Изчислително изследване на производни на бензалацетофенон срещу SARS-CoV-2 като потенциални многоцелеви биоактивни съединения Ⅱ

3.7.2. Стабилност на комплекса 3CLpro-carmofur

Комплексът 3CLpro-carmofur показа стабилна динамика по време на 150 ns симулация след период на равновесие (60 ns). Средната стойност на RMSD за гръбнака и комплекса беше съответно 2.34 Å и 2.81 Å. N и C-крайните остатъци показват максимални остатъчни флуктуации (~10 Å). Въпреки това, остатъците, ангажирани в стабилните и запазени несвързани взаимодействия, показват относително много по-малки флуктуации (~ 2.0 Å). Стойността на Rg разкрива модел на сгъване по време на ~ 30 ns (Фиг. 10) и беше установено, че изразява частично разгъване, което показва стабилно свързване на лиганда. Освен това беше наблюдавано, че началната и крайната средна повърхностна площ, заета от 3CLpro и докингирания комплекс carmofur, е съответно 145,97 nm2 и 148,49 nm2. Средната хидрофобна повърхностна площ, заета от комплекса, е 148,32 nm2, което представлява протеиново разгъване и гъвкавост на свързващия джоб. Допълнителният филм (S2) представя подробния режим на свързване и стабилната динамика на carmofur към 3CLpro. Този комплекс формира 6 стабилниH-облигации, от които 4 бяха последователни по време на симулациите. Смяташе се, че тези стабилниH-взаимодействията на връзките насърчават образуването на стабилен комплекс. Изчислената относителна енергия на свързване на комплекса 3CLpro-carmofur комплекс беше− 16,67 kcal/mol. Освен това, основните остатъци, допринасящи за енергията на свързване, бяха идентифицирани чрез изчисляване на енергията на разлагане на остатъка. ОстатъцитеThr25, Мет49, Cys142, Met165, Leu167, Arg188,иGln189благоприятства образуването на стабилен комплекс. Въпреки това, остатъциAsn142иGlu166не благоприятстваха взаимодействията. Сред тези остатъци,Met165показа значителен принос към енергията на свързване, тъй като имаше най-малък принос на енергия (− 9,12 kJ/mol). Въпреки това, приносната енергия за други взаимодействащи остатъци варира между− 1,42 до− 5,601 kJ/mol и също участва в образуването на стабилен комплекс.

3.7.3. Стабилност на PLpro - 4-хидроксикордоин (c30) комплекс

Комплексът PLpro–4-хидроксикордоин (c30) показа стабилна динамика и подобна тенденция в продължение на 150 ns. Стойността на RMSD беше стабилна до ~80 ns от ~1.2 до ~1.5 Å и ~1.8 до ~2.2 Å за гръбнак и комплекс, съответно. След ~ 80 ns беше установено, че RMSD е относително по-висок (~ 1, 5–2, 3 Å и ~ 2, 2 до 3, 5 Å, съответно) поради увеличената повърхностна площ на протеина. Остатъчните флуктуации, начертани за C, разкриха образуването на стабилни несвързани контакти в остатъците с по-малко флуктуации, наблюдавани в 4-хидроксикордоин (c30), т.е. Val203, Met207, Tyr208, Met209, Ile223, Pro224 и Pro248 в сравнение с други невзаимодействащи остатъци. Стойността на Rg показа стабилно образуване на комплекс по време на MD симулацията чрез образуване на компактна глобуларна форма, както се разкрива от постоянното намаляване на стойността на Rg. Допълнителният филм (S3) представя режима на свързване на 4-хидроксикордоин (c30) с PLpro. Беше наблюдавано, че примката, образувана от остатъци между два листа, беше близо до свързващия джоб и имаше максимален контакт с молекулата. Въпреки това, поради гъвкавия характер на тази верига, той показа отварянето на свързващия джоб, което води до повишено SASA и движение на лиганд по време на MD симулацията след ~ 85 ns. Първоначалната и крайната повърхностна площ, заета от PLpro и 4-хидроксикордоин (c30) докинг комплекс, беше съответно 169,50 nm2 и 170,29 nm2. Средната площ, заета от комплекса, е 170 nm2. Комплексът образува 3 Н-връзки, от които 2 са последователни. Афинитетът на свързване на 4- хидроксикордоин (c30) с PLpro беше оценен чрез изчисляване на относителната енергия на свързване. Комплексът показва енергия на свързване от −16,28 kcal/mol. За да се получи повече структурна представа за приноса на отделните остатъци в енергията на свързване, беше анализирана енергията на разлагане на остатъка. Беше наблюдавано, че 7 остатъка значително допринесоха за образуването на стабилен комплекс и благоприятстваха съществуващите несвързани взаимодействия, т.е. Val203, Met207, Tyr208, Met209, Ile223, Pro224 и Pro248 (фиг. 11). Най-важното е, че остатъците Tyr208, Met209, Ile223 и Pro224 показаха значителен принос към афинитета на свързване, като отбелязаха най-ниската енергия на принос от -2.97, -3.89, -3.82 и -2.91 kJ/mol, съответно. Допълнителен видеоклип, свързан с тази статия, може да бъде намерен на https://d oi.org/10.1016/j.compbiomed.2022.105668.

