Имунни отговори към последователна бинокулярна трансплантация на алогенни прогениторни клетки на ретината към кухината на стъкловидното тяло при мишки

Резюме:

Интравитреалната трансплантация на алогенни човешки прогениторни клетки на ретината (RPC) е обещаваща като лечение на ослепителна дегенерация на ретината. Предишна работа е показала, че невралните прогенитори се понасят добре като алографти след единични инжекции; въпреки това, последователното доставяне на алогенни клетки повишава потенциалния риск от сенсибилизация на гостоприемника с последващо имунно отхвърляне на присадките. Настоящото проучване е предназначено да оцени дали имунен отговор ще бъде индуциран от повтарящи се интравитреални трансплантации на алогенни RPCs, използвайки миши животински модел. Ние инжектирахме миши ретинални прогениторни клетки (gmRPCs), първоначално получени от донори с C57BL/6 генетичен произход, в BALB/c реципиентни мишки, за да предоставим данни за безопасност относно това какво може да се очаква след многократно лечение на пациенти с алогенен човешки клетъчен продукт . Имунните отговори към gmRPCs са леки, състоящи се от Т клетки, В клетки, неутрофили и естествени клетки убийци, като макрофагите явно преобладават. Животните, третирани с повтарящи се дози gmRPCs, не показват данни за сенсибилизация, нито има имуномедиирано унищожаване на присадките. Въпреки липсата на имуносупресивно лечение, алогенните gmRPC присадки оцеляват след повторно дозиране, като по този начин осигуряват подкрепа за предварителното наблюдение, че многократното инжектиране на алогенни RPCs в кухината на стъкловидното тяло се толерира при пациенти с ретинит пигментоза.

растение цистанче, повишаващо имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Ключови думи: стволови клетки; имунна толерантност; имунна привилегия; отхвърляне на присадката; интравитреална инжекция

1. Въведение

Ретинит пигментоза (RP) обхваща клас генетична дегенерация на пръчковиден конус и води до прогресивно зрително увреждане и евентуална слепота. За по-голямата част от случаите няма налични доказани терапевтични мерки за запазване или възстановяване на зрението; обаче, една стратегия за справяне с тази неудовлетворена медицинска нужда е трансплантацията на стволови клетки. Нашата изследователска група е изследвала интравитреалното инжектиране на култивирани човешки прогениторни клетки на ретината (RPC) като начин за интервенция в RP с терапевтичната цел за стабилизиране на прогресията или може би обръщане на хода на заболяването. RPG могат да бъдат получени от незрели ретини чрез даряване на тъкани или, по-скоро, от плурипотентни клетъчни линии. Проучвания върху животински модели показват, че тези клетки са способни да спасяват фоторецепторите от дегенерация след инжектиране в окото и също така са способни да се диференцират в пръчковидни фоторецептори в окото на гостоприемника. Има някои доказателства от проучвания върху животни, че инжектираните hRPC могат да станат функционални, интегрирани фоторецептори и по този начин потенциално да стабилизират ретината чрез директно заместване на умиращи клетки. По този начин, инжектираните hRPCs могат да лекуват RP както по невротрофичен начин, така и чрез механизъм за заместване на клетки. Така или иначе, този клетъчно базиран подход предлага рационална стратегия за лечение на пациенти, страдащи от RP и, потенциално, други заболявания на ретината.

Друг благоприятен атрибут на RPCs и може би невралните предшественици като цяло е относителната толерантност, предоставена на тези клетки след трансплантация като алографти, особено когато се доставят на място, проявяващо имунна привилегия като ретината [1,2]. Въпреки това последните прегледи на клинични проучвания, проведени в областта на регенеративната медицина, продължават да съобщават за широко разпространени и значителни предизвикателства, свързани с възпаление и имунно отхвърляне [3,4], включително за интервенции, насочени към окото, като генни терапии на ретината [5], като както и някои, но не всички клетъчни терапии [6]. Въпреки че е локален клетъчен тип, клетката на пигментния епител на ретината (RPE) не е освободена от проблеми с отхвърлянето [7–9]; следователно имунната супресия на реципиентите в момента е стандартна практика [10,11]. Човешките RPC, от друга страна, изглеждат забележително добре поносими като алотрансплантати [6,12–16], въпреки че това не се простира до употребата им като ксенотрансплантати, където се изисква имунна супресия [17]. Основата за продължително оцеляване на алогенните RPC в окото вероятно включва редица фактори, свързани с използваните клетки и мястото на реципиента [1,8,18,19]. В предишна работа, използваща поточна цитометрия, ние показахме, че човешки неврални предшественици, както получени от мозъка, така и получени от ретината, експресират клас I, но не и клас II, основни антигени на хистосъвместимост (МНС) [20,21]. Класическият механизъм на отхвърляне на присадката включва неспецифичното разпознаване на чужди МНС молекули клас II от CD4+ лимфоцити гостоприемник [20–25]. По този начин липсата на молекули от клас II може да позволи на присадени прогениторни клетки да избегнат имунното отхвърляне, медиирано чрез този механизъм. Въпреки това, очевидният статус на "имунно привилегирован" на интравитреално инжектирани hRPCs не е непременно абсолютен. Докато прогениторите на мишата централна нервна система (ЦНС) не експресират откриваеми клас I или клас II МНС молекули на изходно ниво и проявяват очевидна имунна привилегия като алографти [1,2,20], тези клетки могат да претърпят имунно отхвърляне при определени обстоятелства. Проучванията показват, че MHC антигените могат да бъдат индуцирани чрез стимулиране на прогенитори на ЦНС с интерферон-гама (IFN) [1,26]. Прогениторите на ЦНС могат да бъдат отхвърлени след сенсибилизация на предварително присаден гостоприемник. Следователно прогениторните клетки на ЦНС (включително RPCs) наистина експресират алоантигени, които се откриват от имунната система на гостоприемника. Заедно, това означава, че имунният привилегирован статус на присадени прогениторни клетки е условен и подлежи на модулация, например от цитокини, присъстващи в локалната микросреда, и които могат да претърпят промяна по време на дегенерации като RP. Поради всички тези причини, имунният отговор на множество интравитреални RPC инжекции е трудно да се предвиди и трябва да бъде специално изследван.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Ако лечението с RPC се окаже клинично успешно при RP, ще има силни стимули за лечение на двете очи при това двустранно ослепяващо заболяване. Най-малкото от съображения за безопасност бинокулярните лечения обикновено се извършват последователно, със значително забавяне между двете инжекции. Трябва да се отбележи, че това последователно доставяне на алогенни клетки може да доведе до сенсибилизация на гостоприемника в отговор на първата инжекция, потенциално задействайки имунно отхвърляне в отговор на втората инжекция. Това може да доведе до загуба на присадки и в двете очи. Предишни доклади, изследващи еднократно субретинално дозиране с hRPCs в RP [27] или повторно дозиране с човешки невронни предшественици при животни [28, 29], включват имунна супресия. Следователно, следващото проучване е проектирано като транслационно изследване на миши RPCs като последователни алографти в имунокомпетентен миши щам с различен генетичен произход. Въпреки че не включва човешки RPC продукти, тази работа е извършена като част от проучвания, позволяващи IND, за да се осигурят данни за животни, насочени към безопасността, т.е. дали имунната супресия ще бъде необходима за пациенти, получаващи многократно лечение с RPC алографт в регистрирани от FDA проучвания.

