,3, Ехуд Гросман^1,2,3и Авшалом Лейбовиц^1,2,3,*

¹Medicine D, Медицински център Хаим Шеба, Tel-Hashomer 5262000, Израел; arielbier@gmail.com (AB);Yehonatan.Sharabi@sheba.health.gov.il (YS); Ehud.Grossman@sheba.health.gov.il (EG)² Hypertension Unit, the Chaim Sheba Medical Center, Tel-Hashomer 5262000, Israel;rawankhasbab@gmail.com³Медицински факултет Sackler, Тел-Авивски университет, Тел-Авив 6997801, Израел*

Резюме: В предишно проучване ние демонстрирахме товамелатонинпредотвратявабъбрекувреждане в модел на индуцирана от сол хипертония чрез намаляване на оксидативния стрес. Ние предположихме, че този ефект включва имуномодулиращите свойства на мелатонина. Проучване in vivo - Дал, чувствителни към сол (DSS) плъхове са хранени с нормална храна, диета с високо съдържание на сол (HSD) или HSD имелатонин(30 mg/kg/ден) във водата им за четири седмици.Бъбрецибяха събрани за незабавно изолиране на лимфоцити и характеризиране чрез поточна цитометрия (CD3 плюс CD4 плюс и CD3 плюс CD8 плюс) и за лимфоцитен хемоатрактант (основно CXCLхемокини) изследвания на генната експресия. In vitro проучване-плъх, мезангиални клетки (RMC) се култивират в среда с високо съдържание на сол без и смелатонин. HSD се свързва със значителна реналинфилтрация на CD4 плюс и CD8 плюс Т лимфоцити в сравнение с контролата. Мелатонинът значително намалява бъбречната лимфоцитна инфилтрация. HSD значително повишава експресията на mRNA на CXCLхемокиниДобавянето на мелатонин към HSD премахна този ефект. Третирането на RMC клетки със сол повишава експресията на CXCL10 и CXCL11, но не и на CXCL9. Добавянемелатонинна културните медии предотврати това увеличение. Третирането на плъхове, хранени с HSD, с мелатонин намалява експресията на хемоатрактантна тРНК на бъбречните лимфоцити и се свързва със значително намаляване на инфилтрацията на бъбречните Т лимфоцити. Солта може да има директен ефект върху произвеждащите хемокин бъбречни клетки, който се притъпява от лечението с мелатонин.

Ключови думи:мелатонин; сол; Т-лимфоцити; хипертония;бъбрек; CXCL 9; CXCL 10; CXCL 11

1. Въведение

Хипертонията (HTN) е водещ модифицируем сърдечно-съдов рисков фактор. Поради застаряването на населението, разпространението на HTN непрекъснато нараства, достигайки до 30 процента при напреднали [1]. Въпреки различните медицински терапевтични възможности, контролът на HTN в световен мащаб е слаб. Последствията от неконтролираната HTN са опустошителни, създавайки огромно отрицателно въздействие върху общественото здраве [2].

Различни поведенчески, екологични и генетични фактори участват в патогенезата на HTN. Високото съдържание на сол в западните диети е замесено като основен фактор за HTN и е свързано с повишена заболеваемост и смъртност. Насоки и публични инициативи препоръчват намаляване на приема на сол за общото население. Въпреки това, не всеки индивид може да се възползва от това ограничение, тъй като патофизиологията, свързваща чувствителността към солта с HTN, не е напълно разбрана и се нуждае от подобрено механично разбиране [3]. По този начин новите стратегии са от решаващо значение за по-доброто разбиране и контрол на HTN, което прави новите изследователски парадигми незабавна необходимост.

Установено е, че възпалението и оксидативният стрес участват в патогенезата на основната HTN. Докато се изследват тригерите, иницииращи и продължаващи тези процеси, много експериментални модели на HTN предполагат участието на адаптивния имунен отговор [4].

Кликнете, за даCistanche ползи и странични ефекти за бъбречната функция

Улики, свързващи адаптивния имунитет с HTN, вече съществуват от 1960 г. Въпреки това, едва напоследък, с по-добро разбиране на имунната система, може да се постигне напредък в тази посока. Пионерско проучване на Guzik et al. демонстрира, че ангиотензин (Ang) II или дезоксикортикостеронова (DOC) сол HTN е притъпен в rag1−/−мишки, които са с дефицит на Т и В лимфоцити, и адоптивният трансфер на Т, но не и на В клетки, може да възстанови BP отговора [5]. След този документ беше установено, че различни компоненти на адоптивния имунитет са свързани с патогенезата на HTN в повечето от обикновените животински модели. Ролята на Т клетките в индуцирания от сол HTN модел също е широко проучена. Проучванията in vitro показват, че солта може да подтикне диференцирането на наивни Т клетки в TH17 клетки [6]. Многобройни in vivo работи в модели на HTN, индуцирани от диета с високо съдържание на сол (HSD), като Dhal сол-чувствителни (DSS) плъхове, показват екстензивна инфилтрация на бъбречни Т клетки [7–9].

Сред многото физиологични процеси,на мелатонинучастието в регулирането на кръвното налягане е донякъде интуитивно. Циркадният модел на кръвното налягане насърчава обширни изследвания относно мелатонина и HTN. Много изследвания в миналото, при хора и в експериментални модели, свързват ниските нива на мелатонин с HTN [10]. Има някои клинични данни, които предполагат, че добавките с мелатонин могат да лекуват HTN, главно при пациенти с нощна HTN [11]. Несъответствието на тези данни обаче повдига въпроси дали нециркадните свойства на мелатонин също участват в регулирането на кръвното налягане.