3.7.4. Стабилност на комплекса PLpro-GRL-0617

Комплексът PLpro-GRL-0617 беше стабилен и показа подобни RMSD стойности до 120 ns. RMSD стойността за гръбнака варира от ~1,3 Å до ~3.0 Å и ~1,8 Å до ~4,5 Å за комплекса. Стабилното намаляване на основната RMSD стойност се наблюдава след ~120 ns (от ~3.{{20}} Å до 2.0 Å) и остава стабилно през цялото Период на MD симулация (150 ns). По същия начин, комплексната RMSD стойност показва подобно стабилно намаляване на RMSD стойността, варираща от ~4,5 Å до ~3,0 Å. След ~ 120 ns стойността на RMSD допълнително се увеличава до 3, 8 Å до 150 ns. Остатъчните флуктуации на Gly164, Asp165, Thr211, Leu212, Asn216, Ile223, Ala247, Pro248 и Tyr265 са относително по-малки в сравнение с други невзаимодействащи остатъци. Въпреки че Cys225, Val226 и Cys227 показват максимална остатъчна флуктуация до 6 Å поради повишена локална гъвкавост, взаимодействието на лиганда се наблюдава по време на симулацията. Освен това стойността на Rg показва стабилно комплексно образуване до ~ 70 ns. В допълнение, поради гъвкавостта на примковата област в съседство с джоба за свързване на лиганда "Lys158 към Val166", движението на лиганда се наблюдава към други джобове за свързване (допълнителен филм S4), което също се доказва от увеличение на Rg стойността ~70 ns. В допълнение, GRL-0617 формира стабилни несвързани контакти по време на 150 ns MD симулация, както се поддържа от стабилния Rg модел. Първоначално SASA показа гъвкав джоб за свързване и повишена стойност на SASA. Това може да е предизвикало преориентирането на лиганда GRL- 0617. Първоначалната и крайната повърхностна площ, заета от PLpro и GRL- 0617 докинг комплекс, беше отбелязана като 164,32 nm2 и 162,263 nm2 съответно. Средната площ, заета от комплекса, е 165,02 nm2. По подобен начин, повишените стойности на SASA показват отвора на свързващия джоб за образуване на стабилен комплекс, който се предпочита главно поради гъвкавия характер на остатъците от свързващия джоб. Комплексът образува 4 Н-връзки, от които 2 Н-връзки бяха постоянни по време на периода на симулация. Освен това комплексът PLpro-GRL-0617 показва енергия на свързване от −11,83 kcal/mol. В допълнение, структурните прозрения за приноса на отделните остатъци в енергията на свързване бяха количествено определени чрез изчисляване на енергията на разлагане на остатък. Беше наблюдавано, че 9 остатъка имат значителен принос за образуването на стабилен комплекс и благоприятстват съществуващите несвързани взаимодействия, т.е. Thr211, Leu212, Asn216, Ile223, Cys225, Val226, Cys227, Ala247 и Pro248 (фиг. 12). Най-важното е, че остатъците Ile223, Cys225, Val226 и Cys227 показаха значителен принос в афинитета на свързване, като отбелязаха най-ниската енергия на принос от -0,91, -0,74, -1.86 и -1,08 kJ/mol, съответно .

Допълнителен видеоклип, свързан с тази статия, може да бъде намерен на https://d oi.org/10.1016/j.compbiomed.2022.105668.

Фиг. 5. GO анализи на регулирани протеини от производни на бензалацетофенон, представящи клетъчни компоненти, молекулярна функция и биологични процеси.

3.7.5. Стабилност на шиповия протеин - mallotophilippen D (c42) Complex

Комплексът шип протеин-mallotophilippen D (c42) показва стабилна динамика след период на равновесие от 100 ns, подобно на другите изследвани комплекси. Стойността на RMSD варира между ~1,2 Å до 3 Å и 1,8 Å до ~4 Å съответно за гръбнак и комплекс. Симулацията беше допълнително разширена до 200 ns, тъй като този комплекс достигна състояние на равновесие след 100 ns. Наблюдаваните средни гръбначни и комплексни стойности на RMSD бяха ~2,6 Å и ~3,8 Å, съответно. Остатъчните флуктуации, начертани за C , разкриват по-малко флуктуации за остатъците, участващи в несвързаните контакти с mallotophilippen D (c42) в сравнение с други невзаимодействащи остатъци. Въпреки това, гъвкавата примкова област, образувана от остатъци Alal344-Trp353 и Glu516-Thr523, беше силно динамична и показа по-високи флуктуации (~3 Å). Остатъците, активно ангажирани във взаимодействията лиганд-протеин, включително Phe342, Leu368 и Ile434, показват най-малко колебание (допълнителен филм S5). Освен това, по време на MD симулацията се формира стабилен комплекс и се установява компактна глобуларна форма, както се разкрива чрез намаляване на стойността на Rg след 10 ns. Комплексът следва стабилна Rg стойност след 100 ns, показваща правилното нагъване, което е необходимо за образуване на стабилен комплекс между лиганд и протеин. Първоначалната и крайната повърхностна площ, заета от шиповия протеин и докинг комплекс mallotophilippen D (c42), беше съответно 112,38 nm2 и 112,6 nm2. Средната площ, заета от комплекса, е 111,4 nm2. Допълнителният филм (S5) демонстрира подробния режим на свързване на mallotophilippen D (c42) с шипов протеин. Комплексът образува 6 Н-връзки, от които 3 са последователни. Афинитетът на свързване на mallotophilippen D (c42) към шиповия протеин се оценява чрез изчисляване на относителната енергия на свързване. В допълнение, комплексът показва енергия на свързване от −34,10 kcal/mol. Освен това енергията на приноса на остатък разкри 12 остатъка от свързващия джоб, а именно Phe342, Ala363, Asp364, Tyr365, Leu368, Leu371, Ala372, Phe374, Ile434, Trp436, Val511 и Leu513, за да допринесат значително за образуването на стабилен комплекс (фиг. 13). Остатъците Phe342, Leu368, Ile434 и Trp436 от свързващия джоб показаха значителен принос към афинитета на свързване чрез постигане на най-малка енергия на разлагане/принос на остатък от -5,78, -9,39, -4,71 и -4,20 kJ/mol съответно.

Фиг. 7. Прогнозираноантивирусни спектрина производни на бензалацетофенон срещу множество вируси. Предвижда се, че по-голямата част от производните на бензалацетофенона са активни срещу вируса на херпес (12,57 процента) и най-малко срещу трахома (0.57 процента).

