Конструиране на нови термостабилни кандидати за химерна ваксина за генотип VII на вируса на нюкасълската болест

Резюме: Генотип VII Вирусът на нюкасълската болест (NDV) е причинил пандемия в много страни и обикновено причинява фатални последици при заразени пилета. Въпреки че настоящите търговски атенюирани ваксини срещу NDV могат да осигурят идеална защита срещу генотип VII NDV, те не могат напълно да предотвратят инфекцията и отделянето на вируса и генотипът на някои ваксинални щамове не може да съответства на преобладаващия щам. В това проучване, за да конструираме термостабилна и съвпадаща с генотип VII жива атенюирана ваксина, ние използвахме термостабилен вирулентен щам HR09 от генотип VIII като гръбнак и заменихме неговия F ген с този на генотип VII DT-2014 щам. Междувременно, мястото на разцепване на F гена на DT-2014 е мутирало съответно в това на протеин от клас IF и авирулентен F протеин от клас II. Резултатите показват, че двата химерни вируса, обозначени като rcHR09-CI и rcHR09-CII, споделят подобна кинетика на растеж и термостабилност с техния родителски щам HR09. Тестовете за средно време на смърт (MDT) и индекс на интрацеребрална патогенност (ICPI) показват, че двата химерни вируса са силно атенюирани. Въпреки че както химерните NDV, така и ваксиналния щам La Sota могат да осигурят пълна защита на имунизираните пилета срещу предизвикателството на вирулентен генотип VII ZJ1 щам, двата химерни NDV могат да индуцират по-високо ниво на отговор на антитела срещу ZJ1 щам и могат значително да намалят отделянето на вируса в сравнение с Ваксинален щам La Sota. В заключение, нашето проучване конструира два химерни термостабилни кандидати за NDV ваксина, съответстващи на генотип VII, които осигуряват пълна защита срещу предизвикателството на вирулентен генотип VII NDV.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Ключови думи: вирус на нюкасълската болест; термостабилност; генотип VII-съвпадащ химерен вирус; F протеин; ефективност на защитата; отделяне на вируси

1. Въведение

Вирусът на нюкасълската болест (NDV), причинителят на нюкасълската болест (ND), принадлежи към рода Orthoavulavirus в подсемейството Avulavirinae на семейството Paramyxoviridae [1]. NDV има отрицателен, едноверижен РНК геном, който кодира нуклеопротеин (N), фосфопротеин (P), матричен протеин (M), слят протеин (F), хемаглутинин-невраминидазен протеин (HN) и голям протеин (L ) [2]. Въз основа на еволюцията на щамовете на NDV, NDV може да бъде разделен на два класа: единият е вируси от клас I, с размер на генома от 15 198 нуклеотида; друг е вируси от клас II, с размер на генома 15 186 или 15 192 [3]. Въз основа на своята патогенност NDV е класифициран в три патотипа: лентогенен, мезогенен и велогенен [4]. NDV може да се класифицира в два класа, единият е клас I NDV, който е изолиран главно от диви птици и винаги е авирулентен за пилета. Другият е клас II NDV, който е открит при домашни и диви птици, включително вирулентни и авирулентни щамове [1,5,6]. F протеинът на NDV първо се синтезира като неактивен прекурсор, F 0, който допълнително се разцепва на две активни F1 и F2 субединици от клетъчна протеаза на гостоприемника [7]. Активният F протеин може да медиира сливането на вирусни и клетъчни мембрани [8]. Изследователите са открили, че мотивът на мястото на разцепване на F протеин също е индикатор за вирулентността на NDV. Беше съобщено, че вирулентният щам за пилета показва мотив на мястото на разцепване от 112R/KR-QK/RR↓F 117, докато нисковирулентните NDVs имат мотив от 112G/EK/R-QG/ER↓L 117 в същия регион [9,10]. Следователно, промяната на мотива на мястото на разцепване на F протеин е ефективен начин за атенюиране на вирулентния NDV [11,12]. Въпреки важната си роля във вирулентността на NDV, F протеинът също е основен фактор за защитния имунитет на съвпадащи по генотип ваксини [13]. Термостабилната вирусна ваксина може да улесни нейното съхранение и транспортиране, особено за някои отдалечени области, където не е налично транспортиране по хладилна верига. Преди това естествен термостабилен NDV щам, обозначен като HR09, беше изолиран в нашата лаборатория и можеше да остане инфекциозен повече от един час при третиране с 56 ◦C [14]. След това, използвайки обратна генетична система, беше установено, че остатъците 315 и 369 в HN протеина са отговорни за неговата устойчивост на топлина [15]. Тъй като HR09 е вирулентен щам, ние мутирахме неговото място на разцепване на F протеин от 112RRQKR↓F 117 до авирулентен мотив 112GRQGR↓L 117, използвайки обратна генетична система и установихме, че рекомбинантният вирус rHR09 може да осигури пълна защита срещу предизвикателството на генотип VII NDV вирулентен щам [16]. Освен това, атенюираният HR09 беше допълнително използван като ваксинен вектор за експресия на HA гена на H9N2 подтип вирус на инфлуенца по птиците (AIV), който също осигури идеална защита срещу предизвикателството на H9N2 AIV [17]. В това проучване, за да конструираме термостабилна и съвпадаща с генотип VII NDV атенюирана ваксина, използвахме термостабилен генотип VIII NDV вирулентен HR09 щам като гръбнак и заменихме неговия F ген с този на генотип VII DT-2014 щам. Междувременно, мястото на разцепване на F гена на DT-2014 е мутирало съответно в това на клас I NDV F протеин и авирулентен клас II NDV F протеин. Резултатите показват, че двата химерни вируса споделят подобна кинетика на растеж и термостабилност с HR09. В допълнение, тестовете за средното време на смърт (MDT) и интрацеребралния индекс на патогенност (ICPI) показват, че двата химерни вируса принадлежат към авирулентен щам. И двете могат да индуцират високо ниво на отговор на антитела срещу себе си и генотип VII ZJ1 щам в имунизирани пилета, биха могли значително да намалят отделянето на вируси и да осигурят пълна защита срещу заразените с ZJ1 щам. В заключение, нашето проучване предоставя два химерични кандидата за термостабилна ваксина за генотип VII NDV.

Ползи от Cistanche tubulosa- укрепване на имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. Материали и методи

2.1. Клетки и вируси

BSR-T7/5 клетки, селективна клетъчна линия от BHK клетки, които могат да експресират Т7 РНК полимеразата, се култивират с модифицирана Eagle среда на Dulbecco (DMEM, Gibco), допълнена с 15% фетален волски серум (Pan Biotech, Германия) и 1% пеницилин-стрептомицин (Thermo Fisher Scientific, Waltham, САЩ) при 37 ◦C в инкубатор с 5% CO2. Кокоши яйца от ембриони без специфични патогени (SPF), които могат да се използват за размножаване на NDV, са закупени от Beijing Boehringer Ingelheim Vital Biotechnology Co., Ltd. Термостабилен генотип VIII NDV HR09 щам (MF285077.1) и генотип VII ZJ1 щам се съхраняват в нашата лаборатория.

2.2. Плазмидна конструкция

Плазмидът, обозначен като pNDV/rHR09, е конструиран чрез клониране на пълната дължина на геномната последователност на генотип VIII HR09 с мутацията във F протеин във вектор TVT7R (0.0) [16]. Генът F на щама на генотип VII DT-2014, който имаше голямо сходство с преобладаващите щамове на генотип VII NDV, беше амплифициран и мутациите на неговите места на разцепване бяха генерирани чрез сайт-насочена мутагенеза. След това F генът в pNDV/rHR09 беше заменен от мутиралия DT-2014 F ген. Всички праймерни последователности, използвани в изследването, са достъпни при поискване.

2.3. Спасяване на рекомбинантен вирус

В това проучване двама кандидати за химерна NDV ваксина бяха спасени, както е описано по-рано [18]. Основните процедури са описани по-долу: първо, NDV плазмидите с пълна дължина, които съдържат мутиралия F ген на NDV DT-2014 в местата на разцепване, обозначен като pNDV/rcHR09-CI и pNDV/rcHR{{4} }CII, бяха трансфектирани с трите помощни плазмида pCI-NP, pCI-P и pCI-L чрез използване на реагент Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, САЩ) съгласно инструкциите на производителя. Второ, алантоичните течности от SPF-ембрионирани пилешки яйца бяха добавени съответно на 12 часа и 36 часа след трансфекцията. Трето, целите клетъчни лизати се събират на 72 часа след трансфекцията и се поставят на трикратно замразяване/размразяване. Накрая, клетъчните лизати бяха инжектирани в 10--дневни SPF ембрионални кокоши яйца за 3-5 дни и алантоичните течности бяха събрани и подложени на HA анализ за съществуването на спасени химерни NDV.

2.4. RT-PCR и QRT-PCR

РНК се екстрахира с помощта на TRIzol реагент (Merck, Darmstadt, Германия) от алантоисните течности, събрани от заразени ембрионални пилешки яйца, и след това се транскрибира обратно в сДНК с помощта на PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Пекин, Китай). Пълната дължина на спасената геномна последователност на NDV беше амплифицирана с помощта на 10-чифт праймери (налични при поискване). Нивата на отделяне на вируса се определят количествено чрез абсолютна количествена RT-PCR в реално време, като се използва инструмент Life Technology. Накратко, пробите от клоакален и трахеален тампон бяха събрани на 3- и 5- дни след провокацията (dpc), след това РНК беше екстрахирана, обратно транскрибирана към cDNA и подложена на количествена PCR в реално време (QRT-PCR) за количествено определяне на отделянето на вируси. Количеството вирусно отделяне се изчислява като средно ± SD на нивото на иРНК на всички събрани тампони. Последователностите на праймера и сондата, използвани при откриване на отделяне на вируси, са налични при поискване.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

2.5. Вирусна крива на растеж

Кинетиката на растеж на различни NDV е измерена в 10--дневни ембрионални кокоши яйца. Накратко, NDV бяха разредени и инжектирани в 10-дневни ембрионални кокоши яйца чрез алантоисна инокулация. Алантоичната течност беше събрана на 24-, 48-, 72- и 96-h след инфекцията. EID50 на всяка проба се изчислява по метода на Reed и Muench [19].

2.6. Тест за термостабилност

Термостабилността на всеки вирус се измерва, както е описано по-горе [18]. Накратко, всеки вирус с 108 EID50 титър при 0,1 mL на флакон се подлага на водна баня с 56 ◦C, след което пробите се събират при 10-, 20-, {{ 8}}, 40-, 50- и 60- минути след инкубация. Накрая, вирусният титър се измерва с помощта на метода EID50.

2.7. Определяне на вирулентност и стабилност

Вирулентността на всеки вирус беше оценена чрез прилагане на теста за средното време на смърт (MDT) в 10-дневни SPF ембрионални кокоши яйца, както е описано по-горе [20,21]. Накратко, събраната алантоична течност от всеки химерен NDV щам се разрежда от 10−6 до 10−9 в 10-кратни серии и се инжектира в 10-дневни SPF ембрионални кокоши яйца с 5 на група и се инкубират със 100 L от всяко разреждане. След това заразените кокоши яйца с ембриони се инкубират при 37 ◦C и се осветяват за общо 7 дни. Смъртта на всяка група беше записана и стойността на MDT беше изчислена. В допълнение, ICPI тестът при SPF пилета на 1-дневна възраст също беше измерен, за да се провери вирулентността на химерния вирус. Накратко, химерният вирус беше разреден в 10-кратна серия с помощта на PBS и инжектиран в 1-дневни SPF ембрионални кокоши яйца. Инкубираните яйца бяха осветени за общо 8 дни и беше изчислена стойността на ICPI. За да се оцени стабилността на двата химерни NDVs, те бяха размножени в 10-дневни SPF ембрионални кокоши яйца чрез алантоисна инокулация за общо 20 пасажа, след което бяха измерени стойностите на MDT и ICPI на избрани пасажи.

2.8. Имунизация на пилета и предизвикателство

Общо 48 8-дневни SPF пилета бяха разделени на случаен принцип в четири групи и три групи бяха инокулирани с 106 EID50 от rcHR09-CI, rcHR09-CII и щам La Sota в 100 µL DMEM по окулоназален път, съответно. Пилетата в контролната група бяха инжектирани със 100 µL DMEM. Серумът от имунизирани пилета се събира на 7-, 14- и 21 дни след имунизацията (dpi) за определяне на титъра на антитялото. При 21 dpi, пилетата бяха провокирани с щам 105 EID50 NDV генотип VII ZJ1 по окулоназален път. Клоакалните и орофарингеалните тампони бяха събрани на 3- и 5-ден след предизвикване (dpc) за по-нататъшно откриване на вирусно отделяне. Клиничните признаци и смъртта се записват всеки ден до 14 dpc.

2.9. Определяне на титър на серумни антитела

Титърът на антитялото срещу NDV се измерва чрез метода на инхибиране на хемаглутинацията (HI), както е описано по-рано [22].

2.10. Етична декларация

Имунизацията и предизвикателството на пилетата бяха одобрени от институционалния комитет за грижа и използване на животните на университета в Янджоу (№ YZUDWLL-201904-002; дата: 4 февруари 2019 г.).

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

2.11. Статистически анализ

Данните са показани като средни стойности ± стандартни отклонения (SD) и са получени от три повторения. Статистическата значимост между различните групи беше анализирана чрез метода t-тест на Student, като се използва софтуер GraphPad Prism 7.0 (La Jolla, Калифорния, САЩ). (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001).

3. Резултати

3.1. Схема за изграждането на два химерични NDV

Генотип VII NDV е разпространен по целия свят и често причинява фатални последици за пилета и други податливи птици [23]. Преди това изолирахме термостабилен генотип VIII NDV HR09 щам, който може да поддържа инфекциозност за повече от 60 минути, когато се инкубира при 56 ◦C [14]. В това проучване, за да генерираме термостабилна атенюирана кандидат ваксина срещу NDV генотип VII, ние използвахме HR09 като гръбнак и заменихме F гена с този на VII DT-2014 щам; междувременно, местата на разцепване бяха мутирани от 112RRQRR↓F 117 до места на разцепване на протеин клас I NDV F 112ERQER↓L 117 и авирулентен щам на места на разцепване на протеин клас II NDV F 112GRQGR↓L 117. Плазмидите, които съдържат пълната дължина на геномът HR09 с мутиралия F протеин бяха обозначени съответно като prcHR09-CI и prcHR09-CII (Фигура 1).

фигура 1. Схематична стратегия за изграждането на два химерни NDV. F генът на генотип VIII термостабилен щам HR09 беше заменен с мутиралия F ген на генотип VII DT-2014 щам.

3.2. Конструкция на химерния NDV rcHR09-CΙ и rcHR09-CⅡ

За да се конструират химерните вируси, плазмидите prcHR09-CI или prcHR09-CII бяха котрансфектирани с трите помощни плазмида, pCI-NP, pCI-P и pCI-L в BSR-T7/5 клетки , който може да експресира Т7 РНК полимераза. 72 часа по-късно, целият клетъчен лизат беше събран и инжектиран в 10-дневни SPF ембрионални яйца и алантоичните течности бяха събрани на 4 дни след инкубацията. За да се проверят местата на разцепване на двата спасени химерни вируса, беше извършен PCR експериментът на F гена и продуктите бяха подложени на секвениране; резултатите показват, че местата на разцепване са успешно мутирани до 112ERQER↓L 117 в rcHR09-CI (Фигура 2A) и 112GRQGR↓L 117 в rcHR09-CII (Фигура 2B), поотделно. И накрая, геномът с пълна дължина на двата термостабилни химерни NDVs беше амплифициран с помощта на 10 двойки праймери и резултатите показаха, че както rcHR09-CI (Фигура 2C), така и rcHR09-CII (Фигура 2D) съдържат генома с пълна дължина на NDV. Взети заедно, тези данни показват, че двата термостабилни химерни вируса са успешно конструирани.

Фигура 2. Конструиране и валидиране на химерния NDV rcHR09-CI и rcHR09-CII. Общата РНК на спасените вируси беше извлечена и обратно транскрибирана в сДНК, F генът на rcHR09-CI (A) и rcHR09-CII (B) беше амплифициран и настроен за секвениране. Пълната дължина на химерния NDV rcHR09-CI (C) и rcHR09-CII (D) беше амплифицирана с помощта на 10 двойки праймери и S1–S10 са тяхното представяне.

3.3. Биологични характеристики на химерния NDV rcHR09-CI и rcHR09-CII

За да се провери дали замяната на F гена засяга репликацията на NDV, кинетиката на растежа беше извършена в 10-дневни ембрионални кокоши яйца чрез измерване на EID50 за тях. NDV бяха разредени и инкубирани в 10-дневни ембрионални кокоши яйца и алантоичната течност беше събрана на 24-, 48-, 72- и 96- h след инкубация. Резултатите от EID50 показват, че и спасените химерни rcHR09-CI и rcHR09-CII споделят подобна кинетика на растеж с техния родителски щам HR09 (Фигура 3A), което демонстрира, че заместването на F гена няма ефект върху репликацията на HR09.

Фигура 3. Биологичните характеристики на химерния NDV rcHR09-CI и rcHR09-CII. (A) Двата химерни NDV rcHR09-CI и rcHR09-CII имат сходна кинетика на растеж с техния майчин щам HR09. Кривата на растеж на двата химерни вируса и техния майчин щам HR09 бяха измерени с метода EID50 в 10-дневни SPF ембрионални кокоши яйца. (B) Двата химерни NDV rcHR09-CI и rcHR09-CII споделят термостабилността с HR09. Общо 108 EID50 от щамовете NDV rcHR09-CI, rcHR09-CII, HR09 и La Sota бяха инкубирани при 56 ◦C за 10-, 20-, {{21 }}, 40-, 50- и 60-мин, съответно. След това титрите на четирите NDVs бяха измерени с помощта на метода EID50.

Тъй като щамът HR09 беше термостабилен NDV щам, също беше изследвано дали заместването на F протеина повлиява неговата термостабилност. Всеки химерен вирус и HR09 със същия вирусен титър (108 EID5{{50}}) бяха третирани с 10-, 20- , 30-, 40-, 50- и 60-мин под 56 ◦C. След това вирусният титър се измерва чрез извършване на EID50 анализ. Резултатите показват, че двата химерични вируса и техният родителски щам HR09 могат да останат инфекциозни за повече от 60 минути, докато нетермостабилният щам La Sota просто остава инфекциозен за не повече от 20 минути (Фигура 3B). Тези данни показват, че химерните вируси rcHR09-CI и rcHR09- 218 CII все още са термостабилни. В това изследване F генът на VIII HR09 беше заменен с мутиралия F ген на VII DT- 2014, за да се получат две атенюирани химерни NDV. За да се оцени вирулентността на химерните rcHR09-CI и rcHR09-CII, бяха открити стойностите на MDT и ICPI. Резултатите показват, че стойността на MDT на всичките два химерни NDV е по-голяма от 120 h. Като контрола стойността на MDT на техния родителски щам HR09 е 57,6 часа. Стойностите на ICPI на rcHR09-CI и rcHR09-CII бяха нула, като контрола ICPI на HR09 беше 1,8 (Таблица 1). Вирулентността на NDV въз основа на стойността на MDT е класифицирана в три групи: велогенна (под 60 часа), мезогенна (60–90 часа) и лентогенна (повече от 90 часа). Междувременно стойността на ICPI също е общ критерий за определяне на вирулентността на NDV: велогенен (под 60 часа), мезогенен (60–90 часа) и лентогенен (повече от 90 часа): велогенен (1,5–2,0), мезогенен (0,7) –1,5) и лентогенен (0,0–0,7) [24]. Взети заедно, тези данни показват, че както спасените химерни rcHR09-CI, така и rcHR09-CII са силно атенюирани чрез промяна на местата на разцепване на F протеин.

Таблица 1. Оценка на патогенността и стабилността на двата химерни NDV (общо 20 пасажа).

В допълнение, стабилността на двата химерни NDVs беше открита чрез инкубиране за 20 пасажа в 10-дневни ембрионални кокоши яйца и пасажи 10 и 20 бяха избрани за измерване на стойностите на MDT и ICPI. Резултатите показват, че стойностите на MDT на пасаж 10 и пасаж 20 са по-големи от 120 часа, а стойностите на ICPI на пасаж 10 и пасаж 20 са нула (Таблица 1). Тези данни показват, че след 20 пасажа в 10-дневни ембрионални кокоши яйца, стойностите на MDT и ICPI на две химерни NDV нямат значителна разлика, което показва, че двете спасени химерни NDV са относително стабилни.

3.4. Висок HI титър на антитела беше индуциран след имунизация на химерните NDVs

За да се провери дали имунизацията на спасените химерни NDV може да индуцира отговора на антитялото при пилетата, 48 8-дневните SPF пилета бяха разделени на четири групи. Различни групи бяха инокулирани с 106 EID50 от rcHR09-CI, rcHR09-CII, щам La Sota или 100 µL DMEM по окулоназален път, съответно. Серумът от имунизирани пилета се събира на 7-, 14- и 21 дни след имунизацията (dpi) за определяне на титъра на HI антитела. HI антитялото на събрания серум срещу имунизирания NDV щам показа, че няма значителна разлика между серума на rcHR09-CI, rcHR09-CII и La Sota в 7 dpi. Нещо повече, с течение на времето титърът на HI антитялото нараства в серума от 14 и 21 dpi и няма значителна разлика между трите групи (Фигура 4А)

Фигура 4. Химерните вируси индуцират високо ниво на антителен отговор. SPF пилетата бяха имунизирани съответно с 106 EID50 rcHR09-CI, rcHR09-CII и търговската ваксина La Sota щам по окулоназален път. Серумът беше събран на 1-, 2- и 3 седмици след имунизацията, титърът на антителата беше измерен с помощта на HI метод срещу самите тях (A) и кръстосаният HI титър на антитела срещу ZJ1 (B). (ns: няма значима разлика; * p < 0,05; ** p < 0,01).

