Текущи клинични приложения на in vivo генна терапия с AAV, част 1

Наследствените заболявания се причиняват от мутации в гени и повече от 7000 редки заболявания засягат над 30 милиона американци.

Генетичните заболявания са заболявания, причинени от генни мутации, като вродена глухота, мозъчна дегенерация и т.н. Появата на тези заболявания се определя от генетични фактори, а паметта е важна когнитивна способност, която трябва да използваме в ежедневието си.

Генетичните заболявания обаче не увреждат непременно паметта. Много изследвания показват, че въпреки че има известна връзка между някои генетични заболявания и паметта, много генетични фактори нямат никакъв ефект върху паметта на някои хора.

Например, проучванията показват, че някои хора могат да носят гена на болестта на Алцхаймер, но те все още могат да поддържат нормална памет и когнитивни способности в по-късните си години. Въпреки че тези хора са изложени на риск от развитие на болестта на Алцхаймер, те не са непременно засегнати от болестта.

В допълнение, много генетични фактори могат да имат положителен ефект върху паметта на човек. Например, някои проучвания показват, че някои хора с гени за късогледство могат да запомнят по-добре местоположението на статични обекти. Тези хора имат специални когнитивни способности, които може да са свързани с техните гени за късогледство.

В допълнение, някои хора може да носят някои генни мутации, които улесняват хората да запомнят и виждат нещата. Тези генетични фактори дават на тези хора по-отлични когнитивни способности.

Следователно, въпреки че има известна връзка между наследствените заболявания и паметта, ние трябва да гледаме на тази връзка положително. Паметта е важна когнитивна способност и може да бъде подобрена с подходящо обучение. Може би можем да разглеждаме наследствените заболявания като предизвикателство за нас да подобрим паметта си, да преодолеем трудностите и да подобрим когнитивните си способности. Вижда се, че трябва да подобрим паметта си и Cistanche може значително да подобри паметта ни, тъй като Cistanche е традиционна китайска медицина с много уникални ефекти, един от които е да подобри паметта. Ефикасността на Cistanche идва от различните активни съставки, които съдържа, включително танинова киселина, полизахариди, флавоноидни гликозиди и др. Тези съставки могат да насърчат здравето на мозъка по много начини.

Кликнете върху Познаване на краткосрочната памет как да се подобри

Повече от 30 години стотици изследователи твърдят, че генетичните модификации ще осигурят ефективно лечение на много наследствени човешки заболявания, предлагайки трайни и вероятно лечебни клинични ползи с едно лечение.

Този преглед е ограничен до генна терапия, използваща адено-асоцииран вирус (AAV), тъй като генът, доставен от този вектор, не се интегрира в генома на пациента и има ниска имуногенност.

Сега има пет лечения, одобрени за комерсиализация и налични понастоящем, т.е. Luxturna, Zolgensma, терапиите с два химерни антигенни рецептора на Т клетки (CAR-T) (Yescarta и Kymriah) и Strimvelis (гамаретровирусът, одобрен за аденозин дезаминаза-тежък комбиниран имунен дефицит [ADA-SCID ] в Европа). Десетки други лечения са подклинични изпитвания.

Обзорната статия представя широк преглед на областта на терапията чрез in vivo генен трансфер. Ние правим преглед на генната терапия за невромускулни нарушения (спинална мускулна атрофия [SMA]; мускулна дистрофия на Дюшен [DMD]; X-свързана миотубулна миопатия [XLMTM]; и заболявания на централната нервна система, включително болест на Алцхаймер, болест на Паркинсон, болест на Канаван, ароматна L -дефицит на аминокиселинна декарбоксилаза [AADC] и гигантска аксонална невропатия), очни нарушения (вродена амавроза на Leber, свързана с възрастта макулна дегенерация [AMD], хороидеремия, ахроматопсия, ретинитиспигментоза и X-свързана ретиношиза), нарушение на кръвосъсирването, хемофилия и лизозомно съхранение разстройства.

Наследствените заболявания се причиняват от мутации в гени. Има повече от 7000 редки заболявания, засягащи 30 милиона американци, т.е. около 10% от населението. Има няколкостотин милиона пациенти по света, според Националната организация за редки заболявания. Две трети от заболелите са деца. В момента няма ефективни терапии за повече от 95 процента от тези пациенти.

Малкото лечения, базирани на лекарства, одобрени за генетични заболявания, в най-добрия случай управляват или променят симптомите. Те обаче не засягат основната генетична причина за заболяването.

