Вторичните метаболити на цианобактериите като биотехнологични съставки в естествената козметика против стареене 2

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

2.3.Биологични активности

2.3.1. Дейност по отстраняване на радикали

Супероксидният анионен радикал е физиологичен свободен радикал с изключително значение за човешкото тяло. Когато има свръхпроизводство на тази ROS по време на аеробно дишане или когато ендогенните механизми за детоксикация се провалят или са недостатъчни, съществува повишен риск от оксидативно увреждане със сериозни вредни ефекти. В този смисъл намирането на механизми за инхибиране на вредните ефекти на Oz* е от ключово значение, не само в областта на козметиката, но и при обмислянето на подобряването и превенцията на широк спектър от заболявания. Поведението за отстраняване на O2" от екстракти от цианобактерии е показано на Фигура 1, а стойностите на IC50 са обобщени в Таблица 6.

Водните екстракти са значително по-ефективни при отстраняване на Oz*- от ацетоновите екстракти (Таблица 6) и показват зависима от дозата активност (Фигура 1), като сладководните щамове се открояват от морските щамове. Cephalothorax lacustris LEGE 15493 е най-ефективният щам, представящ най-ниската стойност на ICso (65,5 ug сух екстракт/mL, p<0.05), followed="" by="" leptolyngbya="" boryana="" lege="" 15486="" and="" nodosilinea="" nodulosa="" lege="" 06104.="" leptolyngbya="" cf.="" ectocarpi="" lege="" 11479="" was="" the="" only="" strain="" that="" did="" not="" reach="" the="" ic5o="" for="" the="" aqueous="" extract="" (table="" 6).="" on="" the="" other="" hand,="" the="" acetone="" extract="" of="" this="" strain="" was="" the="" most="" effective="" in="" o2*-="">

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Сравнението на антиоксидантния капацитет между различни цианобактерии е предизвикателство поради различните прилагани методи. Morone и сътрудници оцениха способността за отстраняване на радикалите на етанол (70 процента v/v) екстракти от различни щамове цианобактерии [26], като най-ниската стойност на ICso е 822,70 ug/mL за Phormidium sp.LEGE 02 05292, докато не беше открита активност за Nodosilinea nodulosa LEGE 06102. Lopes и колегите докладваха за активност на поглъщане на O2 за Nodosilinea (Leptolynbbya) Antarctica LEGE13457 и Cuspidothrix issatschenkoi LEGE 03282 ацетонови екстракти, със стойности на IC25 от 319 и 286 ug/mL и без активност за Leptolynbbya- като sp.LEGE 13412 [27]. Авторите също съобщават за по-висока ефективност на ацетоновите екстракти в сравнение с етаноловите екстракти. Друго проучване, проведено от Amaro и сътрудници, разкри стойности на IC50 от 1394 и 826 ug/mL за Gloeothece sp. и Scenedesmus obliquus (M2-1), съответно [37]. Получените тук резултати за ацетонови екстракти изглеждат по-малко обещаващи от докладваните по-рано, въпреки че са в същия порядък. От друга страна, водните екстракти разкриват огромен потенциал, достоен за по-нататъшна експлоатация по отношение на козметичните приложения в областта на стареенето на кожата.

2.3.2.Ензимно инхибиране

ММР са семейство извънклетъчни цинк-зависими ензими, чиято основна функция е да ремоделират и разграждат ECM [38], гелообразен материал, който е от съществено значение за задържането на клетките заедно и осигурява път за хранителни вещества и кислород [39]. Промените в компонентите на ECM, като колаген и еластин, предизвикани от MMPs, са в основата на увреждането на кожата и образуването на бръчки [40]. Заедно с тези ензими, свързани със структурата на кожата и образуването на бръчки, друг поема решаваща роля в процеса на стареене поради своята активност в меланогенезата: тирозиназата. Наред с други фактори, излагането на UVR причинява натрупване на необичайно количество меланин, поради увеличеното производство на ROS. Тези реактивни видове засягат активността на меланоцитите, което увеличава превръщането на тирозин в меланин чрез окисление, което води до хиперпигментация и неравномерни кожни петна [41].

