Координирано регулиране на системния и бъбречния метаболизъм на триптофан от преносителите на лекарства OAT1 и OAT3

Джефри С. Гранадос¹, Ан Ришел², Джахир М. Гутиерес¹, Патрик Джан³, Синлиан Джан⁴, Вибха Бхатнагар⁵, Нейтън Е. Луис^1,2,6и Санджай К. Нигам^2,7,*

^{Контакт:joanna.jia@wecistanche.com}

Cistanche опит

Как органите усещат циркулиращите метаболити е ключов въпрос. Тук показваме, че мултиспецифичните транспортери на органични аниони на лекарства, OAT1 (SLC22A6 или NKT) и OAT3 (SLC22A8), играят роля в усещането на органи. Метаболомичните анализи на серума на Oat1 и Oat3 нокаут мишки разкриват промени в производните на триптофан, участващи в метаболизма и сигнализирането. Няколко от тези метаболити произлизат от микробиома на червата и са замесени като уремични токсини вхрониченбъбрекзаболяване. Директното взаимодействие с транспортерите беше подкрепено с клетъчно базирани транспортни анализи. За да се оцени въздействието на загубата на OAT1 или OAT3 функция върху бъбрека, орган, където тези транспортери на поглъщане са силно изразени, нокаутните транскриптомни данни бяха картографирани върху базиран на "метаболитна задача" изчислителен модел, който оценява над 150 клетъчни функции. Въпреки промените на метаболитите на триптофан и в двата нокаута, само в нокаута Oat1 бяха увеличени множество свързани с триптофан клетъчни функции. По този начин, лишен от способността да приема кинуренин, кинуренат, антранилат и N-за-милантранилат чрез OAT1, бъбрекът реагира чрез активиране на собствените си биосинтетични пътища, свързани с триптофан. Резултатите подкрепят теорията за дистанционно наблюдение и сигнализиране, която описва как преносителите на "лекарства" спомагат за оптимизирането на нивата на метаболитите и сигналните молекули чрез улесняване на кръстосаните разговори между органите. Тъй като OAT1 и OAT3 се инхибират от много лекарства, данните предполагат потенциал за взаимодействия лекарство-метаболит. Действително, лечението на хора с пробенецид, инхибитор на ОАТ, използван за лечение на подагра, повишава циркулиращите метаболити на триптофан. Освен това, като се има предвид, че регулаторните агенции са препоръчали лекарствата да бъдат тествани за свързване или транспортиране на OAT1 и OAT3, следва, че тези метаболити могат да се използват като ендогенни биомаркери, за да се определи дали кандидатите за лекарства взаимодействат с OAT1 и/или OAT3.

Транспортерите на органични аниони OAT1 (SLC22A6, първоначално NKT (1)) и OAT3 (SLC22A8, първоначално ROCT (2)) се намират в проксималния тубул набъбреки хороидния плексус на мозъка и контролира физиологичното разпределение и елиминиране на множество лекарства и токсини от околната среда, както и ендогенни метаболити като -кетоглутарат, простагландини и урати (3, 4). В допълнение, ОАТ помагат за регулиране на нивата на погълнати натурални продукти и съединения, получени от чревната микробиома (напр. епикатехин, 3-индоксил сулфат, р-крезол сулфат) (5, 6).

OAT1 и OAT3, членове на семейството SLC22, са сред най-известните мултиспецифични преносители на лекарства. Тази група преносители на лекарства включва други членове на суперсемействата SLC (носител на разтворени вещества) и ABC (ATP-свързваща касета) (7, 8). Има обширна литература за фармацевтичните и токсикологичните роли на тези транспортери, но ендогенните функции на тези еволюционно запазени протеини, както и регулаторната мрежа, в която те участват, едва започват да се характеризират (9). Тези мултиспецифични транспортери влияят върху много аспекти на физиологията и патофизиологията, вероятно като функционират в комбинация с моно- или олигоспецифични транспортери. Три добре охарактеризирани патофизиологични примера са ролите на OAT1, OAT3, URAT1 и ABCG2 при подагра (10), ролята на OAT1 и OAT3 в натрупването на уремични токсини, свързани с хроничнибъбрекзаболяване (CKD) (11, 12) и семейството SLC22 при остърбъбрекнараняване (13).

Поради широкия набор от малки органични анионни съединения, транспортирани от OAT1 и OAT3, широка гама от ксенобиотици и ендогенни молекули могат да се конкурират за достъп до и бъбречен клирънс от тези OAT транспортери (14, 15). Това има важни последици, тъй като много от метаболитите, включително тези, произтичащи от микробиома на червата и транспортирани от OAT1 и OAT3, регулират ендогенната физиология и са свързани с развитието на клинични разстройства, като ХБН, метаболитен синдром и диабет (14, 16, 17). Например, количеството CMPF (3-карбокси-4-метил-5-пропил-2- фуран пропанова киселина), субстрат на OAT3, в кръвообращението е свързано с диабета. CMPF е метаболит на фуранова мастна киселина, който се намира в рибено масло, растително масло, масло и други храни и нарушава функцията на панкреатичните клетки, което води до непоносимост към глюкоза (18, 19). Потенциалните последици от конкуренцията на ниво транспортер между лекарството и транспортирания ендогенен метаболит включват (а) променени вътреклетъчни концентрации на метаболити, тъй като транспортирано лекарство блокира навлизането на метаболит в клетката; (b) променени серумни концентрации на лекарството, метаболита или и двете, което води до повишен полуживот и/или метаболитни нива; и (c) променен системен метаболизъм, възникващ от дистални каскадни ефекти върху множество метаболитни пътища, които зависят от OAT1 или OAT3 или и от двете.