Следователно тези лекарства трябва да се прилагат цял ​​живот. Стотици изследователи са посветили живота си на преследването на това, което първоначално изглеждаше като невъзможна мечта: разработването на генни терапии за наследствени заболявания, т.е. еднократно лечебно възстановяване или промяна на засегнатия ген на индивида, който минимизира или дори елиминира симптомите за целия живот на пациента.

Тази мечта вече е реалност: генната терапия значително подобрява перспективите за понастоящем нелечими наследствени заболявания! Този преглед е ограничен до генна терапия, използваща адено-асоцииран вирус (AAV), тъй като генът, доставен от този вектор, не се интегрира в генома на пациента.

Glybera беше одобрена от Американската администрация по храните и лекарствата (FDA) през октомври 2012 г. като първата AAV-медиирана генна терапия, достигнала този етап. Glybera коригира наследствения дефицит на липопротеинова липаза (LPLD), който се проявява като панкреатит, повтаряща се коремна болка и изригващи петна, пълни с мазнини, които са резултат от много високи нива на триглицериди.

Въпреки това, рядкостта на заболяването (1 на милион), цената за пациента и разходите за поддържане на терапевтична готовност от компанията направиха много трудно продължаването на комерсиалната доставка на ген. Тази форма на генна терапия вече не е достъпна след 2018 г., когато само 31 души в света са били лекувани.

Вече има пет лечения, одобрени за комерсиализация и понастоящем са налични, т.е. Luxturna, Zolgensma, двете терапии с химерни антигенни рецептори на Т клетки (CAR-T) (Yescarta и Kymriah) и Strimvelis (гамаретровирусът, одобрен за аденозин деаминаза-тежък комбиниран имунен дефицит [ADA-SCID] в Европа). Десетки други лечения са в процес на клинични изпитвания.

Обзорната статия представя широк преглед на областта на терапията чрез in vivo генен трансфер, който се основава на директното прилагане на вектор на генна терапия в тялото, а не на трансплантация на генно коригирани клетки.

Тук ще разгледаме in vivo генната терапия за невромускулни разстройства (спинална мускулна атрофия [SMA]; мускулна дистрофия на Дюшен [DMD]; X-свързана миотубулна миопатия [XLMTM]; и заболявания на централната нервна система [CNS], включително болестта на Алцхаймер [AD] , болест на Паркинсон [PD], болест на Canavan [CD], дефицит на ароматна L-аминокиселина декарбоксилаза [AADC] и гигантска аксонална невропатия [GAN]), очни нарушения (вродена амавроза на Leber [LCA], свързана с възрастта дегенерация на макулата [AMD] ], хороидеремия, ахроматопсия [ACHM], ретинит пигментоза и X-свързана ретиношиза [XLRS]), нарушение на кръвосъсирването, хемофилия и лизозомни нарушения на съхранението (LSD).

Във всяка от тези области напредъкът е фантастичен, провеждат се клинични изпитания и в някои случаи леченията са одобрени от регулаторните агенции и комерсиализирани.

Клинична генна терапия при невромускулни разстройства

Клиничната генна терапия в различните й форми се развива бързо, предлагайки проблясък на надежда, който по-широката общност на редките заболявания отдавна е очаквала. Най-обещаващият вирусен вектор за генен трансфер за невромускулни заболявания е AAV, който има отличен профил на безопасност и ефективност при транслация.

Тук разглеждаме три обещаващи подхода за клинична AAV генна терапия, които са обещаващи за пациенти с тежки и инвалидизиращи невромускулни заболявания.

СМА

SMA е опустошително невродегенеративно заболяване в резултат на прогресивна загуба на моторни неврони.1

Това автозомно рецесивно разстройство е резултат от мутация в гена SMN1 на моторния неврон за оцеляване с честота приблизително 1:10,000 живородени, 60% от които имат SMA тип 1.2,3. Човешкият SMN ген е инвертирана дупликация на хромозома 5q13 .2.

SMN1 е теломерен, а силно хомоложният SMN2, намиращ се в центромерна позиция.1,4 Точкова мутация на екзон 7-на гена SMN2 води до снаждане на екзон и изключване от крайния транскрипт, което води до нестабилен разградим протеин.5

Функционалният SMN протеин с пълна дължина е основно отговорност на SMN1 с малък принос от SMN2.6 При отсъствието на SMN1 броят на копията на SMN2 е основната детерминанта на клиничния фенотип.7

Засегнатите бебета с 2 копия на SMN2 има вероятност да развият тежък тип 1 (SMA1), характеризиращ се с бързопрогресираща слабост, неспособност да седят самостоятелно, дихателна недостатъчност с прогресия до смърт или постоянна вентилация преди 2-годишна възраст.8 При подготовката за изпитвания върху хора основна стъпка беше демонстрирайки, че AAV9 достига до нервните клетки на мозъчния ствол и гръбначния мозък.