2. Резултати

За изследване на имунологичните последици от двустранно инжектиране на RPC в алогенни мишки, gmRPCs (C57BL/6 генетичен фон) се инжектират интравитреално в едното око на реципиенти на BALB/c и втора доза RPCs се инжектира в другото око 2 седмици по-късно. 2-седмичният интервал от време беше избран да бъде достатъчен, за да позволи на първата присадка да индуцира както вроден, така и адаптивен имунен отговор. Нито едно от експерименталните животни не е получило никакво имуносупресивно лекарствено лечение, така че да могат да се наблюдават естествените физиологични имунни отговори.

2.1.Клиничното наблюдение и офталмологичният преглед не разкриха аномалии

Теглото на експерименталните животни се измерва по време на всяко инжектиране на gmRPC. Всички експериментални животни показват наддаване на тегло между първата и втората инжекция, което съответства на общото добро здраве. Животните, които са прекратени на ден 14 и ден 28 ± 1 след втората инжекция с gmRPC, се изследват през хирургическия микроскоп. Както предният, така и задният сегмент на по-голямата част от изследваните очи бяха оценени като "в нормални граници" (WNL). Няма признаци на възпаление или други видими аномалии в рамките на нелекувани, фиктивно третирани и третирани с gmRPC групи, което показва, че интравитреалното инжектиране на gmRPC не е довело до незаконни възпалителни реакции или физическо увреждане на тъканите, откриваемо чрез този метод. Клетъчните клъстери, съставляващи присадката, бяха видими в стъкловидното тяло както на ден 14, така и на ден 28 ± 1 след втората инжекция с gmRPC (Фигура 1). Многократното инжектиране на gmRPCs не предизвиква забележими промени в размера на клетъчните клъстери, в съответствие с продължително оцеляване на донорни клетки. Грубата патология също беше оценена в крайната крайна точка и не бяха отбелязани увеличени очни ябълки (показателни за образуване на тумор) или други аномалии.

Фигура 1. Трансплантирани gmRPCs, визуализирани in vivo чрез фотография на фундуса през хирургически микроскоп (всички=ляво око, OS). (A, B), фалшиво третирани животни (sham/sham, S/S); (C, D), контролни животни с ляво око, третирано с фиктивно око, последвано от ляво око, третирано с gmRPCs (фалшиво/клетка, S/C), и животни с двете очи, третирани последователно с gmRPCs (клетка/клетка, C/C) бяха наблюдавани и изобразени през хирургическия микроскоп. Горният панел (A, C, E) показва изображения на OS, направени на ден 14 след втората инжекция; долният панел (B, D, F) показва изображения на OS, направени на Ден 28 след второто инжектиране. Алографтите се наблюдават като бледооцветени клетъчни струпвания (стрелки), видими в стъкловидното тяло на клетъчно инжектираните леви очи (S/C, C/C) и в двете времеви точки (Ден 14: (C, D); и Ден 28: ( E, F)). Освен присадките, няма очевидно възпаление или допълнителна аномалия, наблюдавана в предния и задния сегмент, както се гледа аксиално по този начин.

2.2. Имунофлуоресцентното маркиране показва имунни клетки в стъкловидното тяло

Имунофлуоресцентно маркиране за пет основни типа имунни клетки (макрофаги, неутрофили, естествени клетки убийци, Т клетки и В клетки) беше извършено върху очните криосекции и разкри положителна имунна клетъчна инфилтрация в окото след инжектиране на gmRPC (Фигура 2A-F). Т-клетките (CD3), В-клетките (CD45R), неутрофилите (Ly-6G) и естествените клетки убийци (CD49b) показват ограничено присъствие в очите, инжектирани с gmRPCs, докато активираните макрофаги (Iba-1 ) бяха основните имунни клетки, отговарящи на интравитреалните присадки. Сравнима тъкан от нелекувани и фиктивно третирани животни не показва имунни клетки в очни криосекции, което предполага, че наблюдаваната имунна клетъчна инфилтрация е отговор на gmRPC присадките. В съответствие с това наблюдение, имунните клетки са разположени в областта около gmRPC присадките или в самите gmRPC клъстери.

Фигура 2. Имуномаркиране на инфилтрирани имунни клетки по група на лечение. Имунофлуоресцентни изображения на (A) контролни секции (само вторично антитяло), (B) анти-Iba-1 (маркер за активирани макрофаги и микроглия), (C) анти-Ly-6G (маркер за неутрофили), (D) анти-CD49b (естествен клетъчен маркер убиец), (E) антитела анти-CD3 (Т клетъчен маркер) и (F) анти-CD45R (В клетъчен маркер) са показани на фигурата. Наличните ограничени червени сигнали показват положително маркиране на антитяло за левкоцитни маркери, зелените сигнали показват gmRPC присадките, а сините сигнали показват DAPI ядрено маркиране. Жълтото е неспецифично припокриване на сигнали, най-очевидно във външните сегменти на фоторецептора, които проявяват автофлуоресценция. Групи на лечение: нелекувани (UT), и двете очи нелекувани; S/S, двете очи са третирани (последователно) с носител; S/C, дясно око, инжектирано с носител, последвано от ляво око с 50,000 gmRPC и; C/C, двете очи инжектирани с 50,000 gmRPCs (последователно) по график в раздел 4

Пиковите числа на всяка имунна клетка в окото варират според типа клетка (Фигура 3A-E). За разлика от това, двупосочната ANOVA не разкрива разлики в инфилтрацията на имунните клетки при сравняване на животни, които са получили единични gmRPC инжекции (фалшиви/клетки) с тези, които са получили двустранни инжекции (клетки/клетки). Такъв беше случаят с инфилтрация на макрофаги (анти-Iba-1 оцветяване) (Фигура 3A), неутрофили (анти-Ly-6G оцветяване) (Фигура 3B), естествени клетки убийци (CD49b оцветяване) ( Фигура 3C), Т клетки (CD3 оцветяване) (Фигура 3D) и В клетки (CD45R оцветяване) (Фигура 3E).