Противовъзпалителните и антиоксидантните свойства на мелатонина предполагат, че мелатонинът взаимодейства с имунната система. Появяващите се данни показват ролята на сигнализирането на мелатонин в развитието, активирането, диференциацията и паметта на Т клетките. Има доказателства, чемелатонинмембранни и ядрени рецептори присъстват върху Т клетки [12,13].Мелатонинповлиява производството на много цитокини, участващи в имунния отговор, като интерферон (IFN) - който е основен регулатор на Th1 отговора [14].

Оксидативният стрес и Т-клетъчният отговор, според някои изследователи, работят съвместно, насърчавайки развитието на HTN и органно хипертонично увреждане [15]. В нашата предишна работа ние демонстрирахме товамелатониннамалява локалния (бъбречен) оксидативен стрес и предотвратява индуцираната от сол бъбречна фиброза и протеинурия в модел на чувствителен към сол HTN плъх (моделът DSS) [16]. Тъй като оксидативният стрес има основна роля в свързания с HTN адаптивен имунен отговор, ние предположихме, че имуномодулаторните свойства на мелатонина са отговорни за неговата защитна роля при HSD-индуцирана HTN.

Целта на това изследване е да се оцени далимелатониннамалява индуцирания от сол Т-клетъчен отговор и за изясняване на механизмите, отговорни за този ефект.

2. Материали и методи

2.1. Животни и протокол за изследване

Протоколът от изследването е одобрен от институционалния комитет по етика на животните в медицински център Шеба в Израел. Тяхното здравословно състояние беше наблюдавано чрез измерване на телесното тегло и ежедневно общо наблюдение за движение и здравословно състояние на всяко животно. Мъжки плъхове Dahl, чувствителни към сол, четири седмици (RGD Cat # 1582190, RRID: RGD_1582190), бяха настанени в съоръжение за животни в обикновени клетки (два плъха на клетка) при 22 ◦C с цикъл от 14 часа светлина/10 часа тъмнина. Плъховете са поддържани на нормална солена диета и им е дадена вода от чешмата да пият ad libitum за период на аклиматизация от пет дни. След това плъховете бяха разделени на три групи (n=8), според диетата, за период от 8 седмици. Според комисията по етика животните, които показват признаци на заболяване и страдание, трябва да бъдат умъртвени.

Контролната група беше хранена със стандартна храна за плъхове (2018 SC; Teklad Envigo, Madison, WI, USA) и чешмяна вода; групата с диета с високо съдържание на сол (HSD) беше хранена с подходяща обогатена солена диета (4 процента) (TD.120485; Teklad Envigo, Madison, WI, USA) и чешмяна вода, имелатонингрупата е била хранена със същата обогатена със сол диета (4 процента) с мелатонин (M5250; Sigma, Rehovot, Израел) (30 mg/kg/ден) в тяхната вода за пиене. Телесното тегло и консумацията на вода се измерват периодично. Правилното количество мелатонин се разтваря във водните нужди за всяка клетка, за да се достави точната доза за всяко животно. Ден нула се определя като ден на започване на приема на HSD и мелатонин. В края на изследването плъховете бяха умъртвени чрез дълбока анестезия с 3 процента изофлуран (дълбочината на анестезията се потвърждава чрез стискане на задните крака) ибъбрецибяха събрани. Двата бъбрека бяха отстранени и хемизифицирани. Бъбреците бяха взети за анализ с поточна цитометрия, с изключение на няколко части, които бяха бързо отстранени и бързо замразени в течен N2 и съхранени при -80 ◦C. Използвани са замразени тъкани за екстракция на РНК.

Cistanche - симптоми на бъбречно заболяване

2.2. Количествена PCR с обратна транскрипция в реално време

Нивата на експресия на иРНК на гените бяха установени вбъбректъкан чрез количествена PCR с обратна транскриптаза в реално време (qRT-PCR). Общата РНК се екстрахира от бъбречната тъкан с помощта на комплект NucleoSpin RNA (MACHERY-NAGEL, Düren, Германия). Обратната транскрипция се извършва с помощта на комплект за обратна транскрипция cDNAR с висок капацитет на Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). qRT-PCR реакциите бяха извършени с помощта на Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, UK) и Applied Biosystems 7500 PCR система в реално време. Условията на цикъла бяха: първа единична стъпка от 95 ◦C за 0.20 минути и след това 40 цикъла на стадий на топене за 3 s при 95 ◦C и удължен етап от 30 s при 60 ◦C. В края на 40-те цикъла беше извършена кривина на стопилката. Рибозомната протеинова субединица на латералното стъбло P0 (Rplp0) mRNA беше използвана като вътрешна контрола. Праймерите са изброени в таблица 1.

Таблица 1. Списък на праймерите за плъхове, използвани в това изследване.

2.3. Изолиране на Т клетки от бъбреците

След отстраняване на бъбречната капсула, дветебъбрецибяха смлени и разбъркани с буталото на спринцовка от 2 ml през 100 µm клетъчна цедка в RPMI 1640, съдържащ 2 mML-глутамин, 10 процента FBS, 10 ug/mL ДНКаза 1 (технологии на стволови клетки, Кеймбридж, Масачузетс , САЩ) и 0,1 процента колагеназа тип IV (CLS 4, Worthington Decatur, AL, САЩ). Разтворът се инкубира в продължение на 25 минути при 37 ◦C. Промивен разтвор (DPBS/2 процента FBS/2 mM EDTA) след това се добавя към бъбречния хомогенат до достигане на 45 mL и се филтрува през 70 цт клетъчен филтър. Разтворът се центрофугира при 400 × g/7 минути. и пелетата се суспендира в 5 mL промивен разтвор и се филтрува през 40 µm клетъчна цедка и повторно се центрофугира при 400 × g/7 min. Пелетата се суспендира повторно в 3 ml FBS (10 mM EDTA) и се наслоява върху Histopaque-1083 (Sigma, Rehovot, Израел) и се центрофугира при 20 ◦C при 400 × g/30 min с изключена спирачка. Мононуклеарният клетъчен слой, разположен над Histopaque, беше отстранен, промит с промивен разтвор два пъти и суспендиран в 5 mL промивен разтвор за поточен цитометричен анализ.