It was confirmed in SMA murine models that systemically delivered self-complementary AAV9 (scAAV9) crossed the blood-brain barrier and achieved high levels of neuronal transduction.9,10 Preclinical studies, delivering scAAV9-SMN to SMA pups, demonstrated positive effects on survival, growth, and neuromuscular transmission.11,12 Two key observations from these studies worth noting were both time of intervention and dose-response effects on survival. Early treatment at postnatal day 2 extended the lifespan from 15 days to >250 дни.11

Изследваното ново лекарство (IND) предостави отворено изпитване за клинична генна терапия с нарастваща доза, започващо на 13 май 2014 г. Проучване за вариране на дозата на scAAV9.пилешки b-актин (CB).SMN (START изпитване) при ниска ( n=3; 6,7 1013 mg/kg) и висока (n=6; 3,3 1014 mg/kg) доза беше одобрена.13 Включването включваше симптоматични SMA1 бебета с 2 копия на SMN2 и поява на симптоми преди 6-месечна възраст при липса на постоянна вентилация. В началото на изпитването преднизолон не е включен в протокола.

На 9-ия ден след доставянето на SMN ген на първия пациент, серумните химични изследвания показват повишение на аланин аминотрансферазата (ALT) 16 > нормално. Въз основа на тези констатации, измененията на протокола бяха представени на FDA и включваха преднизон, 1 mg/kg на ден, започнат 24 часа преди доставката на ген и като мярка за безопасност, намален вирусен товар за висока доза от 3,3 1014 vg /kg до 2,0 1014vg/kg.

Сега това се счита за „терапевтична доза“ и се приема за други клинични изпитвания на генна терапия. Резултатите от изпитването на SMA генна терапия може би надминаха очакванията за 15-те включени субекта на SMA (ниска доза n=3; висока доза n=12) .

В заключението на проучването (декември 2017 г.) всички бебета са били живи и всичките 12 пациенти, лекувани с терапевтичната доза, са били без постоянна вентилация.14 Ползата от лечението е бърза: Тестът за невромускулни нарушения в детската болница на Филаделфия (CHOPINTEND) се повишава с 9,8 точки на 1 месец и 15,4 точки на 3 месеца.

При терапевтичната доза 11 седяха без помощ, 9 се търкаляха, 11 се хранеха през устата и можеха да говорят, а 2 се събудиха независимо.13 Фигура 1 показва средни резултати по CHOP-INTEND за 24 месеца за пациенти със СМА, лекувани с терапевтичната доза, в сравнение с естествената история. Тези двигателни етапи са безпрецедентни при SMA1 бебета и са ясна индикация за стабилна широкоразпространена трансдукция на моторните неврони.

Ключово клинично наблюдение, което отличава пациентите, лекувани с терапевтични дози, е запазването и възстановяването на дихателните и оралните моторни умения. Ефикасност, свързана с ранно лечение и висок CHOP-INTEND.15

Единичният пациент, лекуван на 7,9 месеца, не реагира на терапията. Повишени серумни аминотрансферази са наблюдавани при 4 пациенти и са атенюирани от кортикостероиди.

През април 2018 г. Novartis сключи споразумение за придобиване на AveXis и продължи да следи 15-те субекта, включени в проучването. През май 2019 г. onasemnogene abeparvovec (Zolgensma) получи одобрение от FDA като първата по рода си системно доставяна AAV генна терапия. След одобрението забележителните събития включват продължително дългосрочно наблюдение на субекти, включени в изпитването START.

При последното изрязване на данни на 31 декември 2019 г. 11 от 12 пациенти, лекувани в първия опит с терапевтичната доза, са оцелели без необходимост от постоянна вентилация. Бяха документирани нови важни етапи и резултатът CHOP-INTEND се увеличи с 24,5 точки.

Двама допълнителни пациенти постигнаха крайъгълен камък на изправяне с помощ. При изрязването на данните най-възрастният пациент, получаващ терапевтичната доза, е бил на 5,6 години, сега 5,2 години от трансфера на гена.

За по-нататъшна оценка на въздействието на ранната интервенция започна ново многоцентрово проучване на пресимптоматични бебета (%6 седмична възраст) с 2 или 3 копия на SMN2 (SPR1NT).

Treatment at a mean age of 20 days shows improvement in CHOP-INTEND scores >50 при всички субекти с преживяемост до 18 месеца (Фигура 2). През 2019 г. SMA беше добавен към Препоръчителния единен панел за скрининг (RUSP) и много щати приеха тази определяща политиката генна терапия, достъпна за новородени през първите няколко седмици след раждането.

В Охайо 5 пресимптоматични пациенти са били лекувани с onasemnogeneabeparvovec, като най-възрастният вече е на 12 месеца. Бъдещето изглежда светло за пациентите със СМА. Успехът на генната терапия на СМА тип 1 беше разширен за пациенти със СМА R6 месеца до<5 years with three copies of SMN2, and eligibility required the ability to sit independently in the absence of walking without support. 

Три дози от scAAV.CB.SMN трябваше да бъдат приложени интратекално. Кохортите с ниска и средна доза завършиха отписването, но високата доза беше частично задържана от FDA.

Това беше в отговор на докладвано от AveXis предклинично проучване при нечовекоподобни примати (NHPs), получаващи интратекални вектори. Те откриха мононуклеарно клетъчно възпаление на дорзалните коренови ганглии (DRG), понякога придружено от дегенерация или загуба на тялото на невронни клетки. Thehold не е повлиял клиничните изпитвания на интравенозния Zolgensma. Скорошни проучвания от лабораторията на Wilson18 предоставят допълнителна представа.

При инфузия на AAV вектор в субарахноидалното пространство при NHP, патологията в DRG е последователна находка при почти всички животни. Подобни находки са наблюдавани дори в някои проучвания, когато по-високи дози се прилагат системно. Въпреки това, в тези NHP има забележима липса на каквито и да било клинични последствия при използване на терапевтични трансгени.

По този начин, в контекста на съотношението риск-полза, отговорът на доставянето на ген при клинично заболяване на SMA13 надвишава опасенията относно възпалителния инфилтрат, наблюдаван при DRG. DMDDMD е Х-свързана, дегенеративна мускулна дистрофия, причинена от мутации в гена на DMD.19

Генният продукт, дистрофин, е интегрален цитоскелетен протеин, закотвящ контрактилните актинови филаменти към сарколемата както на скелетните, така и на гладките мускулни клетки.

По време на заболяването загубата на дистрофин води до чупливост на мембраната, цикли на некроза и регенерация, намален регенеративен капацитет и мускулно заместване с фиброза.20 Клинично, прогресивната мускулна слабост води до загуба на възможност за придвижване на 914-годишна възраст и сърдечно-респираторна недостатъчност, водеща до смърт през второто или третото десетилетие.21

Повишаването на мускулната креатинкиназа (CK), което е показателно за продължаваща дистрофична патология, е очевидно при раждането.22 CK намалява при пациенти, които не се движат, тъй като скелетните мускули се заместват от фиброза.

Големият размер на DMD гена го прави податлив на спонтанни мутации. Честотата е 1:5,000 мъжки раждания.22,23 Производството на функционален дистрофин в различно количество е резултат от насочени специфични мутации, податливи на прескачане на екзон.24 Въпреки че някои терапии с антисенс олигонуклеотиди (AON) имат одобрение от FDA,25 приложимият пациент населението и запазването на функцията остават ограничени. Генната заместителна терапия е потенциално подобрена стратегия за насочване към по-широка група пациенти с ДМД.

Голямо препятствие е опаковането на големия DMD ген в AAV вектори, ограничени до<5 kb. To circumvent this challenge, designs for miniaturizing the dystrophin gene have been developed. 

Приемането на съкратена версия на дистрофин като възможно лечение на DMD се основава на пациент с мускулна дистрофия на Бекер, който е ходил в продължение на седем десетилетия, въпреки изтриването на почти половината от неговия DMD ген.26

Понастоящем трансгени, включващи различен брой повторения на спектрин (SRs) и панти и доставка, използвайки различни AAV серотипове, са подложени на оценка на безопасността и ефикасността в едновременни изпитвания за системна генна терапия (Таблица 1), спонсорирани от Sarepta Therapeutics, Pfizer и Solid Biosciences, обобщени по-долу .Sarepta Therapeutics наскоро докладва резултатите от своята фаза 1/2 отворено проучване за безопасност и поносимост, проведено в NationwideChildren's Hospital (ClinicalTrials.gov: NCT03375164).27 Записването включва 4 DMD момчета на средна възраст 4,8 години, с мутации между екзони 18 и 58, приемащи преднизолон за R12 седмици, които са получили rAAVrh74.

MHCK7.micro-dystrophin (SRP-9001) delivered through an extremity vein. Subjects with AAVrh74 total binding antibody titers >1:400 бяха изключени. Протоколът включва единична доза от преднизон дневно, 1 mg/kg, започвайки 1 ден преди доставката на ген и продължавайки 30 дни (или повече, ако е необходимо). Влива се единична доза SRP9001, 2,0 1014 mg/kg. Серотипът AAVrh74 в комбинация с тъканно-специфичния MHCK7 промотор с a-myosinenhancer прогнозира високи нива на експресия както в скелетния, така и в сърдечния мускул.

Микро-дистрофиновият трансген съдържа SRs 13, които се свързват със сарколемата, което води до подобряване на сарколеммалсвързването и производството на сила, както и SR 24 и панти 1, 2 и 4.28 На 12 седмици биопсия на стомашно-чревния мускул със сравнение с изходното ниво показа средно микро- експресия на дистрофин от 81,2% от мускулните влакна, със среден интензитет от 96%.

Western blot (WB) показа средна експресия от 74,3% без корекция за мазнини или фиброза и 95,8% с корекция. Серумната СК остава намалена при всички субекти (диапазон 46%85%) с функционално подобрение със средно 5,5 пункта в амбулаторната оценка на North Star (NSAA) на 1 година.

Имаше също така подобрение във времето за изкачване на 4 стълба и бягане/ходене 100. Хистологичните находки разкриха липса на централно ядро ​​и пръстеновидни миофибри и намаляване на процента на съдържание на колаген в мускулите след лечението в сравнение с изходното ниво (средно 26,7% ± 8,4%).

Профилът на нежеланите събития (AE) е минимален. Трима пациенти са имали преходно повишаване на g-глутамилтрансферазата, което е изчезнало с кортикостероиди. Общо 18 събития се считат за свързани с лечението; най-често срещаното е повръщане (50%).

Причината за повръщане е неясна, но не корелира с AAV имунитета. Профилът на безопасност и ефикасност насърчи дългосрочно проследяване и текуща фаза 2, рандомизирано, плацебо-контролирано, 96-седмично удължено проучване с по-голям размер на извадката (ClinicalTrials.gov: NCT03769116).

Фармацевтичната компания Pfizer предостави резултати от текущото си изпитване за безопасност и поносимост на PF-06939926 на неотдавнашната среща на Американското дружество по генна и клетъчна терапия (ASGCT) на 15 май 2020 г. rAAV9.mini-dystrophin беше доставен на 9 момчета с ДМД на възраст от 6,2 до 12,8 години; всички са приемали ежедневно глюкокортикоиди, без предварително съществуващи неутрализиращи AAV9 антитела.

Схемата за нарастване на дозата включва 1.0 1014 mg/kg (n=3) или 3,0 1014 mg/kg (n=6). Мускулните биопсии на изходно ниво сравнява мини-дистрофин с нормален с помощта на течна хроматография-масспектрометрия (LCMS): 2 месеца 20% и на 12 месеца 24% (n=3).

При висока доза, експресията беше 35% (n=6) и 52% (n=3), съответно на месец 2 и 12. Резултатите от имунофлуоресценцията (IF) са в същия диапазон за проби, тествани при високи и ниски дози с леко намаление на 12 месеца. NSAA за 3 субекта на 1 година показва средно увеличение от 3,5 точки спрямо изходното ниво.

Мастната фракция, оценена чрез MRI на 12 месеца, показва намаление от 8% при висока доза (n=3) и не се променя при ниска доза. Профилът на AE е по-сложен.

Повече от 40% от участниците са имали повръщане, гадене, намален апетит и пирексия. Поради доклада за остро бъбречно увреждане, включващо подобен на атипичен хемолитичен уремичен синдром (aHUS) с активиране на комплемента, изискващо хемодиализа и екулизумаб, изпитването първоначално беше спряно от Pfizer, за да активиране на изменения на протокола (юни 2019 г.).

При друг субект тромбоцитопенията с aHUS-подобно активиране на комплемента изисква трансфузия на тромбоцити и екулизумаб. Pfizer обяви планирана фаза 3, рандомизирано, многоцентрово, двойно-сляпо, плацебо-контролирано проучване, включващо 99 субекта (C3391003), регистрирано в ClinicalTrials.gov: NCT04281485.

For more information:1950477648nn@gmail.com