Фенолни съединения от листа и цветя на Hibiscus Roseus: потенциални козметични приложения за кожата на недостатъчно проучен вид

Моля свържете сеoscar.xiao@wecistanche.comза повече информация

Резюме:Използването на растителни екстракти в козметиката за грижа за кожата е модерна тенденция поради богатството им на полифеноли, които действат като молекули против стареене. хибискус роза е многогодишен вид, натурализиран в Италия, с красиви нежно розови цветове; неговият фенолен състав и биологична активност все още не са проучени. Целта на това проучване беше да се характеризират и количествено определят фенолните съединения и да се оцени антиоксидантната, слънцезащитният фактор (SIPF) и антиколагеназната активност на етаноловите екстракти от листата и цветовете на H. roseus (HL) и цветовете (HE). Производни на кумарова, хлорогенна и трансферулова киселина, както и флавоноиди кверцетин и кемпферол, са основните открити фенолни съединения. Бяха открити катехин, епикатехин, кемпферол-3-О-рутинозид, кемпферол-3-О-глюкозид, кемпферол-7-О-глюкозид, салидрозид, оенин и пеонидин-3-О-глюкозид само при HF, докато флоридинът е изключителен от HL, който също показва по-големи количества производни на хидроксиканелена киселина. HF е по-богат на флавоноиди и общи феноли, като също така проявява по-голям антиоксидантен капацитет.биофлавоноидиSPF и антиколагеназната активност на двата екстракта са подобни и сравними с тези на синтетичните стандарти. Общите резултати показват, че екстрактите от H. roseus са обещаващи източници на биоактивни фенолни съединения, които биха могли потенциално да се прилагат като агенти против стареене в козметиката за грижа за кожата.

Ключови думи:анти-колагеназа; антиоксидант; флавоноиди; цветя; билкова козметика; хидроксиканелени киселини; LC-MS/MS-MRM; листа; грижа за кожата; слънцезащита

1. Въведение

Използването на козметика е древно и нейната история се формира успоредно с тази на човечеството [1,2]. Козметиката за грижа за кожата е едни от най-важните продукти, основната категория в тази индустрия [1,3]. Поради това интересът към грижата за кожата стана широко разпространен, предизвиквайки търсенето на ефективни продукти, получени от естествени източници [2].

Моля, щракнете тук, за да научите повече

Неотдавнашното осъзнаване на околната среда, здравеопазването и малката употреба на синтетични химикали доведе до нарастващ интерес към козметиката на растителна основа, която сега представлява една трета от целия козметичен сектор [1A]. По този начин използването на растителни екстракти и техните фитоконституенти като активни съставки е модерен "проекологичен" подход [5,6]. Нарастващото търсене на тези продукти може да се дължи на намалените им странични ефекти, широкия им спектър на действие, съчетан с висока ефикасност и като цяло ниските им цени [7,8].

Растенията са богати на няколко класа биоактивни съединения, като са един от най-изобилните източници на нови съставки, отговорни за лечението на много заболявания [9,10]. В допълнение, растенията също са източници на естествени овлажнители, ароматизатори и пигменти, което ги прави много интересни за приложения в козметиката на кожата [5]. И накрая, растителните екстракти обикновено се считат за безопасни и отговарят на изискванията на регулаторните органи [10,11].

Сред съединенията, присъстващи в растителните екстракти, фенолните съединения са спечелили специално внимание като активни съставки [12,13], главно защото се открояват като противовъзпалителни, антимикробни и антиоксидантни агенти [14,15]. Тези свойства ги правят идеални превантивни и лечебни молекули за кожни заболявания, прилагани в козметологията и дерматологията [16]. Забележимата антиоксидантна активност на фенолните съединения също е частично отговорна за техните ефекти против стареене, които вероятно се дължат на способността им да намаляват разграждането на колаген и да осигуряват UV защита [16]. Следователно, използването на естествени богати на феноли екстракти с висок антиоксидантен капацитет е изследвано и насърчавано за заместване на синтетичните антиоксиданти в продуктите за кожа [12].

