Синергичен имунитет и защита при мишки чрез коимунизация с ДНК ваксини, кодиращи шиповия протеин и други структурни протеини на SARS-CoV-2

Резюме:Появата на нови варианти на тежък остър респираторен синдром коронавирус 2 (SARS CoV-2) генерира повтарящи се огнища на инфекция в световен мащаб. Тези силно мутирани варианти намаляват ефективността на настоящите ваксини срещу коронавирусна болест 2019 (COVID-19), които са предназначени да се насочват само към шиповия (S) протеин на оригиналния вирус. С изключение на S на SARS-CoV-2, имунопротективният потенциал на други структурни протеини (нуклеокапсид, N; обвивка, E; мембрана, M) като таргетни антигени на ваксината все още е неясен и заслужава да бъде изследван. В това проучване бяха разработени синтетични ДНК ваксини, кодиращи четири SARS-CoV-2 структурни протеина (pS, pN, pE и pM), и мишките бяха имунизирани с три дози чрез интрамускулно инжектиране и електропорация. Трябва да се отбележи, че съвместната имунизация с две ДНК ваксини, които експресират S и N протеините, индуцира по-високи неутрализиращи антитела и е по-ефективна за намаляване на SARS-CoV-2 вирусния товар, отколкото само S протеин при мишки. В допълнение, pS коимунизация с pN или pE + pM индуцира по-висок S протеин-специфичен клетъчен имунитет след три имунизации и причинява по-леки хистопатологични промени, отколкото pS самостоятелно след предизвикване. Ролята на запазените структурни протеини на SARS-CoV-2, включително N/E/M протеините, трябва да се проучи допълнително за техните приложения в дизайна на ваксини, като иРНК ваксини.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Ключови думи: COVID-19; SARS-CoV-2}}; коимунизация; ДНК ваксина; шпайков протеин; структурен протеин

1. Въведение

Тежкият остър респираторен синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2) е причината за коронавирусната болест 2019 (COVID-19), която причини милиони инфекции и смъртни случаи по света и застраши човешкото здраве и световната икономика . Въпреки че все още не са налични ефективни терапевтични подходи, те напредват бързо, включително прилагането на CAR-T клетъчна терапия и нанотехнологии [1,2]. Ваксинирането е ефективен начин за контролиране на пандемията и няколко ваксини са одобрени за употреба от различни регулаторни здравни органи [3,4]. Геномът на коронавируса кодира четири основни структурни протеина, а именно шип (S), нуклеокапсид (N), мембрана (M) и обвивка (E) протеини, които са отговорни за сглобяването на вириона и потискането на имунния отговор на гостоприемника [5]. ]. S протеинът се състои от 1273 аминокиселинни остатъка, съдържащи две субединици, а именно S1 и S2. Той медиира навлизането на вируса и е основна цел за разработване на коронавирусни ваксини [6–11]. Протеинът SARS-CoV-2 S обаче има висока честота на мутация. Не е изненадващо, че при SARS-CoV-2, РНК вирус, мутацията е непрекъсната и неизбежна. Има пет тревожни варианта на SARS-CoV-2 (VOC), които се появиха от септември 2020 г., включително B.1.1.7 (Обединеното кралство, алфа), B.1.351 (Южна Африка, бета), P.1 (Бразилия, Гама), B.1.617.2 (Индия, Делта) и B.1.1.529 (Южна Африка, Omicron) (Андреано и Рапуоли, 2021 г.; Гупта, 2021 г.). Всички те имат няколко мутации в шиповия протеин [12]. Тези варианти застрашават ефективността на настоящите ваксини срещу COVID-19, които са предназначени да се насочват само към шиповия протеин.

N протеинът на SARS-CoV-2 се свързва с вирусна РНК чрез 140-Дълга аминокиселина РНК-свързващ домен в сърцевината им по начин на „перли на връв“. Той е силно консервативен сред коронавирусите, като споделя ~90% идентичност на последователността с тази на SARS-CoV и също така е единственият структурен протеин във вириона [13]. В допълнение, той играе важна роля в опаковането на вирусна РНК в рибонуклео капсидния комплекс и е необходим за репликацията на вирусна РНК, сглобяването на вириони и освобождаването от клетките гостоприемници [14]. Въз основа на голямото сходство на последователността на N протеина в коронавирусите, той може да бъде предложен като цел на ваксина за кръстосана защита. По-рано установихме, че съвместната имунизация с две ДНК ваксини, експресиращи Е и М протеини, осигурява частична защита срещу SARS-CoV-2 и този метод трябва да се има предвид по време на разработването на ваксина [15]. В зависимост от ландшафтния документ от СЗО обикновено има седем стратегии за кандидати за ваксина срещу SARS-CoV-2, които могат допълнително да бъдат разделени на три категории: първо, ваксини на базата на протеини, включително ваксини срещу инактивирани вируси, вирусоподобни ваксини с частици и протеинова субединица; второ, генно-базирани ваксини, включително вирусно-векторни ваксини, ДНК ваксини и иРНК ваксини; трето, комбинация от базирани на протеини и гени подходи, като например живи атенюирани вирусни ваксини. ДНК технологиите, като нови генно-базирани стратегии за ваксини, могат бързо да сравняват множество кандидати за ваксини и стратегии по време на предклинични тестове [16,17]. Теоретично, почти всички вирусни протеини са потенциални имуногени и мишени на ваксината. Въпреки това, доколкото ни е известно, имуногенността и защитният потенциал на синтетичните ДНК ваксини при кодирането на SARS-CoV-2 S протеини и други структурни протеини все още не са докладвани систематично. Четири ДНК ваксини, експресиращи SARS-CoV-2 протеини S, N, E и Ml, бяха оценени за тяхната имуногенност и защитна ефикасност при мишки, за да се изследват имунологичните ефекти на S в комбинация с други структурни протеини.

2. Материали и методи

2.1. клетки

Huh7.5 клетки и 293T клетки от човешки ембрионални бъбреци се култивират при 37 ◦C във влажна атмосфера при 5% CO2 по време на цялото изследване. Клетките се култивират в среда DMEM (HyClone, Logan, UT, USA), допълнена с 10% FBS (GEMINI Co., Shanghai, China) и 1% пеницилин-стрептомицин (Gibco, New York, NY, USA). Всички клетъчни линии бяха потвърдени като отрицателни за заразяване с микоплазма.

2.2. Конструиране на ДНК ваксини, кодиращи SARS-CoV-2 S/N/E/M

SARS-CoV-2 S/N протеин-кодиращ ген, съдържащ N-терминална последователност на Kozak (GCCACC), последвана от иницииращ кодон (ATG), беше синтезиран с помощта на оптимизиран за бозайник кодон (GenScript Co., Nanjing , Китай). След това се клонира в експресионния вектор pcDNA3.1 (+) чрез EcoRI и XbaI смилане и се нарича pS/pN (ДНК ваксини) (Фигура 1А). Протеинът pE/PM беше конструиран и идентифициран, както е описано по-рано [15]. Ваксините бяха приготвени с помощта на комплекти Maxiprep без ендотоксин (Qiagen, Пекин, Китай) и последователностите бяха потвърдени с помощта на Sanger ДНК секвениране. Експресията на S/N протеина се потвърждава с помощта на Western blotting и анти-S (Sino Biological, Пекин, Китай)/анти-N антитела, разредени при 1:1000. Тези експерименти бяха проведени, както е описано по-рано [15,18].

Фигура 1. Дизайн и експресия на базирани на рекомбинантна ДНК SARS-CoV-2 S/N протеинова ваксина. (A) Схематична диаграма на базирани на рекомбинантна ДНК ваксини, кодиращи SARS-CoV-2 шип (PS), нуклеокапсид (pN), обвивка (pE) и/или мембранни (PM) протеини. (B) Експресията на целевия протеин в ДНК ваксините беше валидирана чрез Western blot анализ на 293T клетки, трансфектирани с pS/pN/pE/pM плазмидите.

2.3. Имунизация и предизвикателство

Женски BALB/c мишки (Charles River Laboratories, Франция) на 6-седмична възраст бяха настанени в Националния институт по професионално здраве и контрол на отравянията в среда с контролирана температура от 21 °C и влажност с 12-часови цикъла светлина/тъмнина. Междувременно храната и водата бяха предоставени ad libitum и всички експерименти с животни бяха одобрени от Комитета по етика на експериментите с животни към Китайския център за контрол и превенция на заболяванията (China CDC). Изследването е в съответствие със съответните етични разпоредби.

Мишките бяха разделени на случаен принцип в пет групи и имунизирани само с pS/pN или съвместно имунизирани с pS + pN или pS + pE + PM на дни 0, 21 и 42 чрез интрамускулна инжекция плюс електропорация (35 mg/50 mL) (Фигура 2) [19,20]. Накратко, ДНК ваксините се инжектират в предния тибиален мускул (TA) и незабавно импулсират с електричество, като се използва 5 mm един от друг двуиглен масивен електрод (ECM830; BTX) с игли. Серумите от мишките бяха събрани за анализ на хуморалния имунен отговор и миши далаци бяха обработени за измерване на клетъчния имунен отговор (Фигура 2).

Фигура 2. Схема на предизвикателството за имунизация и SARS-CoV-2. Времеви ход на ваксинация, предизвикателство и вземане на проби от кръв/тъкан. BALB/C мишки бяха разделени на случаен принцип в групи.

Експериментите за предизвикване на SARS-CoV-2 бяха проведени, както е описано по-рано [15,21]. Накратко, мишките бяха анестезирани и след това трансдуцирани интраназално с 2.5 × 108 PFU от Ad5-hACE2 в общ обем от 45 µL. Пет дни след трансдукцията, мишките бяха анестезирани и след това интраназално заразени с 1 × 105 TCID50 от SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC HB-02/2019) в общ обем от 50 µL физиологичен разтвор буфер. Цялата работа с жив SARS-CoV-2 в модели на мишки е извършена в лаборатории за биобезопасност на животните ниво 3 (ABSL-3).

2.4. Имунособентен анализ, свързан с ензимите

Ензимно-свързаните имуносорбентни анализи (ELISA) бяха проведени, както е описано по-рано [15]. Накратко, S (закупени от Sino Biological)/N протеини (подарък от Song), разредени в карбонатен буфер (0.1 М, рН 9,6) бяха покрити върху 96-ямкови EIA/RIA плаки (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, САЩ) през нощта при 4 ◦C. Плаките се блокират с 200 µL 10% кози серум в PBS при 37 °C за 2 часа, последвано от промиване пет пъти с PBST. След това се добавят серумни проби, серийно разредени в 2% кози серум в PBS, и се инкубират в продължение на 2 часа при 37 °C, последвано от пет промивания с PBST. HRP-конюгирани кози анти-миши IgG Ab (1:5000) се добавят при 37 °C за 1 час. Общо 100 µL от ТМВ субстрат се добавят към всяка ямка и се потушават с 50 µL 2М H2SO4. Абсорбцията се отчита при дължина на вълната 450 nm с помощта на SPECTR Ostar Nano (BIO-GENE, Хонконг, Китай).

растение цистанче, повишаващо имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. Псевдовирусна инфекция и експерименти за неутрализиране

Тестът за неутрализиране на псевдовирус се извършва, както е описано по-рано [21, 22]. Преди това е конструиран плазмид, експресиращ S протеина на наследствения вирус [22]. Генът на шиповия протеин на варианта на Omicron SARS-CoV-2 (GISAID: EPI_ISL_6590782.2) беше синтезиран (подарък от Vazyme Biotech Co., Ltd., Нанкин, Китай) използвайки оптимизиран за бозайник кодон и клониран във вектора pcDNA3.1, както е описано по-рано [22]. Накратко, плазмиди, експресиращи луциферазен репортер, и плазмиди, експресиращи S протеин, бяха ко-трансфектирани в HEK 293T клетки, като се използва X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent. Клетъчната култура се обновява 6 часа след трансфекцията и супернатантата, съдържаща псевдовирус, се събира след 48 часа и се съхранява при -70 ◦C. В анализа за неутрализиране на псевдовирус, еднаква смес серум-вирус след това се инкубира при 37 обема от супернатантата, съдържаща псевдовирус, и след това се добавя към разредения серум. ◦C за 1 час. Културалната среда на Huh7.5 клетки след това се заменя със 100 µL от сместа серум-вирус и се инкубира при 37 °C в продължение на 12 часа. Клетки, култивирани само с псевдовируси на SARS-CoV-2, бяха пуснати успоредно. След това средата се заменя с DMEM (2% FBS) и инкубацията се инкубира при 37 °C в продължение на 48 часа. След това луциферазният сигнал беше измерен с помощта на комплекта за луцифераза на светулка Bright-Glo (Promega).

2.6. Тест за неутрализиране на SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC-HB-02/2019) беше използван в този експеримент. Накратко, серумите бяха разредени два пъти от начално разреждане 1:10, смесени с равен обем (10–15 pfu/ямка) жив SARS-CoV-2 и инкубирани за 1 час при 37 ◦C, след което те бяха добавени към посетите Vero клетки. След инкубиране при 37 °C в продължение на 48 часа се наблюдава цитопатичен ефект (CPE) и 100 µL от супернатантата на културата се събират за екстракция на нуклеинова киселина и PCR с обратна транскрипция на флуоресценция в реално време (RT-PCR). Средната неутрализираща доза (ND50) се изчислява по метода на Reed-Munch [15].

2.7. IFN-ELISpot анализ

Пептидните групи, обхващащи целия S/N/E/M протеин като последователни 15-мери, припокриващи се с 10 аминокиселини, бяха синтезирани от Scilight Biotechnology, LLC. Приблизително 2,5 mg от всеки пречистен пептид в пептидния пул присъства на флакон. Експериментът беше проведен, както е описано по-рано [18]. Накратко, 96-плаки с ямки (BD ELISPOT Set, САЩ) бяха покрити с анти-IFN-улавяне Ab и инкубирани за една нощ при 4 ◦C. Плаките се блокират с пълната културална среда след трикратно промиване. Спленоцитите бяха събрани, след като мишките бяха евтаназирани на 35-ия ден и 120 пресни едноклетъчни суспензии от всяка група бяха поставени при 5 × 106 на ямка и бяха добавени пептиди. След това плаките се инкубират при 37 °C в 5% CO2 в продължение на 22 часа и се откриват с помощта на четец на плаки ELISpot (Biosys, So. Pasadena, CA, USA). Единица, образуваща петно ​​(SFU) представлява секретиращ Т клетки IFN-.

2.8. Оценка на защитата при мишки след SARS-CoV-2 Challenge

Експериментите бяха проведени, както е описано по-рано [15,21]. Накратко, белите дробове бяха събрани, след като мишките бяха евтаназирани. Половината от тъканите бяха използвани за екстракция на нуклеинова киселина, флуоресценция в реално време RT-PCR и TCID50. Другата половина е изпратена в Колежа по ветеринарна медицина, Китайския селскостопански университет за патологична оценка.

2.9. Статистически анализ

Несдвоените t-тестове, двупосочните ANOVA тестове и тестът за множество сравнения на Dunnett бяха извършени с помощта на GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software LLC). p-стойности < 0.05 се считат за статистически значими (* p < 0.05; ** p < 0.01; * ** p < 0,001; **** p < 0,0001).

3. Резултати

3.1. Характеризиране на ДНК ваксини

Нивата на Е и М протеини бяха открити с помощта на Western blotting. Измерихме експресията на кодираните S/N/E/M протеини на SARS-CoV-2 в HEK-293T клетки, трансфектирани с pS/pN/pE/pM плазмиди чрез Western blot анализ, използвайки анти -S/anti-N антитела и анти-6 x His антитяло в клетъчните лизати. Лентите приближават прогнозираното молекулно тегло на протеините S (140–142 kDa), N (45 kDa), E (10 kDa) и M (22–25 kDa) (Фигура 1B).

3.2. Силно и устойчиво производство на анти-S и/или анти-N IgG, индуцирано от pS и/или pN ДНК

Ваксини Серумът се събира от BALB/c мишки на 35, 56, 96 и 120 дни (Фигура 2). Нивата на анти S/anti-N IgG бяха открити с помощта на ELISA. Големината на S- или N-специфичния IgG отговор, индуциран от pS или pN, се повишава в серума след първото и второто усилване. Анти-S и анти-N IgG титрите са по-високи в pS + pN групата, отколкото в другите групи; разликата обаче не е статистически значима (Фигура 3A, B). Не са открити стабилни отговори на E/M протеин-специфични антитела, което е в съответствие с резултатите от предишно проучване (данните не са показани) [15].

Фигура 3. В-клетъчни отговори на SARS-CoV-2 при BALB/c мишки. (A) Серумни IgG свързващи титри на крайна точка за SARS-CoV-2 S (A) и N протеини (B). (C) Неутрализационните титри бяха определени въз основа на SARS-CoV-2 псевдотипирана вирусна система. (D) Анти-SARS-CoV-2 неутрализационните титри бяха определени с помощта на SARS-CoV-2 вирус. (E) Тест за неутрализиране, базиран на SARS-CoV-2 Omicron псевдотипирана вирусна система. Показани са коефициентите на инхибиране за серуми от фалшивите (сини), pS (червени), pS + pN (зелени), pS + pE + pM (розови) и pN (оранжеви) групи. Лентите за грешки представляват SEM и p-стойностите са изчислени с помощта на двупосочна ANOVA и post hoc анализ на Sidak, където * p < 0.05

3.3. Високи нива на неутрализиращи антитела, предизвикани от съвместна имунизация с pS и pN ваксини

Неутрализиращите титри на серийно разредени серумни проби бяха определени с помощта на псевдотипния SARS-CoV-2 вирус. Най-високите нива на неутрализиращи антитела (nAbs) се наблюдават в pS + pN групата, като реципрочните средни геометрични титри EC50 достигат 2988 (на ден 35) и 3578 (на ден 56) (Фигура 3C). Подобни резултати бяха наблюдавани при използване на теста за микронеутрализиране на жив вирус (MN), при който нивата на nAbs в pS + pN групата бяха по-високи от тези в S групата на дни 56 и 96 (p < 0.05; фигура 3D). Нещо повече, нивата на nAbs в pS + pN групата на ден 56 (второ усилване) са значително по-високи от тези на ден 35 (p <0,05; Фигура 3D).

Неутрализиращата активност на всеки режим на ваксина срещу варианта на SARS-CoV-2 Omicron беше допълнително определена с помощта на псевдотипирана платформа и серумни проби. Профилът на неутрализация срещу вируса Omicron на дни 35 и 56 е подобен на този срещу предшественика на вируса (Фигура 3E), което предполага, че лечението с PS + pN има кръстосано неутрализиращ ефект.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

3.4. Т-клетъчни отговори, предизвикани от ДНК ваксинация

Както беше описано по-горе, Т-клетъчните отговори срещу SARS-CoV-2 S/N/E/M антигените бяха оценени с помощта на IFN-ELISpot, както беше описано по-рано [15]. Както се очакваше, режимите PS + pN и pS + pE + pM индуцираха значително по-високи нива на IFN + Т клетки, специфични за S протеина на ден 120, отколкото на ден 35 (p < 0. 05; Фигура 4A). Освен това, броят на IFN + Т клетки, специфични за N протеина на ден 120 (второ усилване) е значително по-висок от този на ден 35 в pS + pN групата (р <0,05; Фигура 4В). И накрая, броят на IFN + Т клетки, специфични за М протеина на ден 120 (второ усилване) е значително по-висок от този на ден 35 и в двете групи (р <0,05; Фигура 4D).

Фигура 4. Т-клетъчни отговори на SARS-CoV-2 отделни структурни протеини в BALB/c мишки. (A) Т-клетъчните отговори бяха измерени с помощта на IFN-ELISpot в спленоцити, стимулирани за 20 h с припокриващи се пептидни групи, обхващащи SARS-CoV-2 S, (B) N, (C) E, и (D) М протеини. Стълбчетата представляват средната стойност ± SD. Статистическите анализи бяха извършени с помощта на двупосочен ANOVA и post hoc тест на Sidak, където * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.01 и **** p < 0.0001.

3.5. Синергична защита, предизвикана от коимунизация с pS/pN или pS/pE/pM

След това оценихме защитната ефикасност на ДНК ваксините, използвайки hACE2 мишки, имунизирани след заразяване с предшественика на SARS-CoV-2 вируса. След предизвикателството, мишките в фалшивата група показват постепенна загуба на тегло. Обратно, мишките, имунизирани или с pS, или с pS+, показват лека загуба на тегло веднага след инфекцията, последвана от възстановяване (Фигура 5А). Не е открит жив вирус в мишките, ваксинирани с pS, pS + pN или pS + pE + pM. Освен това, pS + pN ваксинацията значително намалява броя на копията на вирусната РНК в сравнение с тези, получени само с pS ваксинация (p=0.0228; Фигура 5B). Нещо повече, хистопатологията на белите дробове демонстрира, че мишките както в фалшивите, така и в pN групите показват фокални петна от възпаление, плеврална инвагинация, алвеоларен колапс, високи нива на възпалителна клетъчна инфилтрация и хеморагични области. За сравнение, мишки, третирани или с pS + pN, или с pS + pE + pM, показват по-леки хистопатологични промени и по-ниски INHAND резултати след предизвикване, отколкото другата група (Фигура 5C).

Фигура 5. Защитна ефикасност на имунизацията след заразяване с жив SARS-CoV-2 вирус. (A) Мишките се претеглят ежедневно (средно ± стандартна грешка на средната стойност (SEM), n=4) в продължение на три дни след заразяването. (B) Инфекциозен SARS-CoV-2 титър в белодробни хомогенати на третия ден след предизвикване, както е определено чрез TCID5{{10}} анализ и брой копия на РНК. Статистически значимите разлики между групите бяха определени с помощта на еднопосочна ANOVA, последвана от корекция на множествено сравнение на Dunnett (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 и **** p < 0,0001). (C) Белодробен хистопатологичен анализ с помощта на H&E оцветяване.

4. Дискусия

В това проучване съвместната имунизация с две ДНК ваксини, експресиращи S и N протеините, индуцира високи нива на nAbs и е много ефективна за намаляване на вирусния товар на SARS-CoV-2 при мишки. ДНК ваксини, експресиращи S протеина, индуцират повишени нива на специфичен за S протеин клетъчен имунитет след три имунизации, когато мишките са били коимунизирани с N/E и M протеини и облекчават хистопатологичните промени след предизвикване. Доколкото ни е известно, това е първият доклад, разкриващ синергичното повишаване на имунитета и защитата при мишки, използващи ДНК ваксина, кодираща S протеина, когато те са коимунизирани с ДНК ваксини, кодиращи други структурни протеини на SARS-CoV{{8 }}.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Имунодоминантни В-клетъчни епитопи в N антигенни области са наблюдавани в няколко проучвания. Базираните на N ваксини обикновено не могат да индуцират nAbs, вероятно защото N протеинът не се показва на повърхността на вируса. Трябва да се отбележи, че съвместната имунизация с S и N протеините индуцира по-високи нива на nAbs срещу наследствения и Omicron SARS-CoV-2 вирус, отколкото другите групи. Повишените отговори на nAb са свързани с по-добър вирусен клирънс и защитна ефикасност. Нашите резултати показаха, че лечението с pS + pN е по-ефективно от лечението само с pS за намаляване на вирусния товар на SARS-CoV-2 след предизвикване. Предишно проучване съобщава, че хамстери, имунизирани с ваксина, ко-експресираща протеините M и N, са били защитени срещу тежка загуба на тегло и белодробна патология и са имали значително намалени вирусни титри в орофаринкса и белите дробове след заразяване със SARS-CoV-2, което е в съответствие с нашите резултати [23]. За съжаление, намаляването на вирусните титри не може да се припише конкретно на M или N протеина и нивата на nAb не са оценени в това проучване. Едно проучване на SARS-CoV-2 мРНК ваксина съобщава, че S + N коимунизацията индуцира усилен S-специфичен CD8+ Т-клетъчен отговор и активност на неутрализиращи антитела, осигурявайки по-добра защита в белите дробове срещу Delta вариант в сравнение само със S, което е в съответствие с резултатите от това проучване [24]. Друго проучване съобщава, че N протеинът на трансмисивен гастроентеритен коронавирус насърчава синтеза на неутрализиращи антитела, когато свински TGEV-IMMUNE клетки са стимулирани с комбинация от S и N протеини in vitro и този ефект може да се обясни с отговора на помощните Т-лимфоцити към N протеин [25].

Имунодоминантни CD4+/CD8+ Т-клетъчни епитопи в N-антигенни области са идентифицирани по-рано. Няколко проучвания съобщават, че ваксини, базирани на SARS-CoV-2 N протеина, ефективно предизвикват клетъчни имунни отговори. Групата S + N показва повишени нива на специфичен за S протеин клетъчен имунитет след три имунизации. Едно проучване на SARS-CoV-2 иРНК ваксина съобщава, че комбинаторният S + N индуцира увеличен S-специфичен CD8+ Т-клетъчен отговор в сравнение със S самостоятелно, което е в съответствие с нашите резултати [24]. Друго проучване съобщава, че отговорите на Т-клетките към S и N антигени само след ваксинация с двоен антиген hAd5 S + N са еквивалентни на тези от инфектирани преди това SARS-CoV-2- пациенти и in silico модели за прогнозиране на Т-клетки HLA свързването на епитоп предполага, че Т-клетъчните отговори на hAd5 S + N ваксината ще запазят своята ефикасност срещу варианта B.1.351. Нещо повече, плазмата от инфектирани преди SARS-CoV-2-пациенти показва по-висок афинитет на свързване към клетки, експресиращи двойния антиген S-Fusion + N-ETSD конструкт, отколкото към hAd5 S-Fusion самостоятелно, което допълнително предполага, че имуногенността на Ваксината с двоен антиген S + N е по-добра от тази на ваксината с единичен антиген S [26].

Живият вирус не беше открит в белите дробове и загубата на тегло след провокацията беше смекчена в групите pS, pS + pN и pS + pE + pM, докато лечението с pN не намали ефективно титъра на вируса. Тези констатации подчертават незаменимостта и ефективността на S протеина като цел за ваксина. Трябва да се отбележи, че съвместната имунизация с pS и pN има по-добри ефекти от pS или pN върху вирусния клирънс. Групата pS + pE + pM показва по-малко хистопатологични промени в белите дробове, което е в съответствие с резултатите от нашето предишно проучване [15]. S + N групата имаше ниски копия на вирусна РНК в белия дроб, намалена загуба на тегло и бързо време за възстановяване след провокация след SARS-CoV-2 в сравнение с групата, имунизирана само със S/N, което беше в съответствие с резултатите от това проучване. Въпреки това, никоя от групите не открива титрите на неутрализиращите антитела, което може да се обясни с разликите в разнообразието на ваксината и експерименталните животни [26]. Едно проучване на векторна ваксина срещу аденовирус SARS-CoV-2 съобщава, че S ваксината осигурява остра мозъчна защита само при коимунизация с N ваксина [27]. Друго проучване разработи ваксини Tri: ChAd, Bi: ChAd и Mono: ChAd, експресиращи съответно протеините S1/N/RdRp, N/RdRp и S1, и ги тества в животински модел B.1.351. Обширна груба патология се наблюдава при Mono: ChAdlungs, докато Bi: ChAd и Tri: ChAd белите дробове изглеждат почти свободни от тази патология [28].

Освен това, неваксинираните животни имат високо белодробно вирусно натоварване, докато лечението с Tri: ChAd значително намалява вирусното натоварване с 3,5 log. За сравнение и двете ваксини Bi: ChAd и Mono: ChAd само умерено намаляват вирусния товар. Тези резултати предполагат, че защитният ефект на ваксината с двоен антиген S/N срещу варианти може да е по-добър от този на ваксината с единичен антиген S, което е в съответствие с нашите резултати [28]. Няколко проучвания съобщават, че имунизираните с N протеин мишки развиват тежко възпаление на белите дробове след инфекция със SARS-CoV [29–31]. Предишни проучвания също съобщават, че имунизацията с аденовирусна векторна ваксина, експресираща N протеина на вируса на миши хепатит, предпазва мишките от смъртоносна инфекция, което показва, че N протеинът може да генерира защитен ефект [32]. Освен това, групата, имунизирана с CRT/N ДНК ваксина, има значително намален вирусен титър след провокация, с вирус на ваксиния, експресиращ SARS-CoV N протеин [33].

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Едно проучване върху S протеина демонстрира, че комбинираната ДНК/протеинова ваксина индуцира хуморален и клетъчен имунитет по-добре от ДНК/протеинова ваксина самостоятелно [8]. Ваксините, насочени само към S протеина, демонстрират намалена ефективност при защита срещу лека до умерена форма на COVID-19, причинена от нововъзникващи варианти. Ролите на запазените структурни протеини на SARS-CoV-2, включително N/E/M протеините, заслужават внимание при проектирането и приложенията на ваксината, тъй като индуцираните от ваксина Т-клетъчни отговори срещу запазени епитопи обикновено не се влияят от мутации . Едно проучване съобщава, че пациентите, възстановени от SARS (n=23), все още притежават Т-клетки с дълготрайна памет, реагиращи на SARS-CoV N протеина 17 години след избухването през 2003 г., което показва силна кръстосана реактивност към SARS CoV{ {15}} N протеин, което допълнително утвърждава използването на N протеина като цел за кръстосана защита на ваксината [34]. Това проучване показа, че коимунизацията с pS/pN е свързана с по-високи отговори на nAb, по-добър вирусен клирънс и подобрени клетъчни имунни отговори и може да осигури по-добра защита след предизвикателство SARS-CoV-2 в сравнение само с pS. Освен това е доказано, че вариантите на SARS-CoV-2 заразяват много животински видове и е наблюдавано предаване от човек на животно при някои диви животни и домашни любимци [7]. Така че ветеринарната ваксина срещу SARS-CoV-2 се нуждае от повече внимание. В допълнение, нанотехнологиите могат да бъдат мощен инструмент за оптимизиране на ваксините и заслужават повече внимание [2].

Това проучване има няколко ограничения. Първо, ние наблюдавахме само стратегията за ДНК ваксина при BALB/c мишки и бъдещите проучвания трябва да оценят имуногенните ефекти на тези режими на ваксина при други животински модели. Второ, необходими са допълнителни изследвания, за да се разберат напълно молекулярните механизми, лежащи в основата на увеличените nAb- и S-специфични CD8 Т-клетъчни отговори, предизвикани от съвместна имунизация с помощта на S и N протеини, и да се използват тези знания за оптимизиране на COVID-19 дизайн на ваксина. И накрая, функцията на N протеин-специфичните антитела заслужава допълнително проучване.

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

В заключение, това проучване оценява имунозащитния потенциал на съвместната имунизация с протеините SARS-CoV-2 S, N, E и M. Няколко ваксини, насочени само към S протеина, имат намален защитен ефект върху нововъзникващите вариантни щамове. Нашите резултати ще положат основата за разработване на кръстосано реактивна ваксина срещу COVID-19 за контролиране на настоящите и нововъзникващите варианти на SARS-CoV-2 и предотвратяване на потенциални пандемии от коронавирус.

Препратки

1. Змиевская, Е.; Валиулина, А.; Ганеева, И.; Петухов, А.; Ризванов, А.; Булатов, Е. Приложение на CAR-T клетъчната терапия извън онкологията: автоимунни заболявания и вирусни инфекции. Biomedicines 2021, 9, 59. [CrossRef] [PubMed]

2. Рашидзаде, Х.; Danafar, H.; Рахими, Х.; Мозафари, Ф.; Salehiabar, M.; Рахмати, MA; Rahamooz-Haghighi, S.; Mousazadeh, N.; Мохамади, А.; Ertas, YN; et al. Нанотехнология срещу новия коронавирус (тежък остър респираторен синдром коронавирус 2): Диагностика, лечение, терапия и бъдещи перспективи. Наномедицина 2021, 16, 497–516. [CrossRef]

3. Фонтанет, А.; Cauchemez, S. COVID-19 колективен имунитет: Къде сме? Нац. Rev. Immunol. 2020, 20, 583–584. [CrossRef] [PubMed]

4. Джеянатан, М.; Афхами, С.; Smaill, F.; Милър, MS; Lichty, BD; Xing, Z. Имунологични съображения за стратегии за ваксина срещу COVID-19. Нац. Rev. Immunol. 2020, 20, 615–632. [CrossRef] [PubMed]

5. Вандели, А.; Монти, М.; Миланети, Е.; Armaos, A.; Rupert, J.; Зако, Е.; Бечара, Е.; Дели Понти, Р.; Tartaglia, GG Структурен анализ на генома на SARS-CoV-2 и прогнози за човешкия интерактом. Nucleic Acids Res. 2020 г., 48, 11270–11283. [CrossRef] [PubMed]

6. Джаксън, CB; Фарзан, М.; Чен, Б.; Choe, H. Механизми на навлизане на SARS-CoV-2 в клетките. Нац. Rev. Mol. Cell Biol. 2022, 23, 3–20. [CrossRef]

7. Конфорти, А.; Санчес, Е.; Салватори, Е.; Лайън, Л.; Compagnone, М.; Пинто, Е.; Паломбо, Ф.; Д'Акунто, Е.; Музи, А.; Roscilli, G.; et al. Линеен кандидат за ДНК ваксина, кодиращ SARS-CoV-2 рецепторно свързващия домейн, предизвиква мощен имунен отговор и неутрализиращи антитела при домашни котки. Mol. Там. Методи Clin. Dev. 2023. [CrossRef]

8. Боргоякова, М.Б.; Карпенко, LI; Меркулева, И.А.; Щербаков, Д.Н.; Рудометов, AP; Старостина, Е.В.; Шаншин, DV; Исаева, АА; Несмеянова, В.С.; Волкова, Н.В.; et al. Имуногенност на ДНК/протеинова комбинирана ваксина срещу COVID-19. Бик. Exp. Biol. Med. 2023, 1–4. [CrossRef]

9. Ку, Л.; Yi, Z.; Шен, Й.; Лин, Л.; Чен, Ф.; Xu, Y.; Wu, Z.; Танг, Х.; Джан, X.; Тиан, Ф.; et al. Циркулярни РНК ваксини срещу SARS-CoV-2 и нововъзникващи варианти. Cell 2022, 185, 1728–1744.e16. [CrossRef]

10. Корбет, Канзас; Едуардс, Дания; Leist, SR; Абиона, OM; Бойоглу-Барнум, С.; Gillespie, RA; Химансу, С.; Schäfer, A.; Ziwawo, CT; DiPiazza, AT; et al. SARS-CoV-2 дизайн на иРНК ваксина, активиран от подготвеността на прототипа на патогена. Nature 2020, 586, 567–571. [CrossRef]

11. Tian, ​​JH; Пател, Н.; Haupt, R.; Джоу, Х.; Уестън, С.; Хамънд, Х.; Logue, J.; Портноф, А.; Norton, J.; Guebre-Xabier, М.; et al. SARS-CoV-2 шипова гликопротеинова ваксина кандидат NVX-CoV2373 имуногенност при бабуини и защита при мишки. Нац. Общ. 2021, 12, 372. [CrossRef] [PubMed]

12. Андреано, Е.; Пачиело, И.; Piccini, G.; Манганаро, Н.; Пилери, П.; Хисени, И.; Леонарди, М.; Пантано, Е.; Абиенто, В.; Benincasa, L.; et al. Хибридният имунитет подобрява В клетките и антителата срещу SARS-CoV-2 варианти. Nature 2021, 600, 530–535. [CrossRef]

13. Накви, AAT; Фатима, К.; Мохамад, Т.; Фатима, У.; Сингх, IK; Сингх, А.; Атиф, SM; Hariprasad, G.; Хасан, GM; Hassan, MI Прозрения за SARS-CoV-2 геном, структура, еволюция, патогенеза и терапии: Подход на структурната геномика. Biochim. Biophys. Acta Mol. Основа. дис. 2020, 1866, 165878. [CrossRef] [PubMed]

14. Abbasi, J. Новата COVID{1}} ДНК ваксина в Индия за юноши и възрастни е първата. JAMA 2021, 326, 1365. [CrossRef] [PubMed]

15. Чен, Дж.; Deng, Y.; Хуанг, Б.; Хан, Д.; Wang, W.; Хуанг, М.; Zhai, C.; Джао, З.; Янг, Р.; Zhao, Y.; et al. ДНК ваксини, експресиращи обвивката и мембранните протеини, осигуряват частична защита срещу SARS-CoV-2 при мишки. Преден. Immunol. 2022, 13, 827605. [CrossRef]

16. Тебас, П.; Крайняк, К.А.; Пател, А.; Maslow, JN; Мороу, MP; Силвестър, AJ; Ноблок, Д.; Гилеспи, Е.; Аманте, Д.; Racine, T.; et al. Интрадермалната ДНК ваксина SynCon®Ebola GP е температурно стабилна и безопасно демонстрира предимства на клетъчната и хуморалната имуногенност при здрави доброволци. J. Инфектирайте. дис. 2019, 220, 400–410. [CrossRef]

17. Смит, TRF; Пател, А.; Рамос, С.; Елууд, Д.; Жу, X.; Ян, J.; Гари, EN; Walker, SN; Schultheis, K.; Пурвар, М.; et al. Имуногенност на кандидат за ДНК ваксина срещу COVID-19. Нац. Общ. 2020, 11, 2601. [CrossRef]

18. Джао, З.; Deng, Y.; Ниу, П.; Песен, J.; Wang, W.; Du, Y.; Хуанг, Б.; Wang, W.; Джан, Л.; Zhao, P.; et al. Коимунизацията с CHIKV VLP и ДНК ваксини предизвиква обещаващ хуморален отговор при мишки. Преден имунол. 2021, 12, 655743. [CrossRef]

19. Гуан, Дж.; Deng, Y.; Чен, Х.; Ин, X.; Янг, Й.; Tan, W. Подготовка с две ДНК ваксини, експресиращи NS3 протеин на вируса на хепатит С, насочен към дендритни клетки, предизвиква превъзходен хетероложен защитен потенциал при мишки. арх. Virol. 2015, 160, 2517–2524. [CrossRef]

20. Чен, Х.; Уен, Б.; Deng, Y.; Wang, W.; Ин, X.; Guan, J.; Руан, Л.; Tan, W. Подобрен ефект на ДНК имунизация плюс in vivo електропорация с комбинация от плазмиди на вируса на хепатит B core-PreS1 и S-PreS1. Clin. Ваксина Имунол. 2011, 18, 1789–1795. [CrossRef]

21. Янг, Р.; Deng, Y.; Хуанг, Б.; Хуанг, Л.; Лин, А.; Li, Y.; Wang, W.; Liu, J.; Lu, S.; Жан, З.; et al. Структурирана ядро-обвивка COVID-19 иРНК ваксина с благоприятен модел на биоразпределение и обещаващ имунитет. Сигнален трансдукт. Target Ther. 2021, 6, 213. [CrossRef] [PubMed]

22. Янг, Р.; Хуанг, Б.; А, Р.; Li, W.; Wang, W.; Deng, Y.; Tan, W. Разработване и ефективност на псевдотипирана SARS-CoV-2 система, както е определено чрез неутрализираща ефективност и тест за инхибиране на навлизане in vitro. Biosaf. Здраве 2020, 2, 226–231. [CrossRef] [PubMed]

23. Jia, Q.; Bielefeldt-Ohmann, H.; Maison, RM; Маслеша-Галиц, С.; Купър, SK; Bowen, RA; Horwitz, MRA Репликираща бактериално-векторна ваксина, експресираща SARS-CoV-2 мембранни и нуклеокапсидни протеини, предпазва от тежко COVID-19-подобно заболяване при хамстери. NPJ ваксини 2021, 6, 47. [CrossRef] [PubMed]

24. Хайник, Р.Л.; Plante, JA; Liang, Y.; Alameh, M.-G.; Танг, Дж.; Zhong, C.; Адам, А.; Scharton, D.; Рафаел, GH; Liu, Y.; et al. Комбинаторната иРНК ваксинация подобрява защитата срещу делта варианта на SARS-CoV-2. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Антон, IM; González, S.; Булидо, MJ; Корсин, М.; Risco, C.; Langeveld, JP; Enjuanes, L. Сътрудничество между структурни протеини на трансмисивен гастроентерит коронавирус (TGEV) при in vitro индукция на вирус-специфични антитела. Virus Res. 1996, 46, 111–124. [CrossRef]

26. Deschambault, Y.; Линч, Дж.; Warner, B.; Tierney, K.; Huynh, D.; Vendramelli, R.; Шивач, Н.; Фрост, К.; Буут, С.; Саджеш, Б.; et al. Единичната имунизация с рекомбинантни ACAM2000 ваксиниа вируси, експресиращи шипа и нуклеокапсидните протеини, предпазва хамстерите от клинично заболяване, причинено от SARS-CoV-2-. bioRxiv 2021. [CrossRef]

27. Penaloza-MacMaster, P.; Клас, J.; По дяволите.; Richner, JM A SARS CoV-2 нуклеокапсидна ваксина предпазва от дистално вирусно разпространение. bioRxiv 2021.

28. Афхами, С.; D'Agostino, MR; Джан, А.; Стейси, HD; Марзок, А.; Канг, А.; Сингх, Р.; Bavananthasivam, J.; Йе, Г.; Луо, X.; et al. Доставянето на респираторна лигавица на ваксина срещу COVID-19 от следващо поколение осигурява стабилна защита както срещу наследствени, така и срещу вариантни щамове на SARS-CoV-2. Cell 2022, 185, 896–915.e19. [CrossRef]

29. Джън, Н.; Xia, R.; Yang, C.; Ин, Б.; Li, Y.; Duan, C.; Liang, L.; Guo, H.; Xie, Q. Повишена експресия на SARS-CoV нуклеокапсидния протеин в тютюна и неговата имуногенност при мишки. Vaccine 2009, 27, 5001–5007. [CrossRef]

30. Ясуи, Ф.; Kai, C.; Китабатаке, М.; Inoue, S.; Йонеда, М.; Йокочи, С.; Касе, Р.; Секигучи, С.; Морита, К.; Хишима, Т.; et al. Предишна имунизация с нуклеокапсиден протеин, свързан с тежък остър респираторен синдром (SARS), свързан с коронавирус (SARS-CoV), причинява тежка пневмония при мишки, заразени със SARS-CoV. J. Immunol. 2008, 181, 6337–6348. [CrossRef]

31. Деминг, Д.; Шеахан, Т.; Heise, M.; Юнт, Б.; Дейвис, Н.; Sims, A.; Сутар, М.; Harkema, J.; Whitmore, A.; Пикълс, Р.; et al. Ефикасност на ваксината при стареещи мишки, заразени с рекомбинантни SARS-CoV, носещи епидемични и зоонозни пикови варианти. PLoS Med. 2006, 3, e525. [CrossRef] [PubMed]

32. Wesseling, JG; Godeke, GJ; Schijns, VE; Превец, Л.; Греъм, Ф.; Horzinek, MC; Rottier, PJ Шип на миши вирусен хепатит и нуклеокапсидни протеини, експресирани от аденовирусни вектори, предпазват мишките от смъртоносна инфекция. J. Gen. Virol. 1993, 74, 2061–2069. [CrossRef] [PubMed]

33. Ким, TW; Лий, JH; Hung, CF; Peng, S.; Роден, Р.; Wang, MC; Viscidi, R.; Tsai, YC; Той, Л.; Чен, PJ; et al. Генериране и характеризиране на ДНК ваксини, насочени към нуклеокапсидния протеин на коронавирус на тежък остър респираторен синдром. J. Virol. 2004, 78, 4638–4645. [CrossRef] [PubMed]

34. Le Bert, N.; Тан, AT; Kunasegaran, K.; Tham, CYL; Хафези, М.; Chia, A.; Chng, MHY; Лин, М.; Тан, Н.; Линстър, М.; et al. SARS-CoV-2-специфичен Т-клетъчен имунитет в случаи на COVID-19 и SARS и неинфектирани контроли. Nature 2020, 584, 457–462. [CrossRef]