3.7.6. Стабилност на шиповия протеин - комплекс DRI-C23041

Комплексът шипов протеин-DRI-C23041 също показа стабилна динамика след период на равновесие от 100 ns, подобно на комплекса шипов протеин mallotophilippen D (c42). Първоначално стойностите на гръбнака и комплекса RMSD постепенно се увеличават от ~1.8 Å до 5 Å и ~2 Å до ~5.1 Å съответно за гръбнак и комплекс. Остатъците Val367, Leu368, Asp339, Asp364, Asp389 и Leu441 показват относително по-малко флуктуации (~ 4.0 Å), тъй като те участват в стабилни несвързани взаимодействия с DRI-C23041. Гъвкавият контур, образуван от остатъците Ala475 до Asn487, показва максимални остатъчни флуктуации (~ 11.0 Å). В допълнение, стабилен комплекс се образува от постоянна Rg стойност от ~ 18 Å. В допълнение, въртенето обратно на часовниковата стрелка на лиганда се наблюдава при около ~ 63 ns при частичното разгъване на комплексите, което също се доказва от повишената Rg стойност до 19, 5 Å (допълнителен филм S6). Въпреки това, лигандът възвърна първоначалната си позиция и заема стабилни конформации, а комплексът образува компактни кълбовидни форми, поддържани от намаляване на стойността на Rg до 18, 3 Å. Този структурен преход на лиганд благоприятства образуването на стабилен комплекс по време на 150 ns MD симулация. Първоначалната и крайната повърхностна площ, заета от спайк протеин и DRI-C23041 докинг комплекс, беше 109.379 nm2 и 107.334 nm2. Средната площ, заета от комплекса, е 110,57 nm2. Комплексът образува 4 Н-връзки, от които 2 са последователни. Установено е, че относителната енергия на свързване между DRI-C23041 и пиковия протеин е -3,10 kcal/mol. Енергията на принос на остатък разкри 11 остатъка от свързващия джоб, а именно Asp339, Glu340, Asp364, Asp389, Asp398, Asp405, Glu406, Asp427, Asp428, Asp442 и Glu516, ​​които допринасят значително за образуването на стабилния комплекс (фиг. 14) и тези остатъците отбелязаха най-малко енергия на разлагане/принос на остатък, която варира съответно от −11,90 kJ/mol до −27,17 kJ/mol.

3.7.7. Главен компонент и динамична кръстосана корелационна матрица

Извършихме анализ на главните компоненти, за да изследваме конформационната гъвкавост и разнообразието от конформации, които възникват от стабилната траектория, получена от 150 ns MD симулации, т.е. 100–150 ns за пет комплекса и 150–200 ns за шипов протеин-малотофилипен D комплекс. Максималното колективно движение се улавя от първите 10 собствени вектора/главни компоненти. Ето защо, ние проучихме точно първите два собствени вектора/PC (основни компоненти) в детайли. Фигура 15 представлява 2D проекцията на първите два собствени вектора. Беше наблюдавано, че стандартните молекули, използвани в настоящото изследване, а именно Carmofur, GRL-0617 и DRI-C23041, насочени съответно към 3CLpro, PLpro и спайк протеин, показват по-голямо разнообразие от конформации по време на симулациите (показани като червена линия на Фиг. 15A–C) Въпреки това избрани лиганди, а именно 3'-(3-метил-2-бутенил)-4′ -O- -D-глюкопиранозил{{22} },2′-дихидроксихалкон, 4-хидроксикордоин и малотофилипен D, насочени съответно към 3CLpro, PLpro и спайк протеин, показват по-малко разнообразие от конформации по време на симулацията. Това разкрива, че комплексите 3'-(3-метил-2-бутенил)-4' -O- -D-глюкопиранозил-4,2'-дихидроксихалкон с 3CLpro, 4-хидроксикордоин с PLpro и mallotophilippen D с шипов протеин са добре уравновесени и стабилизирани по време на симулацията. В допълнение, по-голямото конформационно пространство, заето от комплексите (стандартни молекули), показва по-висока конформационна гъвкавост с максимален брой различни конформации. Интересно е, че съединенията 3'-(3-метил-2-бутенил)-4′ -O- -D-глюкопиранозил-4,2'-дихидроксихалкон, {{ 51}}хидроксикордоин и малотофилипен D с 3CLpro, PLpro и шипов протеин заемат относително много по-малко конформационно пространство в сравнение със съответните им контроли/стандарт. По този начин ние предлагаме, че скринираните молекули могат да бъдат по-ефективни от стандартните лекарства (фиг. 15D–F).

Динамичната кръстосана корелация на С атоми, наблюдавана в комплексите, придобива повече структурни прозрения за колективното движение на домените за свързване на лиганда. Фиг. 16 представя съгласуваното остатъчно движение на С атомите във всички симулирани комплекси. Диагоналната линия с кехлибарен цвят показва силна самокорелация на всеки остатък със себе си. Амплитудата на корелацията към антикорелацията се мащабира съответно от кехлибарен до син цвят. В комплекс 3'-(3-метил-2-бутенил)-4′ -O- -D глюкопиранозил-4,2'-дихидрокси халкон-3 CLpro, остатъците от мястото на свързване показват антикорелация с N-терминалния домейн на 3CLpro. Амплитудата на антикорелацията обаче е умерена, докато комплексът 3CLpro-carmofur (стандартен) показва подобна антикорелация с много по-малка амплитуда. По този начин, ние предлагаме свързване на 3'-(3-метил-2-бутенил)- 4' -O- -D-глюкопиранозил-4,2'-дихидроксихалкон, който ще благоприятства конформационния преход и ще насърчи образуването на стабилен комплекс с подобрени несвързани взаимодействия в сравнение със стандартната му молекула, т.е. кармофур. По същия начин друг комплекс 4-хидроксикордоин PLpro показа силна корелация между остатъците 50–175, но същите остатъци в комплекс със стандартно лекарство GRL-0617, свързано с PLpro, показаха относително по-слабо кооперативно движение. Кооперативното движение, изразено чрез остатъците от свързващи джобове, вариращи от 175 до 240 с N-терминалния участък, разкрива значението на остатъците от активния сайт за стабилизиране на GRL-0617-PLpro комплекса. Корелацията на обвързващия джоб беше загубена в комплекса GRL-0617-PLpro. Стандартната молекула DRI-C23041-шип протеинов комплекс показа силно кооперативно движение за остатъци 390 до 470 със себе си, докато тези остатъци в комплекса шип-malotophilippen D показаха антикооперативнодвижение. Освен това комплексът spike-mallotophilippen D показва антикооперативно движение, с изключение на силна самокорелация, изразена от всички остатъци.