Cistanche може да спре стареенето

В търсене на естествени алтернативи на търговските съставки против стареене, като се фокусира върху ензимите, споменати по-горе, беше изследвана активността на екстрактите от цианобактерии (Фигура 2). По отношение на HAase, само три щама са били в състояние да инхибират този ензим, действайки в зависимост от дозата: водният екстракт от Leptolyngbya cf. ectocarpiLEGE 11479 (IC50=863 ug/mL) и ацетоновите екстракти от Cephalothrix lacustris LEGE 15493 и Nodosilinea nodulosa LEGE 06104, като последните два достигат само IC25 (съответно 832 и 995 ug/mL). Въпреки че тези стойности изглеждат високи, обхватът им на активност е подобен на този на референтното лекарство динатриев кромогликат（DSCG）（IC50=105 ug/mL）. Освен това си струва да се спомене, че за най-високата тествана концентрация (1 mg/mL), Leptolyngbya cf. ectocarpi LEGE 11479 инхибира този ензим с 80 процента (Фигура 2), което прави този екстракт обещаващ като козметична съставка.

Малко проучвания съобщават за потенциалния ефект на съединенията и екстрактите от цианобактерии върху активността на хиалуронидазата и всяко сравнение на биологичния потенциал на екстрактите трябва да вземе предвид, че метаболизмът на цианобактериите претърпява значителни вариации в зависимост от условията на култивиране, влияещи върху химичния състав на екстрактите. Morone и сътрудници [26] оценяват ефекта на етаноловите екстракти от Tychonema sp. LEGE 07196 и Cyanobium sp. LEGE 07175 върху хиалуронидаза и установи по-силна инхибиторна активност със стойности на ICso от 182,74 и 208,36 ug/mL, съответно. Активността на етаноловите екстракти също е докладвана за неразтворима фракция на Spirulina platensis с IC5o от 150 ug/mL[42]. Друго проучване, проведено от Yamaguchi и Koketsu [19], показва, че Nostochopsis lobatus MAC0804NAN произвежда голямо количество полизахариди със силен инхибиторен ефект (IC50=7.18 ug/mL). Беше съобщено също, че Arthrospira- производен пептид може да участва в инхибирането на хиалуронидаза [4]. Заедно тези резултати подкрепят потенциала на съединенията и екстрактите от цианобактерии като съставки против стареене за козмецевтични приложения.

Като се има предвид еластазата, само ацетоновите екстракти показват интересна биоактивност. Leptolyng-bya вж. ectocarpi LEGE 11479 отново беше най-активният (Фигура 2), като единственият щам достигна ICso, със стойност от 391 ug/mL. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104, Cephalothrix lacustris LEGE 15493 и Leptolyngbya boryana LEGE 15486 достигат само IC25 със стойности съответно 126,86 и 99 ug/mL. Що се отнася до хиалуронидазата, морските щамове се оказаха най-обещаващи.

Доколкото ни е известно, няма предишни доклади за инхибиторна активност на еластазата за изследваните тук щамове. По отношение на други щамове беше открито, че Nostoc minutum произвежда пептиди от микровиридинов тип и ностопептини с ICso =1.3 и 11.0 ug/mL [44,45]. Микровиридините B и съдържащите се от Microcystis aeruginosa също инхибират ефективно еластазата, със стойности на ICso от 0.044 и 0,084 ug/mL [46]. Повечето от наличните данни относно инхибирането на еластазата се фокусират върху изолирани съединения, така че е трудно да се правят сравнения с екстрактите от нашите щамове.

Неравномерната пигментация на кожата, свързана както със стареенето, така и с излагането на ултравиолетови лъчи, остава основен проблем на застаряващото население и козметичната индустрия. По-голямата част от наличните изследвания са незначителни и използват тирозиназа от гъби като ензимен модел, което затруднява пренасянето на резултатите в човешката среда, въпреки това този ензим има голямо сходство и хомология с човешката тирозиназа [47]. По този начин, същият ензимен модел беше използван тук за изследване на потенциала на екстрактите от цианобактерии при инхибирането на тирозиназата. Що се отнася до еластазата, само екстракти от ацетон са били в състояние да инхибират тирозиназата. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 беше най-ефективният (Фигура 2), като единственият щам достигна IC#N (989,26±4,3 ug/mL). Под това беше Leptolyngbya boryana LEGE 15486, с IC25=784 78±4,33 ug/ mL и накрая Leptolyngbya cf.ectocarpi LEGE 11479, като най-обещаващите резултати са открити за морските щамове.