Cistanche може да спре стареенето

Естествените продукти, извлечени от растения от семейство Malvaceae, се използват по целия свят, а родът Hibiscus привлече голямо внимание заради множеството фармакологични активности на техните екстракти и високото им фенолно изобилие [17-19]. Хибискус spp. съдържа около 240 вида едногодишни или многогодишни цъфтящи билки, храсти или дървета, които са разпространени в различни региони на света [20]. Екстрактите от хибискус се прилагат в традиционната медицина като емолиенти за лечение на много кожни заболявания и изгаряния [19,21].купи цистанчеВъз основа на тези литературни данни, екстракти от Hibiscus sp. растенията могат да бъдат интересни активни съставки за козметични формули за кожа, предпазващи клетките от оксидативен стрес, разграждане на колаген и вредните ефекти на UV радиацията.

Въпреки че родът Hibiscus включва много видове, по-малко от 10 процента от тях са изследвани досега [17]. Hibiscus roseus Thore (син. H.palustris L., H.moscheutos subsp. palustris (L.) RT Clausen.) е тревист многогодишен вид, натурализиран в Италия [22,23]Идентификацията и описанието на H. roseus все още са предмет на дебат[ 20,23]. Според литературата видът H. moscheutos subsp. palustris е въведен много рано в Европа, докато във Франция е описан като нов вид, H. roseus, от Тор през 1807 г. [23]. Този вид не е характеризиран за фенолния си състав и не е изследван за биологичните си активности, което го прави потенциален неразкрит източник на биоактивни съединения за продукти за грижа за кожата.

Народната употреба при лечение на кожата и широкият спектър от биоактивности на видовете Hibiscus оправдават важността на новите изследвания, фокусирани върху този растителен род [17]. Следователно, целта на това изследване е да се характеризира фенолният състав и да се оцени антиоксидантният капацитет, слънцезащитата и инхибиращата активност на колагеназата на етаноловите екстракти от листа и цветове на H. roseus. Нашите резултати представят за първи път фенолния състав и свързаните с стареенето биоактивности на H. roseus, което показва потенциала на този недостатъчно проучен вид в медицинските и козметични приложения като антиоксидант и добавка против стареене.

2. Резултати и дискусия

2.1. Фенолна характеристика и количествено определяне

Беше проведен целеви анализ, базиран на LC-MS/MS-MRM (течна хроматография, съчетана с тандемна масспектрометрия, работеща в режим на наблюдение на множество реакции), за условно идентифициране на фенолните съединения, присъстващи в етаноловите екстракти на H. roseus, тъй като фенолният състав на този вид все още не е описан в литературата. Деветнадесет фенолни съединения, описани по-рано в рода Hibiscus, бяха използвани като стандарти (допълнителна таблица S1) за разработване на метода MRM, като изборът на най-добрите преходи е проектиран чрез оптимизиране на инструменталните параметри и от литературни данни [24].

The main classes of compounds detected in H.roseus leaf and flower extracts were chlorogenic, p-coumaric, and trans-ferulic acids derivatives and flavonoid derivatives (Figure 1,Table 1), similarly to the previous phytochemical characterization of other Hibiscus species[25-29]. Although the phenolic profile was quite similar, some qualitative differences were observed between flowers (HF) and leaves (HL)(Figure 1 and Table 1). While leaves showed richness in p-coumaric acid derivatives (Figure 1, blue line, peaks with Rt from 2 to 9 min), flowers were especially rich in flavonoid derivatives such as catechins, dihydrochalcones, and anthocyanins (Figure 1, red line, Rt>9.3 минути, Таблица 1).

Тринадесет от деветнадесетте целеви фенолни съединения бяха автентично идентифицирани в екстрактите, анализирани чрез LC-MS/MS в режим MRM (Таблица 1).цистанчMRM е мощен начин за едновременно определяне на няколко компонента, базирано на съотношението маса към заряд (m/z) на молекулния йон (((MH]) и неговия съответен дъщерен йон. Той позволява подобряване на селективността и чувствителност на LC-MS/MS анализи [30] Тази методология е много надеждна и подходяща за анализи на растителни екстракти и други сложни смеси, което води до най-висока специфичност, отлична чувствителност и изключителен мултиплексиращ капацитет благодарение на възможността за разграничаване на съединения, които имат едни и същи изходни йони, но различни фрагменти [31,32] Използвайки този метод, ние получихме значително намаляване на хроматографските серии, по-висока специфичност и точност, осигурени от добро разделяне на съединенията, открити със същите преходи, като същевременно избягваме загуба на чувствителност в случай на различни съвместно елуиращи се съединения или за съединения, присъстващи в много ниска концентрация [24,334].