По този начин, динамичната кръстосана корелационна матрица показа кооперативното и антикооперативното движение в протеина, подчертавайки конформационната гъвкавост на изследваните комплекси и стабилни несвързани взаимодействия, лекувани от некооперативно движение от противоположната страна, което задейства отварянето и затварянето на свързващия джоб остатъци, улесняващи образуването на стабилен комплекс по време на MD симулацията.

Фиг. 9. Параметри, описващи 3CLpro-3'-(3-метил-2-бутенил)-4′-O- -D-глюкопиранозил-4, Структурна стабилност на 2'-дихидроксихалкон комплекс. (a) RMSD на гръбнака и комплекса, (b) RMSF, (c) Rg, (d) SASA, (e) брой взаимодействия на Н-връзка и (f) енергиен график на приноса, подчертаващ важността на остатъците от свързващия джоб в образуване на стабилен комплекс.

Таблица 6

MM-PBSA изчисления на свободната енергия на свързване и енергиите на взаимодействие на най-успешните комплекси.

4. Дискусия

Беше посочено, че имуностимулаторите могат да играят основна роля в профилактиката срещу множество инфекциозни пандемии, включително COVID-19, тъй като те са по-разпространени при компрометиран имунитет. По-рано ролята на имуностимулаторите при справянето с COVID-19 е била обяснявана с помощта на подходи на химиоинформатика и биоинформатика [34]. По същия начин настоящата работа се опита да изследва бензалацетофеноните (прекурсори на флавоноидите) [35] като имуностимулатори и антивирусни средства срещу новия коронавирус.

Първоначално съединенията бяха извлечени и подложени на прогнозиране на подобното на лекарството въз основа на молекулното тегло, донорите на Н-връзката, акцепторите и липофилността, както е обяснено от петоричното правило на Липински. Тук по-голямата част от бензалацетофеноните бяха идентифицирани с положителни резултати за сходство с лекарства, което предполага тяхната перорална бионаличност [16]. В допълнение, могат да бъдат направени няколко модификации в структурата на бензалацето феноните с отрицателни резултати за подобие на лекарството, за да се подобри тяхната орална бионаличност. Все пак трябва да се отбележи, че тяхната биологична функция не трябва да бъде засегната. Освен това, топ 5 лиганди с положителни резултати за сходство с лекарства, т.е. абисинон VI (c1), изобавахалкон (c11), 4-хидроксикордоин (c30), малотофилипен Е (c31) и оксигениран ксантохумол (c39) бяха предвидени за техните липофилност, водоразтворимост, фармакокинетика и лекарствено сходство, тъй като това са централни ограничения, които трябва да се вземат предвид за действието на лекарството. Интересното е, че нито едно от тези 5 попадения не нарушава Липкински (молекулно тегло<500, number of H-bond acceptors <10, number of H-bond donors <5, and XLogP<5) [36] and Veber (number of rotatable bonds ≤10, and the total polar surface area ≤140, also questions 500 molecular weight cutoff in Lipinski rule of 5) [37] rules. 

В допълнение, общо 55 различни пътя са регулирани от изследваните бензалацетофенони, в които хипоксия-индуцируем фактор (HIF) -1, p53, ядрен фактор kappa B (NF-kB), подобен на такса рецептор, туморна некроза фактор (TNF), вилообразна кутия, подгрупа O (FoxO), естроген, Wnt, NOD-подобен рецептор и интерлевкин-17 (IL-17) сигнален път и взаимодействие цитокин-цитокинов рецептор бяха идентифицирани да се притесняваш врегулиране на имунната. Съобщава се, че експресията и стабилизирането на HIF се задействат от хипоксия и патогенеза, свързана с микроби. Освен това ЗЗОК регулираимунната функция на гостоприемника, повишавайки микробицидния капацитет на фагоцитите и диференциацията на Т клетките, последвано от цитотоксична активност. В допълнение, сигналният път на HIF играе основна роля при възпаление, метаболизъм и поляризация на макрофагите, микробна инфекция (както вирусна, така и бактериална), представяне на антиген ивроден имунитет[38]. По подобен начин HIF-1 сигналният път (hsa04066) беше идентифициран като регулиран чрез модулирането на гени FLT1, GAPDH, HMOX1, NOS2, TFRC и TIMP1, които биха играли важна роля в манипулирането наимунна системапри коронавирусни инфекции и се справят с възпалението в засегнатата тъкан. Също така, сигналният път p53 манипулираимунен отговорчрез трансактивиране на ключови регулатори наимунни сигнални пътища.  

Фиг. 10. Параметри, описващи структурната стабилност на комплекса 3CLpro-Carmofur. (a) RMSD на гръбнака и комплекса, (b) RMSF, (c) Rg, (d) SASA, (e) брой взаимодействия на Hbond и (f) енергиен график на приноса, подчертаващ важността на остатъците от свързващи джобове в стабилен комплекс образуване.

Фиг. 11. Параметри, описващи структурната стабилност на PLpro-4-хидроксикордоиновия комплекс. (a) RMSD на гръбнака и комплекса, (b) RMSF, (c) Rg, (d) SASA, (e) брой взаимодействия на Н-връзка и (f) енергиен график на приноса, подчертаващ важността на остатъците от свързващия джоб в образуване на стабилен комплекс.

Освен това, множество гени от сигналните пътища на р53 също се съобщават за производството на цитокини, отчитането на патогени, възпалението и изчистването на мъртвите клетки [39]. Следователно, бензалацетофеноните могат да участват в регулирането на CASP8, CCND2, CHEK1 и MDM2 гени от p53 сигналния път (hsa04115) и могат да задействат цитокините за повишаване на имунитета, последвано от изчистване на мъртвите тъкани от тялото. Възпалителните цитокини като TNF или IL влияят на вродените и адаптивни имунни отговори. В допълнение, тяхното значение е илюстрирано чрез приемане на патогенезата, генерирана чрез блокирането на единични цитокини като IL-6 или TNF [40]. Тук също се предполага, че бензалацетофеноните модулират множество пътища като NF-kB (hsa04064), TNF (hsa04668) и IL-17 (hsa04657) сигнален път и взаимодействие цитокин-цитокинен рецептор (hsa04060), които са пряко свързани с възпалителния цитокини. Toll-подобните рецептори обикновено се експресират в сентинелни клетки (дендритни клетки и макрофаги), за да разпознават получени от микроби структурно запазени молекули и да играят ключова роля ввродена имунна система. В допълнение, те набират специфични адапторни молекули, активират транскрипционни фактори като NF-kB, посочват резултата от вродените имунни отговори и играят важна роля в множество аспекти на вродения имунен отговор към патогени [41]. Тук бе идентифицирано, че бензалацетофеноните регулират трите протеина, т.е. CASP8, CD14 и CD86 в сигналния път на подобен на такса рецептор. Освен това, подсемейството FoxO на транскрипционните фактори на челото (Fox) играе решаваща роля в клетъчната и хомеостатичната функция наимунно-релевантни клеткивключително Т клетки, В клетки, неутрофили и други нелимфоидни линии [42]. Освен това, бензалацетофеноните регулират сигналния път на FoxO (hsa04068) чрез модулиране на три протеина (CAT, CCND2 и MDM2) срещу 130 фонови протеина със степен на фалшиво откриване от 0,0137. По подобен начин се признава, че естрогенните рецептори развиват имунните клетки, последвано от участието им в инициираното от мембраната стероидно сигнализиране. В допълнение, те произвеждат интерферон тип I, а също и производството на вродени цитокини и развиват или функционират отговора на вродените имунни клетки [43]. По същия начин, настоящата работа демонстрира, че бензалацетофеноните регулират естрогенния сигнален път (hsa04915) чрез модулирането на три протеина, т.е. MMP2, PGR и RARA, които могат да предизвикат производството на интерферони и цитокини и да помогнат за бързия отговор на имунните клетки. По подобен начин Wnt сигналът играе важна роля в множество биологични процеси, включително регулиране на имунните клетки, което е много разнообразно в развитието на естествените клетки убийци, инициирането на Т-клетките, действието на макрофагите върху възстановяването на тъканите и тимопоезата на Т-клетките [44]. Тук бензалацетофеноните регулират Wnt сигналния път (hsa04310) чрез модулирането на три протеина, т.е. CCND2, CTNNB1 и MMP7, и могат да допринесат за развитието и регулирането на естествените клетки убийци, Т-клетките и макрофагите. По подобен начин, NOD-подобни рецептори функционират при микробно разпознаване и се съобщават защитни механизми на гостоприемника и също така задействат вродения имунен отговор на гостоприемника. Освен това семейството на NOD-подобни рецептори се занимава с взаимодействия гостоприемник-патоген и възпалителни реакции [45], които са регулирани чрез модулиране на 3 протеина, т.е. CASP8, CCL2 и CYBA.

При взаимодействието бензалацетофенони-цели-пътища бяха оценени множество параметри на цялата мрежа. Средната свързаност на всички възли с техните съседи се определя от „съседската свързаност“ [46]. Тази променлива е дефинирана в гореспоменатата мрежа от съседи на 63,8 процента. В допълнение, „централността между центровете“ измерва честотата на възела, която присъства на най-краткия път между други възли. Това насочва възела да действа като мост между възлите в мрежата. Това помага да се идентифицира най-краткият път и честотата на независимите възли, които да попаднат на един [47], което се наблюдава като корелирано с броя на съседите с 1. По същия начин, „централността на близостта“ отчита всеки възел въз основа на тяхната „близост“ до други възли и изчислява най-краткия път между възлите. Това помага най-бързо да се разбере влиянието на отделния възел върху дадена мрежа [47]. В настоящата работа беше наблюдавано, че централната близост зависи от съседите с 2 процента.

По време на идентифицирането на нови антивирусни агенти за новия вирус, проследяването на антивирусното свойство към добре разпознат вирус може да играе лесна игра. Приемайки това, ние изследвахме бензалацето феноните, които представляват интерес в антивирусния биологичен спектър. При това се наблюдава, че избрани бензалацетофенони притежават антивирусни свойства срещу адено, цитомегало, хепатит, херпес, трахома, грип, параинфлуенца, пикорна, шарка, носорог и човешки имунодефицитен вирус. Освен това, GO анализът също идентифицира регулирането на пътищата на инфекциозните заболявания, т.е. инфекция с човешки папиломен вирус (hsa05165), херпесвирусна инфекция, свързана със саркома на Капоши (hsa05167), вирусна карциногенеза (hsa05203), HTLV-I инфекция (hsa05166), херпес симплекс инфекция (hsa05168). ) и вирусен миокардит (hsa05416), които се отнасят до вирусна инфекция по отношение на базата данни на KEGG. Тези резултати допълнително ни подтикнаха да проучим вероятните антивирусни свойства на бензалацетофеноните срещу новия коронавирус.