Morone и сътрудници [26] преди това са изследвали активността на етанолови екстракти от цианобактерии в същия модел, но не са открили активност. Един интересен аспект на това е, че един от изследваните щамове е Nodosilinea nodulosa LEGE 06102, който показва най-добри резултати тук, още веднъж подчертавайки важността на екстракционните разтворители за получаване на целеви биоактивни екстракти. Що се отнася до другите изследвани ензими, проучванията, фокусирани върху цианобактериите, също са оскъдни за тирозиназата. В работата, проведена от Yabuta и неговия екип [48], се съобщава, че екстрактът от гореща вода от Nostochopsis spp. значително инхибира активността на тирозиназата (IC50=250 ug/mL). Това е много интересен резултат, като се има предвид, че е резултат от воден екстракт, за който не е открита активност в настоящото изследване. Авторите приписват резултата на съединенията с ниско молекулно тегло, освободени от PBP чрез топлинна обработка, а именно жлъчен остатък, който действа като мощен абсорбатор на пероксилни радикали. Друго проучване оценява инхибиторната активност на екстракти от етанол (IC50=14,000 ug/mL) и вода (IC50 =72,000 ug/mL) на Arthrospira platensis, където стойностите се приписват на наличието на фенолни съединения като ферулова и кафеена киселини в етаноловия екстракт [49].

2.3.3.UV защита

Въпреки че нарастващ брой козметични компании включват слънцезащитни продукти в своите продукти, все още е трудно да се убедят потребителите в ползите от ежедневната им употреба за забавяне на преждевременното стареене на кожата. Ако, от една страна, ежедневното прилагане на слънцеблокери е малко вкоренен навик, от друга страна, има известен страх при употребата на синтетични вещества, поради нежеланите свързани с тях рискове[50]. Вследствие на това изследванията върху естествената фотозащита се увеличиха значително през последните няколко години, като се има предвид техният потенциал за биоразградимост и по-ниска токсичност, което ги прави по-полезни за хората и околната среда. За да се изследват екстрактите от цианобактерии в тази област, техният капацитет да действат като слънцезащитни продукти беше оценен in vitro за UVR-B, тъй като това е най-вредното лъчение. Резултатите, намерени за водни и ацетонови екстракти от цианобактерии, са представени в Таблица 7.

Що се отнася до ацетоновите екстракти, най-обещаващата стойност (19,2) е открита за Leptolyngbya boryana LEGE 15486, следвана от Leptolyngbya cf.ectocarpiLEGE 1479 (10,7), и двете при най-ниската тествана концентрация, 200 ug/mL. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 беше най-малко обещаващият сред ацетоновите екстракти. Във водните екстракти са получени най-обещаващите резултати за най-високата тествана концентрация, като Leptolyngbya boryana LEGE 15486 и Cephalothrix lacustris LEGE 15493 се открояват с in vitro SPF стойности от 17,1 и 14,9, съответно (Таблица 7).Cistanche удължаване на животаОбсъждайки предишни проучвания в тази област, Hossain и неговият екип [51] съобщават, че стойността на SPF за екстракт от Cephalothrix komarekiana е 2,37. Друга група установи, че SPF на метанолов екстракт от Aphanizomenon flos-aquae е 4 [52]. Въпреки това информацията за концентрацията на екстракта, използвана от авторите, не е налична, което затруднява възможните сравнения.

Броят на щамовете цианобактерии, изследвани в областта на козметиката, особено по отношение на SPF, е много оскъден, като се имат предвид потенциалните възможности на тези ресурси. Резултатите, представени тук, показват, че видовете, които се изследват, могат да бъдат добри варианти като биологични фотопротектори и вероятно да действат като бустери за други слънцезащитни продукти, предлагани в момента на пазара, позволявайки намаляване на концентрацията на синтетични слънцезащитни продукти във формулите. Поради това е от решаващо значение да се увеличат изследванията върху тези организми, особено техните биоактивни екстракти, които, тъй като са със значително по-ниска цена, по-висок добив и по-бързо получаване, отколкото изолираните съединения са по-щадящи околната среда и икономически по-привлекателни.