Сред 13-те фенолни съединения, идентифицирани с помощта на автентични стандарти (допълнителна таблица S1), десет присъстват изключително в цветни екстракти (фигура 1 червена линия, таблица 1 HF): катехин и епикатехин (пикове 16b и 23), хлорогенна киселина (пик 18), пеонидин-3-О-глюкозид и енин (пикове 21 и 22), транс-ферулова киселина (пик 27), три кемпферол гликозидни производни (кемпферол-3-О-рутинозид, кемпферол-7-О- глюкозид и кемпферол-3-О-глюкозид; пикове 30, 31b и 32) и салидрозид (пик 34). Освен това, флоридин (пик 33b) беше открит само в екстракти от листа (Фигура 1 синя линия, Таблица 1 HL), докато рутин и кверцетин-3-O-глюкозид (пикове 26b и 28a) бяха идентифицирани и в двата вида екстракти (Фигура 1, Таблица 1HF/HL). Подобни производни на кверцетин, като кверцетин-3-О-самбубиозид и изокверцитрин, са наблюдавани преди това в H.sabdariffa [26,29,35,36] и в екстракти от H. rosa-sinensis [18]. Някои от тези гликозиди биха могли да съответстват на производните на кверцетин, които открихме в H. roseus. В допълнение, тилирозид също е бил открит преди това във фенолни екстракти от H. цветя на сабдарифа [37,38]. Оенин (малвидин-3-О-глюкозид) и пеонидин-3-О-глюкозид, двата антоцианина, идентифицирани тук за първи път в цветовете на H. roseus, са различни от описаните по-рано в цветята на H. sabdariffa, делфинидин 3-самбубиозид, делфинидин-3-глюкозид и цианидин-3-О-самбубиозид [27,35,39,40]. Важно е обаче да се спомене, че най-изучената част от цветя на H. sabdariffa е чашката (чашелистчетата), а не венчелистчетата, както е изследвано тук за H.roseus.

В допълнение към съединенията, идентифицирани и потвърдени от автентичните целеви стандарти, други 27 съединения са предполагаемо идентифицирани в екстракти от листа и цветя на H.roseus въз основа на техните MRM (m/z) и техните дъщерни йони, като по този начин се вземат предвид получените продукти на фрагментация от прекурсора (допълнителна таблица S1). По-специално, наличието на производни на р-кумарова, транс-ферулова и хлорогенова киселина и производни на кверцетин, както и производни на флоретин и флоридзин бяха открити и в двата екстракта (Таблица 1).

Количественото определяне на фенолните съединения, идентифицирани в тези екстракти, беше извършено чрез HPLC-DAD анализ (високоефективна течна хроматография, свързана с откриване на диодна матрица; Таблица 2). Съдържанието на производни на хидроксиканелена киселина (THC) е по-високо в листата, отколкото в цветята, докато по-големи количества флавоноиди (TFC) са открити в цветя, отколкото в листа (p<0.001,table 2).catechin="" derivatives(tcd),dihydrochalcones(tdc),and="" anthocyanins="" (tac)="" were="" quantified="" only="" in="" flower="" extracts(table=""><0.001).therefore, flowers="" represent="" a="" greater="" source="" of="" phenolics="" compared="" to="" leaves="" (tpc,p="0.02," table="" 2).="">cistanche АвстралияПодобно на екстрактите от H. sabdariffa, основните класове съединения, открити в листата на H. roseus, са производни на хлорогенна и р-кумарова киселина, както и кафеоилхинова и р-кумароилхинова киселина [26,40,41]. В допълнение, антоцианините са докладвани изключително в Hibiscus spp. цветове и чашки, заедно с катехини [19,28,35].

Обратно, феруловата киселина и нейните производни са по-малко докладвани като съставки на Hibis-cus spp. екстракти, но те могат да бъдат от голямо значение за тяхната биологична активност [6,42-44]. Наистина, производните на феруловата киселина, получени от различни видове Hibiscus, показват важни фармакологични свойства като антивирусна и инхибиторна активност на ангиотензин-конвертиращия ензим [43,44]. В допълнение, феруловата киселина е описана като активна молекула в екстракти от H.mutabilis, H.taivanensis [45,46] и в екстракти от чашка на H.sabdariffa [28,38].

По отношение на потенциалните козметични приложения е доказано, че феруловата киселина инхибира образуването на меланин [6,42], докато производните на р-кумариновата киселина притежават депигментация [47,48], противовъзпалителна и инхибираща активност на тирозиназата [49]. В допълнение, много изследвания подчертават допълнителните роли на флавонолите и антоцианините, които могат да действат като защитни съединения за кожата, по-специално като инхибират меланогенезата [50,51] и чрез действието си като съединения против стареене и предотвратяват меланома [52,53]. В допълнение, потенциалните приложения на екстракти от H. roseusleaf за кожни заболявания могат също да бъдат подобрени от присъствието на флоридин, който е показал, че намалява експресията на UVB-индуцирани провъзпалителни цитокини в изложена на UV лъчи кожа [54].

2.2. Тестове за антиоксидантна активност

В днешно време е широко доказано, че натрупването на реактивни кислородни видове (ROS) е отговорно за процесите на стареене на кожата, което води до сухота, загуба на подкожна тъкан и образуване на бръчки [55,56]. Следователно намирането на естествени потенциални антиоксидантни съединения, които могат да се прилагат в продукти за грижа за кожата, е много важно за козметичната индустрия.

Нашите резултати показват, че екстрактите от листа на H. roseus имат по-ниска антиоксидантна активност (изразена като стойности на ECso) от цветята (Таблица 3). Действително, антиоксидантните активности на екстрактите от листа са поне два пъти по-високи от тези на екстрактите от листа и в двата анализа (Таблица 3). Тези резултати са в съответствие с фенолния състав и съдържанието на тези екстракти (Фигура 1, Таблици 1 и 2), тъй като HF екстрактите са по-богати на фенолни съединения (Таблица 2). Наистина, корелационният анализ между стойностите на ECso и съдържанието на различните класове феноли показва, че е значителен и отрицателен за всички съединения с изключение на THC. Като такива, по-високите количества флавоноиди, катехини, антоцианини, дихидрохалкони и общо фенолно съдържание допринасят за по-голям антиоксидантен капацитет (по-ниски стойности на EC50 — Таблица 4).

Сред флавоноидите кверцетинът и неговите производни са най-утвърдените антиоксиданти и уловители на свободни радикали, действащи също като ефективни инхибитори на оксидазите и липоксигеназите [57]. Освен това дихидрохалконите, като флоретин, също са описани като мощни антиоксиданти в 2,2-дифенил-1-пикрилхидразил (DPPH)-почистващи и OH-почистващи анализи [58]. В допълнение, антоцианините, изолирани от екстракти от хибискус, се оказаха основни антиоксидантни съединения в човешките клетки [59].

Екстрактите от различни части на вида Hibiscus са показали висок антиоксидантен капацитет [18,21,27,35,40]. Фракциите на етанолови екстракти от H. sabdariffa показват много ниски стойности на EC50 при антиоксидантни анализи, които са свързани с високото съдържание на протокатехуинова киселина [21,59], хлорогенна киселина, флавоноиди и антоцианини [24,60]. В допълнение, проучване върху H. esculentus показа in vitro антиоксидантния потенциал на производните на кверцетин и катехините, присъстващи в неговите екстракти [61]. И накрая, в H.acetosella, антиоксидантната активност е силно свързана със съдържанието на антоцианини [62].

Резултатите от нашето проучване върху етанолови екстракти от H. roseus показаха антиоксидантна активност, която беше сто пъти по-висока от тази, докладвана за водни екстракти от чашка на H. sabdariffl, за които EC беше близо до 45 mg mL- в подобен DPPH in vitro модел [56] Въпреки това, за разлика от нашите открития, общото съдържание на флавоноиди и антиоксидантният капацитет на екстрактите от листа на H. sabdariffa са по-високи от тези на цветята [63,64]. 2.3. In Vitro слънцезащитен фактор (SPF)

Ултравиолетовото лъчение е един от най-вредните фактори на околната среда, влияещи върху здравето и физиологията на кожата, като е важна външна причина за стареенето на кожата [65,6] Постоянното излагане на ултравиолетова радиация увеличава риска от нарушения на пигментацията и фотостареене на кожата [67]. Това се дължи най-вече на повишаването на нивата на ROS, което води до стимулиране на производството на колагеназа и води до значително увреждане на клетъчните функции на кожата [56]. Следователно UV-защитните съставки, включително тези, присъстващи в растителните екстракти, се прилагат широко в козметиката, за да се избегне проникването на ултравиолетова радиация в кожата, но също така да се предотврати производството на ROS, като действат като антиоксиданти [56,

Лесен метод за проверка на ефикасността на различни естествени компоненти като UV филтри е анализът на слънцезащитния фактор (SPF), който е бърз и надежден in vitro метод, базиран на скрининга на абсорбцията в UV-B спектралната област (между 290 и 320 nm), които са полезни в ранна фаза на избор на активни съставки за фотозащита [69].

Високото фенолно съдържание и антиоксидантната активност на H.Cistanche ползиroseus extracts suggest that they may have also an UV absorbing activity. Both leaf and flower extracts of H. roseus at 0.1 mgmL-1 showed comparable SPF results (p>{{0}}.05):2,6±0,15 за HL и 2,4±0,19 за HF. Тези резултати са обещаващи, тъй като стандартна слънцезащитна формула, съдържаща 8 процента хомосалат (широко използван химически слънцезащитен крем), показва SPF стойност 4[69,70]. Резултатите, намерени тук за H.roseus, са подобни на тези, открити за други растителни видове [68,69,71,72] и са важни предвид ниската концентрация на екстрактите, използвани за тестване на този ефект.

Екстрактите от H. rosa-Sinensis вече са показали положителни ефекти срещу увреждане от ултравиолетовата радиация в кожата на мишка чрез антиоксидантна защита [73]. Естествените продукти, показващи SPF, заедно с висок антиоксидантен капацитет и инхибиране на колагеназа и еластаза, са важни кандидати за използване за защита на кожата от фотоувреждане и за предотвратяване на появата на бръчки [66,71]. Всъщност връзката между одобреното традиционно слънце филтри и тези производни на естествени източници представлява тенденция в козметичната индустрия, тъй като потребителите възприемат тези продукти като по-безопасни, поради страничните ефекти на синтетичните UV филтри[72].

По-високото съдържание на общите фенолни съединения на HF екстрактите (TPC; Таблица 2) може да показва тяхната по-висока UV абсорбираща активност. Въпреки това, екстрактите от листа и цветя показват много сходни резултати, което показва, че повече от общото съдържание на феноли, фенолният профил на екстрактите ще бъде свързан със защитата срещу UV. По-специално, по-високото съдържание на производни на хидроксиканелена киселина в HL( Таблица 2) може да допринесе за увеличаване на тяхната SPF стойност, тъй като тези съединения имат UV абсорбция около 300-320 nm [74], която по този начин е центрирана в UV-B областта. Обратно, флавоноидите и антоцианините, присъстващи предимно в екстрактите от цветя, имат по-широк спектър на абсорбция, в който присъстват поне две ленти, като основната лента е във или близо до видимия диапазон, около 350 nm за флавоноли и 505-550 nm за антоцианини [53,69]. Наистина, производните на хидроксиканелената киселина се произвеждат от растенията, особено за тяхната защита срещу UV радиация [75]. Следователно, тези производни на хидроксиканелената киселина могат значително да допринесат за абсорбцията на UV-B от човешката кожа [6]. Въпреки това, като се има предвид наличието на антоцианини и флавоноиди, които покриват граничен диапазон от абсорбция на дължини на вълните, включително UV-A и видимите области, екстрактите от цветя на H. roseus може да са обещаващи за по-нататъшен анализ и разработване на слънцезащитни козметични продукти. В допълнение, по-високата антиоксидантна активност, наблюдавана за HF (Таблица 3), може да подобри слънцезащитните ефекти в възможни допълнителни формулировки [69].

2.4. Инхибираща активност на колагеназата

Both H.roseus extracts showed high collagenase inhibitory activity (>80%)at0.25mg mL-1, which is comparable to that of the synthetic inhibitor 1,10-phenanthroline 1M (Figure 2). The IC50 value of both extracts were very similar( >{{0}}.05),IC50екстракти от цветя =0.14 ± 0.02 mg mL-1 и IC50 листа екстракти =0.13±0.01 mg mL-1, въпреки разликите им във фенолния състав и съдържание (Таблици 1 и 2). Това може да се дължи на синергичните взаимодействия между фенолите и колагеназата, които могат да играят важна роля в механизма на инхибиране. В допълнение, други съединения, които вероятно присъстват в екстрактите от H. roseus и не са анализирани тук, могат да участват в антиколагеназната активност, включително витамин Е и аскорбинова киселина [71,7]. Освен това, двете тествани стандартни съединения, хлорогенна киселина и кверцетин, чиито производни присъстват в екстракти от листа и цветя на H. roseus (Таблица 1), показват много високо инхибиране на колагеназата, със стойности на ICso от 5,8±0,5 и 5,6±0,7ug mL -съответно. Следователно, тези съединения може да са отговорни за наблюдаваната антиколагеназна активност. Уместно е да се отбележи, че различни класове феноли, които също присъстват в нашите растителни екстракти, вече са показали активност против стареене чрез инхибиране на разграждането на колаген и допринасят за овлажняването на кожата [78]. Например, доказано е, че феруловата киселина и нейните производни овлажняват кожата и стимулират синтеза на колагенови влакна, като се използват в козметика като кремове против бръчки [6]. Освен това флавонолите, по-специално производните на кверцетин, са силни инхибитори на ензима колагеназа [79].

Нашите резултати показват обещаващия ефект на екстрактите от H. roseus срещу разграждането на колагена, който е един от най-важните протеини, отговорни за загубата на еластичност и цялост на кожата и за образуването на бръчки [80,81]. Ензимът колагеназа инхибира запазването на еластичността на кожата и якостта на опън [82]. Наистина, различни проучвания показват значението на естествените антиоксиданти поради тяхната ефикасност при забавяне на преждевременното стареене чрез инхибиране на колагеназната активност [78,83].

Проведени са предишни проучвания, оценяващи ефектите на видовете Hibiscus за стимулиране на производството на колаген и за инхибиране на активността на колагеназата [56,84,85]. Инхибирането на колагеназната активност на водни екстракти от H. sabdariffa е описано наскоро в литературата [56]. Подобно на нашите открития, авторите не наблюдават ефектите от инхибирането на колагеназата при ниски концентрации на екстрактите, а само при значително високи концентрации [56]. В друго проучване стойността на ICso при инхибирането на колагеназата на етанолови екстракти от H. sabdariffin е 0.75±0.04 mg mL-1[65], което е активност, която е почти шест пъти по-ниски от описаните тук за H. roseus.

3. Материали и методи

3.1. Растителен материал

Десет растения Hibiscus roseus Thore, закупени от търговски разсадник във Флоренция (Италия), бяха засадени в 10-литрови саксии, пълни с песъчлива почва (пясък/торф, 60:40, v/v) и поддържани в оранжерията на Министерството на земеделието, храните, околната среда и горите (DAGRI)—Университета на Флоренция (UNIFD, Sesto Fiorentino (Италия,43949/N,1137/E). Растенията са култивирани в оранжерията от януари до юли 2019 г., ръчно напояване при воден капацитет на саксията От тези десет различни растения листата и цветовете, събрани в две групи, бяха събрани в края на юли по време на периода на цъфтеж и незабавно съхранени при -80 градуса до екстракцията.

Лиофилизирани проби (900 mg) от цветове и листа на H.roseus (HF) и листа (HL) се смилат в течен азот и се екстрахират с 3 × 15,0 ml етанол 75 процента (рН 2,5, регулирано с HCOOH) чрез екстракция с помощта на ултразвук (ОАЕ). UAE се провежда в ултразвукова баня (BioClass@ CP104), като се използва постоянна честота от 39 kHz и входна мощност от 100 W, за 30 минути, при 5 градуса. След центрофугиране (5 min, 9000 rpm, 5 градуса; ALC@4239R, Милано, Италия), супернатантите се разделят с 3 × 15 mL n-хексан, за да се отстранят липофилните съединения, които биха могли да попречат на анализа. Етаноловата фаза се редуцира до сухо, претегля се на дигитална аналитична везна (Precisa[125A) и остатъкът се суспендира повторно с подкислен разтвор метанол/вода (1:1 обем/обем, рН 2,5 коригирано с HCOOH). Процесът на екстракция се провежда в три екземпляра.

3.3.LC-MS анализ: Фенолен профил на екстрактите

LC-MS анализът беше проведен с помощта на ABSciex API3000 троен квадруполен масспектрометър (AB Sciex LC, Framingham, MA, САЩ), съчетан с Agilent 1100 HPLC система с бинарна помпа и автосамплер (Agilent Technologies, Inc, Санта Клара, Калифорния, САЩ ). Придобиването и редуцирането на данни бяха извършени с помощта на софтуер Analyst 1.6.2 (AB Sciex LLC, Framingham, MA, USA).

HPLC разделянето се извършва на колона Agilent Phenyl (3 × 10 mm; 2,7 um), а елуентите са (A) подкиселена вода (при pH 2,5, регулирано с HCOOH) и (B) ацетонитрил/ вода (90/10, при рН 2,5, коригирано с HCOOH). Използвана е градиентна система от разтворители, както следва: 0-3 min, 5 процента B; 3-18 min, 5-40 процента B; 18-28 min,40 процента B;28-38min, 40-80 процент B; 38-43min, 80 процента B,43-45min, 80-5 процента B, при дебит от 0,4 mLmin -l. MS анализът е извършен при следните експериментални условия: Атмосферно налягане Химическа йонизация (APCI) с помощта на нагреваемия интерфейс на пулверизатора; Ток на иглата （NC）,-5 μA; Небулизатор Газ (въздух), 10 (произволни единици); Допълнителен газ (въздух), 3L min-l; Температура на спомагателния газ (TEM), 550 градуса; Завесен газ (CUR, азот), 6 (произволни единици); Газ от сблъсък (CAD, азот), 9 (произволни единици, съответстващи на 2,6 × 10~ Torr налягане в клетката за сблъсък).

Идентифицирането на различните фенолни компоненти беше извършено с помощта на целенасочен подход, използвайки метод за наблюдение на множество реакции (MRM), оптимизиран със стандарти за 19 целеви съединения (избрани въз основа на предишни изследвания на полифенолния състав на Hibiscus spp. [25,35] ): два флаван-3-ола (катехин и епикатехин), седем флавонола (кверцетагетин-7-О-глюкозид, рутин, кверцетин-3-О-глюкозид, кемпферол-3-О. рутинозид , кемпферол-7-О-глюкозид, кемпферол-3-О-глюкозид и кверцетин), един цинаматен естер (хлорогенна киселина), две хидроксиканелени киселини (р-кумарова и транс-ферулова киселина), два дихидрохалкона ( флоридин и флоретин), един оксифлавон (салидрозид) и четири антоцианина (миртилин, куроманин, пеонидин-3-О-глюкозид и оенин). Времето на задържане и относителните MRM преходи (квантор и квалификатор) са докладвани в допълнителна таблица S1. Освен това са предложени допълнителни условни идентификации, като се използва нецелеви подход, сканиращ квадрупола от m/z 100 до 100 Da.

3.4.HPLC-DAD анализ: Количествено определяне на фенолни съединения

Беше извършен HPLC-DAD анализ за количествено определяне на различните класове феноли (производни на хидроксиканелена киселина, катехини, дихидрохалкони, флавоноиди и антоцианини) в екстрактите. Аликвотни части от пробите (15 μL) бяха инжектирани в течен хроматограф Perkin Elmer Flexar, оборудван с кватернерна помпа 200Q/410 и LC 200 детектор с диодна матрица (DAD) (всички от Perkin Elmer", Брадфорд, Коннектикут, САЩ). Хроматографските условия бяха същите като тези, използвани за HPLC-MS/MS анализи (раздел 3.3) .