2.3. ELISPOT не показа отговори за припомняне на антиген

ELISPOT е начин за изследване на антиген-специфичен IFN, продуциращ активиране на Т клетки. Лечението с форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA) е положителна контрола, имитираща втория посредник, DAG, за активиране на Т-клетъчния рецепторен път и на свой ред причинява активиране на Т-клетките. На Фигура 4A-D групите, третирани с PMA, показват много по-висок брой точки на IFN в сравнение с контролните групи само с реагиращи клетки (т.е. лимфоцити от CLNs, спленоцити от далаци). Когато респондерните клетки бяха съвместно култивирани със C57BL/6 спленоцити (B6 SPL), пробите от ден 14 бяха сравними с групите само с респондерни клетки, само с малко по-висок брой точки на IFN, което показва липса на Т клетъчно активиране (Фигура 4А, Б).

Фигура 3. Количествено определяне на инфилтрацията на имунни клетки след трансплантация на gmRPC. Инфилтрираните имунни клетки се визуализират като червени флуоресцентни сигнали в полето за изобразяване след инжектиране на gmRPC за всяко експериментално състояние, преброени с помощта на ImageJ и нанесени в лентови графики. Данни от Iba-1 (маркер за активирани макрофаги и микроглия) (A), анти-Ly-6G (маркер за неутрофили) (B), anti-CD49b (маркер за естествени клетки убийци) (C), антитела анти-CD3 (Т клетъчен маркер) (D) и анти CD45R (В клетъчен маркер) (E) са показани на фигурата. Използвани са двупосочни ANOVA тестове за тестване на значимостта между групите фалшиви/клетъчни и клетки/клетъчни; p стойностите бяха: (A) p < {{10}}.4492, (B) p < 0.9376, (C) p < 0.119{{18 }}, (D) p <0,6411 и (E) p <0,7201 (нито един не е значим).

При тестване на алогенни донорни клетки с помощта на този анализ, отговорните клетки от животните, инжектирани интраперитонеално с gmRPCs (IP група), не са имали отговори за припомняне на антиген, тъй като пробите не са показали повече Т клетъчно активиране чрез преброяване на точки на IFN в сравнение с фиктивните животни, които никога не са били експонирани към gmRPC (фалшиво/фалшиво). Нито животните, които са били интравитреално инжектирани с gmRPCs, нито веднъж (фалшиво/клетка), нито многократно (клетка/клетка), не показват реакции на припомняне на антиген. В един случай отговорите на повторното дозиране на gmRPC изглеждаха по-приглушени (Фигура 4B). Заедно тези резултати показват, че gmRPCs проявяват много ниска антигенност. Имайте предвид, че C57BL/6 спленоцитите са съпоставени с генетичния фон на gmRPCs. Неочаквано, алтернативните стимулаторни клетки, gmRPCs, увеличиха броя на точките на IFN във всички експериментални групи в сравнение с отрицателните контролни групи (Фигура 4A-D). Потенциално обяснение може да са gmRPCs, причиняващи висок фон в този анализ. Важно е, че няма разлика между групите с нелекувани, фиктивно третирани, единична инжекция с gmRPC и групите с повторно инжектиране на gmRPC, което отново показва липса на реакции за припомняне на антиген.

Фигура 4. Количествено определяне на ELISPOT след трансплантация на gmRPC. Тестовете ELISPOT бяха определени като следните групи: контрола, само реагиращи клетки (лимфоцити или спленоцити, съдържащи Т клетки, изолирани от цервикални лимфни възли (CLNs) или далаци (SPL) на експерименталните животни; PMA, реагиращи клетки, третирани с форбол {{1} }миристат 13-ацетат (PMA) и Ca йонофор; B6 SPL, отговарящи клетки, смесени със спленоцити, изолирани от C57BL/6 животни; gmRPCs, същите отговарящи клетки, смесени с gmRPCs. (A), отговарящите клетки са спленоцитите от експерименталните животни, които са били умъртвени на 14-ия ден след втората инжекция с gmRPCs. (B) Отговорилите клетки са били лимфоцитите от CLNs на експерименталните животни, които са били умъртвени на 14-ия ден след втората инжекция с gmRPCs. (C) Отговорилите клетки бяха спленоцитите от експерименталните животни, които бяха умъртвени на ден 29 след втората инжекция с gmRPCs.(D) Реагиращите клетки бяха лимфоцитите от CLNs на експерименталните животни, които бяха умъртвени на ден 29 след втората инжекция с gmRPCs. Използвани са двупосочни ANOVA тестове за тестване на значимостта (*) между групите фалшива/клетка и клетка/клетка; p стойностите бяха: (A) p < 0.5332, (B) p < 0.0001 (значително), (C) p < 0,0207 ( значимо) и (D) p <0.3355.

3. Дискусия 

Има значителен интерес към технологията на стволовите клетки като средство за лечение на дегенеративни заболявания на ретината и нашата група проучва използването на алогенни hRPCs в RP. За да съберем данни, насочени към потенциални имунни последствия, когато повече от една доза алогенен човешки RPC продукт се прилага чрез интравитреална инжекция, ние проведохме настоящото изследване върху животни, използвайки gmRPCs от C57BL/6 фон като присадки и BALB/c мишки като гостоприемници. Тези различни генетични среди бяха използвани за моделиране на последователно лечение с алогенни hRPCs и предоставяне на предварителни данни за безопасност преди тестване при хора.

