Контакт:jerry.he@wecistanche.com

Юто Мицухата1, Такая Абе2, Казуйо Мисаки3, Юна Накаджима1, Кейта Кирия1,

Мива Кавазаки4, Хироши Кийонари2, Масатоши Такеичи4*, Мика Тоя1,4,5,6*&

Масамицу Сато1,6,7

Cistanche може да подобри функцията на бъбреците

Епителните клетки организират подреден набор от нецентрозомни микротубули, минусовите краища на които се регулират от CAMSAP3. Ролята на тези микротубули в епителните функции обаче е слабо разбрана. Тук показваме, чебъбрецина мишки, в които Camsap3 е мутирал, се развиваткистив проксималните извити тубули (PCTs). PCTs бяха силно разширени в мутантабъбреци, и те също така показват повишена клетъчна пролиферация. В тези PCT, епителните клетки стават угоени заедно със смущението на микротубулните масиви, както и на някои субклетъчни структури, като интердигитиращи базални процеси. Освен това, YAP и PIEZO1, които са известни като механочувствителни регулатори за клетъчно оформяне и пролиферация, бяха активирани в тези мутантни PCT клетки. Тези наблюдения предполагат, че CAMSAP3-медиираните микротубулни мрежи са важни за поддържане на правилните механични свойства на PCT клетките и неговата загуба предизвиква клетъчна деформация и пролиферация чрез активиране на механосензори, което води до разширяване на PCT.

Епителните клетки са основни компоненти на различни органи. Те показват апикална към базална полярност, която е свързана с техните функции, като абсорбция и секреция. В диференцираните епителни клетки по-голямата част от микротубулите са нецентрозомални и са подредени по протежение на апикалната към базалната ос1-3. CAMSAP3 е член на калмодулин-регулирания спектрин-асоцииран протеин (CAMSAP)/Nezha/Patronin протеинова фамилия и е важен за организацията на епителните микротубули4–8. CAMSAP3 свързва и стабилизира отрицателните краища на микротубулите 4,6,9. В клетките на тънките черва при мишки, CAMSAP3 се концентрира в апикалните кортикални региони, закрепвайки минусовите краища на нецентрозомалните микротубули към тези места 10,11, което води до образуването на микротубулни масиви, ориентирани към апикобазалната посока с плюсови краища, насочени базално . Въпреки това, тази характерна микротубулна организация се губи при мишки, носещи мутантен ген, кодиращ съкратен Camsap3 (Camsap3dc/dc мишки), в който С-терминалният микротубулен свързващ домейн е изтрит. Чревните епителни клетки в тези мишки имат различни цитологични дефекти, включително намалена клетъчна височина и неправилно разположени органели като ядрото и Golgi10. Въпреки такива големи смущения във вътреклетъчната архитектура, епителните клетки поддържат нормално изглеждащи двуизмерни листове 10, 12, а мутиралите черва нямат очевидни физиологични дефекти.

тубули (PCTs), примката на Henle, дистални извити тубули и събирателен канал. Тези субструктури на нефрона се състоят от един слой епител, който функционира за филтриране, реабсорбция и секреция.

A бъбречна кистае често срещано патологично увреждане набъбреци. Кистозната лезия е променлива; фокални или множествени кисти се образуват от едната страна или двустранно в бъбреците, показвайки различна степен на симптоми13-15. Няколко вродени кистознибъбречназаболявания, включително поликистозабъбрекзаболявания (PKD), гломерулоцитозна бъбречна болест (GCKD) и медуларна кистична болестбъбрек(MCKD), е известно, че причиняват множествобъбречнакисти в двустранни бъбреци. При PKD кистите се разпределят равномерно в целия орган, включително PCTs, докато GCKD и MCKD развиват кисти съответно в капсулите на Bowman и събирателните канали (главно в областта на медулата)16–19.

Що се отнася до PKD, известни са две основни причини: 1) мутации в гена Pkd1 или Pkd2 и 2) мутации в гени, необходими за първичната биогенеза на ресничките. Pkd1 и Pkd2 кодират съответно полицистин1 и полицистин2, които са неселективни катионни канали20, които се локализират в няколко клетъчни отделения, включително първичните реснички 21,22. При мишки, носещи мутантна форма на PKD1 или PKD2, полицистиновите протеини не се локализират в ресничките23. Гените, необходими за биогенезата на първичните реснички, включват If88 и Kif3a, които участват в интрафагеларния транспорт 24-26. Мутациите в тези гени също водят добъбречнакистозни заболявания24–27 . Въпреки че връзката между тези два причинно-следствени пътя е сложна23, един път, за който е доказано, че индуцира PKD, включва сигналния ефектор на Hippo Yap28. В Pkd1 мутантни мишки, ко-активаторът на транскрипция YAP/TAZ и неговият ефектор c-Myc се активират и насърчават цистогенезата28. Независимо от това, механизмите, лежащи в основата на развитието на поликистозабъбрециостават до голяма степен неизвестни.

В настоящото проучване изследвахме ролите на CAMSAP3 вбъбрекструктура и функция. Нашите наблюдения показват, че апикално локализираният CAMSAP3 допринася за правилната ориентация на нецентрозомалните микротубули, както и за установяването на вътреклетъчната архитектура на епителните клетки в PCTs, както се наблюдава в тънките черва. За разлика от чревния епител обаче, CAMSAP3дисфункцияпричинява аномалии на ниво орган в двустранните бъбреци - тоест образуване на кисти в PCT. Загубата на функция CAMSAP3 доведе до активиране на механочувствителни регулатори, които обикновено помагат за запазване целостта на тъканите. Нашето проучване предполага, че медиираната от CAMSAP3- нецентрозомна микротубулна организация е важна за поддържане на механочувствителните свойства на PCT и загубата на тази система причинява регионално образуване на кисти в бъбрека.

Резултати

Кистаобразуване вбъбрецина Camsap3 мутантни мишки. Фенотипният анализ на Camsap3dc/dc мутантни мишки разкри товабъбреципри възрастни (~ 2 години) мишки Camsap3dc/dc бяха хипертрофични и обезцветени (фиг. 1а). За по-нататъшен анализ на аномалии в Camsap3dc/dcбъбреци, изследвахме по-млади мишки. На постнатален ден 21 (P21) бъбреците на Camsap3dc/dc имат нормален вид. Разрезът на бъбрека обаче разкри кистозни структури в кортикалните области (фиг. 1b и допълнителна фигура S1a), както се потвърждава от изчисляването на кистозния индекс, който е съотношението на областите, съдържащи киста, към общата бъбречна площ (фиг. 1в). Изследвахме мутантни ембриони, за да определим кога кистите започват да се образуват по време на развитието, което разкри признак на повишено образуване на кисти на приблизително ембрионален ден 17.5 (E17.5) (допълнителна фигура S1a, стрелки). При P 0 кортикалните кисти станаха лесно забележими (допълнителна фигура S1a, стрелки) и техният размер и брой се увеличиха с P21 (фиг. 1b, допълнителна фигура S1a, стрелки). С напредването на възрастта на мишките кистозните фенотипове стават по-очевидни, въпреки че степента на образуване на кисти варира сред индивидите (фиг. 1c и допълнителна фигура S1b). В допълнение, съотношението тегло на бъбреците към телесното тегло е по-високо за мишки Camsap3dc/dc, отколкото мишки от див тип (WT) през целия им живот (фиг. 1d и допълнителна фигура S1c, d). И така, бъбреците на Camsap3dc/dc показват образуване на кисти, което се засилва с течение на времето, което води до хипертрофия в остарели бъбреци.

Camsap3dc/dc мишки експресират С-краен домейн-скъсен CAMSAP3 (CAMSAP3-dc)10, който може да бъде включен в наблюдавания кистичен фенотип на бъбреците на мишката. За да проучим тази възможност, ние генерирахме мишка Camsap3–/– (Camsap3-null) (допълнителна фигура S2a, b) (вижте също методите подробно). Тези мишки също имахабъбрецис множество кисти и техният фенотип е неразличим от този, наблюдаван при Camsap3dc/dc мишки; по-специално, хетерозиготни (Camsap3 плюс /–) мишки не показват признаци на поликистозни бъбреци (допълнителна фигура S2c).

Образуване на кисти в PCT на Camsap3dc/dcбъбреци. Да се ​​определи кои структури са станали кистозни в мутантабъбреци, проведохме имунооцветяване на три нефронови сегмента за три протеина, а именно мегалин (локализира се в PCTs), котранспортер Na plus /Cl– (дистални извити тубули) и аквапорин-2 (събирателни канали). Резултатите показват, че дилатацията е настъпила изключително при мегалин-положителни тубули при P21 (фиг. 1e и допълнителна фигура S1e), което показва, че цистогенезата е ограничена до PCTs. PCTs са подразделени на три сегмента, а именно S1, S2 и S3, и ние ги разграничихме чрез имунооцветяване за глюкозните транспортери SGLT1 и SGLT2, които се локализират съответно в S3 и S1/S2 сегменти29,30. Разширените тубули са маркирани единствено от SGLT2 (фиг. 1f), което показва, че цистогенезата се появява в S1/S2 сегментите. При по-стари мутантни мишки, обаче, образуването на кисти също се разпростира до капсулата на Bowman (фиг. 1g).

Дезорганизирана клетъчна архитектура в кистозни PCT. За да изследваме дефектите на клетъчно ниво в кистозните PCT, първо ги изследвахме чрез сканираща електронна микроскопия, откривайки, че популация отбъбречнатубулите са значително набъбнали в бъбреците на Camsap3dc/dc (фиг. 2а), въпреки че степента на подуване варира от позиция до позиция на тубула. Напречните сечения разкриват, че при подутите части на тубула, неговият лумен е разширен заедно с изтъняване на епителния слой, съставляващ тубулите (фиг. 2а). Количественото определяне с помощта на проби, оцветени с хематоксилин и еозин, потвърди, че височината на клетките е намалена в разширените тубули (фиг. 2b), докато апикалният периметър на всяка клетка е увеличен (фиг. 2c), което показва, че мутантните клетки са по-дебели от тези в WTбъбреци.

След това проверихме дали клетъчната архитектура и/или субклетъчните структури на PCTs са били засегнати от мутацията на Camsap3. Имунооцветяването за DPP IV, апикален мембранен маркер, и за Na плюс /K плюс -ATPase, базолатерален мембранен маркер, показва, че общата клетъчна полярност е нормална във всекибъбречнатубулна клетка на Camsap3dc/dc

Фигура 1. Образуване на кисти в проксималните извити тубули на Camsap3dc/dcбъбреци. (a) Морфология на бъбреците на WT (плюс / плюс) и Camsap3 мутант (Camsap3dc/dc) мишки при P666. ( b ) H&E оцветяване на WT и Camsap3dc/dc бъбреци при P21. Множество кисти се образуват в кората на Camsap3dc/dc бъбреците. ( c ) Промяна на кистозния индекс на WT и Camsap3dc / dc мишки с течение на времето. 9 мишки бяха изследвани за WT или Camsap3dc/dc. Вижте МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ за определяне на кистозния индекс. (d) Съотношение на бъбрека към телесното тегло. 11 мишки бяха изследвани за WT или Camsap3dc/dc. (д) Имунооцветяване за маркери на проксимални извити тубули (PCT) (Megalin), дистални извити тубули (DCT), ко-транспортер на NaCl и събирателни канали (CD) (аквапорин-2; AQP2) в WT и Camsap3dc/ dcбъбрецина P21. Изображенията на увеличения изглед на мегалин показват делокализиран мегалин в кистозни клетки в бъбреците Camsap3dc/dc, както е посочено от върха на стрелката. Прекъснатите и непрекъснатите линии показват съответно апикалния и базалния ръб на клетката. (f) Имунооцветяване за маркери на сегментите S1/S2 (SGLT2, зелено) и S3 сегмента (SGLT1, червено) в WT и Camsap3dc/dc бъбреците при P21. Изображенията на увеличения изглед на SGLT2 показват намален интензитет на SGLT2 сигнала в кистозни клетки в бъбреците на Camsap3dc/dc, както е показано с върхове на стрелки. (g) Морфология на гломерула при P21 и P487. Стрелките показват разширения гломерул. Вижте също фигури S1 и S2.

Фигура 2. Дезорганизирана клетъчна архитектура в кистозни PCT клетки. (a) Изображения от сканираща електронна микроскопия ▸

Cistanche може да подобри функцията на бъбреците

на WT и Camsap3dc/dcбъбрецина P21. Бъбречни тубули в Camsap3dc/dcбъбрецие частично подут. (b) Количествено определяне на височината на клетката в кората [плюс / плюс, n=121 клетки; dc/dc (разширени), n=128 клетки; dc/dc (недилатирани), n=66 клетки]. Лентите за грешки показват SD ***p<0.001, t-test.="" see="" materials="" and="" methods="" for="" the="" defnition="" of="" dilated="" and="" non-dilated="" tubules.="" (c)="" quantifcation="" of="" cell="" width="" in="" the="" cortex="" [+="" +="" ,="" n="26" tubules;="" dc/="" dc="" (dilated),="" n="8" tubules;="" dc/dc="" (non-dilated),="" n="14" tubules].="" error="" bars="" indicate="" s.d.="" ***p=""><0.001, t-test.="" (d)="" cell="" polarity="" markers="" were="" visualized:="" dpp="" iv="" (apical="" marker)="" and="" na+/k+-atpase="" (basal="" marker).="" te="" localization="" of="" cell="" polarity="" markers="" in="" camsap3dc/dc="" kidney="" is="" overall="" normal.="" te="" arrowhead="" indicates="" basal="" plasma="" membranes,="" whose="" invagination="" is="" not="" normal.="" (e)="" apical="" structures="" (actin="" and="" ezrin)="" and="" the="" golgi="" were="" visualized.="" arrowheads="" indicate="" disrupted="" structures="" such="" as="" the="" lack="" of="" actin="" signal="" and="" misplacement="" of="" the="" golgi.="" broken="" and="" continuous="" lines="" indicate="" the="" apical="" and="" basal="" margin="" of="" the="" cell,="" respectively,="" in="" d="" and="" e.="" (f)="" transmission="" electron="" microscopy="" images="" of="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" subcellular="" defects="" such="" as="" a="" fattened="" nucleus="" and="" misaligned="" mitochondria="" are="" observed="" in="" camsap3dc/dc="" kidneys.="" arrowheads="" indicate="" invaginated="" basal="" membranes.="" note="" that="" their="" extensive="" invagination="" is="" suppressed="" in="" camsap3dc/dc.="" asterisks="" denote="" mitochondria.="" drawings="" are="" the="" traced="" invagination="" in="" electron="" microscopy="" images.="" (g)="" quantifcation="" of="" the="" shape="" of="" the="" nucleus="" [+="" +="" ,="" n="72" cells;="" dc/dc="" (dilated),="" n="72" cells;="" dc/dc="" (non-dilated),="" n="71" cells].="" (h)="" immunostaining="" for="" acetylated="" tubulin,="" a="" marker="" for="" the="" primary="" cilium,="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" te="" primary="" cilium="" was="" present="" in="" both="" wt="" and="" camsap3dc/dc="">бъбреци. (i) Брой първични реснички при PCTs. Броят на първичните реснички се изчислява, като се използва дължината на апикалната обиколка на напречните сечения на PCT, заедно с броя на първичните реснички и ядра. [ плюс / плюс , N=340 клетки, 63 напречни сечения на PCT, брой първични реснички=268; dc/dc, N=221 клетки, 29 напречни сечения на PCT, брой първични реснички=133].

мишки (фиг. 2d). За разлика от това, въпреки че Megalin се натрупва в апикалните области в WT клетки, той се разпространява в цитоплазмата в някои от кистозните Camsap3dc/dc клетки (Фиг. 1e увеличен изглед и Фиг. 2d). Флуоресцентното оцветяване за F-актин, който се натрупва с висока плътност в апикалните микровили, предполага, че микровилите понякога са били разстроени в угоените клетки на мутантбъбреци(Фиг. 2e стрелка), както е потвърдено от трансмисионна електронна микроскопия (Фиг. 2f). Ezrin, част от ERM-комплекса, който се свързва с апикалната плазмена мембрана31, е намален или загубен в кистозни клетки на Camsap3dc/dcбъбреци(Фиг. 2е), което предполага, че цитоархитектурата е анормална в мутантните клетки. В допълнение, докато Giantin-позитивният апарат на Голджи обикновено се разпространява като тънки нишки, разположени в съседство с ядрото в WT клетките, Голджи понякога се кондензира в клетки Camsap3dc/dc (фиг. 2е). Трансмисионната електронна микроскопия разкри допълнителни субклетъчни дефекти в разширени PCT на Camsap3dc/dcбъбреци. В WT PCT клетки митохондриите са удължени, показвайки подредена ориентация по протежение на апико-базалната ос на клетката, докато в кистозните PCT клетки митохондриите са склонни да бъдат кръгли - вече не показват никаква подредена ориентация (фиг. 2f). В тези клетки базалните набраздявания също бяха дезорганизирани, губейки своите паралелни и дълбоки инвагинации, които са често срещани в WT клетките (фиг. 2f върхове на стрелки и проследен чертеж), както също е показано чрез имунооцветяване за Na плюс /K плюс -АТФаза (фиг. 2d върхове на стрели). Освен това, ядрата бяха угоени в кистозните клетки, в сравнение с тяхната кръгла форма в WT клетки (фиг. 2f, g). Първичните реснички се откриват в луминалната страна на PCT клетките както в WT, така и в мутантните бъбреци (фиг. 2h,i), за разлика от случая на мутантни мишки, които са дефектни за цилиогенеза, което причинява поликистозни бъбреци 24-27, което предполага, че увреждането на цилиогенезата е не е вероятната причина за

наблюдавани поликистозни фенотипове в Camsap3dc/dc мишки. Взети заедно, тези наблюдения показват, чедисфункцияна CAMSAP3 нарушава субклетъчната архитектура на PCT кистозни клетки.

Мишките Camsap3dc/dc показват някои физиологични дефекти. След това проверихме дали бъбреците на Camsap3dc/dc имат някакви физиологични дефекти. Гореспоменатите имуноцитологични изследвания показват, че мегалин, който функционира като мултилиганден ендоцитен рецептор32,33, има тенденция да се дифузира в цитоплазмата на Camsap3dc/dc PCT клетки (фиг. 1e стрелка и фиг. 2d), за разлика от неговата ясна апикална локализация в WT PCT клетки. Освен това, въпреки че глюкозният транспортер SGLT2, който е отговорен за 90 процента от реабсорбцията на глюкоза29, локализиран предимно в апикалните области на клетките Camsap3dc/dc (както се наблюдава и в WT клетките), неговият интензитет на сигнала намалява в определени области на кистозни тубули ( Фиг. 1f върхове на стрелки), което предполага, че физиологията на мутантните тубули може да е била отрицателно засегната. Затова проведохме изследвания на урина и кръв, използвайки P396- до P424-стари мишки. Тестовете на урината разкриха тенденция на прекомерно изтичане на K plus, Mg2 plus и уреен азот в Camsap3dc/dc мишки (допълнителна фигура S3a). Кръвните тестове показват по-убедително, че мишките Camsap3dc/dc имат значително по-ниски нива на K plus и Mg2 plus в сравнение с WT или Camsap3 plus /dc мишки, въпреки че не е открита промяна в нивата на урея азот и глюкоза (допълнителна фигура S3b) . Нивата на креатинин в урината и кръвта не се различават между WT и мутантни мишки (допълнителна фигура S3c). Така наблюдавахме само частични физиологични дефекти в Camsap3dc/dc мишки.

Организация на микротубулите вбъбречнатубулни епителни клетки. Тъй като мутацията на Camsap3 води до дезориентация на микротубулите в епителните клетки на тънките черва 10, 12, ние проучихме дали това се случва и вбъбрекепителни клетки. Първо имунооцветихме -тубулин заедно с мегалин. Трябва да се отбележи, че както в WT, така и в Camsap3dc/dc бъбреците, мегалин-негативните тубули, т.е. дистални извити тубули или събирателни канали, показват по-силен интензитет на имунооцветяване с -тубулин, отколкото наблюдаван за -тубулин в мегалин-позитивни PCT (фиг. 3a, b) . Както се намира в тънките черва10, CAMSAP3 се локализира апикално във всички епителни клетки на WTбъбреци, припокриващи апикалния край на микротубулите, които са подредени по протежение на апико-базалната ос (фиг. 3c вляво). Епителните клетки на бъбрека Camsap3dc/dc също бяха донякъде имунопозитивни за CAMSAP3, но на неправилни позиции (фиг. 3c вдясно, върхове на стрелки), което предполага, че мутирали CAMSAP3 се задържат в клетките, закотвени към някои неидентифицирани структури. В кистозните клетки на мутантните бъбреци, масивът от микротубули е заплетен и дезорганизиран (фиг. 3c вдясно), както се наблюдава в чревните клетки на мишки Camsap3dc/dc10. В нецистичните клетки обаче организацията на микротубулите не е засегната

Фигура 3. Микротубули в епителните клетки на бъбречните тубули. ( а ) Имунооцветяване за -тубулин, мегалин и ядра в WT и Camsap3dc/dc бъбреци при P21. (b) Количествено определяне на интензитета на -тубулин в PCT и DCT/CD на WT бъбреци (PCT, n=28 тубули; DCT/CD, n=18 тубули) и Camsap3dc/dc бъбреци (PCT, n { {8}} тубули; DCT/CD, n=9 тубули). Лентите за грешки показват SD ***p<0.001, t-test.="" (c)="" immunostaining="" for="" α-tubulin,="" camsap3,="" and="" dapi="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" arrowheads="" indicate="" camsap3-dc="" proteins="" anchoring="" to="" unidentifed="" structures.="" te="" apical="" localization="" of="" camsap3="" was="" absent="" in="" camsap3dc/dc="" cells.="" see="" also="" figure="">

дори в отсъствието на функционален CAMSAP3, което може да обясни защо тези клетки не показват цитологични аномалии. В допълнение, Camsap3-нулевите бъбречни епителни клетки също показват подобни микротубулни дефекти, но само в кистозни клетки (допълнителна фигура S2d). Взети заедно, тези резултати показват, че CAMSAP3 играе роля в поддържането на апико-базалната организация на микротубулите само за субпопулация от бъбречни епителни клетки.

Подобрена клетъчна пролиферация в Camsap3dc/dc PCT. Образуването на кисти в бъбреците е тясно свързано с повишената пролиферация на бъбречни клетки34. За да проверим дали клетъчната пролиферация е била променена в бъбреците Camsap3dc/dc, сравнихме пролиферацията на PCT клетки между WT и мутантни бъбреци чрез съвместно имунооцветяване за Megalin и Ki-67, маркер за клетъчна пролиферация. Ki-67-позитивните клетки рядко се наблюдават в PCTs на WT бъбреците, докато те са лесно забележими в PCT клетките на Camsap3dc/dc бъбреците. Въпреки това, Ki -67 беше открит както в неразширени, така и в разширени тубули (Фиг. 4a, b), не показвайки корелация между клетъчната пролиферация и образуването на кисти. Тус, CAMSAP3дисфункциянасърчава клетъчната пролиферация, но този процес не винаги е свързан с образуването на кисти.

Промени в локализацията на YAP и немускулния миозин, свързани с клетъчна деформация. YAP е транскрипционен активатор, който регулира клетъчната пролиферация35, както и зависимо от механичното напрежение клетъчно оформяне36. YAP се активира заедно с ядрената си локализация в бъбреците на мишки с дефицит на Pkd1-, модел на PKD37, и активирането на Yap насърчава клетъчната пролиферация и тубулната дилатация в бъбреците28. Затова тествахме дали YAP също е активиран в PCTs на Camsap3dc/dc бъбреците. Имунооцветяването за YAP разкрива неговата цитоплазмена локализация в PCTs на WT бъбреците. Забележително е, че YAP се концентрира в ядрата на Camsap3dc/dc PCT, но само в техните разширени части (Фиг. 5а), както се потвърждава от количественото определяне (Фиг. 5b), което предполага, че наблюдаваното преразпределение на YAP е настъпило в отговор на промяна в клетката морфология, а не CAMSAP3дисфункцияper se.

YAP е ефектор надолу по веригата на пътя на Hippo, който се регулира от механични сигнали38. Всъщност кистозните клетки в бъбрека на Camsap3dc/dc изглеждаха разтегнати, което предполага, че може да са били изложени на повишено напрежение.

Фигура 4. Клетъчна пролиферация в Camsap3dc/dc PCT. (a) Имунооцветяване за Ki-67, Megalin и DAPI в WT и Camsap3dc/dc бъбреци при P22. Стрелките показват Ki-67-позитивни клетки в кистозни тубули. (b) Процент Ki-67–позитивни клетки в PCT епителни клетки [плюс / плюс, n=700 клетки; dc/dc (разширени), n=224 клетки; dc/dc (недилатирани), n=396 клетки]. Лентите за грешки показват SD *p<0.05,>

Затова проучихме дали са настъпили някакви механични промени заедно с образуването на кисти. Тъй като немускулното активиране на миозин II е чувствителен към напрежение процес39, ние оценихме разпределението на леката верига на миозин 2 (MLC2), която участва в активирането на миозин II, в бъбреците. Въпреки че MLC2 се разпръсква в цитоплазмата в WT тубулни клетки, той се концентрира близо до апикалните части на кистозни клетки в бъбреците на Camsap3dc/dc (Фиг. 5c стрелка), което предполага, че тези клетки са били подложени на сила на опън. Клетките в недилатирани PCT не показват такава концентрация на MCL2. Тези констатации са в съответствие с идеята, че YAP навлиза в ядрото, когато клетките са механично разтегнати 40, 41.

Промени в разпределението на PIEZO1 в Camsap3dc/dc PCT. За по-нататъшно тестване дали кистозните клетки са изложени на сила на разтягане, ние изследвахме субклетъчното разпределение на PIEZO1, механочувствителен йонен канал 42–45, тъй като това е типичен маркер за механично разтягане; Локализацията на PIEZO1 се измества от плазмената мембрана/цитоплазма към ядрената обвивка, когато усети сигнали за разтягане46. Имунооцветяването за PIEZO1 показа, че PIEZO1 се локализира най-вече в цитоплазмата на WT PCT клетки, докато неговата локализация се припокрива с ядрото в кистозни клетки на Camsap3dc / dc PCTs (фиг. 6а). Имунооцветяването за YAP и PIEZO1 в последователни секции също предполага, че тяхната ядрена локализация съвпада при разширени PCT (допълнителна фигура S4, върхове на стрелки). От друга страна, в недилатирани Camsap3dc/dc PCT, разпределението на PIEZO1 изглеждаше цитоплазмено (фиг. 6а). Въпреки това, близките наблюдения на имунофлуоресцентните изображения, както и количественото определяне показват, че неговата ядрена локализация има тенденция да се увеличава до известна степен, в сравнение с WT клетки (фиг. 6a, b). И така, за разлика от YAP, изглежда, че PIEZO1 започва да се активира преди откриваемата деформация на клетките в Camsap3dc/dc PCT.

Дискусия

В това проучване ние открихме, че мутацията на CAMSAP3 или нейната загуба е довела до разширяване на PCT клетки, което е причинило напречните сечения на тубулите да придобият кистозен вид. Признак на цистогенеза вече е наблюдаван още при E17.5, с постепенно увеличаване на дилатацията по време на стареене и нейното евентуално разширяване до капсулата на Bowman. Епителните клетки в разширените области станаха по-тънки, проявявайки различни цитологични дефекти, както се наблюдава в клетките на тънките черва на Camsap3dc/dc мишки 10,12. Бяха наблюдавани и някои специфични за бъбреците дефекти, включително смущението в подреждането на митохондриите и структурирането на базалната плазмена мембрана. Тези промени съвпаднаха с нарушаването на подреждането на микротубулите, което предполага, че CAMSAP3-медиираните микротубулни мрежи са отговорни за нормалната организация на тези субклетъчни структури в PCT клетките, както се среща в други типове клетки. От друга страна, въпреки че CAMSAP3 изглежда се експресира във всички епителни клетки на бъбречните тубули, анормални структурни фенотипове се наблюдават само в PCT, което предполага съществуването на излишен механизъм(и) за поддържане на микротубулни мрежи в отсъствието на CAMSAP3. Възможно е молекули, различни от CAMSAP3, като други CAMSAP, да участват в поддържането на целостта на мрежите от микротубули в тези клетки. PCT клетките имат относително по-ниска плътност на микротубулите в сравнение с други тубулни клетки. Това вероятно е улеснило клетъчната деформация, тъй като мрежите от микротубули, които биха останали след загубата на CAMSAP3, може да са били недостатъчни за поддържане

правилната клетъчна архитектура. Дори в PCT клетки обаче изглежда съществуват механизми, които компенсират загубата на CAMSAP3, тъй като дилатацията на PCTs не се случва равномерно.

Фигура 5. Локализация на YAP и немускулен миозин, свързан с клетъчна деформация. ( а ) Имунооцветяване за YAP, Megalin и DAPI в WT и Camsap3dc/dc бъбреци при P22. Флуоресцентните сигнали на DAPI и YAP бяха сканирани по линията, начертана в увеличените изображения, и пространствените промени в интензитета на флуоресценция са показани в синьо за DAPI и зелено за YAP. Прекъснатите линии показват приблизителната площ на ядрото. Стрелките показват позицията на ядрото в представителните клетки. (b) Съотношение на интензитета на ядрения YAP към интензитета на цитоплазмения YAP [плюс / плюс, n=81 клетки; dc/dc (разширени), n =43 клетки; dc/dc (недилатирани), n=53 клетки]. Графиките с кутия показват стойности на първи квартил, медиана и трети квартил. ***стр<0.001, t-test.="" (b)="" immunostaining="" for="" mlc2,="" actin,="" and="" dapi="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p22.="" arrowheads="" indicate="" apical="" accumulation="" of="" mlc2="" in="" cystic="">

Фигура 6. Промяна в разпределението на PIEZO1 в Camsap3dc/dc PCT. ( a ) Имунооцветяване за PIEZO1, Megalin и DAPI в WT и Camsap3dc/dc бъбреци при P22. Флуоресцентните сигнали на DAPI и PIEZO1 бяха сканирани по линията, начертана в увеличените изображения, и пространствените промени в интензитета на флуоресценция са показани в синьо за DAPI и зелено за PIEZO1. Прекъснатите линии показват приблизителната площ на ядрото. Стрелките показват позицията на ядрото в представителните клетки. (b) Съотношение на интензитета на ядрения пиезо1 към интензитета на цитоплазмения пиезо1 [плюс / плюс, n=66 клетки; dc/dc (разширени), n =44 клетки; dc/dc (недилатирани), n=81 клетки]. Графиките с кутия показват стойности на първи квартил, медиана и трети квартил. ***стр<0.001, **p=""><0.01, t-test.="" see="" also="" figure="">

Как тогава PCTs са били разширени по регионален начин, придружени от угояване на епителните клетки? Трябва да се отбележи, че образуването на кисти става откриваемо при E17.5 и това време корелира с началото на примитивно производство на урина при мишки47. Следователно, можем да предположим, че "урината" е потенциален механичен фактор, който предизвиква дилатация на бъбречните тубули. Вероятно PCT клетките, които са загубили CAMSAP3-медиирания микротубулен цитоскелет, са механично по-податливи на външни сили, тоест по-деформируеми, в сравнение с WT PCT клетките. От друга страна, силите, произведени от потока на урината в бъбречните тубули, могат да причинят дилатация на тубулите, което води до тяхното угояване. Такива сили може да не са еднакви, което води до различни степени на дилатация по PCT. Излишно е да казвам, че тази идея не изключва други възможни механизми за PCT дилатация.

Нашите наблюдения показаха, че PIEZO1 се премества от цитоплазмата в ядрената област в разширени PCT клетки на бъбреците Camsap3dc/dc, което предполага, че този механосензор е активиран в отговор на клетъчна деформация, най-вероятно „разтягането“ на клетките, както беше съобщено по-рано46. Разтегнатото състояние на разширените PCT клетки се потвърждава от наблюдението, че MLC2 се увеличава в техните кортикални области. Нашият анализ допълнително показа, че PIEZO1 вече е активиран до известна степен в неразширени PCT клетки, което предполага, че дори тези клетки са били подложени на механични промени въпреки нормално изглеждащия им вид. Друг механосензор, YAP, също се активира в PCT клетки, но неговото активиране изглежда се случва само в разтегнати клетки.

Как тогава тези механочувствителни регулатори допринасят за клетъчната деформация, както и за клетъчната пролиферация, която беше насърчавана в отсъствието на CAMSAP3? Показано е, че индуцираното от разтягане активиране на PIEZO1 насърчава клетъчната пролиферация в епителните клетки46, което предполага, че този механизъм работи и в PCT клетки на Camsap3dc/dc бъбреците. Тази идея е в съответствие с нашето наблюдение, че повишената клетъчна пролиферация и частичното активиране на PIEZO1 се появяват заедно, дори в неразширени клетки на Camsap3dc/dc PCT. По отношение на YAP, неговото активиране беше забавено, без да показва ясна връзка с началото на усилването на клетъчната пролиферация. YAP е известен не само като клетъчен растежен фактор, но и като регулатор на механичната хомеостаза, както беше показано по-рано 36, 48. Следователно е възможно YAP, който е бил преместен в ядрото заедно с деформацията на PCT клетките, да функционира, за да регулира тяхната форма, тоест да възстанови увредената форма на тези клетки. В противен случай, YAP може да си сътрудничи с PIEZO1 за усилване на пролиферацията на разширени клетки, тъй като е известно, че YAP участва в образуването на поликистозни бъбреци чрез усилване на клетъчната пролиферация28.

Открихме, че мишките Camsap3dc/dc имат значително по-ниски нива на K plus и Mg2 plus в кръвта, което предполага, че техните бъбреци може да са страдали от някакво ненормално функциониране. Тежки цитологични дефекти, които наблюдавахме в апикалните и базалните плазмени мембрани на PCT клетки, където се намира активната транспортна машина, може да са свързани с тази аномалия. Не можем обаче да изключим възможността други части на бъбречните тубули или други органи също да бъдат функционално дефектни, предизвиквайки този фенотип. Освен това не получихме никакви доказателства, че филтриращите функции на гломерула са били увредени, тъй като кръвните нива на креатинин и уреен азот, които се екскретират през гломерула, са били нормални.

Нарушаването на първичната биогенеза на ресничките води до PKD24–27. В случай на мутация Camsap3, образуването на първични реснички изглеждаше незасегнато. Едно скорошно проучване показа, че загубата на CAMSAP3 в назални многоресничести епителни клетки повлиява образуването на централните двойки микротубули в аксонемата, причинявайки аберантна подвижност в подвижните реснички49 . Въпреки че първичните реснички върху епителните клетки са неподвижни и им липсват централните двойки микротубули50, остава несигурно дали първичните реснички в Camsap3 мутантните мишки все още функционират. Въпреки тази несигурност, аномалиите в PKD и Camsap3 мутанти са доста различни, тъй като образуването на кисти се случва равномерно по целия бъбрек в първия, докато това е локално събитие в последния. Тази разлика най-вероятно се дължи на различния молекулен фон на образуването на кисти между тях.

За да обобщим, нашето проучване разкрива, че CAMSAP3 е важен за поддържане на структурата и функцията на бъбречните тубули в проксималните области, вероятно чрез регулиране на сглобяването на нецентрозомни микротубули. Въпреки това ще са необходими допълнителни проучвания за задълбочено разбиране на това как загубата на тази микротубулна организационна система пречи на физиологичните функции на бъбрека.

Материали и методи

Всички експерименти са извършени в съответствие със съответните насоки, разпоредби и са одобрени от RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research и/или от Комитета по биобезопасност на университета Васеда.

мишки. Camsap3 мутантни (Camsap3dc/dc) мишки, използвани в това проучване, са генерирани в нашето предишно проучване10 (номер за достъп CDB0716K; http://www2.clst.riken.jp/arg/mutant percent 20mice percent 20list.html). При тези мишки С-терминалният участък на Camsap3, а именно екзони 14-17, беше премахнат и ние преди това потвърдихме, че миши клетки експресират нефункционален С-терминално съкратен CAMSAP3 (CAMSAP3-dc)10. В настоящото изследване в експерименти са използвани мишки от поколение N4 и 5.

Camsap3 нокаут (Camsap3–/–) мишки (номер за достъп CDB0033E), на които липсва цялата 22-kb Camsap3 кодираща област, бяха генерирани с CRISPR/Cas9-медиирано редактиране на геном чрез електропорация на зигота51. Накратко, две насочващи РНК и едноверижен олигодезоксинуклеотид (ssODN) са предназначени да изтрият 22-kb региона и е добавен EcoRI сайт с цел разпознаване за успешно вмъкване в мутантни мишки. За електропорация cRNAs, tracrRNA, ssODN и Cas9 протеин бяха въведени в C57BL/6 зиготите. След електропорация, зиготите бяха прехвърлени в псевдобременни ICR женски мишки и мишките основатели бяха скринирани чрез PCR и ДНК секвениране. Бяха получени дървесни нокаут мишки (#4, #10, #23) и една от тях (#23) имаше проектирания EcoRI нокаут алел. Водещите РНК последователности са проектирани от CRISPRdirect (https://crispr.dbcls.jp). Te crRNA, tracrRNA и ssODN последователности, използвани за редактиране на генома, бяха синтезирани, както следва: 5'-cRNA, 5'-UGA UCC CAC ACA UAU GCA GGg uuu uag agc uau gcu guu uug-3', 3'-cRNA , 5′-CAGCCACCUCUGAUC UGACCguuuuagagcuaugcuguuuug-3′; tracrRNA, 5'-AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCC

GUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3′; ssODN, 5′-TAGAACTTACTGTATAGTAAT

AGCCACAAACTCCATATGCATATGTGAACTCCACCTGAATTCACCTGGCAAGAGATTCCAGACCAG

CTCTCCTCTCCTGGGCCTCCTCCACCCCCACAT-3′ . Главните и малките букви означават съответно кодиране и спомагателни последователности. Линията на мишка #23 беше кръстосана с C57BL/6 три пъти и в експериментите бяха използвани мишки от поколение N3.

Експериментите, използващи мишки, бяха одобрени от Комитета за институционална грижа и използване на животните на Центъра за изследване на динамиката на биосистемите RIKEN или Университета Васеда и бяха извършени в съответствие с протоколите, предоставени от тези комитети. Проучването е проведено в съответствие с указанията на ARRIVE: https: //arriveguidelines.org.

Генотипизиране. Генотипирането за мишки се извършва чрез PCR. За Camsap3dc/dc мишки използвахме праймери, описани в Toya et al. (2016). За Camsap3–/– мишки използвахме следните праймери за откриване на алел от див тип (WT) (P1/P2, 411 bp) или Camsap3–/– (P1/P3, 614 bp) (допълнителна фигура S2a, b) : P1, 5′- CATGTACCTACCACC ATCC-3′; P2, 5′- GGACCCTGGAGAGGCTTAG-3′; P3, 5′- GCAAGGCTGTAGTGAGCC-3′ . Te P1/P3 регион в WT не беше амплифициран при използваните PCR условия.

Хистология: Подготовка на замразени тъканни срезове. Разрязаната бъбречна тъкан се фиксира в 2 процента параформалдехид (Termo Fisher) / 0.1 М сорбитол (Nacalai Tesque) / PEM буфер за 1 час при стайна температура. Рецептата за PEM е: 100 mM PIPES (Nacalai Tesque), 5 mM EGTA (Nacalai Tesque) и 5 ​​mM MgCl2 (Wako), коригирано до рН 6,9 с 2 М KOH. След фиксация, бъбречната тъкан се промива три пъти с PEM за 10 минути. Десет, криопротекция се извършва със захароза/PEM: 15 процента захароза в PEM разтвор за 2 часа при 4 градуса, последвано от 20 процента захароза в PEM разтвор за една нощ при 4 градуса и заместване с 30 процента захароза в PEM разтвор за ~ 2 часа на 4 градуса. Бъбречната тъкан се замразява в OCT съединение във форма за вграждане (Polysciences, Inc.) в течен азот и се съхранява при -80 градуса. Замразените проби се нарязват с дебелина 5 µm с криостат CM1850 (Leica). Срезовете върху предметни стъкла се държат при -80 градуса до оцветяване.

Хистология: Приготвяне на тъканни срезове, вградени в парафин. Разчленената бъбречна тъкан се фиксира в разтвор на Super Fix (Kurabo) в продължение на 2 часа при стайна температура, след което се прехвърля на 4 градуса за една нощ. Всяка проба беше изложена на три водни разтвора на етанол с нарастваща концентрация при стайна температура: 30 процента етанол за 3{{20}} минути два пъти, 50 процента етанол за 3{ {35}} мин. и накрая 70 процента етанол за 30 мин. Всяка проба беше обработена с ASP300 тъканен процесор (Leica). Десет, пробите от бъбречна тъкан бяха поставени в парафинов восък (Sakura Finetek) с EG1160 (Leica) и съхранени при 4 градуса. Вградените в парафин проби бяха нарязани на 6 µm дебелина с RV240 ротационен микротом (Yamato Kohki). Срезовете върху предметни стъкла се държат при 4 градуса до оцветяване. Имунофлуоресцентно оцветяване. Замразени бъбречни срезове бяха потопени в 0,1 процента Triton X-100 (Nacalai Tesque) / PEM за 10 минути при стайна температура. Десет, пробите се пермеабилизират чрез прилагане на 0,2 процента Triton X-100 / PEM за 10 минути при стайна температура. Още веднъж, пробите бяха потопени в 0,1 процента Triton X-100 / PEM за 10 минути при стайна температура. След това пробите бяха блокирани с 3 процента говежди серумен албумин (BSA; Roche) / 0,1 процента Triton X-100 / PEM за 30 минути при стайна температура, последвано от реакция на първично антитяло за една нощ при 4 градуса. Първичните антитела бяха разредени в 3 процента BSA / 0,1 процента Triton X -100 / PEM. За първични антитела, отглеждани в мишки, беше проведено допълнително блокиране с MOM блокиращ реагент (Vector Laboratories) преди блокиране в 3 процента BSA / 0,1 процента Triton X-100 / PEM. Блокиращият реагент MOM се разрежда в 0,1 процента Triton X-100 / PEM и се прилага върху пробите за 30 минути при стайна температура. След третиране с MOM, пробите се промиват с 0,1 процента Triton X-100 / PEM три пъти за 5, 10 и 15 минути при стайна температура. След реакцията на първичното антитяло, пробите се промиват в продължение на 15 минути при стайна температура с 0,1 процента Triton X-100 / PEM три пъти. Реакцията на вторично антитяло се провежда в продължение на 2 часа при стайна температура на тъмно. Вторичните антитела бяха разредени в 3 процента BSA / 0,1 процента Triton X -100 / PEM. След реакцията пробите бяха промити с 0,1 процента Triton X-100 / PEM три пъти за 5, 10 и 15 минути при стайна температура и запечатани с VECTASHIELD Монтажна среда (Vector Laboratories). Антитела и реагенти. ДНК се оцветява с DAPI разтвор (Dojindo, D523, 1:1000). F-актинът се оцветява с Alexa Fluor 594 фалоидин (Termo Fisher, A12381, 1:400). Микротубулите се оцветяват с миши анти- -тубулин-FITC (DM1A; Sigma Aldrich, F2168, 1:200). Използвани са следните първични антитела: кози анти-мегалин (P-20; Santa Cruz Biotechnology, sc-16478, 1:200), заешки анти-NaCl ко-транспортер (MERCK, AB3533, 1:500 ), заешки анти-аквапорин-2 (abcam, AB3274, 1:400), кози анти-SGLT1 (M-19; Santa Cruz Biotechnology, sc-20582, 1:200) , заешки анти-SGLT2 (Novus Biologicals, NBP1-92384, 1:200), миши анти-езрин (3C12; abcam, ab4069, 1:500), заешки анти-гиантин (Covance, PRB-114 C, 1:700), заешки анти-aPKC (Santa Cruz Biotechnology, sc-216, 1:400), кози анти-DPP IV (R&D Systems, AF954, 1:100), миши анти-Na плюс /K плюс -ATPase (abcam, ab7671, 1:100), миши анти-ацетилиран тубулин (Sigma Aldrich, T6793, 1:200), заешки анти-CAMSAP3 (Tanaka et al., 2012, 1:400), миши анти-тирозиниран тубулин (Sigma Aldrich, T9028, 1:200), заешки анти-Ki-67 (SP6; abcam, ab16667, 1:250), заешки анти-YAP (клетъчно сигнализиране, #4912, 1:100) ), заешка анти-миозинова лека верига 2 (Cell Signaling, #8505, 1:100), заешка анти-пиезо1 (Novus Biologicals, N BP1-78446, 1:100), плъши анти-Е-кадхерин (52, 1:400) и заешки анти-мерлин (Sigma Aldrich, HPA003097, 1:100). Използвани са следните вторични антитела: магарешки Dylight 594–конюгирани анти-кози IgG (Jackson, 1:500), кози Alexa Fluor 488/594–конюгирани анти-заешки IgG (Termo Fisher, A-11034, A -11037, 1:500), кози Alexa Fluor 488/594–конюгиран анти-миши IgG (Termo Fisher, A-11029, A-11032, 1:500) и кози Alexa Fluor 488–конюгирани анти-плъши IgG (Termo Fisher, A-11006,