Приложихме подход на системна биология, който използва метаболомични и транскриптомни данни от Oat1 и Oat3knockout (KO) мишки, за да анализира основните метаболитни функции, които се влияят от OAT1 и OAT3. Серумните метаболомични данни от Oat1 и Oat3 KO мишки представляват въздействието, което тези транспортери имат върху ендогенния системен метаболизъм. Използвахме транскриптомичните данни отбъбрек, което е мястото на експресия на кодиращите транспортни гени, за оценка на активността на стотици метаболитни функции, използвайки анализ на метаболитни задачи. По този начин успяхме да допълним разбирането за извънклетъчните метаболитни промени поради загубата на OAT1 или OAT3 транспортера с анализ на засегнатите вътреклетъчни метаболитни пътища.

Заедно подходът на мулти-омика и анализът на системната биология, използвани тук, предоставят портрет на локалните и системни метаболитни и сигнални пътища, модулирани отделно и съвместно от OAT1 и OAT3. Ние показваме, че OAT1 не само регулира метаболизма на триптофан системно, но също така играе ключова роля в метаболитните пътища на триптофан в тъканта, където се намира. По този начин, нашите резултати показват, че проучванията на нови лекарствени единици трябва не само да вземат предвид ефектите на взаимодействието лекарство-метаболит (DMI) в серума, но също така да оценят потенциалните промени в клетъчния метаболизъм поради загуба на приток на метаболит чрез конкуренция на ниво транспортер. В подкрепа на значението на нашата работа за хората, ние показваме, че много от промените в серумните нива на метаболитите на триптофан, наблюдавани при нокаут мишки, се наблюдават и при хора след прилагане на пробенецид, лекарство, използвано за лечение на подагра, което инхибира OAT1 и OAT3.

\

cistanche мъжки ползи

Резултати

Обобщение на цялостния подход

Семейството гени SLC22 (OATs, OCTs, OCTNs) кодира транспортери, които участват в усвояването на много уникални съединения в няколко тъкани, въпреки че голяма част от изследванията са фокусирани върху шепа членове (SLC22A1, SLC22A2, SLC22A6, SLC22A8), които управляват много често срещани лекарства (20, 21). Въпреки това, тези гени са силно запазени, с ортолози в муха, червей, риба и морски таралеж (22); това означава, че те имат важни физиологични роли извън боравенето с лекарства. За да се определят ендогенните роли на OAT1 и OAT3 в контролирането на метаболизма на тъканно ниво и на ниво организъм, независимо от техните добре известни роли като преносители на лекарства и токсини, ние анализирахме тъканно-специфични транскриптомични данни и серумни метаболомични данни (фиг. 1). Сравнихме данни от мишки с генетичен дефицит на Oat1 или Oat3 и техните контроли от див тип. Тези набори от данни преди това са били изследвани от химиоинформационна гледна точка (23) и за предоставяне на широк преглед на засегнатите пътища (24), но тук поставяме акцент върху тяхната специфична роля в разпределението на метаболитите на триптофан. Тъй като тези два транспортера се намират вбъбрек, анализирахмебъбректранскриптомични данни с помощта на метаболитен анализ на задачите, метод на системна биология, който групира гените според техните координирани роли в биосинтезата на ограничен набор от ключови метаболитни междинни продукти от различни метаболитни входове (вижте раздела Методи за повече подробности). Ние подкрепихме тези проучвания в рамките на анализи за витро транспорт; ние също подкрепяме клиничното значение на нашите открития с човешки метаболомни данни.

Известни характеристики на Oat1 KO и Oat3 KO мишки Почти всички характеристики на мишки с дефицит на Oat1 или Oat3 са подобни на тези на мишки от див тип (25-27) (Таблица 1). Нокаутираните мишки са жизнеспособни с оцеляване, сравнимо с това на мишки от див тип. Нещо повече, те не показват видими аномалии в развитието или растежа, а хистологичното и физиологичното изследване на тези различни нокаути (на възраст ~2–8 месеца) разкриха малки или никакви разлики от дивия тип, различни от мишките Oat3 KO, които имат малко по-ниско кръвно налягане ( 28). Тенденция към отлагане на липиди в черния дроб в Oat1 KO също е отбелязана, но само за много стари мишки (29).

Тези мишки с нокаут на транспортер също са характеризирани от фармакологична и токсикологична гледна точка (Таблица 2). OAT1 и OAT3 играят важна роля в боравенето с различни лекарства и токсини, както от околната среда, така и ендогенно произведени (30–38). И двете нокаут мишки имат променен отговор към бримковите и тиазидните диуретици поради неспособността на тези лекарства да имат достъп до лумена на нефрона – процес, зависим от OAT1-или OAT3-медиирано поемане в проксималните тубулни клетки . Oat1 KO животните са защитени срещу индуцирана от живак нефротоксичност поради липса набъбрекусвояване на живачни конюгати. И двете мишки натрупаха уремични токсини в серума и показаха намалена секреция на пикочна киселина. Ex vivo анализ на тъкани от Oat1 KO или Oat3 KO мишки показва намалено усвояване на няколко антивирусни средства.

Докладвахме, че животни с дефицит на овес1- може да имат намалена експресия на OAT3 (39). Редица проучвания обаче показват, че функционалното въздействие на това е скромно в най-добрия случай в основното състояние. Например нокаутът Oat1бъбрециимат значително намален транспорт на PAH, но няма видима загуба на транспорт на OAT3 субстрата, естрон сулфат (26). Химиоинформационният анализ идентифицира групи от молекулярни свойства, които разграничават метаболитите, променени в Oat1 в сравнение с мишките с дефицит на Oat3 (23). Освен това, ембрионаленбъбрекорганни култури от двете линии мишки транспортират различни комплекти антивирусни средства (36–38). Има също разлики в видовете уремични токсини, открити в Oat1 спрямо Oat3 KO (34).

Метаболизмът на триптофан се променя системно при Oat1 и Oat3 KO мишки

Публикуваните метаболомични анализи на Oat1 KO и Oat3 KO мишки предполагат физиологично важни промени в обработката на ендогенни метаболити и чревни микробиомни продукти, включително някои уремични токсини (34, 35). Тук анализирахме 731 метаболита с известна идентичност в серума, събран от контролни и Oat1 KO мишки. По същия начин, 611 метаболита с известна идентичност бяха открити в серума от контролни и Oat3 KO мишки.