За да се оценят напълно отговорите, животните гостоприемници не са получили имуносупресивно лечение. Сравнихме имунните отговори, генерирани от единична инжекция на gmRPC с последователно двустранно дозиране съгласно описания график на инжектиране. Офталмологичните прегледи не разкриват възпаление или други забележими разлики между групите животни, които са получили 1 доза gmRPCs или 2 дози gmRPCs, което предполага, че или реципиентите не са били сенсибилизирани от първоначалното лечение с gmRPC, или сенсибилизацията е била едва доловима. Резултатите от имуномаркирането разкриха, че всичките пет изследвани типа имунни клетки, а именно Т клетки (CD3), В клетки (CD45R), макрофаги (Iba-1), неутрофили (Ly-6G) и естествени клетки убийци ( CD49b), е инфилтрирал в окото и е насочен към RPC присадките след трансплантация. Независимо от това, тази инфилтрация беше сравнително умерена и въпреки че други типове клетки бяха откриваеми, тя беше предимно съставена от Iba-1 положителни макрофаги. Присъстваха много ограничен брой Т клетки, В клетки, неутрофили и естествени клетки убийци. Интересното е, че преживяемостта, демонстрирана от единични и повтарящи се RPC присадки, е еквивалентна, без загуба на присадки и в двата случая, въпреки наличието на макрофаги. Като цяло, това предполага, че както вродените, така и адаптивните имунни отговори към генетично различни RPCs са били умерени, въпреки че имунната супресия не е била използвана. Освен това, резултатите от анализа на ELISPOT не показват реакции на припомняне на антиген в групи, третирани с gmRPC, в съответствие с твърдението, че Т клетките не играят важна роля в отхвърлянето на gmRPC присадки от C57BL/6 мишки. Отново се наблюдава инфилтрация на макрофаги на gmRPC присадки, въпреки че това не е свързано със значително разрушаване на присадката от типа, свързан с класическото имунно отхвърляне [22–24].

Cistanche ползи за мъжете - укрепване на имунната система

Заедно тези наблюдения разкриват ситуация, която ясно се различава от широко признатите механизми за алогенно отхвърляне на трансплантант, медиирани от Т и В клетки, наблюдавани в други тъкани. Множество фактори могат да допринесат за тази ситуация. От една страна, съществува представата за окото като място с "имунни привилегии", въпреки че степента, до която стъкловидното тяло споделя подобни характеристики с роговицата и ретината, е по-малко проучена и може би по-спорна. От друга страна, изглежда, че самите RPCs проявяват намалена имуногенност като алографти, в сравнение с по-често изследваните типове клетки. Както показахме по-рано, миши RPCs нямат изходна експресия на МНС клас I и клас II антигени, въпреки че те са индуцируеми чрез цитокинова стимулация. Тази липса на експресия на МНС може да допринесе за оцеляването на тези клетки след трансплантация. Независимо от това, наличието на имунни клетки в присадките подкрепя концепцията, че толерантността към присадката в тази среда не е пасивна и е резултат от активен имунорегулаторен феномен. Тук трябва да се подчертае, че същият вид имунна клетъчна инфилтрация вече е налице след единични инжекции и не се влошава от повторно дозиране, като по този начин се подчертава нашето заключение, че имунната клетъчна инфилтрация на присадките, особено от макрофагите, не е резултат от предишни сенсибилизация на гостоприемника. В рамките на параметрите на този експеримент, многократното дозиране изглежда не намалява общата жизнеспособност на присадката, което е в съответствие с възможността за продължителна ефикасност в терапевтичен контекст. Алтернативни параметри, като различни интервали между инжектиране, могат или да увеличат, или да намалят активността на имунните клетки до степен, която би била от значение за клиничното приложение. Не е ясно дали клетъчните съставки на инфилтратите, включително преобладаването на макрофаги, ще се отнасят и за хората. Освен това, оцеляването на тези алографти може да не зависи от нормална ретина със здрава кръвно-ретинална бариера. Получателите на BALB/c, използвани тук, са албиноси и са податливи на светлинни увреждания [30]. Освен това, продължително оцеляване е наблюдавано многократно в предишна работа с различни модели на дегенерация на ретината (напр. [31]).

В сравнение с оцеляването на присадката, жизнеспособността на клетките в присадките представлява по-сложна ситуация. Съществува известна загуба на прогениторни клетки на ЦНС, която настъпва бързо след трансплантация, вероятно поради множество фактори, потенциално включващи внезапно отнемане на растежния фактор. Веднъж установени в окото, дисоциираните клетки се сливат в сферични агрегати, чиито центрове изглежда осигуряват неоптимална микросреда за растеж, вероятно поради липсата на васкуларизация и предизвикателства пред дифузията на хранителни вещества. Очевидният тропизъм на макрофагите за RPC присадките може да бъде неспецифичен отговор на присъствието на тези нежизнеспособни клетки във вътрешността на присадките, като макрофагите функционират в ролята си на чистачи на клетъчни остатъци. Като алтернатива, напълно жизнеспособни RPC могат активно да привличат макрофагите, например чрез експресия на химио-атрактивни цитокини, при което клетките-гостоприемници биха се сблъскали вторично с отломките от нежизнеспособни донорни клетки. Важно е, че степента на инфилтрация на макрофаги, наблюдавана в тези конкретни настройки, не изглежда да има отрицателни последици за присадката или ретината на гостоприемника, за разлика от отговорите на клетъчни алографти в неимунизирани привилегировани места [4]. И накрая, заслужава да се спомене, че докладваните тук резултати, макар и ограничени до миши модел, може да имат отражение върху работата при хора. За разлика от мишката, ние знаем, че култивираните човешки RPC наистина експресират стабилни нива на МНС клас I антигени в началото; следователно сравнението несъмнено е условно. Независимо от това е интересно да се отбележи, че клиничното тестване на субретинални hRPC присадки от група в Китай [13], както и интравитреална hRPC трансплантация от нашата група, впоследствие показаха устойчиво оцеляване на алографтите при неимуносупресирани пациенти с RP (JC -01, [32], непубликувани данни). Такъв беше и случаят след последователното инжектиране на двете очи (JC-01 разширение, непубликувани данни), аналогично на представената тук работа. В допълнение, оцеляването на присадката се наблюдава в последващо проучване на JC-02 [33], при което последователни повторни дози са приложени на едно и също око [34]. Взети заедно, тези констатации показват, че имунната супресия не винаги е необходима в условията на трансплантация на невронни прогенитори, особено на окото, въпреки че границите на това явление и основните регулаторни механизми остават да бъдат изяснени.