1:400). Специфичността на свързване на анти-YAP (клетъчно сигнализиране, #4912) и анти-PIEZO1 (Novus Biologicals, NBP1-78446) антитела, използвани в изследването, бяха потвърдени от предишна работа46,53. Оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E). Стъклени предметни стъкла с бъбречни срезове се поставят върху плоча от 55 градуса за 30 минути, за да се разтегне парафинът. След това пробите се потапят в ксилол за 15 минути два пъти, последвано от потапяне в серия от 70-100 процента етанол: 100 процента етанол за 5 минути два пъти, 90 процента етанол за 5 минути, 80 процента етанол за 5 минути и 70 процента етанол за 5 минути. След изплакване във вода за 20 минути и в дестилирана/дейонизирана H2O (ddH2O) за 1 минута, пробите се оцветяват в разтвор на хематоксилин на Mayer (Wako) за 5 минути. Пробите се потапят в ddH2O два пъти, след което се изплакват с ddH2O за 10 минути. Пробите отново се потапят в ddH2O и след това се оцветяват в разтвор на еозин (Merck) за 2 минути. За промиване пробите бяха потопени в ddH2O за 30 s, последвано от потапяне в серии от 70-100 процента етанол и ксилен: 70 процента етанол за 5 s, 80 процента етанол за 5 s, 90 процента етанол за 5 s, 100 процента етанол за 5 s два пъти и ксилен за 10 min. Накрая, пробите бяха запечатани в глицерол. Микроскопия. Изображенията са получени с флуоресцентен микроскоп BZ-X710 All-in-one (Keyence) или лазерно сканиращ конфокален микроскоп LSM880 (Zeiss). За BZ-X710 използваните обективи са Nikon CFI Plan Apo λ 2 ×, 10 ×, 40 ×, 100 × и Nikon CFI Plan Fluor 4 ×. Получените изображения бяха обработени със софтуер BZ-X Analyzer. Te LSM880 беше оборудван с обърнат микроскоп Axio Observer Z1 с маслен имерсионен обектив Plan-Apochromat 63 × /1,40 NA (Zeiss). Изображенията бяха обработени и анализирани с помощта на ImageJ и Adobe Photoshop CC2019. Анализ на кистозния индекс. Кистозният индекс се анализира от ImageJ, като се използват H&E-оцветени изображения на хоризонталната част на бъбрека. Като измерване на зоната, съдържаща киста, периметърът на разширения тубуларен лумен беше проследен с помощта на функцията "Freehand selections" и неговата площ беше измерена с функцията "Measure". Тази работа беше извършена за всички кисти в бъбречната секция и площите на всички кисти бяха добавени заедно, за да се определи зоната, съдържаща киста. Общата бъбречна площ се измерва по същия начин. Външната обиколка на бъбрека беше проследена с помощта на функцията "Свободни селекции" и нейната площ беше оценена. Накрая изчислихме кистозния индекс, като разделихме площта, съдържаща киста, на общата площ на бъбреците.

Дефиниция на разширени тубули и неразширени тубули. В това изследване тубулите с площ на лумена по-голяма или равна на 500 µm2 са дефинирани като "разширени", докато тези с площ на лумена от<500 µm2="" have="" been="" defned="" as"non-dilated".="" when="" selecting="" a="" "dilated"="" tubule="" in="" camsap3dc/dc="" samples,="" we="" frst="" visually="" picked="" up="" a="" cyst="" that="" was="" not="" recognized="" in="" wt="" samples="" and="" then="" roughly="" measured="" its="" lumen="" area="" using="" imagej.="" if="" the="" value="" was="" ≧500="" µm2,="" it="" was="" regarded="" as="">

Електронна микроскопия. За електронна микроскопия бяха изследвани мъжки мишки P21. Пробите за сканираща електронна микроскопия бяха приготвени съгласно Takahashi-Iwanaga54 с определени модификации, както следва. Мишките бяха анестезирани с изофуран и перфузирани с 2 процента (w/vol) формалдехид и 2,5 процента (w/vol) глутаралдехид в 0.1 М какодилатен буфер, pH 7,4. Всеки бъбрек беше изрязан и нарязан на кубчета, които бяха потопени в същия фксатив за една нощ и след това изплакнати с 0.1 М какодилатен буфер. Фиксираните проби се прехвърлят през 30 процента воден разтвор на диметилсулфоксид в 60 процента диметилсулфоксид и след това се разбиват в течен N2. Разбитите проби се изплакват с 0.1 М какодилатен буфер и се поставят в 6 N NaOH за 1{{30}}–20 минути при 60 градуса. След мацерация в разтвора на NaOH, всяка проба се изплаква с 0,1 М какодилатен буфер, съдържащ 0,05 процента Tween 20 и се фиксира с 1 процент OsO4 в 0,1 М какодилатен буфер върху лед за 2 часа. Постфиксираните проби бяха: (1) изплакнати с ddH2O и поставени в 1% воден разтвор на тиокарбохидразид за 20 минути при стайна температура и (2) изплакнати с ddH2O и постфлексирани отново в 1% OsO4 в 0,1 М какодилатен буфер за 1 час при стайна температура . След повтаряне на стъпки (1) и (2), пробите бяха изплакнати с ddH2O и оцветени с 0,5 процента разтвор на уранил ацетат за една нощ при стайна температура. Тъканните блокове се изплакват с ddH2O и се дехидратират през градуирани серии от етанол, прехвърлят се в изопентил ацетат и се сушат до критична точка с помощта на течен СО2. Изсушените образци бяха покрити чрез изпаряване с осмий и изследвани с JSM-5600LV сканиращ електронен микроскоп при ускоряващо напрежение от 10 kV. Изображенията са обработени с Adobe Photoshop.

За трансмисионна електронна микроскопия, кубчета от разрязани бъбреци се фиксират за най-малко 2 часа в 2 процента (тегл./об.) формалдехид и 2,5 процента (об./об.) глутаралдехид в 0.1 М какодилатен буфер при стайна температура. Пробите се промиват с 0.1 М какодилатен буфер и се фиксират с 1 процент OsO4 в {{10}}.1 М какодилатен буфер върху лед за 2 часа. След това пробите се промиват с ddH2O и се оцветяват за една нощ с 0,5 процента воден разтвор на уранил ацетат при стайна температура. Оцветените проби се дехидратират със степенувана серия от етанол, прехвърлят се в пропилей оксид и се поставят в Polybed 812 (Polysciences). Ултратънките срезове бяха изрязани с диамантен нож, двойно оцветени с уранил ацетат и оловен цитрат и наблюдавани при 100 kV ускоряващо напрежение с помощта на трансмисионен електронен микроскоп (JEM-1010; JEOL), оборудван с камера със зарядно свързано устройство ( BioScan модел 792; Gatan). Изображенията са обработени с Adobe Photoshop.

Изследване на урина и кръвен тест. За сравнение с Camsap3dc/dc мишки, WT (плюс / плюс) и хетерозиготни (плюс /dc) мишки бяха използвани като контроли в тези анализи. Хетерозиготни мишки не показват признаци на Camsap3дисфункция10и имат организирани апико-базални масиви от микротубули. Мишките са на възраст 56-60 седмици.

Мишките бяха настанени в метаболитна клетка (TECNIPLAST). Проби от урина се събират всеки ден в продължение на пет последователни дни и събраните проби се съхраняват при -80 градуса. Накрая, всичките пет проби за всяка мишка бяха смесени, така че крайната смес да отразява средното състояние на всяка мишка през този период.

За вземане на кръв мишките са приложили {{0}}.02 ml анестезия на грам телесно тегло. Съставът на анестезията беше Domitor (ZENOAQ) 30 µL, Midazolam (Sandoz) 80 µL, Vetorphale (Meiji Seika Pharma) 100 µL и 0,9 процента воден NaCl до 1 mL. Кръвта е взета чрез сърдечна пункция. За да се избегне хемолиза, спринцовката беше внимателно поставена и изтеглена. Всяка кръвна проба се държи при стайна температура в продължение на 1 час за коагулация. След това всяка проба се центрофугира (10,000×g, 25 градуса, 15 минути) и серумът се събира и съхранява при -80 градуса. Всички проби от урина и кръв бяха анализирани от Oriental Yeast Co.