За мишки Oat1 KO открихме, че 63 метаболита в суперпътя на аминокиселините (допълнителна таблица S1) са значително увеличени (p По-малко или равно на 0.05, 54 метаболита, сред които 12 метаболита имат кратни промени по-високи от 3) или тенденция към значително повишение (0.05 По-малко или равно на p По-малко или равно на 0,10, девет метаболита), което предполага, че те са или OAT1 субстрати, или че серумните им концентрации зависят на OAT1. За Oat3 KO мишки открихме, че десет метаболита в суперпътя на аминокиселините са значително увеличени, докато 11 са с тенденция към значително увеличение (допълнителна таблица S2). Като допълнение към p-стойностите, ние също изчислихме d на Коен, което показа големи размери на ефекта (вариращи от 1,76 до 4,17) за метаболитите на триптофан. В съответствие с други фармакологични и физиологични данни, получени от OAT1 и OAT3 нокаут мишки или тяхната тъкан, показващи важни функционални разлики (23, 36, 38), сравнението на промените в серумните метаболити по пътя на Superpath на аминокиселините между Oat1 KO (63 метаболита) и Oat3 KO (21 метаболита) мишки разкриват само десет припокриващи се метаболита в тези подгрупи (допълнителна таблица S3).

Всеки метаболит беше класифициран с помощта на софтуера на Metabolon в един от осемте суперпътища (аминокиселини, въглехидрати, кофактори и витамини, енергия, липиди, нуклеотиди, пептиди, ксенобиотици) и един от 90 подпътища. От 17-те метаболита, които значително се натрупват в серума както на животните Oat1 KO, така и на Oat3 KO, четири принадлежат към подпътеката на метаболизма на триптофана, което показва, че тези два транспортера имат важна споделена роля в регулирането на системния метаболизъм на триптофан (фиг. 2) . Независимо от това, метаболизмът на триптофана е сред най-обогатените подпътеки и за двата нокаут модела (фиг. 3). Шестнадесет Фигура 3. Метаболизмът на триптофана е един от най-променените пътища и при двете нокаут мишки. Диаграма на вулкан за Oat1 KO (n=5) ​​показва метаболитите на триптофан спрямо всички други измерени метаболити. B, метаболизмът на триптофан е вторият най-обогатен път за значително повишени метаболити. C, графика на вулкана за Oat3 KO (n=3), показваща метаболитите на триптофан спрямо всички други измерени метаболити. D, метаболизмът на триптофан е най-обогатеният път за значително повишени метаболити въз основа на анализ на метаболонния подпът. Роля на OAT1 и OAT3 в метаболизма на триптофана 4 J. Biol. Chem. (2021) 296 100575метаболитите на триптофан бяха измерени в серума на двете мишки и 12 бяха значително променени в поне една група. Oat1 KO мишките имат повишени 11 метаболита, включително един (N-формилант хранилат), който не е измерен в серума на Oat3 KO (Таблица 3). Анализът на Oat3 KO разкри, че шест от 16-те метаболита са били значително променени или с тенденция към значително промяна. Известно е, че някои от тези метаболити, включително тези, произтичащи от бактерии в чревната микрофлора, имат дистални ефекти върху няколко други органи. Например 3-индоксил сулфатът се свързва с прогресирането набъбрекзаболяване и уремичен синдром (12, 40). Данните показват, че OAT1 и OAT3 работят заедно за регулиране на системния метаболизъм на триптофан и въпреки това имат специфични функции в метаболизма на триптофан, като се справят с различни набори от метаболити, засягащи различни биохимични реакции.

Оценка на взаимодействията лекарство-метаболит при хора, включващи ОАТ-инхибиращо лекарство и метаболити на триптофан

Пробенецид, лекарство, използвано за лечение на подагра, се прилага на хора, за да се определи краткосрочното въздействие на високоафинитетно свързващо ОАТ лекарство върху нивата на циркулиращите метаболити. Пробенецидът има три добре установени мишени: SLC22A12 (URAT1, Rst), OAT1 и OAT3, всички от които са тясно свързани гени в групата на органичния анионен транспортер от семейството SLC22 от носители на разтворени вещества. URAT1 е транспортер на пикочна киселина, разположен на апикалната мембрана (гледащата към урината страна) на проксималния тубул, така че се очаква OAT1 и OAT3, които са мултиспецифични и се експресират от обърнатата към кръвта страна на проксималния тубул, да упражняват по-дълбок ефект върху серумния метаболом. Сравненията на метаболитните измервания на кръвта преди и 5 часа след дозирането показват значителни промени в подпътеката на метаболизма на триптофана (Таблица 4). Поради различните платформи, в този под-път има 22 метаболита, 16 от които са значително променени. Четиринадесет метаболита бяха измерени във всичките три платформи и разкриха няколко общи черти между нокаутираните мишки и хората, третирани с пробенецид (фиг. 4). Например, повишения на 3-индоксил сулфат, кинуренин, N-ацетилкинуренин и индол лактат са наблюдавани както при нокаут групи мишки, така и при хора. Въпреки това, имаше повече припокриване между мишка Oat1 KO и хора, лекувани с пробенецид. Всичките осем метаболита, които са били значително повишени в Oat1 KO, също са били значително повишени при хората, лекувани с лекарства. Само серотонинът, който е бил повишен при мишката Oat3 KO, не е променен при хората.

Мишки, третирани с лекарство, инхибиращо OAT, показват промени в метаболизма на триптофана

Като междинно звено между нашите нокаут модели на мишки и хора, ние лекувахме мишки от див тип с пробенецид, утвърдено лекарство, инхибиращо OAT. Това лекарствено лечение доведе до повишаване на шест метаболита на триптофан, включително кинуренин, кинуренат и индолелактат (фиг. 5). Тези метаболити са били повишени в един или двата експеримента с нокаут и при хора, лекувани с пробенецид.

По този начин общите резултати при хора и мишки, третирани с пробенецид, както и нокаут мишките, подкрепят ролята на OAT1 и OAT3 в регулирането на циркулиращите нива на метаболитите на триптофан.

Метаболитите на триптофан взаимодействат с човешки OAT1 и OAT3 in vitro транспортни анализи За да потвърдим нашите констатации, извършихме in vitro транспортни анализи, използвайки клетки, свръхекспресиращи човешки OAT1 и OAT3. Много от метаболитите в този подпът са тествани срещу тези транспортери (Таблица 3), но други метаболити остават неизследвани. Анализите на транспортирането на индолоцетна киселина (ILA) разкриват, че ILA взаимодейства с OAT1 и OAT3 (IC50=229.1 ± 74,56 μM, съответно 74,49 ± 23,29 μM) (фиг. 6). Освен това, серотонинът, който беше уникално повишен в Oat3 KO, взаимодейства само с OAT3 in vitro (IC50=288.2 ± 167.0 μM) (данните не са показани). След това стойностите на IC50 бяха интегрирани с известни стойности на Km за изчисляване на инхибиторни константи. Инхибиторната константа (Ki) за ILA с OAT1 е 119,3 μM.

Анализът на метаболомната задача на нокаутния бъбрек показва основна роля на OAT1 в проксималното тубулно отчитане на триптофанови метаболити

Използвахме данни от микрочипове отбъбрецина Oat1 KO, Oat3 KO и техните контроли от див тип, за да идентифицират как промените на транспортера влияят набъбрекметаболитни функции. За тази цел използвахме метод на системна биология (анализ на метаболитни задачи (41) от инструмента CellFie), който прогнозира как промените в генната експресия влияят на предварително определен списък от 175 метаболитни задачи (допълнителна таблица S4), обхващащи общите метаболитни системи на клетка (енергия, нуклеотиди, въглехидрати, аминокиселини, липиди, витамини и кофактори и гликанов метаболизъм). Както е описано в Методи, изчисляването на "резултат за метаболитна задача" взема транскриптомични данни и приписва резултат за генна активност за всеки ген. Модел на метаболизма в геномен мащаб се използва за съставяне на списък от реакции, необходими за изпълнение на всяка от 175-те метаболитни задачи. По този начин, транскриптомният анализ може директно да се използва за количествено сравняване на относителната активност на всяка метаболитна функция при различните условия (напр. див тип спрямо Oat1 KO, див тип спрямо Oat3 KO).

Открихме, че свързаните с триптофан метаболитни задачи са често срещани сред тези с голяма разлика между Oat KO и мишки от див тип. Неочакваното обаче беше, чебъбрекметаболитните задачи, свързани с триптофан, зависят от OAT1, но не и от OAT3. При мишките Oat1 KO, синтезът на кинуренин, кинуренат, антранилат и N-за-милантранилат от триптофан има повишени резултати от метаболитни задачи, докато всяка от тези задачи има намален резултат от метаболитни задачи в Oat3 KO. Това е в съответствие със серумните метаболомични анализи, които показват значително повишаване на нивата на кинуренин, кинуренат, антранилат и N-за-милантранилат в Oat1 KO.

Дискусия

OAT1 и OAT3 са признати за тяхната роля в елиминирането на стотици лекарства (42). Въпреки това, in vivo и in vitro проучвания на OAT1 и OAT3 показват, че тези протеини участват в транспорта на множество ендогенни и получени от чревни микроби метаболити, уремични токсини, сигнални молекули, погълнати хранителни вещества, индустриални токсини и природни продукти (9, 24, 26, 34, 35, 43). Изглежда, че това важи и за други мултиспецифични преносители на лекарства, което предполага, че техният принос към ендогенния метаболизъм е силно подценен (44).

Тези мултиспецифични преносители на лекарства са силно експресирани в почти всички тъкани и играят особено критична роля на Фигура 4. Метаболитите на триптофан са повишени при нокаут мишки с Oat и хора, третирани с пробенецид. Диаграма на Venn на значително променени метаболити на триптофан при нокаутирани мишки и хора, лекувани с пробенецид. От 14 метаболита, общи за трите платформи, 12 са значително повишени в поне един от експериментите. Четири метаболита бяха значително повишени във всеки експеримент. B, химични структури на метаболити, повишени във всеки експеримент: 3-индоксил сулфат, индолелактат, кинуренин и N-ацетилкинуренин. C, графики за всеки метаболит при хора, третирани с пробенецид (n=20), Oat1 KO мишки (n=5) и Oat3 KO мишки (n=3). Линиите в квадратните графики показват медианата. Роля на OAT1 и OAT3 в метаболизма на триптофан. Biol. Chem. (2021) 296 100575 7епителни и ендотелни бариери между кръвта и други телесни течности/компартменти (напр. кръвно-мозъчна бариера, кръвно-ретинна бариера, кръвно-ликворна бариера, носно-мозъчна бариера, кръвно-уринарна бариера). Като регулатори на системния метаболизъм, както и на локалния метаболизъм в тяхната експресивна тъкан, типът изследвания и анализи, които сме описали тук, ако се извършат за всички преносители на "лекарства", могат радикално да променят нашите физиологични възгледи за тези еволюционно запазени протеини.

Клиничното фармацевтично значение на тези преносители е огромно и регулаторните агенции препоръчаха скрининг на нови лекарствени единици срещу поне седем мултиспецифични преносители на лекарства (OAT1, OAT3, OATP1B1, OATP1B3, OCT2, P-GP, BCRP), за да се ограничи възможността от лекарствени взаимодействия (DDI) – случаи, при които две или повече лекарства се конкурират за достъп до един и същ транспортер. Медиираните от транспортер DDI могат да променят концентрацията на лекарствата в кръвта, което потенциално води до неблагоприятни клинични ефекти (45). Като се има предвид броят на субстратите за OAT1 и OAT3, подобно явление може да възникне между лекарствата и метаболитите в обращение. Тези DMI също имат потенциала да повлияят на функцията на тъканите, тъй като метаболитите и сигналните молекули може да не са в състояние да влязат в клетката и да упражнят своите ефекти върху нормалната клетъчна физиология. Настоящото проучване подкрепя тази възможност.