4. Материали и методи

4.1. Клетъчна култура

Преди това характеризирани gmRPC [31] бяха избрани като донорни клетки за това алогенно изследване. Първоначално gmRPCs бяха изолирани от GFP-трансгенни C57BL/6 мишки, генетично модифицирани да експресират подобрен зелен флуоресцентен протеин (GFP). Експресията на GFP протеин в gmRPCs представлява интерес, тъй като позволява визуализиране на присадки след инжектиране без необходимост от допълнително маркиране. За настоящото проучване gmRPCs бяха култивирани в Advanced DMEM/F12, допълнен с N-2 добавка (1:100, Life Technology, Карлсбад, Калифорния, САЩ), Glutamax-1 (1:100, Life Technology , Карлсбад, Калифорния, САЩ) и EGF (20 ng/mL, рекомбинантен, Human, Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, САЩ) и инкубиран при 37 ◦C и 5% CO2. Клетките се поддържат в смесена суспензия/свободно прикрепени колонии в колби за тъканна култура без покритие. Клетките бяха прекарани чрез трипсинизация с TrypLE Select CTS (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, САЩ), разреден 1:5 в PBS за една минута и неутрализиран с 10 пъти обема на добавения трипсин. Клетъчно-трипсиновата смес се центрофугира при 140 g за 2 минути при стайна температура, супернатантата се отстранява и клетъчната пелета се суспендира отново в прясна среда преди посяване в колби за тъканна култура при желаната концентрация. Клетъчната концентрация и жизнеспособността се определят чрез оцветяване с трипаново синьо; преброяването е извършено от Countess (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, САЩ) и хемоцитометър.

За интравитреални инжекции, клетъчната пелета се ресуспендира при 50K клетки/µL в BSS PLUS®. Клетъчната концентрация и жизнеспособността бяха оценени преди и след инжекциите. Инжектираната доза беше 50 000 клетки на око на инжекция. Дозата и носителят бяха избрани въз основа на нашите предишни проучвания.

4.2. Експериментални животни

Целта на настоящото проучване беше да се изследват потенциалните алогенни имунни отговори, предизвикани чрез повторна интравитреална инжекция на алогенни RPC. Реципиентните животни са BALB/c мишки, които се различават генетично от C57BL/6 мишките, от които са изолирани gmRPC. Използването на поне три животни на третирана експериментална група за всяка времева точка се счита за необходимо, за да се даде възможност за оценка на статистическата значимост между групите по отношение на променливите на резултатите и потенциалните загуби на животни по време на експерименталния период. Освен това, като се имат предвид многото допълнителни фактори, потенциално влияещи върху експерименталния резултат, като неуспешна процедура за инжектиране на клетки или потенциално износване в резултат на битка с животни, процедурите за инжектиране бяха извършени на пет животни на група, за да се осигури допълнително постигане на минималния брой, необходим за статистически анализ.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Таблица 1 показва четирите групи животни, подготвени за всяка от четирите времеви точки (4, 7, 14 и 28 дни), при които ще бъдат извършени оценки на хистопатологията, включително имунофлуоресценция. Две допълнителни групи животни, инжектирани с 10ˆ6 gmRPCs интраперитонеално, бяха приготвени като положителни контроли за всяка от двете времеви точки за оценка на ELISPOT (14 и 28 дни). Таблица 2 обобщава оценките, планирани за всяка група.

Таблица 1. Експериментални групи.

Таблица 2. Времеви точки за оценка.

4.3. Интравитреална инжекция

GmRPCs се прилагат чрез интравитреална инжекция. Веднъж анестезирани, мидриацил (1% офталмологичен разтвор на тропикамид) и фенилефрин (2,5% офталмологичен разтвор) се прилагат към двете очи на животното, което трябва да се инжектира. Когато беше постигната адекватна мидриаза, животното беше задържано ръчно и главата му се завъртя, за да се изравни очната ос на окото, което трябва да се инжектира с оптиката на хирургическия микроскоп, така че да се визуализира задният очен сегмент (т.е. стъкловидното тяло и ретината) . Окото беше внимателно предложено ръчно чрез натиск върху клепачите и 31G игла на инсулинова спринцовка беше използвана за внимателно пробиване на склерата в съседство с лимба в долния назален квадрант. Полиран стъклен накрайник на микропипета, съдържащ донорни клетки (или контролен носител) беше прокаран през разреза в кухината на стъкловидното тяло при директна визуализация. Бяха взети мерки да не се наруши целостта на лещата или структурите на задния сегмент. Само клетките или носителите се инжектират в обем от 1 микролитър. След няколко минути пауза, за да се позволи балансиране на вътреочното налягане, върхът на пипетата постепенно се отстранява от окото, всичко това под директна визуализация. Беше отбелязано всяко вътреочно кървене, заедно с местоположението. След инжектирането, животното се поставя в чиста клетка, облицована със свежа подложка за еднократна употреба, ориентирана с абсорбиращата страна нагоре/пластмасовата страна надолу, за да се възстанови. Възстановяването се улеснява с помощта на нагревателна подложка и се проверява чрез способността на животното да се движи. След събуждане, животното се прехвърля в следоперативната клетка с ad libitum достъп до вода. Животните се наблюдават визуално ежедневно след операцията. Наблюдавани са минимални или никакви признаци, свързани с вътреочно инжектиране.

След процедурата животните са наблюдавани за триене на оперираното око, разрошена козина или продължителна летаргия, всички от които са били основание за незабавна евтаназия. Има две животни, убити в резултат на рани, получени при битка. Всички други животни бяха прекратени в планираните крайни точки. Евтаназията е извършена чрез вдишване на CO2.

4.4. Офталмологичен преглед

A Leica Ultimate Red Reflex Surgical Microscope was used for ophthalmic examination and photography of experimental mice. Sedation was performed with a Ketamine Hydrochloride/Xylazine Hydrochloride mixture (50–100 mg/mL Ketamine, 5–10 mg/mL Xylazine) administered by intraperitoneal injection. After sedation, topical mydriatics (Tropicamide, Phenylephrine) were applied to the eye(s) to be imaged in 5 min intervals until adequate mydriasis was achieved, as determined via pupil diameter (>2,5 mm) и реакция на светлинна стимулация. Като компенсация за загубата на мигане, разтвор на хипромелоза (Gonak) се прилага локално, ако е необходимо, в двете очи, за да се предотврати изсушаване на роговицата. За процедурата по образна диагностика анестезираните животни се поставят върху нагревателна подложка и се позиционират в легнало стернално положение. В края на процедурата беше постигнато частично обръщане на анестезията с прилагане на атипамезол (0.1–1 mg/kg) чрез интраперитонеална инжекция.