За да оценим вероятното антивирусно действие на бензалацетофеноните срещу SARS-CoV-2, ние използвахме in silico молекулярен докинг и изцяло атомни явни MD симулации, за да изследваме афинитета на свързване на лиганди срещу 3 мишени на нов коронавирус, т.е. 3CLpro, PLpro и домейн, свързващ рецептор на спайк протеин. Тук всички бензалацетофенони имат резултат на енергия на свързване по-малък от −5.0 kcal/mol. Допълнителни съединения взаимодействаха с всичките три мишени с минимум едно взаимодействие с Н-връзка, с изключение на няколко, т.е. 4-хлорохалкон (c4), обохалколактон (c17), 4'-O-метилбавачалкон (c22) и малотофилипен Е ( c31) с 3CLpro,2′-хидроксихалкон (c2), 4-хлорохалкон (c4), 4- хидроксихалкон (c5), оканин (c7), 2′,3,4,4′,6 ′-пентахидроксихалкон (c8), халкон (c10), (плюс)-тефрозон (c12), пиноцембринхалкон (c13), 4′-O-метилбавачалкон (c22) и 2′,4′-дихидрокси-6′ - метокси-3′,5′-диметилхалкон (c43) с PLpro и 2′-хидроксихалкон (c2), 4-хлорохалкон (c4), халкон (c10), дезметилксан тохумол (c21), 4 ′ -О-метилбавачалкон (c22), 7- метоксипраекансон B (c29), малотофилипен C (c41) и 2′ ,4′ - дихидрокси-6′ -метокси-3′ ,5 ′-диметилхалкон (c43) с пиков протеин. В допълнение, 3CLpro присъства в nsp5, който претърпява автоматично разцепване и освобождава всички субединици на репликаза надолу по веригата, за да промени убиквитиновата система, засягаща функционалните протеини [48], които са били главно насочени от обохалколактон (c17) с −8,5 kcal/mol енергия на свързване, но това нямаше взаимодействия с Н-връзка. Вирусният цикъл на коронавируса се регулира от репликазни протеини, задействани чрез pp1a и pp1ab, и се обработва от PLpro [49], който е модулиран основно от 4-хидроксикордоин (c30) и ксантохумол (c38) с афинитет на свързване от − 8.2 kcal/mol от двата лиганда. По същия начин, коронавирусът използва ACE2 като портал за навлизане в клетката гостоприемник [50, 51] и беше основно насочен от абисинон VI (c1). Тези резултати отразяват множество молекули (от подобна категория), които могат да бъдат използвани за насочване към различните места на вирусната анатомия поради техния афинитет към множество протеини чрез теорията за взаимодействието "мулти-съединение(а)-мулти протеин(и)". Един от важните аспекти на представеното изследване е идентифицирането на инхибитори на навлизане на вируса, които покриват 7,71 процента от общите изследвани бензалацетофенони (фиг. 7). Следователно, свързването на бензалацетофенони с рецепторно-свързващ домейн на шипов протеин беше добавен като шипов протеин и е директен ключ към нормалната клетъчна хомеостаза. В допълнение, един от важните аспекти, които трябва да се имат предвид, е, че „правилна молекула – правилна цел – правилна продължителност“ като ирационална оценка може да причини тахифилаксия към интересуващата ни патогенеза, включително COVID{101}}, което може да бъде разрешено чрез „многокомпонентна -мултипротеинови" взаимодействие над теорията за взаимодействието "единично съединение-единична цел". В допълнение, това проучване посочи регулирането на някои специфични пътища, т.е. TNF, NF-kB и IL{105}} сигнални пътища и взаимодействието между цитокини и цитокинови рецептори (фиг. 17), които са пряко свързани симунна регулацияи също така манипулират цитокиновата буря.

Фиг. 16. Динамична кръстосана корелационна матрица на С атоми, наблюдавана в комплекси за бензалацетофенони (A, C, E) и стандартни лекарства (B, D, F) с 3CLpro, PLpro испайк протеин, съответно. Положителните области, които са оцветени в кехлибар, представляват силно корелирани движения на С атоми (Cij=1), докато отрицателнитеобластите, които са оцветени в синьо, представляват антикорелирани движения (Cij=-1).

Преди това бяха направени множество изследвания за прилагане на моделиране на хомоложност, молекулярно докинг, MD симулации и оценка на MM-PBSA за записване на вариабилността на транспорта на лекарството, идентифициране на протеиново алостерично инхибиране, влияние на хиралността при селективно ензимно инхибиране, изследване на неотменимия режим на рецепторите и оценка на взаимодействията лиганд-протеин [52–56]. По подобен начин, в настоящата работа, стабилността на междумолекулните взаимодействия на идентифицирани потенциални оловни съединения и стандартни молекули с тяхната съответна мишена бяха анализирани чрез класическа MD симулация за 150 ns (шипов протеин - mallotophilippen D (c42) комплекс за 200 ns). Резултатите показват, че 3'-(3-метил-2-бутенил)-4' -O- -D-глюкопиранозил-4, 2'-дихидроксихалкон (c35) проявява стабилна динамика с 3CLpro в сравнение със стандартна молекула carmofur. По-рано беше съобщено, че кармофур инхибира репликацията на коронавирус в клетки Vero E6 (EC50=24.30 μM) чрез взаимодействие с остатъка Cys145 на 3CLpro [57]. По подобен начин, в настоящото изследване се предвиждаше, че кармофурът взаимодейства с остатъка Cys145 чрез отбелязване на приносна енергия от −1,42 kJ/mol, докато 3'-(3-метил-2-бутенил)-4 ′-O- -D-глюкопиранозил-4,2′-дихидроксихалконовите съединения имат резултат - 4,24 kJ/mol за Cys145. В допълнение, Cys145–His41 са двата каталитични диадни остатъка на 3CLpro, които играят важна роля в разцепването на SARS-CoV-2 полипротеини [58]. В допълнение, други изследователски групи също съобщават за потенциалната роля на насочването към Cys145 за проектиране на нови антивирусни средства срещу 3CLpro [59,60]. Интересното е, че наблюдавахме запазени взаимодействия на мястото на свързване (Thr25, Met49 и Met165) в двете тези съединения по време на 150 ns MD симулация. По подобен начин, 4-хидроксикордоин (c30) беше скриниран като инхибитор на PLpro и образува стабилен комплекс в сравнение със стандартна молекула GRL-0617. Преди това GRL-0617 е докладван като мощен инхибитор на PLpro в заразени със SARS-CoV-2 Vero E6 клетки с IC50 от 2,1 μM [61, 62]. В настоящото проучване както GRL-0617, така и 4-хидроксикордоин (c30) образуват стабилен RMSD и споделят общи взаимодействия с Ile223 и Pro248 по време на 150 ns и 200 ns MD производствен цикъл, съответно, и разкриват, че и двата са подходящи действа като PLpro инхибитори.