Хроматограмите са получени при 280,330,350 и при 520 nm (за количествено определяне на антоцианините). Идентифицирането и количественото определяне на фенолните съединения се извършва въз основа на времето на задържане, UV спектралните характеристики и сравнението със стандартите, както и въз основа на литературни данни [25] и в предишния LC-MS анализ. Петточкови калибрационни криви с различни стандарти (хлорогенова киселина, р-кумарова киселина, рутин, епикатехин, нарингин и пеонидин-3-О-глюкозид, всички от Sigma-Aldrich"-Merck KGaA, Дармщат, Германия) бяха използвани за количествено определяне на различните полифеноли, открити и идентифицирани в екстрактите.Ако не е наличен търговски стандарт, количественото определяне се извършва с помощта на калибрационната крива на стандарти от същия фенолен клас, давайки приблизително съдържание.Линейността на кривите се определя от коефициента на определяне (R4), като е по-висока от 0,99 за всички стандарти.

Всички екстракти бяха анализирани в три екземпляра и количествените резултати за фенолните съединения бяха дадени в mg gl сухо тегло (mg gl DW), изразено като общо съдържание на производни на хидрокси канелена киселина (THC), общо съдържание на флавоноиди (TFC), общо производни на катехин съдържание (TCD), общо съдържание на дихидрохалкони (IDC), общо съдържание на антоцианини (TAC) и общо фенолно съдържание (TPC), които бяха оценени като сума от отделните идентифицирани съединения, принадлежащи към всеки клас.

3.5. Тестове за антиоксидантна активност

Анализът на антиоксидантната активност се извършва с помощта на два различни метода: DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилхидразил) и анализи за отстраняване на хидроксилни радикали (OH) (HRS).

Методът на Khandi и Charles [{{0}}] беше приложен за DPPH анализ. Накратко, разредени проби от екстрактите (0.5 mL) се добавят към 0.5 mL DPPH разтвор (0.1 mM в метанол; Sigma-Aldrich@, St. Луис, Мичиган, САЩ), и сместа се оставя да реагира при стайна температура за 40 минути на тъмно. Това време (40 минути) се определя въз основа на резултатите от кинетичните анализи на всеки екстракт и стандартите хлорогенна киселина и рутин. След реакционното време абсорбцията се измерва при 518 nm с помощта на PerkinElmer® Lambda 25UV/VIS спектрофотометър. Абсорбцията на празната проба (0.5 mL метанол и 0,5 mL проби) и на отрицателната контрола (0,5 mL метанол и 0,5 mL DPPH разтвор) също бяха оценени. Всички анализи бяха проведени в три екземпляра. Процентът на антиоксидантна активност се изчислява, както следва (1).

4. Изводи

Вторичните метаболити са потенциални активни съставки за нови козметични формули. Сред тях фенолните съединения, извлечени от растения, могат да имат големи антиоксидантни свойства и свойства против стареене, като са ефективни при инхибирането на дермални ензими (напр. колагеназа) и при UV абсорбция. Следователно недостатъчно изследваните растителни екстракти, като тези от H. roseus, могат да представляват неразкрити източници на биоактивни молекули.

Ние демонстрирахме, че листата и цветята на H.roseus са богати на производни на хидроксиканелена киселина и флавоноиди, като цветята имат по-големи количества кемпферол гликозиди, катехини, дихидрохалкони и антоцианини, всички тези съединения все още не са описани в литературата за този вид . Големият антиоксидантен капацитет, особено на екстрактите от цветя, заедно със слънцезащитната и антиколагеназната активност както на екстрактите от листа, така и на цветя, посочват обещаващото използване на този слабо проучен вид в приложенията за грижа за кожата. В заключение, нашите резултати показаха потенциала на цветовете и листата на H. roseus като източници на феноли, както и активността на техните екстракти като агенти против стареене, които могат да се използват като съставки за функционални козметични продукти.

Тази статия е извлечена от Plants 2021, 10, 522. https://doi.org/10.3390/plants10030522 https://www.mdpi.com/journal/plants