2.4. Дискриминация на екстракти от цианобактерии чрез PCA анализ

Търсенето на биоактивни съединения от естествени източници, с потенциал за използване като съставки в областта на козметиката, нарасна през последните години. Освен че са потенциално по-малко токсични и напълно биоразградими, съединенията, получени от цианобактерии, се предлагат от възобновяеми източници и могат да бъдат получени на ниска цена в контролирана среда.цистанче нзКласификацията на биоактивните екстракти според техния химичен състав и биологична активност може да бъде ценна за посочване на потенциални връзки. В тази връзка беше приложен анализ на главните компоненти (PCA), като се има предвид химичният състав на екстрактите от цианобактерии и биоактивността на най-високата концентрация, тествана във всеки анализ (Фигура 3). Както може да се види, 72,99 процента от променливостта може да се обясни с първите две измерения: PCl представлява 50.41 процента от дисперсията, докато PC2 е отговорен за 22,58 процента. Бяха разграничени три групи (Фигура 3A ): Gl, включващ водния екстракт от Leptolyngbya cf.exocarp LEGE 11479; G2, включващ водни екстракти от Cephalothrix lacustris LEGE 15493, Leptolyngbya boryama LEGE 15486 и Nodosilinea nodulosa LEGE 06104; и G3, включващи всички ацетонови екстракти. Съгласно фигура 3B, Gl е химически различен от другите проби поради съдържанието на PE; Водните екстракти от Cephalothrix lacustris LEGE 15493, Leptolyngbya boryana LEGE 15486 и Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 са групирани според съдържанието им в PC, APC и общи протеини (G2), докато всички ацетонови екстракти се намират в същата група (G3) поради съдържанието им на каротеноиди и хлорофил а и неговите производни. Показани са съединенията извън ензимните активности, като равнините са образувани с PCl положителната ос (Фигура 3B). Може да се наблюдава, че проби с по-високо съдържание на хлорофил а и каротеноиди са тясно свързани с инхибирането на еластазата и тирозиназата. Това се доказва от силната положителна корелация между каротеноидите и еластазата (0,725,p<0.01) and="" tyrosinase=""><0.01) inhibition,="" with="" similar="" observations="" between="" chlorophyll="" a="" and="" the="" same="" enzymes=""><0.01 and=""><0.05,respectively). on="" the="" other="" hand,="" hyaluronidase="" inhibition="" is="" more="" correlated="" vvith="" pe="" content="" (figure="" 3b),="" with="" a="" significant="" positive="" correlation="" between="" the="" values=""><0.01).the compounds="" responsible="" for="" the="" radical="" scavenging="" activity="" of="" the="" extracts="" are="" displayed,="" with="" the="" planes="" formed="" with="" the="" pcl="" negative="" axis.="" the="" closest="" correlation="" is="" observed="" for="" tpc=""><0.05); other="" compounds="" such="" as="" total="" proteins,="" pc,and="" apc="" also="" contribute="" to="" the="" activity,="" although="" to="" a="" lower="" extent="" (figure="" 3b).regarding="" the="" spf,="" there="" is="" a="" close="" correlation="" between="" the="" activity="" of="" the="" extracts="" and="" their="" pbp="" content,mainly="" apc=""><0.01)and pc="" (0.838,="" p="" <="" 0.01),="" which="" points="" to="" these="" compounds="" as="" predominantly="" responsible="" for="" blocking="" uv-b="" radiation.="" the="" total="" protein="" content="" also="" contributed="" to="" this="" biological="" activity="" (0.670,=""><0.01), with="" the="" lowest="" contribution="" being="" observed="" for="" pe="" (0.210,p="">0.05). Като цяло PCA анализът позволява групирането на екстракти според биологичните активности, проявени в областта на стареенето на кожата, което води до заключението, че ацетоновите екстракти са по-ефективни при инхибирането на ензимите, отговорни за разграждането на дермалната матрица и загуба на структурата на кожата, докато водните екстракти са по-ефективни при отстраняването на свободните радикали и защитата на кожата от вредните ефекти на UV радиацията.

Доколкото знаем, това е първият път, когато е установена връзка между химичния състав и биологичната активност на екстракти от тези цианобактериални щамове.

3.Материали и методи

3.1. Производство на биомаса от цианобактерии

Четири нишковидни цианобактериални щама, Cephalothrix lacustris LEGE 15493 и Lep-tolyngbya boryana LEGE 15486, от бразилски сладководни екосистеми, и Leptolyngbya cf. ectocarpi LEGE 11479 и Nodosilinea nodulosa LEGE 06104, от португалски морски екосистеми, бяха използвани в това изследване. Щамовете се съхраняват в Синята колекция от култури за биотехнология и екотоксикология (LEGE CC) в Интердисциплинарния център за изследване на морето и околната среда (CIIMAR). За целите на производството на биомаса беше зададена схема за увеличаване на културата, като се започне с 40 mL под лабораторно контролирани условия, последователно мащабирани до 4 L. Щамовете се отглеждат в среда Z8 [53], допълнена с 10 ug/L витамин B12 и 25 g/LNaCl за морски щамове. Културите се поддържат при 25 градуса, с интензитет на светлината от 10 umol фотони m-2 s-4 и с фотопериод от 14 часа светлина:10 часа тъмнина. Прясната биомаса се събира след 120 или 150 дни растеж (в зависимост от щама) чрез филтриране и се замразява, лиофилизира и съхранява при -20 градуса до приготвяне на екстракта.