В допълнение, по-рано Bojadžić et al. съобщават, че DRI-C23041 инхибира RBD домена на спайк протеин с IC50 от 0,52 μM [63]. В настоящото изследване mallotophilippen D (c42) беше идентифициран като регулатор на шипов протеин и показа по-добър афинитет на свързване към RBD домейна на шипов протеин в сравнение със стандартна молекула DRI-C23041. Резултатът от MM-PBSA разкрива, че mallotophilippen D (c42) притежава свободна енергия на свързване от −34,10 kcal/mol, докато −3,10 kcal/mol от DRI-C23041, което показва по-висок афинитет на mallotophilippen D (c42) към шиповия протеин . Освен това, както DRI-C23041, така и mallotophilippenD (c42) беше установено, че взаимодействат с общ остатък Leu368 на RBD домейн на спайк протеин по време на 150 ns MD симулация. Изследването на комплекси за PCA и DCCM също показа, че халконите с 3CLpro, PLpro и шипов протеин са добре уравновесени и стабилизирани по време на симулацията чрез заемане на относително много по-малко конформационно пространство и конформационна гъвкавост с минимален брой различни конформации в сравнение със стандартните молекули. Съвременен, 4-хидроксикордоин (c30), съединение с най-висок резултат за подобие на лекарството регулира 9 протеина, т.е. FLT1, CD86, CASP8, RARA, KLK3, PLAT, CTNNB1, HMOX1 и TOP2A, в които 6 протеина, т.е. CASP8, CTNNB1, TOP2A, CD86, PLAT и HMOX1, бяха проследени като засегнати от вирусната инфекция. CASP8 кодира каспаза 8; вирусен патоген, който е насочен към CASP8-зависимата апоптотична клетка и пътя на некротичната клетъчна смърт, който зависи от рецептор-взаимодействащия протеин (RIP) 1 и 3. Следователно, придобиването на активността на CASP8 потиска RIP1 и 3, за да укрепи роля в защитата на гостоприемника срещу вътреклетъчни вирусни патогени [64]. По същия начин, CTNNB1 кодира катенин -1 и е отговорен за синтеза на интерферон протеин [65] и е главният модулатор на имунния отговор. В допълнение, той може да попречи на вирусни инфекции [66]. По същия начин, TOP2A кодира топоизомераза 2 и нейното инхибиране предизвиква увреждане на теломерната дезоксирибонуклеинова киселина и Т-клетъчна дисфункция по време на хронична вирусна инфекция [67]. Освен това, CD86 кодира Т-лимфоцитния активиращ антиген CD86 и контролира антивирусната CD8 плюс функцията на Т-клетките и имунния надзор [68]. PLAT кодира плазминогенния активатор и допринася за вредното възпаление на белите дробове и локалното образуване на фибринов съсирек; може да бъде замесен в защитата на гостоприемника срещу инфекции с грипен вирус [69]. По същия начин HMOX1 кодира хемоксигеназа 1. По-рано беше съобщено, че SARS-CoV-2 отворената рамка за четене 3a протеин се свързва с човешкия HMOX1 протеин с висока степен на сигурност. Пътят на HMOX1 може да инхибира агрегацията на тромбоцитите и може да има антитромботични и противовъзпалителни свойства, наред с други, всички от които са критични медицински състояния, наблюдавани при пациенти с COVID-19 [70].

По-рано беше посочено, че геномната РНК на SARS-CoV-2 може да манипулира имунните гени и да лиши тяхната функция. В допълнение, беше посочено, че геномната РНК може да предизвика интерлевкинови взаимодействия и може също да предизвика цитокинова буря [71]. Също така, проучване изследва битовата част на микроРНК (miRNA) при инфекция с COVID, за да се избегне разпознаването и атаката от имунния отговор. За миг SARS-CoV-2 може да действа като памук или гъба, за да абсорбира miPHK и да накара имунната система да дисфункционира. В допълнение, той кодира своята miRNA, навлиза в клетката гостоприемник и се разпознава от имунната система на гостоприемника [72].

Тъй като се съобщава за бензалацетофенони (халкони) при манипулиране на имунния отговор [11] и РНК се занимава със синтеза на имунни гени, тяхната вероятна роля в манипулирането на гостоприемника за взаимодействие с геномна РНК трябва да бъде допълнително проучена.