4.5. Хистопатология

Имунните отговори при животни, получаващи две последователни присадки (по една във всяко око) бяха оценени чрез хистопатология на двете очи на ден 4, ден 7, ден 14 и ден 28 ± 1 след инжектирането на второто око. Мишките, които бяха третирани съгласно Таблица 1, бяха прекратени въз основа на посочения график в Таблица 2. Животните бяха евтаназирани чрез инхалация с въглероден диоксид. Сърдечни перфузии се извършват върху експерименталните животни с 2% параформалдехид (PFA) във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS). След това всички очни ябълки бяха събрани и оставени да се накиснат в 2% PFA/PBS за 48 часа при 4 ◦C. Фиксираните очни ябълки се обработват чрез градиент на захароза (10% захароза в PBS за 1 час при стайна температура, 20% захароза в PBS за 1 час при стайна температура и 30% захароза в PBS при 4 ◦C за една нощ), преди да бъдат вградени в OCT среда за криосекциониране. Криосекции (10 µm) на очите бяха оцветени с хематоксилин и еозин на Харисън (H&E), за да се визуализира микроанатомията на ретината и да се локализират инжектираните донорни клетки.

За групите, третирани с gmRPC, криосекциите бяха оценени с помощта на имунофлуоресценция за GFP+ (донорни) клетки. Идентифицирането на специфичните видове имунни клетки, присъстващи в очите, се извършва чрез маркиране със специфични първични антитела за следното: CD3 (Т лимфоцитен маркер) [35], CD45R (В лимфоцитен маркер) [36], Iba-1 (маркер за активирани макрофаги и микроглия) [37], Ly-6G (маркер за неутрофили) [38] и CD49b (маркер за естествени клетки убийци) [39]. Криосекциите се промиват в PBS три пъти при стайна температура и се блокират с 0.03% Triton X-100 и 10% нормален кози серум в PBS (NGS; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, САЩ) за 1 час при стайна температура. Плъши анти-миши CD3 (разреждане 1:100, BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния, САЩ), плъши анти-миши CD45R (1:100, BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния, САЩ), заешки анти-миши Iba{{ 26}} (разреждане 1:400, Wako Chemicals, Ричмънд, Вирджиния, САЩ), плъши анти-миши Ly-6G (1:100 разреждане, BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния, САЩ) и плъши анти-миши -миши CD49b (разреждане 1:100, BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния, САЩ) се прилагат към проби и се инкубират една нощ при 4 градуса. Пробите се промиват отново в PBS 3 пъти при стайна температура. Alexa-Fluor-конюгирани вторични антитела (кози анти-плъхови Alexa-Flour-568 и кози анти-заешки Alexa-Flour-568, Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, САЩ) бяха приложени към проби за 1 час при стайна температура. След това всички проби се промиват в PBS още три пъти при стайна температура. Покривните стъкла бяха монтирани с помощта на DAPI Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA) и слайдовете бяха оставени да изсъхнат за една нощ при стайна температура.

4.6. ELISPOT и MLR анализи

RPC-специфичните Т-клетки на паметта бяха наблюдавани на 2 и 4 седмици след първото поставяне на присадка чрез ензимно свързан имуносорбентен петнов анализ (ELISPOT). Експерименталните групи бяха създадени, както е показано в таблици 1 и 2 за всяка времева точка. Тестът ELISPOT улавя секретираните протеини върху специфична покрита с антитяло микроплака и може да се използва за определяне на активирането на Т клетки на паметта чрез откриване на Т клетъчна секреция на IFN. Експерименталното отчитане е броят на IFN точките върху микроплаката. Броят на наличните IFN точки е показателен за броя на активираните Т клетки. Честотата на алореактивните Т клетки се оценява чрез извършване на 48-часова смесена левкоцитна реакция (MLR) върху 96-ямкови Multiscreen-IP плаки (Millipore, Burlington, MA, USA). Респондерните клетки бяха лимфоцити/спленоцити, съдържащи Т клетки, пречистени от цервикални лимфни възли (CLNs) и далаци на експерименталните животни, а клетките на стимулатора бяха gmRPCs, първоначално получени от C57BL/6 мишки. Анализите ELISPOT бяха проведени въз основа на стандартен протокол. Плаките с 96-ямки Multiscreen-IP бяха предварително намокрени с 15 µL 35% етанол на ямка при стерилни условия. Плаките се промиват със стерилен PBS три пъти преди 100 µL от антитялото за улавяне на IFN (клон AN-18, eBioscience, Сан Диего, Калифорния, САЩ), разредено в PBS (2 µg/mL), се прилага към плочите. Плаките се инкубират за една нощ при 4 градуса преди MLR анализите да бъдат извършени върху плаките. Плаките, покрити с антитяло за улавяне, се промиват три пъти с PBS и след това се блокират с RPMI1640 в продължение на 2 часа при 37 °C.

Всяка от тестовите плаки включваше следните контроли: ямки, които не съдържаха клетки, ямки, съдържащи клетките без стимулация, и ямки, съдържащи клетките с третиране с форбол {{0}}миристат 13-ацетат (PMA) и Ca йонофор като положителни контроли. Лечението с PMA служи като положителна контрола, като имитира втория пратеник, DAG, за активиране на пътя на Т-клетъчния рецептор и на свой ред предизвиква активиране на Т-клетките, като йонофорът Ca улеснява навлизането на калциеви йони в клетките. Плаките се инкубират в продължение на 36 часа при 37 ◦C преди цветната реакция. Плаките се промиват с PBS, съдържащ {{10}}.01% Tween 20 шест пъти и след това 100 µL антитяло за откриване (клон R64A2, eBioscience, Сан Диего, Калифорния, САЩ), разредено в PBS (0.5 ug/mL) се прилага към всяка ямка. Плаките се инкубират при 37 ◦C за още 2 часа. Плаките отново се промиват с 0.01% Tween 20 в PBS. Прилагат се 100 µL Streptavidin-AP (разреждане 1:1000, Invitrogen) на ямка и плаките се инкубират в продължение на 45 минути при стайна температура. Всички плаки се промиват три пъти отново с 0.01% Tween 20 в PBS и само PBS за още три пъти. Накрая, 100 µL BCIP/NBT (Sigma Aldrich, Мюнхен, Германия) се добавят към всяка ямка за оцветяване. Всички плаки се промиват обилно с чешмяна вода и се сушат преди анализ на данните.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

5. Изводи

Това проучване показва, че последователните бинокулярни присадки на алогенни RPCs към кухината на стъкловидното тяло не провокират класическо имунно отхвърляне при мишката. Въпреки че се признава, че тези алогенни хистологични изследвания не могат да бъдат извършени с човешки RPC клиничен продукт, данните изглеждат в съответствие с резултатите от клинично проучване за безопасност (jCyte, JC-01E, непубликувани данни), в което пациенти с ретинит pigmentosa получи неедновременни двустранни инжекции без имуносупресивно лечение. Въпреки че е трудно двете проучвания да се сравняват директно, трябва да се отбележи, че общите резултати и от двете показват сходство по отношение на оцеляването на алографта.