3.2. Приготвяне на екстракти

Два различни екстракта бяха последователно приготвени от всеки щам: ацетонов и воден. Първо се приготвя ацетоновият екстракт, като се използват 2 g суха биомаса. Биомасата се суспендира в ацетон и се екстрахира в продължение на 10 минути в ултразвукова баня (Fisherbrand [FB15053, Loughborough, UK). След екстракцията с ацетон, получената пелета се оставя да изсъхне в аспиратора и след това се екстрахира със 70 mL дестилирана вода, следвайки същата процедура. Клетъчните остатъци се отстраняват чрез центрофугиране при 10,00×× g Gs за 5 минути при 4 градуса, в микроцентрофуга HERAEUS MegafugeTM 16R (Thermo ScientificTM, Waltham, MA, USA). Супернатантите от всяка екстракция се изпаряват при намалена температура налягане (ротационен изпарител BUCHIR-210) (ацетонов екстракт) или замразени и лиофилизирани (воден екстракт). Екстракцията със съответната суперната се повтаря 3 пъти. Сухите екстракти се държат при -20 градуса до по-нататъшен химичен и биологичен анализ.

3.3. Клетъчни анализи

3.3.1.Клетъчна култура

Човешки кератиноцити HaCAT(ATCC), миши фибробласти 3L1(ATCC) и човешки ендотелни клетки hCMEC (осигурени от д-р POCouraud (INSERM)) бяха използвани за оценка на цитотоксичността. Клетъчните линии се култивират в Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM GlutaMAXTM, Gibco, Glasgow, UK), допълнена с 10 процента (v) фетален волски серум (Gibco), 1 процент пеницилин-стрептомицин (Pen-Strep 100 IU /mL и 10 mg/mL, съответно) (Gibco) и 0,1 процента амфотерицин В (Gibco). Поддържането на клетките и анализите се извършват при 37 градуса в 5 процента CO2 овлажнена атмосфера и културалната среда се подновява на всеки два дни. При 80-90 процента клетъчно сливане, прилепналите клетки се промиват с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS, Gibco), отделят се с експресен ензим TrypLEX (1 ×) (Gibco), преминават се за поддръжка и се посяват за планираните анализи.

3.3.2. Цитотоксичност—MTT анализ

Клетъчната жизнеспособност беше оценена чрез намаляване на {{0}}(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиев бромид (MTI, Sigma-Aldrich, Германия), както беше докладвано по-рано [26]. Всички клетъчни линии (ендотелни клетки, фибробласти и кератиноцити) се посяват в 96-плаки с ямки, при плътност съответно 1,0 × 10 клетки/mL, 3,3 × 104 клетки/mL и 2,5 × 104 клетки/mL.размер на пениса cistancheСлед 24 часа клетъчна адхезия, културалната среда се отстранява и клетките се излагат за 24 и 48 часа на прясна среда, съдържаща различните екстракти от цианобактерии в пет серийни концентрации, от 12,5 до 200 ug/mL. За ацетоновите екстракти изходните разтвори се приготвят в диметилсулфоксид (DMSO) (Gibco) и се разреждат с DMEM преди излагане на клетките, така че максималната концентрация на DMSO да не надвишава 1 процент. Водните екстракти се приготвят в PBS и се разреждат с DMEM преди експонирането на клетките. Отрицателната контрола беше PBS, а контролата за клетъчна смърт беше DMSO 20 процента. След инкубацията беше извършен цитотоксичният анализ на MIT. Накратко, 20 μL от МТТ разтвор се добавят към всяка ямка и се инкубират при 37 градуса за 3 часа. След инкубацията, средата се отстранява внимателно и лилаво оцветените формазанови соли се разтварят в DMSO. Абсорбцията се отчита при 550 nm с четец на микроплаки Synergy HT с много откриване (Biorek, Bad Friedrichshall, Германия), управляван от софтуер GEN51M. Анализът се провежда в четири повторения и се осреднява. За възпроизводимост, всеки анализ се повтаря независимо най-малко три пъти. Цитотоксичността се изразява като процент на клетъчна жизнеспособност, като се има предвид 100 процента жизнеспособност в контролата на разтворителя.