В допълнение, кръстосано реактивният HI титър на антитела срещу ZJ1 щама беше открит, за да се повишат имунизационните ефекти на химерните NDV срещу генотип VII NDV. Резултатите показват, че няма значителна разлика между трите имунизирани срещу NDV групи при 7 dpi и титърът на HI антитялото нараства с времето. За разлика от титъра на HI антитела срещу имунизиран щам, титрите на HI антитела срещу щам ZJ1 на rcHR09-CI- и rcHR09-CII-имунизирани групи бяха значително по-високи от групата, имунизирана с ваксина La Sota, и rcHR 09-CI групата индуцира най-високия HI титър на антитела сред тези три групи (Фигура 4B).

3.5. Отделянето на вируси беше намалено, когато имунизираните пилета бяха заразени с вирулентен генотип VII ZJ1 щам

В това изследване, имунизираните SPF пилета бяха заразени с генотип VII ZJ1 щам за оценка на защитния ефект на химерни вируси срещу генотип VII NDV. При 21 dpi имунизираните пилета бяха провокирани с щам 105 EID50 ZJ1 и клоакалните и орофарингеалните натривки от всички заразени пилета от всяка група бяха събрани на 3- и 5- дни след провокацията (dpc ) за откриване на отделяне на вируси. Резултатите показват, че имунизацията на групите rcHR09-CI, rcHR09-CII и La Sota може да намали отделянето на вируси в тампони от клоака (Фигура 5A, C) и орофарингеални тампони при {{11} } и 5-dpc (Фигура 5B, D) в сравнение с контролната група. В сравнение с групата La Sota, отделянето на вируси в две химерни NDVs е значително по-ниско от това в La Sota имунизирани групи, което демонстрира, че двете химерни NDVs имат по-добра защитна ефективност от щама La Sota срещу предизвикателството на генотип VII NDV.

Фигура 5. QRT-PCR количествено определяне на отделяне на NDV ZJ1 при заразени пилета. Пилетата бяха провокирани с 1{{10}}6 EID50 NDV генотип VII ZJ1 щам на 21 дни след имунизацията. Пробите от клоакален тампон (A,C) и пробите от орофарингеален тампон (B,D) бяха събрани на 3- и 5-дни след провокацията и нивата на NDV ZJ вирусно отделяне бяха количествено определени чрез QRT- PCR. Стойностите бяха показани като средни стойности ± стандартно отклонение (средно ± SD) във всяка група. (ns: няма значима разлика; * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).

3.6. Двете химерни NDV осигуряват пълна защита срещу предизвикателството на генотип VII ZJ1 щам

Тъй като предизвикването на генотип VII ZJ1 щам може да доведе до летални последици, с изключение на откриването на отделяне на вирус, смъртта на заразените пилета също се записва всеки ден до 14 дни. Резултатите показват, че всички пилета в контролната група са показали клинични признаци на духовна депресия, респираторно разстройство, диария и са умрели на 5- до 6-dpc и няма клинични признаци и няма мъртви пилета в rcHR{ {4}}CI, rcHR09-CII и La Sota групи до 14 dpc (Фигура 6), което демонстрира, че всички химерни NDVs и La Sota ваксинален щам могат да осигурят пълна защита срещу предизвикателството на генотип VII NDV.

Фигура 6. Химерни NDV rcHR09-CI и rcHR09-CII осигуряват пълна защита срещу предизвикателството на ZJ1. На 3 седмици след имунизацията, пилетата бяха провокирани със 106 EID50 ZJ1 щама. Състоянието на преживяемост беше наблюдавано за общо 14 дни.

4. Дискусия

Въпреки множеството видове ваксини срещу NDV, които се използват в света, ND все още се случва на много места по света. Един от проблемите може да е, че генотипът на ваксиналния щам не съвпада с преобладаващия щам. Тези генотипно несъответстващи ваксини могат да осигурят известна защита срещу предизвикателството на вирулентните NDVs; те обаче не могат да защитят пилетата от инфекция и не могат ефективно да намалят отделянето на вируси [25,26]. Клас II генотип VII NDV е основен генотип, преобладаващ в регионите на Близкия изток, Африка и Азия; но ваксините, използвани на тези места, обикновено са щамове La Sota и B1 от генотип II, които не са същият генотип с преобладаващите щамове [27–29]. В това проучване, за да се генерира термостабилен генотип VII-съвпадащ кандидат за ваксина, термостабилен генотип VIII HR09 щам беше използван като гръбнак и два химерични генотип VII-съвпадащи кандидати за ваксина бяха конструирани, за да се отговори на необходимостта от ваксина за генотип VII. Досега са разработени множество термостабилни кандидати за NDV ваксина. Първият термостабилен NDV V4 е изолиран от предвентрикула на пилета през 1966 г. [30]. V4 е естествен лентогенен щам и резултатите от филогенетичния анализ показват, че принадлежи към генотип II NDV. За разлика от V4, термостабилният щам HR09, използван в нашето изследване, принадлежи към вирулентен щам [14]. Ако искаме да го поставим в клинична употреба, първото нещо, което трябва да направим, е да определим как да го направим като авирулентен щам. Благодарение на развитието на обратната генетична система, конструирането на авирулентни кандидати за NDV ваксина, отговарящи на генотип, постигна значителен напредък. Тъй като е доказано, че мястото на разцепване на F протеин е основната детерминанта на вирулентността на NDV [31], прост начин за генериране на атенюиран NDV е заместването на мястото на разцепване на F протеин във вирулентния щам с това на авирулентния щам. Междувременно се съобщава, че F протеинът е важен имуногенетичен протеин, който може да индуцира неутрализиращото антитяло за защита на имунизираните пилета срещу предизвикателството на вирулентен NDV [32–34]. Освен това се съобщава, че мястото на разцепване на NDV може да повлияе на имунния отговор при имунизираните пилета [11]. В това изследване ние заменихме F гена на термостабилен HR09 с F гена на NDV генотип VII вирулентен щам DT-2014; междувременно, местата на разцепване на DT-2014 също са мутирани до тези на авирулентните NDV щамове от клас I и клас II, съответно (Фигура 1).