В нашите метаболомични анализи на серума на Oat1 и Oat3 нокаут мишки имаше забележими промени в метаболитите, свързани с триптофан. Увеличаването на системните нива на метаболитите, поради липсата на тези транспортери на границата на кръвта сбъбрек, повиши възможността за намалена вътреклетъчна концентрация вбъбрекклетки на проксималните тубули. Как могат да реагират тези клетки на свой ред? Използвахме анализ на метаболитни задачи, базиран на транскриптомика, за да отговорим на този въпрос. Ние идентифицирахме множество локални (бъбречни) метаболитни задачи, свързани с триптофан, засегнати от липсата на транспортери. Тези промени в резултатите от метаболитните задачи са причинени от компенсаторни увеличения в експресията на гените, свързани с метаболитните задачи, в контекста на дефицит на OAT1. Въпреки че много метаболитни пътища бяха изследвани както чрез метаболомичен, така и чрез анализ на метаболитни задачи, базиран на транскриптомика, използването на двата подхода ни предостави уникална представа за това как някои преносители на лекарства участват в комуникацията между тъканта и извънклетъчната среда. По този начин, докато метаболитите на триптофан се регулират от двата транспортера на системно ниво, метаболитните задачи, свързани с триптофан в бъбреците, зависят предимно от OAT1.

Резултатите показват, че проксималния тубул набъбрек, където се намират ОАТ, не е просто канал за бъбречно елиминиране на метаболитите на триптофан; той усеща метаболитите на триптофан и реагира на промените в тяхното вътреклетъчно изобилие. Взети заедно, данните подкрепят мнението, че OAT1 играе ключова роля не само в изчистването на метаболитите, свързани с триптофан, от кръвообращението, като насърчава тяхното усвояване отбъбрекно също така, че този транспортер регулира вътреклетъчния метаболизъм, особено метаболизма на триптофана.

Това подкрепя мнението, че медиираният от OAT1- транспорт на кинуренин, кинуренат, антранилат и N-за-милантранилат е важен забъбрекфункция (фиг. 8). Тези четири метаболита принадлежат към кинурениновия подпът на разграждане на триптофан и с изключение на кинуренат, те участват в производството на клетъчна енергия чрез синтеза на NAD плюс (46). По този начин е възможно липсата на OAT1 да доведе до нарушен клетъчен метаболизъм, който може да бъде поне частично възстановен чрез производството на тези метаболити.

Почти целият погълнат триптофан се метаболизира в три основни подпътища: кинуренин, серотонин и индол (47, 48). В допълнение към ролята си в производството на NAD плюс, подпътеката на кинуренин произвежда метаболити, които имат различни функции както в здрави, така и в болни състояния (46, 49). Пътят на серотонина произвежда невротрансмитера, серотонин, който играе роля в множество физиологични процеси, най-вече като регулатор на функцията на ЦНС (50). Индоловият подпът, който се медиира от микробиома на червата, произвежда сигнални молекули, които участват в комуникацията гостоприемник-микроб (51). Системно, OAT1 и OAT3 модулират бионаличността на метаболитите на триптофан от всеки от трите подпътища, въпреки че повечето от метаболитите идват от кинурениновия и индоловия подпътеки.

Имайки предвид безбройните сигнални роли, които имат повишените метаболити, има потенциал OAT1 и OAT3 да повлияят на много аспекти на физиологията. Например, кинуренатът активира GPR35, мишена на лекарството, и GPCR, участващи във възпалителни реакции и сърдечно-съдови заболявания (52). Много от значително променените метаболити на триптофан също са установени или предполагаеми лиганди на арил въглеводороден рецептор (AhR) (Таблица 3), транскрипционен регулатор, експресиран в почти всички тъкани, които реагират на ксенобиотици (53).

Метаболомичните изследвания на двете нокаут мишки показват, че ключова ендогенна функция на OAT1 и OAT3 е да регулират системните нива на метаболитите на триптофан. По този начин се очаква лекарство, насочено към OAT1 и OAT3, да има подобно въздействие върху метаболома. Както беше предвидено, транслационният потенциал на нашите нокаут мишки като модели на DMI беше силно подкрепен от резултатите от хора, лекувани с пробенецид, лекарство, инхибиращо ОАТ, което се използва в световен мащаб за лечение на подагра. Няколко от метаболитите на триптофан са повишени както в серума на хора, така и в нокаут мишки.

По този начин има потенциал за съединенията, повишени в проучвания при хора и гризачи, да бъдат използвани като биомаркери за нови лекарствени единици, които могат да инхибират OAT1 и OAT3. Докато моделите с нокаут мишки (които имат нормална продължителност на живота) и хората, лекувани с пробенецид, са били здрави, някои от повишените метаболити са известни уремични токсини, които са повишени в серума на хора, страдащи от хронична бъбречна недостатъчност и свързани с отрицателни резултати (54 , 55). Припокриването на метаболитите, замесени в аспекти на ХБН, и нашите проучвания предполагат, че ОАТ могат да играят ключова роля в проявите на ХБН или нейното прогресиране, въпреки че също е възможно метаболитните концентрации да бъдат повишени поради загуба на секреция в резултат на тъкан щети (56, 57). ХБН също може да доведе до полиорганна недостатъчност, отчасти поради натрупването на уремични токсини и това може да се дължи отчасти на поглъщане в други тъкани чрез SLC и ABC транспортери на лекарства (12, 58).

Пътят на метаболизма на триптофана изисква координирана функция на няколко органа. Триптофанът се абсорбира от червата, модифицира се от черния дроб или други органи, а метаболитите в крайна сметка се транспортират отбъбрек, отчасти чрез функцията на OAT1 и OAT3. Обикновено това се разглежда просто като път на елиминиране. Нашите резултати, които показват, че клетките набъбрекреагират на липсата на тези метаболити и сигнални молекули, като се подготвят да ги произвеждат, предполагат друго. Въпреки че специфичната им роля вбъбрекпроксималният тубул е слабо дефиниран, ясно е, че много от произведените междинни продукти са невротрансмитери и имат важна роля във функцията на ЦНС (46, 49, 59, 60). В допълнение към междуорганната комуникация, метаболизмът на триптофана също отразява междуорганизмовата комуникация между гостоприемника и чревния микробиом. Наистина, серумът на свободни от микроби мишки има понижени нива на 3-индоксил сулфат, индолпропионат и серотонин (61). Освен това, предишни проучвания показват, че в рамките на бъбречните OAT1-позитивни клетки, 3-индоксил сулфатът функционира в клетъчното сигнализиране чрез активиране на AhR и регулиране на тяхната собствена секреция чрез OAT1 (62). Нашите констатации, че извлечените от червата метаболити са били увеличени в серума както на Oat1 KO, така и на Oat3 KO мишки - заедно с нашата демонстрация, че някои са лиганди in vitro, осигуряват допълнителна подкрепа за важността на тези транспортери в регулирането на комуникацията между гостоприемника и комменсал организми. Като цяло, нашите резултати са в съответствие с теорията за дистанционно наблюдение и сигнализиране, която предлага преносителите на лекарства и ензимите, метаболизиращи лекарствата, да участват в междуорганната и междуорганизмовата комуникация чрез транспортиране и модификация на малки молекули за поддържане на хомеостазата (63, 64). По този начин е изключително важно да се разбере гамата от ендогенни физиологични функции на преносителите на лекарства системно и локално.

С подобрени метаболомични данни ние идентифицирахме метаболити, повлияни от липсата на OAT1 и OAT3 в модели на гризачи и метаболити, повлияни от инхибирането на OAT1 и OAT3 при хора, лекувани с лекарства, инхибиращи OAT. Нашата група преди това е използвала мрежи за метаболитна реконструкция, за да предвиди метаболитната функция и докладва за няколко споделени и уникални пътища, регулирани от OAT1 и OAT3 (43, 65). Тези проучвания обаче бяха ограничени от ранни версии на инструменти за реконструкция и много малко метаболомични данни. Тук, използвайки различен подход, Metabolic Task Analysis постави много по-голям акцент върху ролята на OAT1 във вътреклетъчния метаболизъм на триптофан набъбрек. Нашият подход може да се приложи за изследване на ендогенните функции на други членове на семейството на SLC и ABC и за изграждане на отделни, но припокриващи се мрежи за всички тези преносители на лекарства, които се намират не само в мишки, но също и в пълни и червеи (20, 66). Такива представяния също ще улеснят разбирането на пълния обхват на DMI за лекарства, взаимодействащи с OAT1, OAT3 или и двете, които вероятно надхвърлят обикновената конкуренция на нивото на транспортера.

Експериментални процедури

Животни

Всички експериментални протоколи, включващи използването на животни, бяха одобрени от Комитета за институционална грижа и използване на животните на UCSD (IACUC). Всички животни бяха обработени в съответствие с институционалните насоки за използване на живи животни за изследвания. Възрастни мъжки WT, Oat1 KO и Oat3 KO бяха настанени отделно при 12-h цикъл светло-тъмно и им беше осигурен ad libitum достъп до храна и вода. Тези животни са описани в предишни публикации (26, 27). На третираните с пробенецид мишки се прилага ежедневна интраперитонеална инжекция от 200 mg/kg пробенецид или PBS в продължение на 3 дни преди умъртвяването. Последната инжекция се прилага 2 часа преди умъртвяването. Наборите от данни, използвани за този анализ, също са частично описани (23, 24). Наборът от данни Oat1 KO е частично проучен от химиоинформационна гледна точка, но не е извършен подробен анализ на пътя (23). Наборът от данни Oat3 KO беше повторно анализиран и само две групи бяха сравнени (24).

Проучвания при хора с пробенецид

Всички експериментални протоколи бяха прегледани и одобрени от Институционалния съвет за преглед и спазват Декларацията от Хелзинкските етични принципи. Бяха събрани проби от цяла кръв от 20 индивида (14 жени, шест мъже). Средната възраст е 30,85 ± 10,98, а средният ИТМ е 24,18 ± 3,52. Участници, които не са приемали никакви лекарства и са били на вегетарианска диета по време на проучването. Прилага се перорална доза от 1 грам пробенецид и след 5 часа отново се взема цяла кръв. Всяка проба се съхранява замразена при –80 градуса до метаболомен анализ.

Метаболомика Пробите от човешки серум бяха незабавно съхранени при –80 градуса и изпратени върху сух лед до Metabolon Inc. Пробите от миши серум бяха събрани и анализирани, както беше описано по-горе (23, 24). За да обобщим накратко, за всяка проба беше извършено целево метаболомно профилиране от Metabolon Inc. Системата MicroLab STAR от Hamilton Company беше използвана за подготовка на всяка проба и бяха добавени няколко стандарта за възстановяване за контрол на качеството. Серумът се утаява с метанол и се разбърква с Glen Mills GenoGrinder 2000 за отстраняване на протеини от серума и освобождаване на молекули, свързани с тези протеини. Полученият разтвор се разделя на четири по-малки проби. Две бяха анализирани чрез течна хроматография с обратна фаза (RP) ултраефективна течна хроматография (UPLC) масспектрометрия (MS) с йонизация с електроспрей (ESI) в режим на положителни йони. Една проба беше анализирана чрез RP/UPLC-MS/MS с ESI в режим на отрицателни йони. Една проба беше анализирана чрез HILIC/UPLC-MS/MS. Органичният разтворител се отстранява чрез поставяне на всяка проба върху TurboVap (Zymark).

Статистика

Както за проби от хора, така и за мишки, суровите стойности бяха нормализирани до обем, логаритмично трансформирани и липсващите стойности бяха заменени с най-ниската наблюдавана стойност за всяко съединение. В пробите от човешки серум статистическата значимост беше определена с помощта на ANCOVA контрасти, които включват ИТМ и възраст. За проби от миши серум, значимостта се определя с помощта на t-теста на Welch за две проби с метаболити, които постигат статистическа значимост (p По-малко или равно на 0.05), както и тези, които се доближават до значимостта ( 0.05 По-малко или равно на p По-малко или равно на 0,10), включени в последващи анализи. Обогатяването се определя с помощта на уравнение 1, където k е броят на значително променените метаболити в подпътека, m е броят на метаболитите в подпътека, n е броят на значително променените метаболити в общия набор от данни и N е броят на измерени метаболити в общия набор от данни.