3.4. Химическо профилиране на екстракти от цианобактерии

3.4.1. Общо фенолно съдържание (TPC)

За определяне на TPC на екстрактите е използван колориметричен анализ, базиран на методологията на Folin-Ciocalteu [54] с леки модификации. Ацетоновите екстракти се разтварят в DMSO, а водните екстракти във вода. Накратко, 25 μL от всеки екстракт （10mg/mL） се смесват напълно с 25 μL реактив на Folin-Ciocalteu （Sigma-Aldrich）20{{20}} μL разтвор на NagCO3 и 500 μL дейонизирана вода. За празната проба реагентът на Folin-Ciocalteu беше заменен с дейонизирана вода. Абсорбцията на образувания оцветен продукт се измерва при 725 nm, като се използва Synergy HT Multi-detection microplate reader (Biotek, Bad Friedrichshall, Германия), работещ чрез GEN51M софтуер. Стандартните криви за количествено определяне на TPC са получени при използване на седем концентрации на галова киселина (GA) (0,025 до 0,5 mg/mL), приготвени в същия разтворител като екстрактите за тестване (y=2.097x＋0.01560 R²{{ 22}}.9989 за ацетон и y=2.204x＋0.01401,R2=0.9982 за вода, където "y" се отнася за абсорбцията, а "x" се отнася за концентрацията) . Три независими определяния бяха проведени в два екземпляра. Общото фенолно съдържание се изразява като ug GA еквиваленти (GAE) на mg сух екстракт.

3.4.2.Общи протеини

Общата протеинова концентрация се определя с помощта на комплекта за анализ на протеини BCA (#23227, Thermo-Scientific). Водните екстракти се приготвят във вода, докато ацетоновите екстракти се приготвят в DMSO. Накратко, в 96-плака с ямки, 25 uL от всеки екстракт (1 mg/mL) се смесват с 200 μL от работния реагент. Абсорбцията беше измерена при 562 nm, като се използва Synergy HT Multi-detection microplate reader (Biotek, Bad Friedrichshall, Германия), работещ чрез GEN5IM софтуер. Стандартна крива (y=-126.87x3＋547.73.353 -10.017; R2=0.999 и y=162.87x3-248.51x²＋932.13x -11.715;R2=0.99, където "y" се отнася до абсорбцията и "x" се отнася до концентрацията) е получен за всеки екстракт, като се използват девет концентрации на албумин (BSA) (25 до 2000 ug/mL) за количествено определяне на протеините. Проведени са три независими експеримента в три екземпляра. Общото съдържание на протеин се изразява като ug еквиваленти на говежди серумен албумин (BSA) на mg сух екстракт.

3.4.3.Пигменти

Пигментите, присъстващи както във водния, така и в ацетоновия екстракт, се определят количествено спектрофотометрично. Хлорофил а и неговите производни бяха количествено определени с помощта на калибрационна крива, получена с търговски стандарт (Sigma-Aldrich): y=8.0791x-0.0{{19} }22 (R2=0.996), където "y" се отнася за абсорбцията, а "x" се отнася за концентрацията. Общите каротеноиди бяха количествено определени като -каротин (Sigma-Aldrich), чрез неговата калибровъчна крива （y=17.133x＋0.0099; R²=0.990, където "y" се отнася за абсорбцията и "x" се отнася за концентрацията). Общата концентрация на каротеноид се изразява като ug -каротин на mg сух екстракт. Калибрационните криви за двата стандарта бяха получени при използване на пет различни концентрации (0,001 до 0,025 mg/mL). Спектрофотометричните определяния бяха извършени в 96-плаки с ямки, при 450 nm за -каротин и 663 nm за хлорофил а, като се използва четец на микроплаки Synergy HT Multi-detection (Biotek, Bad Friedrichshall, Германия), управляван чрез софтуер GEN5TM.

Съдържанието на PBP се определя спектрофотометрично чрез измерване на абсорбцията на водните екстракти при различни дължини на вълната (562, 615 и 645 nm) и прилагане на съответните формули, както е описано по-рано от Pagels et al. [34]: Водните екстракти бяха ресуспендирани до крайна концентрация от 0.5 mg/mL. Експериментът се провежда в три екземпляра и резултатите се изразяват в ug/mg сух екстракт. 3.5.Биологични активности

3.5.1. Почистване на супероксиден анионен радикал (O2*-).