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Както се очакваше, резултатите от определянето на вирулентността показаха, че и двата химерни термостабилни NDV са силно атенюирани (Таблица 1). Междувременно беше установено също, че и двата химерни NDV показват сходна кинетика на растеж с техния родителски щам HR09 (Фигура 3А). Тъй като HN протеинът беше основният протеин, който беше отговорен за термостабилността на HR09, двата химерни NDVs все още запазиха термостабилността точно като техния родителски щам HR09 (Фигура 3B). Множество проучвания съобщават, че съответстващата на генотипа NDV ваксина може да индуцира по-високо ниво на хуморален имунитет и е по-ефективна за намаляване на отделянето на вируси от хетероложната ваксина, въпреки че както съвпадащите по генотип, така и хетероложните ваксини могат да защитят заразените пилета от очевидни клинични признаци и смърт [35–37]. В това проучване HI титърът на антитялото беше измерен при 7-, 14- и 21-dpi, резултатите от титъра на антитялото срещу имунизирания влак показват, че няма значителна разлика между rcHR{ {13}}CI, rcHR09-CII и щамове La Sota (Фигура 4A), докато HI антитялото срещу щама ZJ1 на генотип VII показа, че двата термостабилни химерни NDV индуцират значително по-високо ниво от щама La Sota, и сред всичките три имунизирани NDV, rcHR09-CI индуцира най-високото ниво на HI антитяло (Фигура 4В). Този резултат е в съответствие с предишни доклади, че мястото на разцепване на F протеин може да повлияе на имунния отговор на кандидатите за ваксина при пилета. Експериментът с предизвикване на генотип VII ZJ1 показа, че и трите имунизирани групи показват значително намаляване на вирусното отделяне в сравнение с контролната група и двата химерни термостабилни NDV могат да намалят вирусното отделяне по-ефективно от щама La Sota (Фигура 5). Кривата на преживяемост показа, че всички щамове rcHR09-CI, rcHR09-CII и La Sota могат да осигурят пълна защита срещу предизвикателството на щама ZJ1 (Фигура 6). Комбинирани, тези данни показват, че двата съвпадащи с генотип VII химерни NDVs, конструирани в това проучване, могат да осигурят ефикасна защита срещу предизвикателството на генотип VII ZJ1 щам и могат да намалят отделянето на вирус по-ефективно от щама La Sota. В обобщение, това проучване конструира две термостабилни химерни кандидати за NDV ваксина, които използват термостабилния генотип VIII NDV вирулентен щам HR09 като гръбнак и заменят неговия F ген с този на генотип VII DT-2014 щам. Междувременно, мястото на разцепване на F протеин на DT-2014 е мутирало от 112RRQRR↓F 117 съответно до 112ERQER↓L 117 и 112GRQGR↓L 117. Двата химерични NDV запазват термостабилността на HR09 и тестовете за вирулентност от MDT и ICPI показват, че те са успешно атенюирани. И двата химерични NDV могат да индуцират високо ниво на отговор на антитела, значително да намалят отделянето на вируса и да осигурят пълна защита срещу предизвикателството на вирулентен генотип VII ZJ1 щам.

Препратки

1. Димитров, К.М.; Abolnik, C.; Афонсо, CL; Албина, Е.; Bahl, J.; Берг, М.; Briand, FX; Браун, IH; Чой, KS; Чвала, И.; et al. Актуализирана унифицирана система за филогенетична класификация и преработена номенклатура за вируса на нюкасълската болест. заразявам. Женет. Еволюция 2019, 74, 103917. [CrossRef] [PubMed]

2. de Leeuw, O.; Peeters, B. Пълна нуклеотидна последователност на вируса на нюкасълската болест: Доказателство за съществуването на нов род в подсемейството Paramyxovirinae. J. Gen. Virol. 1999, 80 Pt 1, 131–136. [CrossRef]

3. Czeglédi, A.; Уйвари, Д.; Somogyi, E.; Wehmann, E.; Werner, O.; Lomniczi, B. Трета категория размер на генома на птичи парамиксовирус серотип 1 (вирус на нюкасълската болест) и еволюционни последици. Virus Res. 2006, 120, 36–48. [CrossRef]

4. Ганар, К.; Дас, М.; Синха, С.; Kumar, S. Вирус на нюкасълската болест: Текущо състояние и нашето разбиране. Virus Res. 2014, 184, 71–81. [CrossRef]

5. Кабилов, М.Р.; Аликина, TY; Юрченко, К. С.; Глущенко, AV; Gunbin, KV; Шестопалов, AM; Губанова, Н. В. Пълни геномни последователности на два щама на вируса на нюкасълската болест, изолирани от дива патица и гълъб в Русия. Обявяване на генома. 2016, 4, e01348-16. [CrossRef]

6. Рен, С.; Xie, X.; Wang, Y.; Тонг, Л.; Гао, X.; Jia, Y.; Wang, H.; Фен, М.; Джан, С.; Xiao, S.; et al. Молекулярна характеристика на клас I щам на вируса на нюкасълската болест, изолиран от гълъб в Китай. Птичи патол. 2016, 45, 408–417. [CrossRef]

7. Morrison, TG. Структура и функция на слят протеин на парамиксовирус. Biochim. Biophys. Acta 2003, 1614, 73–84. [CrossRef]

8. Босарт, К.Н.; Фуско, DL; Broder, CC Paramyxovirus влизане. адв. Exp. Med. Biol. 2013, 790, 95–127. [CrossRef]

9. Колинс, MS; Bashiruddin, JB; Alexander, DJ Изведе аминокиселинни последователности в мястото на разцепване на слети протеини на вируси на Нюкасълска болест, показващи вариации в антигенността и патогенността. арх. Virol. 1993, 128, 363–370. [CrossRef]

10. Панда, А.; Хуанг, З.; Elankumaran, S.; Rockemann, DD; Samal, SK Роля на мястото на разцепване на слят протеин в вирулентността на вируса на нюкасълската болест. Microb. Патоген. 2004, 36, 1–10. [CrossRef]

11. Ким, SH; Чен, З.; Йошида, А.; Палдурай, А.; Xiao, S.; Samal, SK Оценка на последователностите на мястото на разцепване на слети протеини на вируса на нюкасълската болест във ваксини, съответстващи на генотип. PLoS ONE 2017, 12, e0173965. [CrossRef] [PubMed]

12. Манохаран, ВК; Varghese, BP; Палдурай, А.; Samal, SK Ефект на последователността на мястото на разцепване на слят протеин върху генерирането на ваксина срещу вируса на генотип VII на нюкасълската болест. PLoS ONE 2018, 13, e0197253. [CrossRef] [PubMed]

13. Кумар, С.; Наяк, Б.; Колинс, Полша; Samal, SK Оценка на F и HN протеините на вируса на нюкасълската болест в защитния имунитет чрез използване на рекомбинантен вектор на птичи парамиксовирус тип 3 при пилета. J. Virol. 2011, 85, 6521–6534. [CrossRef] [PubMed]

14. Цао, Й.; Liu, Q.; Джан, X.; Hu, H.; Wu, Y. Пълна геномна последователност на топлоустойчив щам на вируса на Нюкасълска болест HR09. Обявяване на генома. 2017, 5, e01149-17. [CrossRef] [PubMed]

15. Руан, Б.; Джан, X.; Zhang, C.; Du, P.; Meng, C.; Гуо, М.; Wu, Y.; Cao, Y. Остатъци 315 и 369 в HN протеин допринасят за термостабилността на вируса на нюкасълската болест. Преден. Microbiol. 2020, 11, 560482. [CrossRef] [PubMed]

16. Руан, Б.; Liu, Q.; Чен, Й.; Ниу, X.; Уанг, X.; Zhang, C.; Гуо, М.; Джан, X.; Cao, Y.; Wu, Y. Генериране и оценка на кандидат за ваксина на атенюиран и топлоустойчив генотип VIII вирус на нюкасълската болест. домашни птици. Sci. 2020, 99, 3437–3444. [CrossRef]

17. Джан, X.; Бо, З.; Meng, C.; Чен, Й.; Zhang, C.; Cao, Y.; Wu, Y. Генериране и оценка на рекомбинантен термостабилен вирус на нюкасълската болест, експресиращ HA на вируса на птичия грип H9N2. Вируси 2021, 13, 1606. [CrossRef]

18. Уен, Г.; Chen, C.; Guo, J.; Джан, З.; Shang, Y.; Шао, Х.; Luo, Q.; Янг, Дж.; Wang, H.; Wang, H.; et al. Разработване на нов термостабилен вектор за ваксина срещу вируса на нюкасълската болест за експресия на хетероложен ген. J. Gen. Virol. 2015, 96, 1219–1228. [CrossRef]

19. LaBarre, DD; Lowy, RJ Подобрения в методите за изчисляване на оценките на вирусния титър от TCID50 и анализи на плака. J. Virol. Методи 2001, 96, 107–126. [CrossRef]

20. Alexander, DJ Нюкасълска болест и други парамиксовируси по птиците. Rev. Sci. техн. Вътр. Изкл. Епизоот. 2000, 19, 443–462. [CrossRef]

21. Ю, XH; Cheng, JL; Xue, J.; Джин, JH; Песен, Й.; Zhao, J.; Zhang, GZ Роли на асоциираните с полимераза протеинови гени във вирулентността на вируса на нюкасълската болест. Преден. Microbiol. 2017, 8, 161. [CrossRef] [PubMed]

22. Maamary, J.; Array, F.; Гао, Q.; Гарсия-Састре, А.; Steinman, RM; Палезе, П.; Nchinda, G. Вирусът на нюкасълската болест, експресиращ насочен към дендритни клетки HIV gag протеин, индуцира мощен gag-специфичен имунен отговор при мишки. J. Virol. 2011, 85, 2235–2246. [CrossRef] [PubMed]

23. Ейд, AAM; Хюсеин, А.; Хасанин, О.; Elbakrey, RM; Daines, R.; Sadeyen, J.-R.; Abdien, HMF; Хрзастек, К.; Iqbal, M. Разпространение на генотип VII на болестта на Нюкасъл при домашни птици и диви птици в Египет. Вируси 2022, 14, 2244. [CrossRef] [PubMed]

24. Хеджази, З.; Tabatabaeizadeh, SE; Toroghi, R.; Farzin, H.; Saffarian, P. Първо откриване и характеризиране на субгенотип XIII.2.1 Вирус на нюкасълската болест, изолиран от пилета в двора в Иран. ветеринарен лекар Med. Sci. 2022, 8, 2521–2531. [CrossRef] [PubMed]

25. Цай, HJ; Chang, KH; Tseng, CH; Фрост, КМ; Манвел, RJ; Alexander, DJ Антигенна и генотипна характеристика на вируси на нюкасълската болест, изолирани в Тайван между 1969 и 1996 г. Vet. Microbiol. 2004, 104, 19–30. [CrossRef]

26. Капчински, DR; Кинг, DJ Защита на пилета срещу явно клинично заболяване и определяне на отделянето на вируси след ваксинация с налични в търговската мрежа ваксини срещу вируса на нюкасълската болест при заразяване със силно вирулентен вирус от екзотичната епидемия от нюкасълската болест в Калифорния през 2002 г. Vaccine 2005, 23, 3424–3433. [CrossRef] [PubMed]

27. Чо, SH; Ким, SJ; Kwon, HJ Геномна последователност на антигенен вариант на вируса на нюкасълската болест, изолиран в Корея. Вирусни гени 2007, 35, 293–302. [CrossRef]

28. Хан, ТА; Рю, Калифорния; Rehmani, SF; Ахмед, А.; Василенко, JL; Милър, PJ; Afonso, CL Филогенетична и биологична характеристика на изолатите на вируса на нюкасълската болест от Пакистан. J. Clin. Microbiol. 2010, 48, 1892–1894. [CrossRef]

29. Лиу, Й.; Sun, C.; Чи, М.; Wen, H.; Zhao, L.; Песен, Й.; Лиу, Н.; Wang, Z. Генетична характеристика и филогенетичен анализ на вируса на нюкасълската болест от Китай. заразявам. Женет. Еволюция 2019, 75, 103958. [CrossRef]

30. Simmons, GC Изолирането на вируса на нюкасълската болест в Куинсланд. Aust. ветеринарен лекар J. 1967, 43, 29–30. [CrossRef]

31. Тойода, Т.; Сакагучи, Т.; Имаи, К.; Inocencio, NM; Gotoh, B.; Хамагучи, М.; Nagai, Y. Структурно сравнение на мястото на активиране на разцепването на слетия гликопротеин между вирулентни и авирулентни щамове на вируса на нюкасълската болест. Вирусология 1987, 158, 242–247. [CrossRef] [PubMed]

32. Динг, Л.; Чен, П.; Бао, X.; Li, A.; Jiang, Y.; Hu, Y.; Ge, J.; Zhao, Y.; Wang, B.; Liu, J.; et al. Рекомбинантните вируси на ентерит по патици, експресиращи F гена на вируса на нюкасълската болест (NDV), предпазват пилетата от смъртоносно заразяване с NDV. ветеринарен лекар Microbiol. 2019, 232, 146–150. [CrossRef] [PubMed]

33. Jia, W.; Джан, X.; Wang, H.; Teng, Q.; Xue, J.; Zhang, G. Конструиране и имунна ефикасност на рекомбинантен ваксинален щам на пуешки херпесвирус, експресиращ слят протеин на генотип VII вирус на нюкасълската болест. ветеринарен лекар Microbiol. 2022, 268, 109429. [CrossRef] [PubMed]

34. Шао, Й.; Sun, J.; Хан, З.; Liu, S. Рекомбинантен вирус на инфекциозен ларинготрахеит, експресиращ F протеин на вируса на нюкасълската болест, предпазва пилетата от заразяване с вируса на инфекциозен ларинготрахеит и вируса на нюкасълската болест. Vaccine 2018, 36, 7975–7986. [CrossRef]

35. Милър, PJ; Кинг, DJ; Афонсо, CL; Suarez, DL Антигенните разлики между щамовете на вируса на нюкасълската болест от различни генотипове, използвани във формулировката на ваксината, влияят на отделянето на вируса след вирулентно предизвикателство. Vaccine 2007, 25, 7238–7246. [CrossRef]

36. Мохамед, MH; Абделазиз, AM; Кумар, С.; Ал-Хабиб, Масачузетс; Megahed, MM Ефект на филогенетичното разнообразие на велогенното предизвикателство с вируса на нюкасълската болест върху отделянето на вирус след хомоложна и хетероложна ДНК ваксинация при пилета. Птичи патол. 2016, 45, 228–234. [CrossRef]

37. Ваджид, А.; Башарат, А.; Биби, Т.; Rehmani, SF Сравнение на защитата и отделянето на вируси след ваксинация с щамове на вируса на нюкасълската болест от различни генотипове, използвани във формулировката на ваксината. Троп. Anim. Health Prod. 2018, 50, 1645–1651. [CrossRef]