2.4. Поточна цитометрия

От всяка група,бъбрециот 5-7 плъха бяха анализирани. За всяка проба бяха взети 1 × 106 клетки. Изолираните мононуклеарни клетки се инкубират с екстрацелуларни маркери: анти-CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 12-0030-82, RRID:AB_465493) и техния изотип контрол (Thermo Fisher Scientific Cat# 12-4742-41, RRID :AB_10753770), анти-CD4 (Thermo FisherScientific Cat# 17-0040-80, RRID:AB_1210581) и неговия изотип контрол (Thermo Fisher Scientific Cat# 17-4724-81, RRID: AB_470188), анти-CD8 (Thermo Fisher Scientific Cat# 25-0084-82, RRID:AB_10548361) и неговия изотип контрол (Thermo Fisher Scientific Cat# 25-4714-80,RRID: AB _657914). Всички клетки бяха анализирани чрез поточна цитометрия (BD FACSCalibur Flow Cytometry System, RRID: SCR_000401) с помощта на софтуера FlowJo (FlowJo, RRID: SCR-008520).

Cistanche-бъбречна функция

2.5. Клетъчна култура

Мезангиалната клетъчна линия на плъх, RMC (ATCC Cat# CRL{{0}}, RRID: CVCL_0506), беше получена от ATCC®. Клетката се култивира в модифицирана на Dulbecco среда Eagle (01-055-1A, biological industries, Beit HaEmek, Израел) с 4 mM L-глутамин, коригиран да съдържа 1,5 g/L натриев бикарбонат и 4,5 g/L глюкоза и допълнен с 0,4 mg/mLG418 и 15 процента фетален говежди серум. Мелатонинът е получен от Sigma (M5250 Rehovot, Израел). 250 mMмелатонинзапасът беше направен в етанол. Клетките се култивират в нормални условия или с високо съдържание на сол (добавяне на 8 0 mM NaCl към средата) без или с мелатонин (0,5 mM). Третирането с мелатонин беше насрочено за 45 минути преди добавяне на NaCl към средата. Всички експерименти бяха в 6 ямкови плаки с 3 × 105 клетки на ямка и бяха извършени чрез 6 независими опита.

2.6. Статистически анализ

Данните са представени като средна стойност ± SEM. Статистическите анализи са извършени с помощта на IBMSPSS Statistics, RRID: SCR_019096. Еднопосочният дисперсионен анализ (ANOVA) и posthoc методът на Tukey изследват разликите между групите. qPCR данните в реално време бяха анализирани с помощта на DataAssist, RRID: SCR_014969.

3. Резултати

3.1. Мелатонинът предпазва плъховете, които консумират HSD

Възрастта на плъховете по време на това проучване е 4–13 седмици. На тази възраст благосъстоянието на плъховете се показва от наддаването на тегло, което е показано от контролната група [17]. Въпреки това, HSDgroup достигна плато на 30-ия ден и добавянето намелатонинкъм HSD подобри това явление (Фигура 1A). Групата HSD показва висока смъртност, при която 50 процента от плъховете умират или имат клинично състояние, което изисква евтаназия според правилата на комисията по етика на животните, по време на експерименталния период. Добавките с мелатонин предотвратяват значително смъртността на плъховете, където само един от осем плъха умира на 58-ия ден, в края на експерименталния период (Фигура 1B).

Фигура 1.Мелатонинподобрено кръвно налягане и преживяемост при HSD. DSS Плъховете са третирани в продължение на 9 седмици с HSD със и без мелатонин. Диета с високо съдържание на сол намалява телесното тегло от ден 36 и мелатонинът намалява този ефект (A). HSD повишава процента на смъртност от ден 40. Третирането на HSD-федрати с мелатонин подобрява тяхното оцеляване. (B). (n=8) *-p По-малко или равно на 0.05 сол и сол плюс мелатонин спрямо контрола. #-p По-малко или равно на 0,05 сол спрямо контрола и сол плюс мелатонин. HSD - диета с високо съдържание на сол.

3.2. Мелатонинът предотвратява бъбречната Т-клетъчна инфилтрация, предизвикана от HSD

Изолирахме клетки отбъбреки ги свързва с Т клетъчния маркер, CD3. CD3 плюс клетките бяха свързани с CD4 и CD8. Както CD3 плюс CD4 плюс, така и CD3 плюс CD8 плюс бяха значително по-високи в HSD (5,18 ± 1,62 и 4,6 ± 0.75 процента, съответно) в сравнение с контролата (0.16 ± {{18} }.{{20}}2 и съответно 0,95 ± 0,15 процента) имелатониндобавката към HSD намалява както CD3 плюс CD4 плюс, така и CD3 плюс CD8 плюс клетките обратно до контролните нива (0.68 ± 0.21 и 1.37 ± 0.45, съответно) (Фигура 2A–D).