5. Заключение

Настоящото проучване изследва множеството бензалацетофенони като имуностимулатори и техните антивирусни спектри срещу SARS-CoV-2. Това проучване съобщава за вероятни водещи антивирусни агенти, а именно абисинон VI (c1), изобутрин (c16), обохалколактон (c17), 4-хидроксикордоин (c30), 3'-(3-метил-2-бутенил )-4′-O- -D-глюкопиранозил-4,2′-дихидроксихалкон (c35), ксантохумол (c38) и 4-малотофилипен D (c42) срещу COVID -19 чрез насочване към 3CLpro, PLpro и спайк протеин. В допълнение, анализът на обогатяването идентифицира регулирането на различни

пътища като HIF-1, p53, NF-kB, Toll-подобен рецептор, TNF, FoxO, естроген, Wnt и IL-17. Също така бяха задействани NOD-подобни рецептори и цитокин-цитокинови рецептори, които са пряко свързани с регулирането на имунната система и манипулирането на цитокиновата буря. По подобен начин имаше задействане на множество пътища срещу вирусни и бактериални инфекции и ендокринна дерегулация, където имунната система е основно компрометирана. Тези резултати предполагат терапевтичния вариант на производно(а) на бензалацетофенон срещу COVID-19. Ограничавайки се до настоящите констатации, ние посочваме, че констатациите, представени в тази работа, се основават на симулации на процесор, които трябва да бъдат допълнително валидирани с експериментални протоколи за мокри лаборатории.

Препратки

[1] AR Fehr, S. Perlman, Коронавируси: преглед на тяхната репликация и патогенеза, Methods Mol. Biol. 1282 (2015) 1–23, https://doi.org/10.1007/978- 1-4939-2438-7_1.

[2] Y. Dong, X. Mo, Y. Hu, X. Qi, F. Jiang, Z. Jiang, S. Tong, Епидемиология на COVID-19 сред децата в Китай, Pediatrics 145 (2020), e20200702, https://doi.org/ 10.1542/peds.2020-0702.

[3] CJ Andersen, KE Murphy, ML Fernandez, Въздействие на затлъстяването и метаболитния синдром върху имунитета, Adv. Nutr. 7 (2016) 66–75, https://doi.org/10.3945/ an.115.010207.

[4] SG Deeks, BD Walker, Имунният отговор към инфекция с вируса на СПИН: добро, лошо или и двете, J. Clin. Инвестирам. 113 (2004) 808–810, https://doi.org/10.1172/JCI21318.

[5] M. Gendrot, E. Javelle, A. Clerc, H. Savini, B. Pradines, Chloroquine като профилактично средство срещу COVID-19, Int. J. Antimicrob. Агенти 55 (2020), 105980, https://doi.org/10.1016/j.ijantimag.2020.105980.

[6] V. Mody, J. Ho, S. Wills, A. Mawri, L. Lawson, MCCJC Ebert, GM Fortin, S. Rayalam, S. Taval, Идентификация на 3-chymotrypsin like protease (3CLPro) инхибитори като потенциални анти-SARS-CoV-2 агенти, Commun Biol 4 (2021) 93, https:// doi.org/10.1038/s42003-020-01577-x.

[7] D. Shin, R. Mukherjee, D. Grewe, D. Bojkova, K. Baek, A. Bhattacharya, L. Schulz, M. Widera, AR Mehdipour, G. Tascher, PP Geurink, A. Wilhelm, GJ van der Heden van Noort, H. Ovaa, S. Müller, KP Knobeloch, K. Rajalingam, BA Schulman, J. Cinatl, G. Hummer, S. Ciesek, I. Dikic, Папаиноподобната протеаза регулира SARS-CoV{{ 3}} вирусно разпространение и вроден имунитет, Nature 587 (2020) 657–662, https://doi.org/10.1038/s41586-020-2601-5.

[8] Y. Huang, C. Yang, XF Xu, W. Xu, SW Liu, Структурни и функционални свойства на шиповия протеин на SARS-CoV-2: потенциално разработване на антивирусни лекарства за COVID-19, Acta Pharmacol. грях. 41 (2020) 1141–1149, https://doi.org/10.1038/s41401-020- 0485-4.

[9] F. Yazdanpanah, MR Hamblin, N. Rezaei, Theимунна системаи COVID-19: приятел или враг, Life Sci. 256 (2020), 117900, https://doi.org/10.1016/j. lfs.2020.117900.

[10] Z. Rozmer, P. Perj´esi, Естествено срещащи се халкони и техните биологични активности, Phytochemistry Rev. 15 (2016) 87–120, https://doi.org/10.1007/s11101-014- 9387-8.

[11] JS Lee, SN Bukhari, NM Fauzi, Ефекти на халконовите производни върху играчите на имунната система, Drug Des DevelTher 9 (2015) 4761–4778, https://doi.org/ 10.2147/DDDT.S{{7 }}.

[12] D. Zhou, D. Xie, F. He, B. Song, D. Hu, Антивирусни свойства и взаимодействие на нови халконови производни, съдържащи пурин и бензенсулфонамидна част, Bioorg. Med. Chem. Lett 28 (2018) 2091–2097, https://doi.org/10.1016/j. bmcl.2018.04.042.

[13] X. Tang, S. Su, M. Chen, J. He, R. Xia, T. Guo, Y. Chen, C. Zhang, J. Wang, W. Xue, Нови халконови производни, съдържащи 1, 2,4-триазинова част: дизайн, синтез, антибактериални и антивирусни активности, RSC Adv. 9 (2019) 6011–6020, https://doi. org/10.1039/C9RA00618D.

[14] Y. Fu, D. Liu, H. Zeng, X. Ren, B. Song, D. Hu, X. Gan, Нови халконови производни: синтез, антивирусна активност и механизъм на действие, RSC Adv. 10 (2020) 24483–24490, https://doi.org/10.1039/D0RA03684F.

[15] А. Лагунин, С. Иванов, А. Рудик, Д. Филимонов, В. Поройков, DIGEP-Pred: уеб услуга за предсказване in silico на лекарствено-индуцирани профили на генна експресия въз основа на структурна формула, Биоинформатика 29 (2013) 2062–2063, https://doi.org/ 10.1093/bioinformatics/btt322.

[16] CA Lipinski, Оловни и подобни на лекарства съединения: правилото на петте революции, Drug Discov. Днес Technol. 1 (2004) 337–341, https://doi.org/10.1016/j. ddtec.2004.11.007.