Анализ на метаболитни задачи

Използвахме анализа на метаболитната задача, както е внедрен в модула CellFie в GenePattern, за да определим количественона бъбрецитеметаболитни функции и влиянието на промените на OAT транспортера от данни за генна експресия (41) (т.е. данни от микрочипове от бъбреците на Oat1 KO, Oat3 KO и техните контроли от див тип). Този анализ прогнозира активността на подбрана колекция от стотици задачи, обхващащи седем основни метаболитни дейности на клетката (генериране на енергия, нуклеотиди, въглехидрати, аминокиселини, липиди, витамини и кофактори и гликанов метаболизъм) директно от транскриптомни данни чрез използване на геномни умалени модели на човешкия метаболизъм. По-конкретно, изчисляването на относителната активност на метаболитна задача (т.е. оценка на метаболитна задача) разчита първо на предварителната обработка на наличните транскриптомни данни и приписването на оценка на генната активност за всеки ген (67). Геномно-мащабният модел на човешкия метаболизъм се използва допълнително за идентифициране на списъка от реакции, необходими за изпълнение на всяка метаболитна задача и по този начин за идентифициране на списъка от гени, които могат да допринесат за придобиването на метаболитна функция въз основа на GPR правила (т.е. , правила за генна протеинова реакция). Следователно резултатът от метаболитната задача се изчислява като среден резултат от активността на всички гени, допринасящи за метаболитната функция. По този начин транскриптомичните данни могат директно да се използват за количествено определяне на относителната активност на всяка метаболитна функция в конкретно състояние.

In vitro транспортни анализи

Човешки ембрионбъбрек(HEK)-293 клетки, които стабилно свръхекспресират човешки OAT1 и OAT3 (Solvo Biotechnology) бяха отгледани до сливане в Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Invitrogen), допълнен с 10 процента фетален говежди серум и 1 процент пеницилин/стрептомицин и поддържани в 5 % CO2 при 37°С. OAT1-експресиращите клетки бяха избрани в присъствието на бластицидин, а OAT3-експресиращите клетки бяха избрани в присъствието на пуромицин. И двете клетъчни линии са тествани отрицателно за заразяване с Mycoplasma. Преди функционалните анализи, клетките се поставят върху 96-плаки с ямки, инкубират се за 24 часа и се допълват със среда. Експериментите за конкурентно поглъщане бяха проведени чрез инкубиране на клетки в буферен разтвор с фиксирана концентрация от 10 μM6-карбоксифлуоресцеин и серийно разредена концентрация на предложения субстрат, започваща от 2 mM. Буферът се отстранява след 10-минутна инкубация при стайна температура и клетките се изплакват с DPBS три пъти. След това FL флуоресценцията се оценява с помощта на FL флуоресцентен четец на плаки. Стойностите на IC50 бяха определени с помощта на GraphPad Prism 8.

Стойностите на флуоресцентния интензитет бяха нормализирани, така че най-ниската стойност беше зададена на 0 процента, а най-високата стойност беше зададена на 100 процента. След нормализиране, данните се напасват към нелинеен модел и IC50 се определя с помощта на уравнение 2.

След това Ki се изчислява за всеки метаболит, като се използва уравнението на Cheng-Prusoff (Уравнение 3), с Km за hOAT1 HEK293 клетки, получени от предишни експерименти (68).

Наличност на данни

Всички съответни метаболомични данни се съдържат в статията и допълнителния материал. Транскриптомните данни са достъпни при поискване от snigam@health.ucsd.edu. хипотеза, ръководи проекта, проектира експериментите и написа и редактира статията.

Финансиране и допълнителна информация— Тази работа беше подкрепена от грант от Националните институти по здравеопазване (NIH) към SKN от Националния институт по общи медицински науки (NIGMS) (R01GM132938). Подкрепата за JCG идва от субсидията за обучение, предоставена от Националния институт по биомедицински изображения и биоинженерство (NIBIB) (T32EB009380) и допълнение към R01GM132938. Тази работа беше финансирана отчасти от щедро финансиране от NIGMS към NEL (R35GM119850), Национален институт по алергии и инфекциозни болести (NIAID) към NEL (UH2AI153029), стипендия на LIFA към AR и стипендия към JMG от правителството на Мексико ( CONACYT) и Института на Калифорнийския университет за Мексико и Съединените щати (UC-MEXUS). Съдържанието е отговорност единствено на авторите и не представлява непременно официалните възгледи на NIH. Някои фигури са генерирани с помощта на Biorender. Тази статия е посветена на паметта на Vibha Bhatnagar, MD, MPH.

Конфликти на интереси— Авторите декларират, че нямат конфликт на интереси със съдържанието на тази статия.

Съкращения— Използваните съкращения са: AhR, арил въглеводороден рецептор; ХБН, хроничнабъбрекзаболяване; DMI, взаимодействие лекарство-метаболит; ESI, йонизация с електроспрей; HEK, човешки ембрионбъбрек; ILA, индол оцетна киселина; KO, нокаут; RP/UPLC/MS, ултраефективна течна хроматография с обратна фаза–масспектрометрия.

Cistanche tubulosa предотвратява бъбречни заболявания, щракнете тук, за да получите пробата

От 1 Департамент по биоинженерство, 2 Департамент по педиатрия, 3 Департамент по биология, 4 Отдел по биостатистика и биоинформатика, Департамент по семейна медицина и обществено здраве, 5 Департамент по семейна и превантивна медицина, 6 Център за биоустойчивост на Фондация NovoNordisk в Калифорнийския университет в Сан Диего и 7 Департамент по медицина, Калифорнийски университет СанДиего, Ла Джола, Калифорния, САЩ Редактирано

от Майк Шипстън

Препратки

1. LopezNieto, CE, You, GF, Bush, KT, Barros, EJG, Beier, DR, и Nigam, SK (1997) Молекулярно клониране и характеризиране на NKT, генен продукт, свързан с фамилията транспортери на органични катиони, която е почти изключително изразено вбъбрек. J. Biol. Chem. 272, 6471–6478

2. Брейди, KP, Dushkin, H., Fornzler, D., Koike, T., Magner, F., Her, H., Gullans, S., Segre, GV, Green, RM и Beier, DR (1999 г. ) Нов предполагаем транспортер се картографира към мутацията на остеосклерозата (oc) и не се експресира в OC мутантната мишка. Геномика 56, 254–261

3. Riedmaier, AE, Nies, AT, Schaeffeler, E. и Schwab, M. (2012) Транспортери на органични аниони и техните последици във фармакотерапията. Pharmacol. Rev. 64, 421–449

4. Ahn, SY и Bhatnagar, V. (2008) Актуализация на молекулярната физиология на транспортьорите на органични аниони. Curr. мнение Нефрол. Хипертоници. 17, 499–505

5. Nigam, SK (2018) Семейството транспортери SLC22: парадигма за въздействието на преносителите на лекарства върху метаболитни пътища, сигнализиране и заболяване. Annu. Rev. Pharmacol. 58, 663–687

6. Lowenstein, J. и Grantham, JJ (2016) Възраждането на интереса към бъбречната тубулна функция. Am. J. Physiol. Бъбречно 310, F1351–F1355

7. Govindarajan, R. и Sparreboom, A. (2016) Преносители на наркотици: Напредък и възможности. Clin. Pharmacol. Там. 100, 398–403

8. Вие, GF и Morris, ME (2014) Предговор. В Молекулярна характеристика на преносители на лекарства и роля в разпределението на лекарствата, 2-ро издание. Wiley Ser Drug Disc, Hoboken, NJ. Xix

9. Nigam, SK, Wu, W., Bush, KT, Hoenig, MP, Blantz, RC и Bhatnagar, V. (2015) Боравене с лекарства, метаболити и уремични токсини отбъбреклекарствени транспортери на проксималните тубули. Clin. J. Am. Soc. Нефрол. 10, 2039–2049

10. Bhatnagar, V., Richard, EL, Wu, W., Nievergelt, CM, Lipkowitz, MS, Jeff, J., Maihofer, AX и Nigam, SK (2016) Анализ на ABCG2 и други транспортери на урат в пикочната киселина хомеостаза при хроничнибъбрекзаболяване: потенциална роля на дистанционното наблюдение и сигнализиране. Clin.БъбрекJ. 9, 444–453 Роля на OAT1 и OAT3 в метаболизма на триптофана

12 J. Biol. Chem. (2021) 296 100575

11. Nigam, SK и Bhatnagar, V. (2018) Системната биология на преносителите на пикочна киселина: Ролята на дистанционното наблюдение и сигнализиране. Curr. мнение Нефрол. Хипертоници. 27, 305–313

12. Nigam, SK и Bush, KT (2019) Уремичен синдром на хроничнабъбрекзаболяване: Променено дистанционно наблюдение и сигнализация. Нац. преп. Нефрол. 15, 301–316

13. Saito, H. (2010) Патофизиологична регулация на транспортери на бъбречна SLC22A организация при остърбъбрекнараняване: Фармакологични и токсикологични последици. Pharmacol. Терапевт. 125, 79–91

14. Lepist, EI и Ray, AS (2017) Отвъд взаимодействията лекарство-лекарство: Ефекти от инхибирането на транспортера върху антибиотици, хранителни вещества и токсини. Експертно мнение. Лекарство Metab. Токсикол. 13, 1075–1087

15. Duan, P., Li, SS, Ai, N., Hu, LQ, Welsh, WJ и You, GF (2012) Мощни инхибитори на транспортери на човешки органични аниони 1 и 3 от библиотеки с клинични лекарства: Откриване и молекулярна характеристика . Mol. Фармацевт. 9, 3340–3346

16. Evers, R., Piquette-Miller, M., Polli, JW, Russel, FGM, Sprowl, JA, Tohyama, K., Ware, JA, de Wildt, SN, Xie, W., Brouwer, KLR и Consortium, IT (2018) Свързаните със заболяването промени в преносителите на лекарства могат да повлияят на фармакокинетиката и/или токсичността на лекарствата: Бяла книга от Международния консорциум за транспортери. Clin. Pharmacol. Ther.104, 900–915

17. Masereeuw, R., Mutsaers, HA, Toyohara, T., Abe, T., Jhawar, S., Sweet, DH, и Lowenstein, J. (2014)бъбреки отстраняване на уремичен токсин: гломерул или тубул? Семин. Нефрол. 34, 191–208

18. Liu, Y., Prentice, KJ, Eversley, JA, Hu, C., Batchuluun, B., Leavey, K., Hansen, JB, Wei, DW, Cox, B., Dai, FHF, Jia, WP , и Wheeler, MB (2016) Бързото повишаване на CMPF може да действа като повратна точка в развитието на диабета. Cell Rep. 14, 2889–2900

19. Prentice, KJ, Luu, L., Allister, EM, Liu, Y., Jun, LS, Sloop, KW, Hardy, AB, Wei, L., Jia, WP, Fantus, IG, Sweet, DH, Sweeney , G., Retnakaran, R., Dai, FF и Wheeler, MB (2014) Метаболитът на фуранова мастна киселина CMPF е повишен при диабет и предизвиква дисфункция на бета-клетките. Cell Metab. 19, 653–666

20. Engelhart, DC, Granados, JC, Shi, D., Saier, MH, Jr., Baker, ME, Jr., Abagyan, R. и Nigam, SK (2020) Анализът на системната биология разкрива осем SLC22 транспортни подгрупи, включително OATs, OCTs и OCTNs.Int. J. Mol. Sci. 21, 1791