Фигура 2. Мелатонинът предотвратява инфилтрацията на Т клетки вбъбрек. Т клетките се изолират от бъбреците на плъхове и се изследват за CD3. CD3-положителните клетки бяха проверени за CD4 и CD8. Мелатонинът (C) намалява както CD3 плюс CD4 плюс, така и CD3 плюс CD8 плюс в сравнение с HSD без мелатонин (B) без разлика от контролната група (A). Анализът за всички плъхове е показан в (D) (n=7–8). HSD - диета с високо съдържание на сол. *-p По-малко или равно на 0.05 спрямо контрола. #-p По-малко или равно на 0,05 спрямо сол плюс мелатонин.

3.3. Мелатонинът намалява определени бъбречни хемокини, които са били регулирани нагоре при HSD

Набирането на Т клетки към възпалителни тъкани се регулира от локална хемокинова експресия. Затова ние измерихме експресията на две семейства хемокини в тези на плъховебъбреци: семейството на хемокин (CXC мотив) лиганд (CXCL) и семейството на хемокин (C-Cmotif) лиганд (CCL).

За семейството CXCL, CXCL 9, 10 и 11, които привличат Т клетки към тяхната целева тъкан, използвайки CXCR3 рецептора върху Т клетките, са значително повишени при HSD плъхове. Добавката намелатонинкъм HSD намалява тяхната експресия обратно до контролните нива. Същият модел беше открит за CXCL 1 и 16. Въпреки това, за CXCL12 не беше открита регулация нагоре в HSD (Фигура 3A).

За семейството на CCL, CCL 2, 4, 12, 17, 19 и CX3CL1 не показаха регулиране нагоре в HSD. CCL3 беше регулирано нагоре в HSD, но не беше открита значителна промяна с добавянето на мелатонин към диетата. За CCL7, значително повишено регулиране в HSD и значително понижено регулиране с добавянето намелатонинкъм HSD беше открит (Фигура 3B).

Фигура 3. Регулиране нана бъбрецитехемокинив HSD с и без мелатонин. Експресията на фамилия лиганд хемокин (CXC мотив) (CXCL) (A), семейство лиганд хемокин (CC мотив) и CX3CL1 (B) бяха определени при плъхове. (n=7–8) *-p По-малко или равно на 0.05 спрямо контрола. #-p По-малко или равно на 0,05 спрямо сол плюс мелатониране. HSD - диета с високо съдържание на сол.

3.4. Директният ефект на мелатонина върху RMC мезангиалната клетъчна линия

След това се фокусирахме върху CXCL9, 10 и 11, които привличат Т клетки чрез свързване към рецептора CXCR3. Ние определихме израза на тезихемокинив RMC клетки, които са мезангиална клетъчна линия на плъх.

Третирахме клетките с 80 mM NaCl без и с 0,5 mMмелатонин. Тази концентрация на NaCl значително повишава експресията на CXCR10 с 2,4 ± 0.26-кратно в сравнение с контролата, а добавянето на 0.5 mM мелатонин значително намалява този израз до 1,4 ± 0.{{10}} пъти в сравнение с контролата (Фигура 4А). За CXCL11, 80 mM NaCl значително повишава експресията с 3 ± 0.48-кратно в сравнение с контролата, а добавянето на 0,5 mM мелатонин значително намалява тази експресия до 1,8 ± 0.{{22 }}сгъване в сравнение с контролата (Фигура 4B). CXCL9 не е открит в RMC клетки.

Фигура 4. Повишено регулиране на солта на CXCL10 и CXCL11 експресия в мезангиална клетъчна линия, където лечението с мелатон намалява нейната експресия. RMC (мезангиална клетъчна линия на плъхове) бяха третирани със сол 80 тМ със и без 0,5 тМ мелатонин. CXCL10 (A) и CXCL11 (B) бяха регулирани нагоре чрез третиране със сол и добавяне намелатониннамалете тази регулация. Графиките представят 6 независими опита. *-p По-малко или равно на 0.001 спрямо контрола #-p По-малко или равно на 0.005 спрямо сол 80 mM и мелатонин 0,5 mM. $-p По-малко или равно на 0,05 спрямо сол 80 mM и мелатонин 0,5 mM.

4. Обсъждане

Благоприятният ефект отмелатонинвърху HTN беше демонстрирано в предишни проучвания и беше предложено като възможен курс на действие при резистентна на лечение HTN [18]. В нашето първо проучване се фокусирахме върху оксидативния стрес и разкрихме, че мелатонинът намалява оксидативния стрес, предизвикан от HSD. В настоящото проучване се фокусирахме върху адаптивния имунен ефект и показахме, че мелатонинът подобрява оцеляването на плъхове, хранени с HSD. Този ефект е свързан с намаляване на Т-клетките, инфилтриращи бъбрека, и понижаване на регулацията набъбрекхемокинова експресия.

Исторически данни показват, че DSS плъхове, консумиращи HSD, развиват тежка HTN и показват по-високи нива на смъртност [19]. Самият Дал съобщава при установяване на модела, че когато DSS плъхове са били поставени на HSD (8 процента NaCl) при отбиване (на възраст 21-23 дни), те бързо са развили HTN и всички са умрели до 16-та седмица на хранене със сол [20]. Lateron, след някои модификации на щама, Rapp et al. съобщават, че всички плъхове са умрели в рамките на осем седмици от HSD (8 процента NaCl) [21]. Плъховете в нашето проучване са имали висока смъртност, но не са достигнали 100 процента, вероятно поради по-ниския процент (4 процента) сол в диетата им. Въпреки това е очевидно, чемелатониндобавките значително предотвратяват смъртността при плъхове.

Наддаването на тегло е маркер за благосъстоянието на плъховете на възраст 4–13 седмици. DSS плъхове произхождат от Sprague Dawley, който е добре характеризиран щам. На възрастта на плъховете, която използвахме в нашите експерименти, плъховете трябва да наддават на тегло последователно [22]. В много проучвания върху животни намаляването на теглото се счита за една от „крайните точки“ на експериментите [23]. От няколко проучвания става ясно, че HSD при DSS плъхове води до по-ниски нива на наддаване на тегло в сравнение с контролите [24,25]. В съответствие с тези проучвания, ние също наблюдавахме разлики в теглото между групите. Тук плъховете не наддават на тегло след четири седмици на HSD. Мелатонинът спира и този ефект на HSD, тъй като плъховете, които са третирани с мелатонин, продължават да наддават на тегло, макар и по-малко от контролите.

Способността намелатонинза намаляване на кръвното налягане при животински модели е открито в края на седемдесетте години на 20 век [26–28]. Оттогава се съобщава в няколко други модела, като например, че диета с високо съдържание на фруктоза предизвиква метаболитен синдром при спонтанно хипертензивни плъхове [29,30]. Нашите изследвания в тази област са първите, които показват, че мелатонинът играе роля в индуцираната от сол HTN, като предотвратява увреждането на органите и намалява смъртността.

В това проучване ние показахме, че HSD индуцира Т лимфоцитна инфилтрация къмбъбрек, процес, който е описан при DSS плъхове главно от групата на Mattson [31–33]. Основната роля на този процес на инфилтрация в DSS модела е демонстрирана от скорошно проучване, което наблюдава, че DSS плъхове с дефицит на Т-клетки са защитени от HTN, индуцирана от HSD и спленоцитен трансфер, изостря чувствителната към сол HTN [34].

Мелатонинът може да повлияе на Т клетките в различни аспекти (за преглед вижте [35]). Това проучване показа за първи път товамелатониннамалява привличането както на CD4 плюс, така и на CD8 плюс Т-клетките къмбъбрекв HSD. Този ефект на мелатонина може да е механизмът, подчертаващ неговия благоприятен ефект в този модел.

Способността на мелатонина да намалява Т клетъчната инфилтрация е описана в експериментален модел на мишки с автоимунен енцефаломиелит (EAE). При EAE е показано, че мелатонинът намалява инфилтрацията на CD4 плюс Т клетки и Th17 клетки в ЦНС [36,37].

Т-клетъчното привличане към специфична тъкан се регулира главно от местни високи концентрации нахемокиникоито са хемотаксични цитокини, които контролират миграционните модели и позиционирането на имунните клетки. Две големи фамилии хемокини, които индуцират Т клетъчна инфилтрация, са семействата хемокини CXC мотив лиганд (CXCL) и CC мотив лиганд (CCL) [38].

Cistanche за подобряване на бъбречната дисфункция

В нашето проучване не открихме постоянен модел в реакцията на семейството на CCL към HSD и къммелатонин. От деветтехемокинив това семейство само CCL7 и CLL21 са наблюдавани да увеличават експресията си поради HSD, а добавянето на мелатонин го намалява. HSD повишава експресията на CCL3, но не е установено намаление при плъховете, третирани с мелатонин. Скорошно проучване на същия модел показа, че HSD регулира нагоре CCL2 вбъбрекчрез използване на метода RNA-Seq [39]. Въпреки това, това проучване тества нивата на 3 и 21 дни след началото на диетата. В нашето проучване тествахме нивата след осем седмици. Възможно е експресията на хемокин да се промени по време на периода на HSD.

Обратно, нивата на по-голямата част от семейството на CXCL, включително CXCL 1, 9, 10, 11 и 16, се повишават при плъховете, третирани с HSD имелатониндобавките премахнаха това нарастване. Само CXCL12 не показа увеличение в отговор на HSD.

CXCL9, CXCL10 и CXCL11, наречени "интерферон-индуцируеми лиганди на CXC хемокинов рецептор 3", се индуцират от IFN- и са лигандите на CXC хемокинов рецептор 3 (CXCR3). Проучванията in vivo показват тяхното значение за активирането и набирането на Т лимфоцити към целевия орган [40–42]. Youn и др. показаха при пациенти с хипертония както бъбречна инфилтрация на Т клетки, така и повишени циркулиращи нива на всичките три CXCR3хемокини, което предполага, че CXCR3 и неговите лиганди са подходящи за Т клетки, участващи в човешки HTN [43]. Друго проучване демонстрира, че CXCL10 е повишен при пациенти с хипертония и нивата му са свързани със стойностите на тяхното кръвно налягане [44].

Поради тези проучвания ние се фокусирахме върху CXCL9, CXCL10 и CXCL11. Култивирахме мезангиалната клетъчна линия на плъх и ги третирахме с 80 mM NaCl и 0,5 mM мелатонин. Открихме, че CXCL 10 и 11 се регулират нагоре в клетките и мелатонинът премахва това повишаване. Нашите резултати показват, че ефектът на солта за повишаване на CXCL 10 и 11 и противоположният ефект намелатонин, и двете бяха директно открити в мезангиални клетки. Обратно, CXCL9 не е открит в тези клетки.

Нашето проучване има ограничения. В нашите резултати от FACS много от CD3 плюс бяха двойно отрицателни както за CD4, така и за CD8. Същите резултати се наблюдават в проучването на Mattson от 2010 г. [31]. Въпреки това, в по-нови проучвания от групата на Mattson, CD3 плюс CD4-CD8-клетките са много малко [32,33,45,46]. Значителното намаляване на двойно отрицателните CD3 клетки може да бъде резултат от добавянето на CD45 маркера и само анализирането на клетките, които са CD45 положителни, което е извършено в по-късните проучвания на Mattson. Възможно е голямата популация на CD3 плюс CD4-CD8- да е артефакт. Обаче не е известен артефакт за CD3 плюс CD4 плюс и CD3 плюс CD8 плюс клетъчна популация.

5. Изводи

В заключение, диета с високо съдържание на сол е свързана с инфилтрация на Т клетки вбъбрецина DSS плъхове. Солта също повишава експресията на специфични Т-клетъчни хемоатрактанти в бъбреците. Лечение съсмелатонин(30 mg/kg/ден) премахва тези ефекти (мелатониннамалява HSD-индуцираната инфилтрация на Т-клетки в бъбреците заедно с намаляване на експресията на CXCL3 лиганд хемокин).

Нашето in vitro проучване показва, че солта и мелатонинът могат да регулират експресията на хемоатрактанти чрез директно въздействиебъбрекклетки.

Авторски принос: Conceptualization, AL; формален анализ, AB и RK; разследване, РК; методология, АБ и АЛ; писане - оригинална чернова, AB и AL; писане—преглед и редактиране, YS и EG Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа.

Финансиране: Това изследване не получи външно финансиране.

Декларация на институционалния съвет за преглед: Протоколът от изследването е одобрен от институционалния комитет по етика на животните в медицински център Шеба, протокол № 1219/19/ANIM и протокол № 16418 на Министерството на здравеопазването.

Изявление за информирано съгласие: Не е приложимо.

Изявление за наличност на данни: Данните, представени в това проучване, са достъпни при поискване от съответния автор.

Благодарности: Авторите благодарят на Зехава Шабтай за нейната отлична техническа поддръжка и на Майкъл Кановски за неговите редакторски услуги.

Конфликти на интереси: Авторите декларират липса на конфликт на интереси.

Препратки

1. Олсен, MH; Angell, SY; Асма, С.; Boutouyrie, P.; Бъргър, Д.; Chirinos, JA; Damasceno, A.; Delles, C.; Gimenez-Roqueplo, AP; Hering, D.; et al. Призив за действие и стратегия за жизнения цикъл за справяне с глобалното бреме на повишеното кръвно налягане върху настоящите и бъдещите поколения: Комисията на Lancet за хипертонията. Lancet 2016, 388, 2665–2712. [CrossRef]

2. O'Brien, E. The Lancet Commission on hypertension: Справяне с глобалното бреме на повишеното кръвно налягане върху настоящите и бъдещите поколения. J. Clin. Хипертония 2017, 19, 564–568. [CrossRef]

3. О'Донъл, М.; Менте, А.; Юсуф, С. Прием на натрий и сърдечно-съдово здраве. Circ. Рез. 2015, 116, 1046–1057. [CrossRef]

4. Schiffrin, EL Механизми на ремоделиране на малките артерии, антихипертензивна терапия и имунната система при хипертония. Клин. разследване. Med. 2015, 38, E394–E402. [CrossRef]

5. Гузик, TJ; Hoch, NE; Браун, Калифорния; McCann, LA; Рахман, А.; Дикалов, С.; Goronzy, J.; Weyand, C.; Harrison, DG Роля на Т-клетката в генезиса на индуцирана от ангиотензин II хипертония и съдова дисфункция. J. Exp. Med. 2007, 204, 2449–2460. [CrossRef][PubMed]

6. Kleinewietfeld, М.; Манзел, А.; Titze, J.; Квакан, Х.; Йосеф, Н.; Linker, RA; Muller, DN; Hafler, DA Натриевият хлорид предизвиква автоимунно заболяване чрез индуциране на патогенни TH17 клетки. Nature 2013, 496, 518–522. [CrossRef]

7. Матсън, DL; Лунд, Х.; Guo, C.; Rudemiller, N.; Geurts, AM; Jacob, H. Генетична мутация на рекомбинация, активираща ген 1 в Dahl, чувствителни към сол плъхове, намалява хипертонията и бъбречното увреждане. Am. J. Physiol. Регул. Цяло число. Comp. Physiol. 2013, 304, 407–414 [CrossRef]

8. Mattson, DL Инфилтриращи имунни клетки вбъбрекпри чувствителна към сол хипертония и бъбречно увреждане. Am. J. Physiol. Рен. Physiol.2014, 307. [CrossRef] [PubMed]

9. Лу, X.; Crowley, SD Възпаление при чувствителна към сол хипертония и бъбречно увреждане. Curr. Hypertens Rep. 2018, 20. [CrossRef][PubMed]

10. Бейкър, Дж.; Кемпински, К. Роля намелатонинпри регулиране на кръвното налягане: Допълнително антихипертензивно средство. Clin. Exp. Pharm.Physiol. 2018, 45, 755–766. [CrossRef] [PubMed]

11. Гросман, Е.; Лаудон, М.; Zisapel, N. Ефект на мелатонин върху нощното кръвно налягане: Мета-анализ на рандомизирани контролирани проучвания. Vasc. Управление на здравния риск. 2011, 7, 577–584. [CrossRef] [PubMed]

12. Позо, Д.; Делгадо, М.; Фернандес-Сантос, JM; Калво, JR; Gomariz, RP; Мартин-Лакав, И.; Ortiz, GG; Guerrero, JM Експресия на мРНК на Mel1a-мелатонин рецептор в Т и В подгрупи на лимфоцити от тимус и далак на плъх. Faseb J. Off. Публ. Fed.Am. Soc. Exp. Biol. 1997, 11, 466–473. [CrossRef]

13. Guerrero, JM; Позо, Д.; Гарсия-Мауриньо, С.; Osuna, C.; Молинеро, П.; Calvo, JR Участие на ядрени рецептори в повишеното производство на IL-2 от мелатонин в клетки Jurkat. Ан. NY Acad. Sci. 2000, 917, 397–403. [CrossRef] [PubMed]

14. Farez, MF; Масканфрони, ID; Méndez-Huergo, SP; Yeste, A.; Murugaiyan, G.; Гаро, LP; Балбуена Агире, ME; Patel, B.; Ysrraelit, MC; Zhu, C.; et al.МелатонинДопринася за сезонността на пристъпите на множествена склероза. Cell 2015, 162, 1338–1352 [CrossRef] [PubMed]

15. Кирабо, А.; Фонтана, В.; de Faria, APC; Лоперена, Р.; Галиндо, CL; Wu, J.; Бикинеева, А.Т.; Дикалов, С.; Xiao, L.; Chen, W.; et al. DC изокетално модифицираните протеини активират Т клетките и насърчават хипертонията. J. Clin. разследване. 2014, 124, 4642–4656. [CrossRef][PubMed]

16. Лейбовиц, А.; Волков, А.; Волошин, К.; Shemesh, C.; Баршак, И.; Grossman, E. Мелатонинът предотвратявабъбрекнараняване в модел на хипертония, предизвикан от диета с високо съдържание на сол, чрез намаляване на оксидативния стрес. J. Pineal Res. 2016, 60, 48–54. [CrossRef] [PubMed]

17. Хокинс, П.; Мортън, DB; Бурман, О.; Денисън, Н.; Честност, П.; Дженингс, М.; Лейн, С.; Мидълтън, В.; Roughan, JV; Wells, S.; et al. Ръководство за определяне и прилагане на протоколи за оценка на хуманното отношение към лабораторните животни: Единадесети доклад на Съвместната работна група за усъвършенстване на BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW. лаборатория. Anim. 2011, 45, 1–13. [CrossRef]

18. Симко, Ф.; Reiter, RJ; Паулис, Л.Мелатонинкато рационална алтернатива в консервативното лечение на резистентна хипертония.Hypertens Res. 2019, 42, 1828–1831. [CrossRef] [PubMed]

19. Rapp, JP Dahl Податливи на сол и устойчиви на сол плъхове. Хипертония 1982, 4, 753–763. [CrossRef]

20. Дал, Л.К.; Knudsen, KD; Heine, MA; Leitl, GJ Ефекти от хронично прекомерно поглъщане на сол. Модификация на експерименталната хипертония при плъхове чрез вариации в диетата. Circ. Рез. 1968, 22, 11–18. [CrossRef] [PubMed]

21. Rapp, JP; Dene, H. Развитие и характеристики на инбредни щамове на плъхове, чувствителни към сол и сол, устойчиви на Dahl. Hypertens 1985, 7, 340–349. [CrossRef]

22. Брауър, М.; Грейс, М.; Kotz, CM; Koya, V. Сравнителен анализ на характеристиките на растежа на плъхове Sprague Dawley, получени от различни източници. лаборатория. Anim Res. 2015, 31, 166–173. [CrossRef]

23. Talbot, SR; Biernat, S.; Bleich, A.; ван Дайк, RM; Ернст, Л.; Häger, C.; Хилгерс, SOA; Koegel, B.; Коска, И.; Kuhla, A.; et al. Определяне на намаляването на телесното тегло като хуманна крайна точка: Критична оценка. лаборатория. Anim 2020, 54, 99–110. [CrossRef] [PubMed]

24. Гешка, С.; Кречмер, А.; Шарковска, Ю.; Евгенов, О.В.; Лоуренц, Б.; Hucke, A.; Hocher, B.; Stasch, J.-P. Стимулирането на разтворимата гуанилатциклаза предотвратява ремоделирането на фиброзната тъкан и подобрява преживяемостта при чувствителни към сол плъхове Dahl. PLoS ONE 2011, 6,e21853. [CrossRef] [PubMed]

25. Wang, Y.; Му, JJ; Лиу, FQ; Рен, Кентъки; Xiao, HY; Янг, З.; Yuan, ZY Индуцираният от сол епителен към мезенхимален преход при плъхове, чувствителни към Dahlsalt, зависи от повишеното кръвно налягане. Браз. J. Med. Biol. Рез. Преподобни сутиени. Pesquisa Med. E Biol. 2014, 47, 223–230 [CrossRef]

26. Холмс, SW; Sugden, D. Процедури: Ефектът на мелатонин върху хипертония, предизвикана от пинеалектомия при плъхове. бр. J. Pharm. 1976, 56, 360P–361P.

27. Занобони, А.; Zanoboni-Muciaccia, W. Експериментална хипертония при пинеалектомизирани плъхове. Life Sci. 1967, 6, 2327–2331. [CrossRef]

28. Занобони, А.; Форни, А.; Zanoboni-Muciaccia, W.; Zanussi, C. Ефект на пинеалектомията върху артериалното кръвно налягане и приема на храна и вода при плъхове. J. Endocrinol. разследване. 1978, 1, 125–130. [CrossRef] [PubMed]

29. Pechánová, O.; Zicha, J.; Paulis, L.; Zenebe, W.; Добесова, З.; Kojsová, S.; Jendeková, L.; Сладкова, М.; Довинова, И.; Simko, F.; et al. Ефектът на N-ацетилцистеин и мелатонин при възрастни спонтанно хипертензивни плъхове с установена хипертония. Евро. J. Pharmcol. 2007, 561, 129–136. [CrossRef] [PubMed]

30. Лейбовиц, А.; Пелег, Е.; Sharabi, Y.; Шабтай, З.; Shamiss, A.; Гросман, Е. Ролята намелатонинв патогенезата на хипертония при плъхове с метаболитен синдром. Am. J. Hypertens 2008, 21. [CrossRef] [PubMed]

31. De Miguel, C.; Das, S.; Лунд, Х.; Mattson, DL T лимфоцитите медиират хипертонията ибъбрекувреждане на чувствителността към сол на Dahl. Am. J. Physiol. Регул. Цяло число. Comp. Physiol. 2010, 298, R1136–R1142. [CrossRef] [PubMed]

32. Еванс, LC; Петрова, Г.; Курт, Т.; Yang, C.; Bukowy, JD; Mattson, DL; Cowley, AW Повишеното перфузионно налягане задвижва бъбречна Т-клетъчна инфилтрация в чувствителния към сол плъх Dahl. Хипертония 2017, 70, 543–551. [CrossRef]

33. Abais-Battad, JM; Алшейх, AJ; Пан, X.; Ференбах, DJ; Dasinger, JH; Лунд, Х.; Робъртс, ML; Kriegel, AJ; Коули, AWJ; Кидамби, С.; et al. Диетични ефекти върху чувствителната към сол на Dahl хипертония, бъбречно увреждане и транскриптом на Т лимфоцити. Hypertens 2019, 74, 854–863. [CrossRef] [PubMed]

34. Ференбах, DJ; Dasinger, JH; Лунд, Х.; Zmaj, J.; Mattson, DL Трансферът на спленоцити изостря чувствителната към сол хипертония при плъхове. Exp. Physiol. 2020, 105, 864–875. [CrossRef] [PubMed]

35. Рен, У.; Liu, G.; Чен, С.; Ин, Дж.; Wang, J.; Тан, Б.; Wu, G.; Bazer, FW; Peng, Y.; Ли, Т.; et al. Сигнализация на мелатонин в Т клетки: Функции и приложения. J. Pineal Res. 2017, 62. [CrossRef]

36. Алварес-Санчес, Н.; Круз-Чаморо, И.; Лопес-Гонзалес, А.; Утрила, JC; Фернандес-Сантос, JM; Мартинес-Лопес, А.; Lardone, PJ; Guerrero, JM; Carrillo-Vico, A. Мелатонинът контролира експерименталния автоимунен енцефаломиелит чрез промяна на T ефекторния/регулаторен баланс. Поведение на мозъка. имунна. 2015, 50, 101–114. [CrossRef]

37. Chen, S.-J.; Huang, S.-H.; Chen, J.-W.; Wang, K.-C.; Янг, Y.-R.; Liu, P.-F.; Lin, G.-J.; Sytwu, H.-K.Мелатонинповишава експресията на интерлевкин 10 и потиска хемотаксиса, за да инхибира възпалението in situ и да намали тежестта на експерименталния автоимунен енцефаломиелит. Вътр. Имунофармакол. 2016, 31, 169–177. [CrossRef] [PubMed]

38. Грифит, JW; Сокол, CL; Лустър, АДХемокинии хемокинови рецептори: позициониране на клетките за защита на гостоприемника и имунитет. Annu. Rev. Immunol. 2014, 32, 659–702. [CrossRef] [PubMed]

39. Алшейх, AJ; Dasinger, JH; Abais-Battad, JM; Ференбах, DJ; Yang, C.; Каули, AWJ; Mattson, DL CCL2 медиира ранната бъбречна левкоцитна инфилтрация по време на чувствителна към сол хипертония. Am. J. Physiol. Рен. Physiol. 2020, 318, F982–F993. [CrossRef][PubMed]

40. Лиу, Л.; Калахан, MK; Хуанг, Д.; Ransohoff, RM Хемокинов рецептор CXCR3: Неочаквана енигма. Curr. Горна част. Dev. Biol.2005, 68, 149–181. [CrossRef] [PubMed]

41. Groom, JR; Luster, AD CXCR3 лиганди: излишни, съвместни и антагонистични функции. Immunol. Cell Biol. 2011, 89,207–215. [CrossRef] [PubMed]

42. Ван Реймдонк, К.; Van den Steen, PE; Liekens, S.; Van Damme, J.; Struyf, S. CXCR3 лиганди при заболяване и терапия. Cytokine Growth Factor Rev. 2015, 26, 311–327. [CrossRef] [PubMed]

43. Юн, J.-C.; Ю, ХТ; Лим, BJ; Ко, MJ; Лий, Дж.; Chang, D.-Y.; Чой, YS; Lee, S.-H.; Kang, S.-M.; Jang, Y.; et al. Имуносенсцентни CD8 плюс Т клетки и CXC хемокинов рецептор тип 3хемокинисе увеличават при човешка хипертония. Hypertens 2013, 62, 126–133 [CrossRef] [PubMed]

44. Stumpf, C.; Auer, C.; Йълмаз, А.; Lewczuk, P.; Klinghammer, L.; Шнайдер, М.; Даниел, WG; Schmieder, RE; Garlichs, CD Серумните нива на Th1 хемоатрактанта интерферон-гама-индуцируем протеин (IP) 10 са повишени при пациенти с есенциална хипертония. Hypertens Res. 2011, 34, 484–488. [CrossRef] [PubMed]

45. Rudemiller, NP; Лунд, Х.; Пристли, JRC; Endres, BT; Прокоп, JW; Яков, HJ; Geurts, AM; Коен, ЕП; Mattson, DL Мутация на SH2B3 (LNK), кандидат за изследване на асоциация за хипертония в целия геном, отслабва чувствителната към сол на Dahl хипертония чрез възпалителна модулация. Hypertens 2015, 65, 1111–1117. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Уейд, Б.; Петрова, Г.; Mattson, DL Роля на имунните фактори при индуцирана от ангиотензин II хипертония и бъбречно увреждане при плъхове, чувствителни към Dahlsalt. Am. J. Physiol. Регул. Цяло число. Comp. Physiol. 2018, 314, R323–R333. [CrossRef] [PubMed]