Тестът за отстраняване на свободните радикали на Oz*- беше извършен за оценка на антиоксидантния потенциал на екстрактите от цианобактерии, според Barbosa и сътрудници [55], с незначителни модификации. Водните екстракти се приготвят във вода, докато ацетоновите екстракти се приготвят в DMSO. Пет серийни разреждания бяха приготвени за всеки екстракт и тествани, за да се оцени поведението на екстрактите и стойностите на IC50. Всички реагенти бяха разтворени във фосфатен буфер (19 uM, рН 7,4). Обем от 50 μL от всяко разреждане се смесва с 50 uL от 166 uM разтвор на редуцирана форма на никотинамид аденин динуклеотид (NADH) и 150 uL от 43 uM нитротетразолиев син хлорид (NBT) в 96-плака с ямки. След добавянето на 50 μL от 2,7 μM феназин метосулфат（PMS）, активността на пробите за отстраняване на радикали се наблюдава с четец на микроплаки Synergy HT с много детекции (Biotek, Bad Friedrichshall, Германия), управляван чрез софтуер GEN51M, в кинетична функция, при стайна температура за 2 минути при 562 nm. Бяха проведени три независими анализа в три екземпляра. GA се използва като положителна контрола. Резултатите бяха изразени като процент на отстраняване на радикалите в сравнение с нетретираната контрола. Резултатите за изчислените IC50 стойности бяха изразени като средно ± SD (ug/mL) от най-малко три независими анализа, извършени в два екземпляра. Стойностите на IC50 и съответните криви доза-отговор бяха изчислени със софтуер Graphpad Prism@ (Сан Диего, Калифорния, САЩ; версия 9, за MacOS).

3.5.2. Инхибиране на хиалуронидаза

Тестът за инхибиране на хиалуронидаза е леко модифициран от този, предложен от Ferreres et al.【56】. Накратко, 25 μL от всеки екстракт （9 mg/mL）, 175 μL хиалуронова киселина （HA）（0.7 mg/mL） и 25 μL хиалуронидаза （HAase）（90{{ 14}} U/mL в NaCl0,9 процента ） бяха смесени в реакционна епруветка. Водните екстракти се приготвят във вода и ацетоновите екстракти се приготвят в DMSO. След 30 минути инкубиране при 37 градуса, реакцията се спира чрез добавяне на 25 μL динатриев тетраборат (0,8 М във вода), последвано от инкубиране за 3 минути при 90 градуса във водна баня. Реакционните епруветки се охлаждат до стайна температура преди да се добавят 375 uL разтвор на DMAB[4-(диметиламино)бензалдехид]. След 20 минути инкубиране при 37 градуса, абсорбцията на образувания оцветен продукт беше измерена при 560 nm, в Synergy, HT Multi-detection microplate reader (Biotek, Bad Friedrichshall, Германия), работещ чрез GEN5IM софтуер. Отрицателната контрола се извършва при липса на екстракт. Като положителна контрола се използва динатриев кромогликат (DSCG).

Бяха проведени три независими анализа в три екземпляра и резултатите бяха изразени като процент на ензимно инхибиране в сравнение с нетретираната контрола.

3.5.3. Инхибиране на еластазата

Тестът за инхибиране на свинската панкреатична еластаза беше извършен съгласно Mota и сътрудници [57] с леки модификации. Водните екстракти се приготвят във вода, докато ацетоновите екстракти се приготвят в DMSO. Накратко, в 96-плака с ямки, 50 μL от екстракта се смесват с 90 uL HEPES буфер (0,1 М), 10 uL N-сукцинил-Ala-Ala-Ala р-нитроанилиден субстрат（100 uM）, 70 uL ацетатен буфер（200 mM） и 30 μL еластаза（1 U/mL） Плаката се инкубира при 37 градуса за 10 минути и абсорбцията на реакционния продукт беше измерена при 405 nm, в четец на микроплаки Synergy HT Multi-detection (Biotek, Bad Friedrichshall, Германия), управляван чрез GEN51M. Отрицателната контрола се извършва в отсъствието на екстракт и аскорбиновата киселина се използва като положителна контрола.цистанче на прахБяха проведени три независими анализа в три екземпляра. Резултатите се изразяват като процент на ензимно инхибиране в сравнение с нетретираната контрола.