Препратки

1. Хори, Дж.; Ng, TF; Шатос, М.; Класен, Х.; Streilein, JW; Young, MJ Невралните прогениторни клетки нямат имуногенност и са устойчиви на разрушаване като алографти. Стволови клетки 2003, 21, 405–416. [CrossRef] [PubMed]

2. Класен, Х.; Шварц, PH; Ziaeian, B.; Nethercott, H.; Йънг, MJ; Брагадотир, Р.; Tullis, GE; Warfvinge, K.; Narfstrom, K. Неврални прекурсори, изолирани от развиващия се котешки мозък, показват ретинална интеграция след трансплантация към ретината на дистрофичната котка. ветеринарен лекар офталмол. 2007, 10, 245–253. [CrossRef] [PubMed]

3. Salado-Manzano, C.; Перпина, У.; Straccia, М.; Молина-Руис, FJ; Кози, Е.; Rosser, AE; Canals, JM Дали имунологичният отговор е тясно място за клетъчната терапия при невродегенеративни заболявания? Отпред. Клетъчни неврони. 2020, 14, 250. [CrossRef]

4. Петрус-Рьорер, С.; Романо, М.; Хаулет, С.; Джоунс, JL; Lombardi, G.; Saeb-Parsy, K. Имунологични съображения и предизвикателства за регенеративни клетъчни терапии. Общ. Biol. 2021, 4, 798. [CrossRef]

5. Бухер, К.; Родригес-Боканегра, Е.; Даулетбеков, Д.; Fischer, MD Имунни отговори към генна терапия на ретината, използвайки без свързани вирусни вектори - Последици за успеха и безопасността на лечението. Прог. ретина. Eye Res. 2021, 83, 100915. [CrossRef]

6. Сингх, MS; Парк, SS; Албини, ТА; Canto-Soler, MV; Класен, Х.; MacLaren, RE; Такахаши, М.; Нагиел, А.; Шварц, SD; Bharti, K. Трансплантация на стволови клетки на ретината: балансиране на безопасността и потенциала. Прог. ретина. Eye Res. 2020, 75, 100779. [CrossRef]

7. Камао, Х.; Мандай, М.; Окамото, С.; Сакай, Н.; Suga, A.; Сугита, С.; Кирю, Дж.; Takahashi, M. Характеризиране на човешки индуцирани плурипотентни стволови клетки, получени от ретинални пигментни епителни клетъчни листове, насочени към клинично приложение. Представител на стволови клетки 2014, 2, 205–218. [CrossRef]

8. Сугита, С.; Камао, Х.; Iwasaki, Y.; Окамото, С.; Хашигучи, Т.; Исеки, К.; Хаяши, Н.; Мандай, М.; Takahashi, M. Инхибиране на Т-клетъчното активиране от пигментни епителни клетки на ретината, получени от индуцирани плурипотентни стволови клетки. разследване. офталмол. Vis. Sci. 2015, 56, 1051–1062. [CrossRef]

9. Макгил, Ти Джей; Stoddard, J.; Renner, LM; Месауди, И.; Бхарти, К.; Миталипов, С.; Лауер, А.; Уилсън, DJ; Neuringer, M. Alogeneic iPSC-Derived RPE Cell Graft Failure след трансплантация в субретиналното пространство при нечовекоподобни примати. разследване. офталмол. Vis. Sci. 2018, 59, 1374–1383. [CrossRef]

10. Сугита, С.; Мандай, М.; Камао, Х.; Такахаши, М. Имунологични аспекти на трансплантацията на RPE клетки. Прог. ретина. Eye Res. 2021, 84, 100950. [CrossRef]

11. Наир, DSR; Thomas, BB Стратегии за лечение на дегенеративни заболявания на ретината, базирани на стволови клетки. Curr. Stem Cell Res. Там. 2022, 17, 214–225. [CrossRef] [PubMed]

12. Мартинес Веласкес, Луизиана; Балиос, БГ Следващото поколение молекулярни и клетъчни терапевтици за наследствени заболявания на ретината. Вътр. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11542. [CrossRef]

13. Лиу, Й.; Чен, SJ; Li, SY; Qu, LH; Мън, XH; Wang, Y.; Xu, HW; Liang, ZQ; Yin, ZQ Дългосрочна безопасност на трансплантация на човешки прогениторни клетки на ретината при пациенти с пигментен ретинит. Stem Cell Res. Там. 2017, 8, 209. [CrossRef] [PubMed]

14. Уанг, Й.; Танг, З.; Gu, P. Трансплантация на базата на стволови / прогениторни клетки за дегенерация на ретината: Преглед на клиничните изпитвания. Клетъчна смърт Dis. 2020, 11, 793. [CrossRef] [PubMed]

15. Немски, OL; Vallese-Maurizi, H.; Сото, TB; Rotstein, NP; Politi, LE Стволови клетки на ретината, надежди и препятствия. World J. Стволови клетки 2021, 13, 1446–1479. [CrossRef]

16. Карамали, Ф.; Бехтай, С.; Бабаей-Абраки, С.; Хадади, Х.; Атефи, А.; Савой, С.; Soroushzadeh, S.; Наджафян, С.; Наср Есфахани, MH; Klassen, H. Потенциални терапевтични стратегии за дегенерация на фоторецептори: Пътят за възстановяване на зрението. J. Превод. Med. 2022, 20, 572. [CrossRef]

17. Семо, М.; Хаамеди, Н.; Стеванато, Л.; Картър, Д.; Брук, Г.; Йънг, М.; Coffey, P.; Sinden, J.; Пател, С.; Vugler, A. Ефикасност и безопасност на човешки ретинални прогениторни клетки. Превод Vis. Sci. техн. 2016, 5, 6. [CrossRef]

18. Мочизуки, М.; Сугита, С.; Kamoi, K. Имунологична хомеостаза на окото. Прог. ретина. Eye Res. 2013, 33, 10–27. [CrossRef]

19. Ямасаки, С.; Сугита, С.; Хориучи, М.; Масуда, Т.; Fujii, S.; Макабе, К.; Кавазаки, А.; Хаяши, Т.; Кувахара, А.; Кишино, А.; и др. Ниска имуногенност и имуносупресивни свойства на човешки ESC- и iPSC-получени ретини. Представител на стволови клетки 2021, 16, 851–867. [CrossRef]

20. Класен, Х.; Шварц, MR; Бейли, AH; Young, MJ Повърхностните маркери, експресирани от мултипотентни човешки и миши нервни прогениторни клетки, включват тетраспанини и непротеинови епитопи. Neurosci. Lett. 2001, 312, 180–182. [CrossRef]

21. Класен, Х.; Ziaeian, B.; Киров, II; Йънг, MJ; Schwartz, PH Изолиране на ретинални прогениторни клетки от човешка тъкан след смъртта и сравнение с автоложни мозъчни прогенитори. J. Neurosci. Рез. 2004, 77, 334–343. [CrossRef]

22. Ingulli, E. Механизъм на клетъчно отхвърляне при трансплантация. Pediatr. Нефрол. 2010, 25, 61–74. [CrossRef]

23. Иса, Ф.; Schiopu, A.; Wood, KJ Роля на Т клетките при отхвърляне на присадка и толерантност към трансплантация. Експерт Rev. Clin. Immunol. 2010, 6, 155–169. [CrossRef] [PubMed]

24. Наср, М.; Сигдел, Т.; Sarwal, M. Напредък в диагностиката за отхвърляне на трансплантация. Експерт преп. мол. диагностика 2016, 16, 1121–1132. [CrossRef] [PubMed]

25. Класен, Х.; Имфелд, KL; Рей, Дж.; Йънг, MJ; Gage, FH; Berman, MA Имунологичните свойства на възрастни хипокампални прогениторни клетки. Vis. Рез. 2003, 43, 947–956. [CrossRef] [PubMed]

26. Weinger, JG; Weist, BM; шпакловка, WC; Клаус, SM; Walsh, CM; Lane, TE MHC несъответствие води до отхвърляне на неврални прогениторни клетки след трансплантация на гръбначен мозък в модел на индуцирана от вирус демиелинизация. Стволови клетки 2012, 30, 2584–2595. [CrossRef] [PubMed]

27. ReNeuron, L. Първо при хора фаза I/IIa, отворено, проспективно проучване на безопасността и поносимостта на субретинално трансплантирани човешки ретинални прогениторни клетки (hRPC) при пациенти с пигментен ретинит (RP). Клинично изпитване # NCT02464436. Налично онлайн: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02464436 (достъп на 27 февруари 2023 г.).

28. Лу, Б.; Лин, Й.; Цай, Й.; Гирман, С.; Адамус, Г.; Джоунс, MK; Шели, Б.; Svendsen, CN; Wang, S. Последваща трансплантация на човешки невронен прогенитор в дегенерираната ретина не компрометира първоначалното оцеляване на присадката или терапевтичната ефикасност. Превод Vis. Sci. техн. 2015, 4, 7. [CrossRef] [PubMed]

29. Джоунс, MK; Лу, Б.; Гирман, С.; Wang, S. Клетъчни терапевтични стратегии за заместване и запазване при дегенеративни заболявания на ретината. Прог. ретина. Eye Res. 2017, 58, 1–27. [CrossRef] [PubMed]

30. Бел, бакалавърска степен; Kaul, C.; Бониля, VL; Рейборн, ME; Шадрах, К.; Hollyfield, JG Мишката BALB/c: Ефект на стандартното осветление на вивариума върху патологията на ретината по време на стареене. Exp. Eye Res. 2015, 135, 192–205. [CrossRef]

31. Klassen, HJ; Ng, TF; Kurimoto, Y.; Киров, И.; Шатос, М.; Coffey, P.; Young, MJ Мултипотентни ретинални прогенитори експресират маркери за развитие, диференцират се в ретинални неврони и запазват медиирано от светлина поведение. разследване. офталмол. Vis. Sci. 2004, 45, 4167–4173. [CrossRef]

32. jCyte, Inc. Безопасност на единична, интравитреална инжекция на човешки ретинални прогениторни клетки (jCell) при ретинит пигментоза. Клинично изпитване # NCT02320812. Налично онлайн: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02320812 (достъп на 24 февруари 2023 г.).

33. jCyte, Inc. Безопасност и ефикасност на интравитреално инжектиране на човешки ретинални прогениторни клетки при възрастни с ретинит пигментоза. Клинично изпитване # NCT03073733. Налично онлайн: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03073733 (достъп на 24 февруари 2023 г.).

34. jCyte, Inc. Безопасност на повтарящо се интравитреално инжектиране на човешки прогениторни клетки на ретината (клетка) при възрастни субекти с ретинит пигментоза. Клинично изпитване # NCT04604899. Налично онлайн: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04604899 (достъп на 24 февруари 2023 г.).

35. Oudejans, JJ; van der Valk, P. Имунохистохимична класификация на Т клетъчни и NK клетъчни неоплазми. J. Clin. Патол. 2002, 55, 892. [CrossRef] [PubMed]

36. Тостаноски, Л.Х.; Chiu, YC; Gammon, JM; Симон, Т.; Андорко, JI; Bromberg, JS; Jewell, CM Препрограмирането на микросредата на локалните лимфни възли насърчава толерантност, която е системна и антиген специфична. Cell Rep. 2016, 16, 2940–2952. [CrossRef] [PubMed]

37. Юрга, AM; Палечна, М.; Kuter, KZ Преглед на общи и дискриминиращи маркери на диференциални фенотипове на микроглия. Отпред. Клетъчни неврони. 2020, 14, 198. [CrossRef] [PubMed]

38. Li, JC; Zou, XM; Янг, SF; Джин, JQ; Жу, Л.; Li, CJ; Янг, Х.; Zhang, AG; Джао, TQ; Chen, CY Неутрофилните извънклетъчни капани участват в развитието на свързана с рака тромбоза при пациенти с рак на стомаха. World J. Gastroenterol. 2022, 28, 3132–3149. [CrossRef]

39. Kee, BL Развитие на естествени клетки убийци и ILC1. енцикл. Immunobiol. 2016, 1, 140–148.