3.5.4. Инхибиране на тирозиназата

Тестът за инхибиране на тирозиназата е извършен съгласно Adhikari et al [58]. с леки модификации. Накратко, в 96-плака с ямки, 20 μL от всеки екстракт се смесват с 100 μL тирозиназа (30 U/mL във фосфатен буфер). Водните екстракти се приготвят във вода, докато ацетоновите екстракти се приготвят в DMSO. Сместа се инкубира при 30 градуса за 8 минути. След това бяха добавени 80 μL разтвор на L-DOPA （L-3,4-дихидроксифенилаланин） (2,5 mM във фосфатен буфер) и абсорбцията (T0, абсорбция във време "нула") беше незабавно измерено със Synergy HT Multi-detection microplate reader (Biotek, Bad Friedrichshall, Германия), работещ чрез GEN5TM софтуер, при 475 nm. Определянето на абсорбцията при T0 (преди образуването на реакционния продукт) позволява елиминирането на възможните смущения, дължащи се на естествения цвят на изследваните екстракти. След 8 минути инкубация при 30 градуса, абсорбцията се измерва отново (T8). Процентът на инхибиране на тирозиназата в присъствието на екстракти от цианобактерии се изчислява в сравнение с нетретираната (отрицателна) контрола, където разликата между абсорбцията (T{ {21}}T0) съответства на 100 процента от ензимната активност. Отрицателната контрола се извършва в отсъствието на екстракт и коджиковата киселина се използва като положителна контрола. Бяха проведени три независими анализа в три екземпляра. Резултатите се изразяват като процент на ензимно инхибиране в сравнение с нетретираната контрола.

3.5.5. Слънцезащитен фактор (SPF)

Слънцезащитният фактор in vitro беше определен според Rohr и сътрудници [59] с леки модификации. Водните екстракти се приготвят във вода, докато ацетоновите екстракти се приготвят в ацетон. Накратко, абсорбцията на 2 ml от всеки екстракт (20 и 1000 ug/mL) се измерва в спектрофотометър (от 290 до 320 nm, 5 в 5 nm). SPF се изчислява по формулата, предложена от Mansur [60]: където EE（A） е спектърът на еритемния ефект, I （A） е спектърът на слънчевата интензивност, Abs（λ） е абсорбцията на екстракта и CF е корекцията фактор (28), определен с помощта на търговски слънцезащитен крем с известна SFP стойност 30.

3.6. Статистически анализ

Статистическият анализ беше извършен с помощта на статистически софтуер IBM SPSS (версия 23.0 за macOS, IBM Corporation, Ню Йорк, Ню Йорк, САЩ, 2015 г.). Данните бяха анализирани за нормалност и хомогенност на дисперсии от Kolmogorov-Smirnov и Leven's тестове, след което се подлагат на еднопосочен ANOVA, използвайки HSD на Tukey (честно казано значителна разлика) като пост-документален тест или на несдвоен t-тест. Използван е корелационен тест на Pearson за сравняване на нормализираните данни за експресия между химичните профили и биологичните активности на екстрактите от цианобактерии.

3.7. Анализ на основните компоненти (PCA)

PCA беше използван за трансформиране на редица потенциално корелирани променливи в редица относително независими променливи, които могат да бъдат класирани въз основа на техния принос за обяснение на вариацията на целия набор от данни [61]. Относително важните компоненти на високоразмерните модели могат да бъдат успешно идентифицирани. Оригиналните високомерни данни могат да бъдат нанесени върху по-нискомерно пространство и следователно сложността на проблема с класификацията на високомерен модел е значително намалена [62]. За настоящото проучване разпознаването на образи, базирано на PCA, беше извършено с помощта на статистически софтуер IBM SPSS (версия 23.0 за macOS, IBM Corporation, Ню Йорк, Ню Йорк, САЩ, 2015 г.). Матрицата с данни се състои от метаболитите, присъстващи във водните и ацетоновите екстракти на четирите щама на цианобактерии, и тяхната активност при най-високата тествана концентрация.

4. Изводи

Биологичната активност, проявена от екстрактите от цианобактерии, анализирани тук, се оказа ясно свързана. Според наличието на биоактивни PBPs, водните екстракти са най-ефективни за защита от ултравиолетови лъчи, което, заедно с техния капацитет за отстраняване на радикалите, ги предполага като обещаващи съставки за използване във формули против стареене, насочени към предотвратяване на стареенето на кожата, влошено от външни фактори. От друга страна, ацетоновите екстракти се оказаха по-ефективни при инхибиране на активността на ензимите, отговорни за разграждането на дермалния матрикс и загубата на структурата на кожата, като по този начин са по-подходящи за свързаното с възрастта стареене на кожата.екстракт от цистанче салсаСхемата за последователна екстракция, която предлагаме, може да се окаже изгодна, позволявайки получаването на химически различни биоактивни екстракти чрез монетизиране на биомаса от цианобактерии, което прави процеса по-устойчив и икономически привлекателен. Като цяло, екстрактите от цианобактерии се оказаха достойни за по-нататъшна употреба в областта на стареенето на кожата, насочени към търсенето на естествени, безопасни и устойчиви съставки за козметични формули.

Тази статия е извлечена от Mar. Drugs 2022, 20, 183. https://doi.org/10.3390/md20030183 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs