Данегаптид предотвратява 1-предизвиканото от TGF увреждане в епителните клетки на човешкия проксимален тубул на бъбрека

edmund.chen@wecistanche.com

Резюме:Хроничназаболяване на бъбреците(CKD) е глобален здравен проблем, свързан с редица съпътстващи заболявания. Последните доказателства предполагат повишено медиирано от хемиканалите освобождаване на аденозин трифосфат (АТФ) при прогресирането на тубулоинтерстициалната фиброза, основната основна патология на ХБН. Тук ние оценяваме ефекта на данегаптид върху блокирането на медиирани от хемиканалите промени в експресията и функцията на протеини, свързани с прогресията на заболяването в тубуларния епителбъбрекклетки. Първичните човешки проксимални тубулни епителни клетки (hPTECs) бяха третирани с бета1 изоформата на профиброзния цитокин трансформиращ растежен фактор (TGF 1) ± данегаптид. qRT-PCR и имуноблотинг потвърждават експресията на иРНК и протеин, докато масив от цитокинови антитела оценява експресията/секрецията на провъзпалителни и профибротични цитокини. Поглъщането на багрилото на карбоксиффлуоресцеин и биосензирането на АТФ измерват хемиканалната активност и освобождаването на АТФ, докато трансепителното електрическо съпротивление се използва за оценка на парацелуларната пропускливост. Данегаптид отрича усвояването на карбоксифлуоресцеиновото багрило и освобождаването на АТФ и предпазва от протеинови промени, свързани с тубулно увреждане. Блокирането на Cx43-медиирано освобождаване на АТФ беше успоредно с частично възстановяване на експресията на инхибитори на клетъчния цикъл, адхеренти и плътно свързващи протеини и намалена парацелуларна пропускливост. Освен това, данегаптид инхибира TGF 1-предизвиканите промени в експресията и секрецията на ключови адипокини, цитокини, хемокини, растежни фактори и интерлевкини. Данните предполагат, че като модулатор на празно съединение и блокер на хемиканалите, данегаптид има потенциал в бъдещото лечение на ХБН.

Ключови думи:данегаптид; конексин; хемиканал; АТФ; хронично бъбречно заболяване; възпаление; фиброза; hPTECs; TGF 1; бъбрек, бъбрек

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНО/БЪБРЕЧНО ЗАБОЛЯВАНЕ

Въведение

Хроничназаболяване на бъбреците(CKD) е нарастваща загриженост за здравето, свързана с повишен риск от сърдечно-съдови заболявания и заболеваемост [1]. Смята се, че засяга 10 процента от световното население [2], рисковите фактори включват възраст, диабет, хипертония, дислипидемия и затлъстяване [3]. Заболяването се характеризира с намаляване на скоростта на гломерулна филтрация (GFR), в допълнение към протеинурия, с гломерулосклероза, тубулна атрофия и тубулоинтерстициална фиброза (TIF), които са чести хистопатологични промени [4]. Кулминирайки със загуба на епителна стабилност, персистиращо възпаление и повишено отлагане на извънклетъчния матрикс [5,6], лечението на TIF и напреднала ХБН представлява незадоволена клинична нужда [3]. Следователно са необходими спешни терапевтични подходи. Променената експресия и функция на конексин (Cx) са замесени в патологията на различни форми на заболяването (както е прегледано в [7]), включително ХБН (както е прегледано в [8,9]). Коннексините са семейство от мембранно свързани протеини, които олигомеризират в хексамерни групи, наречени конексони [10]. Когато съседните клетки се подредят, коннексоните се скачват, за да образуват празнини, непрекъснати пори, през които молекулите на пратениците могат да се обменят, което позволява директен път на комуникация [10]. Когато не са свързани, коннексоните образуват хемиканали, през които молекули, например аденозин трифосфат (АТФ), могат да бъдат освободени в локалното извънклетъчно пространство, за да повлияят на съседните клетки чрез активиране на пуринорецептори [11]. Експресията на пуринергичния P2X7 рецептор (P2X7R) се регулира нагоре вбъбречнатубули на хора с диабетзаболяване на бъбреците[12] и е силно замесен в прогресирането на фиброзата както вбъбрек[13–17] и в други видове тъкани [18–21]. Не е изненадващо, че насочването към пуринергичното сигнализиране е получило значително внимание. Към днешна дата обаче клиничните изпитвания не са успели да демонстрират благоприятни ефекти на антагонизма на P2X7R при множество възпалителни състояния, ефект, вероятно свързан с генетична вариация в рамките на рецептора [22]. Насочването нагоре по веригата на освобождаването на ATP би заобиколило тези проблеми.

Доказателствата свързват аберантната експресия и/или активността на коннексините с различни форми на ХБН [12,23-26]. Първоначалните проучвания на Abed et al. съобщават, че хетерогенни (Cx43 плюс /-) мишки с едностранна обструкция на уретера (UUO) показват намалено отлагане на екстрацелуларен матрикс (ECM) и намалено възпаление [27], докато Cx43-специфичният миметик, GAP{{6} }, успя да инхибира моноцитната адхезия и да притъпи експресията на колаген I в ренин трансгенен (RenTG) миши модел на ренин-зависима ХБН [25]. Съвсем наскоро установихме, че преобладаващата изоформа на коннексин, експресирана в проксималния тубул, Cx43, е повишена в биопсичен материал, изолиран от индивиди с диабетна нефропатия, наблюдение, успоредно с повишено медиирано от хемиканалите освобождаване на АТФ в TGFp1-третирани първично клетки на проксималните тубули [12]. При оценката на въздействието на локалните увеличения на екстрацелуларните концентрации на АТФ, ние установихме, че аберантната Cx43-медиирана комуникация инициира разглобяване на адхеренти (напр. Е-кадхерин) и стегнати (напр. Zona Occludens) съединителни комплекси чрез активиране на P2X7R. Тези ефекти, които бяха отхвърлени в хетерогенен Cx43 плюс /- миши модел на UUO [12], предполагат ясна връзка между Cx43 и тубулно увреждане. Докато частичната аблация на Cx43 потвърждава ролята на коннексините в инициирането на фенотипни промени на тубулно увреждане, фармакологичната интервенция с Cx43 хемиканален блокерен пептид5 установява, че защитната природа на тази намалена Cx43 активност произтича от инхибирането на хемиканално-медиираното освобождаване на АТФ. Използването на миметични пептиди за подчертаване на защитната природа зад блокиране на хемиканалната активност е успешно докладвано при други модели на заболяване, включително ретинопатия [28], невровъзпаление [29], глиома [30,31] и свързана с възрастта макулна дегенерация [32, 33]. В крайна сметка проучванията свързват променената активност на коннексина с повишено възпаление [34-36] и фиброза [37-40] и предполагат, че стабилизирането на комуникацията, медиирана от хемиканала и/или междинната връзка (GJIC), може да забави началото на увреждането наблюдавани при различни модели на нараняване. Следователно, инхибирането на коннексиновите хемиканали осигурява привлекателно средство за намаляване на възпалението и е от значителен терапевтичен интерес.

Данегаптид ((2S, 4R)-1-(2-аминоацил)-4-бензамидопиролидин2-карбоксилна киселина), известен също като ZP1609 или GAP-134, е малък дипептид, получен от ротигаптид (AAP10, ZP123). Първоначално разработен като антиаритмично средство [41], той взаимодейства с Cx43 [42] и действа като мощен модификатор на празнините [43]. Съединението демонстрира защитни и антиаритмични свойства и преди това е показало значителни ефекти в установени предклинични модели на сърдечни исхемични реперфузионни увреждания [44,45]. Докато фаза 2 клинични изпитвания при хора, за съжаление, не успяха да постигнат крайната си точка [46], проучвания от други групи са изследвали терапевтичния потенциал на данегаптид при други видове тъкани и модели на заболяване [41,47–49]. Освен това, докато се знае малко за ролята му в модулирането на активността на хемиканалите, беше доказано, че данегаптид намалява медиираното от хемиканалите усвояване на багрилото в C6 глиомни клетки [43]. Въпреки това, ролята на това съединение за блокиране на медиираното от хемиканалите освобождаване на АТФ в други видове тъкан остава да бъде потвърдена.

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА НЕДОСТАТЪЧНОСТ

Настоящото проучване изследва ефикасността на данегаптид при отричане на медиираното от коннексин освобождаване на хемиканален АТФ в първично третирани с TGF 1-епителни клетки на човешки проксимални тубули (hPTECs), преди да се очертае неговата защитна роля срещу експресията и функционалните промени, обикновено свързани с прогресията на тубулоинтерстициална фиброза. Използвайки техники за определяне на промени в експресията (qRT-PCR, имуноцитохимия, имуноблотинг, масиви от антитела) и функция (биосензиране на ATP, поглъщане на багрило, трансепително електрическо съпротивление, масиви от антитела), нашите открития показват, че наномоларните концентрации на данегаптид блокират Cx хемиканално-медиирания ATP освобождават и частично атенюират TGF 1-предизвиканите промени в експресията на протеини от клетъчния цикъл (напр. p16, p21, циклин D1) и рено-защитни фактори (напр. Klotho). Нещо повече, данегаптид намалява промените, често наблюдавани при тубулно увреждане, включително разглобяване на прилепналите връзки (включително загуба на Е-кадхерин) и стегнати връзки (включително загуба на zona occludens 1 (ZO-1) и claudin 2). Важно е, че масивът от профилиращи протеоми демонстрира способността на данегаптид да възстановява промените в експресията и секрецията на ключови извънклетъчни матрични протеини, адипокини, хемокини и растежни фактори, индуцирани от TGF 1. Следователно, нашите in vitro данни показват, че данегаптид (50–100 nM ) могат успешно да блокират хемиканално медиирано освобождаване на АТФ в първичните hPTECs и частично да предпазват от промени, свързани с възпаление и фиброза, както се наблюдава в късен стадий на ХБН.

2. Резултати

2.1. Данегаптид не повлиява жизнеспособността на тубулните епителни клеткиЧовекбъбрек2 (HK2) клетки се култивират в ниска глюкоза (5 mM) в продължение на 48 часа, преди да бъдат лишени от серум за една нощ и впоследствие да бъдат третирани с оптималната концентрация на TGF 1 (10 ng/mL) [12,24] ± данегаптид (50 nM–1 µM) за 48 часа (Фигура 1A, n=3). Анализ на 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиев бромид (МТТ) потвърди, че нито TGF 1 (101,9 ± 11,7 процента) нито данегаптид самостоятелно не променя клетъчната жизнеспособност (95,2 ± 7 процента (50 nM), 103 ± 5,7 процента (100 nM) и 96,6 ± 5,3 процента (1 µM)) в сравнение с контролите. Не се наблюдава ефект, когато третирани с TGF 1- клетки се инкубират съвместно с данегаптид (104,1 ± 2,2 процента (50 пМ), 93,4 ± 1,6 процента (100 пМ) и 89,3 ± 3,7 процента (1 цМ)). За да се потвърдят тези данни, беше извършен анализ на кристално виолетово (CV) и лактат дехидрогеназа (LDH). Освобождаването на LDH в третираните с TGF 1- клетки е сравнимо с контролите (109,3 ± 11,3 процента), а съвместната инкубация с данегаптид няма допълнителен ефект (106,4 ± 11,6 процента (50 nM), 113,9 ± 15,6 процента (100 nM) и 113,2 ± 4,3 процента (1 цМ)). Както се очакваше, данегаптид сам по себе си не променя значително освобождаването на LDH в сравнение с контролите (104,4 ± 4,3 процента (50 nM), 95,3 ± 4,7 процента (100 nM) и 92,6 ± 3,3 процента (1 µM)). Клетъчното оцветяване с помощта на кристално виолетово обобщава тези констатации, като данните за TGF 1 (10 ng/mL; 96,9 ± 7,3 процента) и TGF 1 плюс данегаптид (50 nM–1 µM) са сравними с контролите (98,2 ± 1,9 процента (50 nM) , 97,5 ± 1,8 процента (100 nM) и 85,8 ± 5,3 процента (1 µM) И накрая, данегаптид сам по себе си не променя кристално виолетово оцветяване (98,3 ± 2,5 процента (50 nM), 99,6 ± 2,7 процента (100 nM) и 98,5 ± ± 2,2 процента (1 µM) от контролите.) В светлината на тези данни, концентрация от 50–100 nM беше избрана за последващи изследвания.

Фигура 1. Данегаптид предотвратява 1-предизвиканите от TGF увеличения на хемиканално-медиираното усвояване на багрилото. В панел (A), човекбъбрек2 (HK2) клетки се култивират в ниска глюкоза (5 mM) ± TGF 1 (10 ng/mL) ± данегаптид (50, 100 и 1000 nM) в продължение на 48 часа и клетъчната жизнеспособност е оценени. Резултатите са представени като средна стойност ± SEM (n=3). Инкубирането с TGF 1 (10 ng/mL ± данегаптид (50–1000 nM)) не променя 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,{{ 19}}поемане на дифенилтетразолиев бромид (MTT), освобождаване на лактат дехидрогеназа (LDH) или оцветяване с кристално виолетово (CV). В панели (B) и (C), поглъщането на карбоксифлуоресцеиново багрило се използва за оценка на хемиканалната активност в HK2 клетки и човешки проксимални тубулни епителни клетки (hPTECs), като степента на натоварване на багрилото е право пропорционална на отварянето. Клетките се култивират в ниска глюкоза (5 mM) ± TGF 1 (10 ng/mL) ± данегаптид (50 или 100 nM) за 48 часа. Данегаптид предотвратява TGF 1-предизвиква повишения в поглъщането на карбоксифлуоресцеинова боя в HK2 клетки (панел (B)) и hPTECs (панел (C)). Наблюдава се минимално натоварване с багрило в контролните клетки, докато натоварването с багрило се увеличава значително в клетките, третирани с TGF 1. Добавянето на данегаптид (50 или 100 nM) намалява усвояването на багрилото, връщайки интензитета на флуоресценцията на FL до контролните нива. Интензитетът се изразява като процент в сравнение с контролите с ниска глюкоза и е представителен за 3 отделни експеримента. Данните са представени като средна стойност ± SEM (n=3), с посочена ключова значимост (** p <0,01, ***="" p=""><0,001; еднопосочен="" anova="" и="" пост-тест="" на="">

2.2. Данегаптид блокира TGF 1-предизвикани промени в хемиканално-медиираното усвояване на багрилото в тубулните епителни клеткиПо-рано показахме, че TGF 1 повишава Cx43-медиираната хемиканална активност и освобождаването на АТФ от епителните клетки на проксималните тубули [24]. Използван е анализ на поглъщането на багрилото карбоксиффлуоресцеин, за да се определи дали данегаптид може да отхвърли TGF 1-индуцираното поемане на багрило през хемиканали в HK2 клетки и първични hPTECs. Както се очаква, TGF 1 (10 ng/mL) повишава усвояването на багрилото до 354,9 ± 32,6 процента от контролите в HK2 клетки, докато ко-инкубацията с данегаптид (50 nM и 100 nM) значително намалява отговорът съответно до 165,5 ± 17,9 процента и 147,6 ± 18,1 процента (Фигура 1B; p По-малко или равно на 0,001, n=4). Данегаптид сам по себе си не променя усвояването на боята. Поглъщането на карбоксифлуоресцеиновото багрило се увеличава от TGF 1 (10 ng/mL) в първичните hPTEC (310,8 ± 38,6 процента от контролите), отговор, частично отхвърлен от съвместната инкубация на данегаптид (100 nM; 145 ± 19,7 процента) в сравнение с контролите (Фигура 1C; p По-малко или равно на 0,01, n=4).

2.3. Данегаптид отрича TGF 1-индуцирано хемиканално-медиирано освобождаване на АТФ в HK2 клеткиЗа да се определи дали данегаптид (5{{10}}–100 nM) може да предотврати индуцираното от TGF 1 (10 ng/mL) освобождаване на АТФ от хемиканали в HK2 клетки, използвахме ATP биосензиране [24,50]. TGF 1 (10 ng/mL) повишава освобождаването на АТФ от 0.33 ± 0.11 µM до 3.60 ± {{40} }.29 µM (Фигура 2A, B, E; p По-малко или равно на 0.001), ефект, частично отхвърлен от данегаптид и при двете 50 nM (1,90 ± 0,26 µM; p По-малко или равно на 0,01 ) и 100 nM (0,79 ± 0,19 µM; p По-малко или равно на 0,001) (Фигура 2D,E, n=3, шест повторения/номер на пробата). Данегаптид самостоятелно не повлиява освобождаването на АТФ (Фигура 2C,E), като нивата на АТФ са записани при 0,35 ± 0,10 µM (50 nM) и 0,31 ± 0,09 µM (100 nM) в сравнение с контролите (Фигура 2E).

2.4. Данегаптид обръща TGF 1-индуцирани промени в протеините на клетъчния цикъл и маркер за Reno-протекция в hPTECsЗа да се определи дали данегаптид може да отхвърли медиираната от хемиканалите регулация на общия клетъчен цикъл и рено-защитните маркери, hPTECs се инкубират с TGF 1 (10 ng/mL) ± данегаптид (100 nM) за 12 часа и експресията на иРНК на кандидат ген, оценена чрез qPCR анализ. Добавянето на данегаптид към третираните с TGF 1-hPTECs върна експресията на p16 от 358,8 ± 21,1 процента до 193 ± 18,5 процента от контролите, експресията на p21 от 221,8 ± 12,9 процента до 142,2 ± 6,2 процента и експресията на циклин D1 от 253,2 ± 7,7 процента до 132,9 ± 15,0 процента (Фигура 3; p По-малко или равно на 0,001, n=3). В допълнение, данегаптид частично обърна спада на Klotho от 43,3 ± 3,8 процента до 59,9 ± 11,7 процента от контролите (Фигура 3, n=3).

2.5. Данегаптид възстановява TGF 1-медиирани промени в прилепналите и плътно свързващите протеини и парацелуларната пропускливост в hPTECsВбъбрекнамалената клетъчна адхезия, медиирана от Е-кадхерин (ECAD), инициира серия от събития, които кулминират в периодичен фенотип, свързан с частична епителна към мезенхимна трансформация. Започването улеснява разглобяването както на прилепналите, така и на комплексите с плътно свързване, кулминирайки със загуба на адхезия, намалена междуклетъчна комуникация на празно съединение и пропусклив епител [12,24,51]. За да се определи дали данегаптид може да отхвърли медиираните от TGF 1- промени в протеините на прилепване и плътно свързване, hPTECs се инкубират с TGF 1 (10 ng/mL) ± данегаптид (10{{41 }} nM) за 48 часа и се оценява експресията на кандидат протеини. Данегаптид възстановява частично експресията на Е-кадхерин от 33,3 ± 3,3 процента до 89 ± 7,6 процента от контролите, експресията на N-кадхерин (NCAD) от 224,4 ± 29,6 до 161,9 ± 27,4 процента и експресията на виментин от 212,9 ± 13 процента до 147,3 ± 8,8 процента ( Фигура 4A; p По-малко или равно на 0.001, p По-малко или равно на 0,01 и p По-малко или равно на 0,001, съответно; n {{43} }). -експресията на катенин остава непроменена от блокера на хемиканала от 149,2 ± 11,2 процента (само TGF 1) до 151,6 ± 16,8 процента (TGF 1 плюс данегаптид, Фигура 4B; p=NS, n=3). Оценката на ефектите на данегаптид върху протеини с плътна връзка потвърди, че модулаторът на празнината на връзката частично възстановява експресията на клаудин-2 от 44,5 ± 5 процента до 74,6 ± 5 процента от контролите и ZO-1 от 27,8 ± 11,3 процента до 52,8 ± 5,4 процента в сравнение с контролите (Фигура 4B; p По-малко или равно на 0,05, n=3). Проучванията, изследващи трансепителното електрическо съпротивление, потвърдиха, че намалената експресия на протеини с плътна връзка, наблюдавана с TGF 1 (10 ng/mL), е успоредна със загуба на трансепително съпротивление от 57,33 ± 1.86 Ω·cm2 до 10 ± 1,53 Ω· cm2 (p По-малко или равно на 0,001, n=3). Тази повишена пропускливост беше частично коригирана чрез съвместна инкубация с данегаптид (36 ± 2,08 Ω·cm2) (Фигура 4C; p По-малко или равно на 0,001, n=3).

2.6. Данегаптид предотвратява TGF 1-предизвиканата регулация на извънклетъчната матрица в hPTECsпричинено от дисбаланс между образуване и разграждане, натрупването на ЕСМ е основен отличителен белег на ХБН. Ролята на TGF 1 в този процес е добре установена [52] и разбирането как да се отхвърлят тези промени има ясни последици за прогресията на заболяването. За да се изследва ефектът на данегаптид върху TGF 1-предизвикани промени в експресията на ECM протеини, hPTECs се култивират в ниска глюкоза (5 mM) в продължение на 48 часа, гладуват се през нощта и се третират с TGF 1 (1{{ 28}} ng/mL) ± данегаптид (100 nM) за 48 часа. В сравнение с контролите, TGF 1 повишава експресията на ECM протеините колаген I (334,6 ± 30,14 процента), колаген IV (354,5 ± 16,9 процента), фибронектин (301,7 ± 50,4 процента) и ламинин (324,8 ± 36,4 процента) (Фигура 5А, B; p По-малко или равно на 0,001, n=3). Съвместната инкубация с данегаптид значително отслабва тези промени, възстановявайки експресията до 180,7 ± 27,3 процента (колаген I), 164 ± 6,9 процента (колаген IV), 161,3 ± 4 процента (фибронектин) и 149 ± 20,4 процента (ламинин) (p По-малко по-голямо или равно на 0,001; n=3 във всеки случай). Данегаптид (100 nM) също редуцира предизвиканите от TGF 1 (10 ng/mL) промени в интегрин-свързаната киназа 1 (ILK1) от 378,9 ± 16,8 процента до 251,8 ± 33 процента (р По-малко или равно на 0,001), но имаше минимален ефект върху матрична металопротеиназа 3 (MMP3), намалявайки експресията от 185,3 ± 19,6 процента само с цитокина до 147,1 ± 12,2 процента при съвместно инкубиране с данегаптид (Фигура 5B)

2.7. Данегаптид намалява TGF 1-предизвикани промени в експресията на адипокини, хемокини, растежни фактори и интерлевкини от hPTECs

Възпалителният отговор в и около проксималните тубули включва както активирането на множество типове клетки, така и секрецията на множество възпалителни маркери. По-конкретно, разтворимите хемокини, цитокини и растежни фактори набират и активират инфилтриращите имунни клетки и стимулират резидентните фибробласти. Продължителното активиране на тези клетки медиира тубулоинтерстициалната фиброза. Използвахме масива за профилиране на протеоми, за да определим дали данегаптид отрича 1-предизвиканите от TGF промени в експресията и секрецията на ключови проин-възпалителни медиатори. Първичните хотели се култивират, както е описано по-горе, и се третират с TGF 1 (10 ng/mL) ± данегаптид (100 nM) в продължение на 48 часа. Предоставен е списък с промени в лизата (Фигура 6) и супернатантата (Фигура 7) за 31 кандидат протеини, групирани по първична функция.

3. Дискусия

През 2017 г. глобалната честота на ХБН е била 697,5 милиона случая, като състоянието е идентифицирано като 12-та водеща причина за смърт в световен мащаб [53]. Към днешна дата няма лечебни терапевтични възможности за краен стадийбъбречно заболяване(ESRD). Освен това, с ниски нива на оцеляване на диализа и глобален недостиг набъбрекдонори, съществува належаща необходимост от разработване на терапии, които биха могли да предотвратят прогресията на ХБН и да подобрят качеството на живот на пациентите. При ХБН тежестта на възпалението в проксималния тубул определя колко бързо aбъбрекще се провали. Допринесено от активирането на множество клетъчни типове, изглежда, че отчасти включва конексин-медиирана комуникация от клетка към клетка [9]. Коннексините улесняват директната и локална паракринно-медиирана клетъчна комуникация чрез тяхната способност да олигомеризират в хексамерни коннексони. Когато съседните клетки се подравнят, коннексоните се скачват, за да образуват празнини [10]. Тези непрекъснати канали осигуряват директен маршрут за трансфер на информация, позволявайки на клетките да се заключват в определена честота и да синхронизират дейността. За разлика от междинните връзки, които обикновено се отварят при физиологични условия, несвързаните коннексони, наричани също хемиканали, имат ниска вероятност за отваряне и се отварят в отговор на нараняване [10]. Променената хемиканална активност е свързана с патофизиологията на множество болестни състояния, с доказателства, свързващи променената комуникация между клетката с повишено стареене [54], възпаление [34,55,56] и фиброза [18–21]. Данните от нашата собствена лаборатория показват, че преобладаващата изоформа на коннексин в проксималния тубул (Cx43) се регулира нагоре при напреднала ХБН и корелира с повишени нива на TGF 1 и тежестта на фиброзата и възпалението [24]. Освен това, тази променена експресия се превръща в загуба на междуклетъчна комуникация на празно съединение, което е придружено от повишено медиирано от хемиканалите освобождаване на АТФ и промени, показателни за ранно тубулно увреждане. Следователно, блокирането на Cx43-медиираното освобождаване на хемиканален АТФ може да представлява жизнеспособна цел за лечение на увреждане в късен стадий, което се развива при индивиди с ХБН.

Данегаптид е малък терапевтичен пептид, който доскоро е бил използван в способността си да възстановява свързването на празнините при множество модели на нараняване, включително исхемия [43,44] и ретинопатия [49]. Показано е, че данегаптид блокира хемиканалната активност и усвояването на багрилото в C6 глиомни клетки [43]; Въпреки това, ролята на съединението в блокирането на медиираното от хемиканалите освобождаване на АТФ остава да бъде потвърдена и все още няма проучвания, оценяващи ефектите на данегаптид върху увреденитебъбректубули. В настоящото проучване ние представихме убедителни доказателства, че данегаптид блокира 1-индуцираното от TGF хемиканално медиирано освобождаване на АТФ в първичните човешки епителни клетки на проксималните тубули. Освен това съединението възстановява TGF 1-предизвиква промени в експресията и секрецията на протеини, свързани с възпаление и фиброза. При ХБН тубулоинтерстициалната фиброза се развива в отговор на различни морфологични и фенотипни промени, включително преход от епител към мезенхим (EMT), възпалителна клетъчна инфилтрация, активиране на фибробласти и ремоделиране на извънклетъчния матрикс (ECM) [57]. Последните данни сочат, че клетъчното стареене може да играе ключова роля в прогресирането на хроничниязаболяване на бъбреците[58], със стареене, свързано с ЕМТ, провъзпалителен секретом и отлагане на екстрацелуларен матрикс [59–62]. Стареенето означава необратимо спиране на пролиферативния растеж със свързани промени в организацията на хроматина, генната транскрипция и протеиновата секреция [63,64]. Следователно, известно е, че стареещите клетки проявяват повишена експресия на инхибитори на циклин-зависима киназа (CDK) (CKIs), включително p21Cip1 (p21) и p16Ink4a (p16), и променена експресия на рено-защитен Klotho [65–68]. В настоящото проучване експресията на mRNA на инхибиторите на CDK p16, p21 и циклин D1 беше значително повишена в третирани с TGF 1-тубулни епителни клетки, докато рено-протективният протеин против стареене Klotho демонстрира намалена експресия в сравнение с контролите. Интересно е, че експресията на р16, р21 и циклин D1 се подобрява, когато клетките се инкубират съвместно с данегаптид. Важността на това наблюдение се подкрепя от многобройни in vivo проучвания [69,70], включително скорошна работа в p16 INK4a миши модел с двоен нокаут. Когато са индуцирани с UUO да проявяват напреднало интерстициално възпаление и фиброза, тези мишки показват намалена апоптоза, стареене, намалени нива на TGF 1/Smad сигнализиране и намаляване на възпалителната клетъчна инфилтрация в сравнение с животни от див тип [70]. Освен това, проксималните тубулни клетки, изолирани от UUO модела, показват повишени нива на p21, чието потискане е успоредно с намаляване на маркерите, обикновено свързани с EMT [71,72]. Вече е установена пряка връзка с клетъчното стареене и индуцирането на ЕМТ [73].

Загубата на E-кадхерин-медиирана клетъчна адхезия е инициатор на ЕМТ, със съпътстващо увеличение на N-кадхерин (превключвателят на кадхерин), придружено от разглобяване на адхерен връзката и придобиване на протеини, обикновено свързани с фибробластен фенотип, напр. , виментин и фибробласт-специфичен протеин [74]. Вбъбрек, добре е установено, че тубулното увреждане предизвиква редица морфологични и фенотипни промени, характерни за частичен, ако не пълен, ЕМТ. Нашите скорошни проучвания показаха, че предизвиканите от глюкоза промени в TGF 1 медиират разглобяването на адхерентите и комплекса с плътно свързване чрез регулиране на промените в експресията на протеина на сцепление (ECAD, NCAD, -катенин) и плътно свързване (ZO-1). Освен това, in vitro прилагането на нехидролизуем ATP понижава експресията на Е-кадхерин в проксималнитебъбрекклетки, чиято загуба беше успоредна с намаляване на междуклетъчните сили на лигиране, намалени събития на разкъсване на връзката и ремоделиране на цитоскелета [51]. Медиирани от P2X7R, ефектите бяха обърнати в хетерогенния Cx43 плюс /-UUO модел [12]. Въз основа на тези констатации, ефективността на данегаптид подчертава защитната роля за блокиране на медиираното от хемиканалите освобождаване на АТФ за предотвратяване на променена експресия на ключов епителен (ECAD, -катенин, ZO-1, клаудин 2) и мезенхимален (NCAD, виментин) протеини, чието въздействие е от терапевтичен интерес.

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА БОЛКА

Адхерен връзката се сглобява, когато цитоплазмената опашка на Е-кадхерин се свързва с -катенин, медиирайки прикрепването към цитоскелетната мрежа и гарантирайки, че клетъчната полярност и архитектура се поддържат [75]. Въпреки ролята си в поддържането на клетъчната полярност, разглобяването на тези връзки позволява освобождаването на -катенин в цитозола, който, когато се активира от Wnt протеини или други регулатори нагоре по веригата, напр. интегрин-свързана киназа (ILK), може да се премести в ядрото и регулират специфичните за клетките ефекти. Интегрин-свързаната киназа е вътреклетъчна серин/треонин-протеин киназа, която играе основна роля в регулирането на клетъчната адхезия, оцеляването, пролиферацията и отлагането на извънклетъчния матрикс (ECM) [76]. Важно е, че инхибирането на ILK отслабвабъбречнафиброза при множество модели на ХБН [77]. В настоящото проучване индуцираните от TGF 1- увеличения на експресията на ILK1 бяха отчасти възстановени, когато клетките бяха съвместно инкубирани с данегаптид, ефект, който успоредно намаляваше експресията на -катенин и свързаните с ECM протеини. Интересно е, че докато данегаптид не успя значително да промени индуцираното от TGF 1- увеличение на експресията на -катенин, важно е да се отбележи, че липсата на промяна в експресията не отразява липсата на неговата функция в клетката. Каноничният път на Wnt включва ядрена транслокация на -катенин и активиране на целеви гени чрез група от транскрипционни фактори, наречени Т клетъчен фактор/лимфоидни усилващи фактори (TCF/LEF) [78]. Обикновено сигнализирането на Wnt/-катенин е безшумно, но се активира отново след нараняване при редица различни модели на хроничнозаболяване на бъбреците[79,80]. Освен това, анормалното Wnt/-катенин сигнализиране е силно свързано с инициирането на стареене, ефект, който е паралелен със загубата на експресия на Klotho, протеин против стареене, който действа като отрицателен регулатор на каноничния Wnt път [81], и в настоящото проучване беше регулирано надолу в клетки, третирани с TGF 1- (Фигура 3). Следователно, продължително активиране на Wnt/-catenin сигнализиране е свързано с прогресията на фиброзата и в дветебъбреки други видове тъкан [79,82,83]. Веднъж преместен в ядрото, -катенинът се свързва с повишена експресия на транскрипционния фактор SNAIL и матриксната металопротеиназа MMP7. Интересното е, че тези събития са свързани с транскрипционна репресия и отделяне на Е-кадхерин от извънклетъчната доменна мембрана, последното от които вижда увеличение в цитоплазмения пул от свободен -катенин [84]. Съответно, Wnt сигнализирането е ключов активатор на ЕМТ в условия на нараняване [85]. Освен това, с доказателства, че сигнализирането на Wnt/-катенин насърчава експресията на множество гени, включително фибронектин, FSP1, Snail1, MMP7 и циклин D1, не е изненадващо, че отслабването на тази сигнална каскада е свързано с подобренабъбречна функция, намален EMT [86] и намалено възпаление [87] и фиброза [80,88]. Следователно, това може отчасти да обясни TGF 1-индуцираната повишена експресия и секреция на извънклетъчни матрични протеини (Фигура 5), провъзпалителни цитокини и хемокини, наблюдавани в това проучване (Фигури 6 и 7). Повишеното отлагане на ECM и секреция на провъзпалителни молекули са отличителни белези на тубулоинтерстициална фиброза, с различни видове клетки, включителнобъбречнатубулни епителни клетки, за които е известно, че секретират голям брой фактори, които колективно се дефинират като секреторен фенотип, свързан с CKD (CASP). Характеризиран с многобройни молекули, включително интерлевкини, извънклетъчни матрични протеини и хемокини, този CASP показва удивителни прилики със свързания със стареенето секреторен фенотип (SASP), като компонентите на CASP са силно свързани с патологията на тубулоинтерстициалната фиброза [89]. Когато бъдат освободени, тези провъзпалителни фактори действат върху съседните здрави клетки по паракринен начин, като по този начин стимулират прогресията на фиброзата при ХБН. Известно е, че много фактори, свързани с CASP, предизвикват фиброза вбъбрек(напр. TGF, интерлевкин (IL)-1 и интерлевкин (IL)-6), насочването нагоре по веригата на тези възпалителни сигнални междинни продукти може да се окаже ефективна алтернативна стратегия за лечение на ХБН. Използвайки масив от протеомни профили, клетъчният супернатант от клетки, третирани с TGF 1±данегаптид, се инкубира върху клетъчна мембрана, предварително абсорбирана с антитела, повдигнати срещу ключови възпалителни протеини. Както е подчертано на фигури 6 и 7, съвместното инкубиране на клетки с TGF 1 и данегаптид възстановява експресията и секрецията на редица кандидат протеини, чиято роля взаболяване на бъбрецитее добре установен като увреждащ (фактор на туморна некроза-алфа, интерлевкин 1-алфа, интерферон-гама) или защитен (фактор на растежа на хепатоцитите). Освен това при ХБН разтворимите хемокини, адхезионните молекули и растежните фактори набират и активират инфилтриращи имунни клетки и резидентни фибробласти, за да медиират възпалението и фиброзата в увреденитебъбрек. Данните от нашия масив потвърждават, че модулирането на Cx43 и блокирането на медиираното от хемиканалите освобождаване на АТФ в тубулни епителни клетки отрича, частично или напълно, секрецията на много възпалителни медиатори, включително хемокини, моноцит хемо-привличащ протеин (MCP1) и регулиран при активиране нормален T Клетъчно експресиран и секретиран (RANTES), като и двата участват в набирането на моноцити. Повишени както при хора, така и при експериментибъбречни заболявания, секрецията на MCP1 се задейства от интерлевкин-1, фактор на туморна некроза-алфа [90] и интерферон-гама [91], всички от които бяха индуцирани в нашия модел от TGF 1, но блокирани, когато се прилагат едновременно с данегаптид. Освен това се наблюдава също така, че данегаптид предотвратява TGF 1-индуцираната секреция на междуклетъчна клетъчна адхезионна молекула (ICAM1) [92], фактор, стимулиращ колониите на гранулоцити-макрофаги (GM-CSF) [93] и епителен-неутрофил-активиращ пептид (ENA78) [94]. Взети заедно, те са свързани с прогресирането на ХБН и с други ключови патогенни протеини, включително дипептидил пептидаза 4 (DPPIV) [95] и съдов ендотелен растежен фактор (VEGF) [96], и са идентифицирани като потенциални терапевтични цели. Въпреки тези наблюдения, анализът на масива идентифицира редица протеини на 48-ия час, където индуцираната от TGF 1- регулация изглежда е независима от хемиканално-медиираното освобождаване на АТФ. Както се вижда от експресията на FLT3 лиганда в клетъчния лизат, данегаптид не успя значително да промени промените, предизвикани от TGF 1- в експресията на цялата клетка. Лигандът FLT3 първоначално се синтезира като мембранно свързан протеин, който трябва да бъде разцепен, за да стане разтворим растежен фактор. В клетки, третирани с TGF 1-, се наблюдава увеличение на свързания с мембраната FLT3L в сравнение с контролите в клетъчния лизат, отговор, който не се повлиява, когато клетките се инкубират съвместно с данегаптид. Въпреки че се знае малко за ензима, участващ в протеолитичното разцепване и освобождаване на FLT3L, проучване на Horiuchi et al. демонстрира, че отделянето на FLT3L и освобождаването от мембраната са зависими от металопротеаза и че този ефект във фибробластите зависи от TNF-конвертиращия ензим (TACE) [97]. Въпреки че можем само да спекулираме, възможно е блокирането на Cx43-медиирано освобождаване на АТФ да притъпи активността на протеин(и), необходим(и) за отделяне на FLT3 мембрана и по този начин, при липса на освобождаване на FLT3L, нивата на FLT3L в супернатанта са значително по-малко в клетките, третирани с TGF 1 плюс данегаптид, в сравнение с контролите, третирани с TGF 1-. Интересно е, че докато данегаптид не изглежда да обръща индуцираното от TGF 1- увеличение на FLT3L клетъчния лизат, той има ефект върху секретираната форма на протеина.

Разтворимият рецептор за крайни продукти на напреднала гликация (RAGE) е потенциален биомаркер за възпаление и оксидативен стрес [98]. Той действа като рецептор-примамка, който предотвратява свързването на крайни продукти на напреднало гликиране към свързан с мембраната RAGE и свързаните с RAGE вредни ефекти. В настоящото проучване наблюдавахме 70% увеличение на секрецията на sRAGE с TGF 1, ефект, възстановен до контрол от данегаптид. sRAGE е функционален и може да предизвика ефект, когато се секретира. Потенциалът на данегаптид значително да отрича тази секреция е от ясен терапевтичен интерес. Интересно е обаче, че не наблюдавахме увеличение на RAGE лизата на 48 h с TGF 1 ± данегаптид. Въпреки че тези експерименти са проведени в човешки първични проксимални тубулни клетки, ограниченията на нашия модел могат да имат ефекти, зависими от клетката, времето и концентрацията. Следователно, докато е необходимо по-добро разбиране на механизма на действие на данегаптид, констатациите от това проучване предоставят важно първоначално доказателство за ползите от използването на данегаптид за отричане на TGF 1-предизвиканите промени в маркерите за възпаление и тубулно увреждане чрез блокада на хемиканално медиирано освобождаване на АТФ. Приемаме, че нашите in vitro данни предоставят минималистичен модел на многофакторните събития, които пораждат тубулоинтерстициална фиброза, и препоръчваме повишено внимание при пренасянето на тези нови открития в in vivo ситуацията, особено когато проучвания върху други видове и модели на нараняване са показали променливи ефекти [41,44,46–49]. Сега са необходими допълнителни проучвания, за да се определи селективността на тези хемиканали и способността на лекарството в предклинични модели на хронично увреждане, преди тестването на ефикасността при клинични изпитвания при хора.

4. Материали и методи

4.1. Материали

Клониран човекбъбрек2 (HK2) епителни клетки и първични човешки проксимални тубулни епителни клетки (hPTECs) бяха закупени от Американската колекция за типови култури (ATCC) (LGC стандарти). Консумативите за тъканни култури бяха закупени от Invitrogen (Paisley, UK). Мембраната Immobilon-FL PVDF беше от Millipore (Watford, UK), а блокиращият буфер на Odyssey и вторичните FL флуоресцентни антитела бяха закупени от LI-COR (Cambridge, UK). Антителата за E-cadherin, N-cadherin, ILK1, MMP-3, -catenin, vimentin и ZO-1 са получени от Cell Signaling Technologies (Hertfordshire, UK), докато claudin-2, ламинин, колаген I и колаген IV антитела бяха получени от ABCAM (Кеймбридж, Обединеното кралство). Фибронектиновото антитяло е закупено от Санта Круз (Санта Круз, Калифорния, САЩ). Рекомбинантният hTGF 1 беше получен от Sigma (Poole, UK), както и всички други общи химикали. Данегаптид е предоставен от Zealand Pharmaceuticals. ATP биосензорите бяха от Sarissa Biomedical Ltd. (Ковънтри, Обединеното кралство) и съдовете за брашно от WPI (Хартфордшир, Обединеното кралство). Филтрите на Transwell са закупени от Corning (Nottinghamshire, UK). Комплектът Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit беше от R&D Systems (Оксфордшир, Обединеното кралство).

4.2. Тъканна култура

Първичните човешки проксимални тубулни епителни клетки (hPTECs) се поддържат в aбъбречнабазална среда на епителни клетки от ATCC, допълнена с 0.5 процента фетален телешки серум (FCS тегло/обем, трийодтиронин (10 nM), rhEGF (10 ng/mL), хидрокортизон хемисукцинат (100 ng/mL), rhИнсулин (5 µg/mL), епинефрин (1 µM), трансферин (5 µg/mL) и L-аланил-глутамин (2,4 mM), във влажна атмосфера при 37 ◦C с 5 процента CO2. Клетките бяха подложени на серумно гладуване преди лечениетобъбрек2 (HK2) клетки (пасажи 18-30) се отглеждат в модифицирана среда на Dulbecco Eagle's Medium (DMEM)/Hams F12 среда, допълнена с 10 процента FCS wt/vol, глутамин (2 mmol/L) и епителен растежен фактор (EGF) ( 5 ng/mL), във влажна атмосфера при 37 ◦C с 5 процента CO2. HK2 клетките бяха обезсмъртени чрез трансдукцията на човешки папиломен вирус 16 (HPV -16) E6/E7 гени и бяха свободни от микоплазма. Във всички експерименти, клетките се посяват в DMEM/F12 с ниско съдържание на глюкоза (5 mmol/L) в продължение на 48 часа и след това се гладуват със серум за една нощ преди лечението.

4.3. МТТ анализ Анализът на 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиев бромид (МТТ) беше извършен, както е описано по-горе, за да се оцени цитотоксичните ефекти на данегаптид върху клетъчната пролиферация [99]. HK2 клетките се посяват в 96-плаки с ямки и се култивират в DMEM/F12 с ниско съдържание на глюкоза (5 mM) в продължение на 48 часа, преди серумно гладуване през нощта, и след това впоследствие се стимулират в продължение на 48 часа с TGF 1 (10 ng/mL ) ± данегаптид (50–1000 nM). Колориметричното измерване на производството на формазан съответства на броя на жизнеспособните клетки.

4.4. Анализ на лактат дехидрогеназаОсвобождаването на лактат дехидрогеназа (LDH) в средата в резултат на увреждане на плазмената мембрана обикновено се използва за оценка на клетъчна смърт или цитотоксичност. HK2 клетките се посяват в 96-плаки с ямки и се култивират в DMEM/F12 с ниско съдържание на глюкоза (5 mM) в продължение на 48 часа преди серумно гладуване за една нощ. След това клетките се стимулират в продължение на 48 часа с TGF 1 (10 ng/mL) ± данегаптид (50-1000 nM). Комплектът II за анализ на LDH цитотоксичност (Abcam) се използва за количествено определяне на LDH съгласно инструкциите на производителя.

4.5. Кристално виолетово изследванеТози прост анализ се използва за измерване на относителната плътност на прилепналите клетки към многоямковите блюда. Кристално виолетово оцветява ДНК и може да бъде количествено определено колориметрично след разтваряне. HK2 клетките се посяват в 12-плаки с ямки и се култивират в DMEM/F12 с ниско съдържание на глюкоза (5 mM) в продължение на 48 часа, преди серумно гладуване през нощта, и след това впоследствие се стимулират в продължение на 48 часа с TGF 1 (1{{16 }} ng/mL) ± данегаптид (50–1000 nM). Анализът е описан по-рано [99]. Накратко, клетките се фиксират с помощта на параформалдехид в продължение на 10 минути, промиват се с буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS) и се инкубират в продължение на 10 минути при стайна температура (RT) в 0.1% разтвор на кристално виолетово. След още няколко измивания, петното се разтваря с помощта на 1% SDS и абсорбцията се измерва с четец на плаки.

4.6. Western blottingПолучаването на цитозолен протеин от HK2 клетки и hPTECs, тяхното разделяне чрез SDS гел електрофореза и прехвърляне върху Immobilon-FL PVDF мембрани са описани по-рано [12]. Мембраните бяха блокирани с помощта на блокиращ буфер на Odyssey (LI-COR) и след това изследвани за една нощ с антитела срещу Е-кадхерин (1:1000), N-кадхерин (1:1000), клаудин-2 (1:500), ZO -1 (1:1000), колаген I (1:1000), колаген IV (1:2000), фибронектин (1:2000), ламинин (1:500), ILK1 (1:500), -катенин (1:2000), виментин (1:500) и ММР3 (1:500). Лентите бяха визуализирани с помощта на OdysseyFC и полуколичествено определени с помощта на ImageStudio (v5.2, LI-COR, Lincoln, NE, USA).

4.7. Трансепителна резистентностHK2 клетките се посяват (6 × 104 клетки/mL) върху Transwell филтри (12 mm диаметър, размер на порите 0,4 µM; Corning, NY, USA) и се култивират в DMEM/F12 с ниско съдържание на глюкоза (5 mM) за 48 часа, без серум за една нощ и впоследствие стимулиран с TGF 1 (10 ng/mL) ± данегаптид (100 nM) за 48 часа. Трансепителното електрическо съпротивление (TER) се измерва с помощта на апарата EVOM (World Precision Instruments, Сарасота, Флорида, САЩ). Празно съпротивление, измерено от ямка само със среда, се изважда от всяко отчитане на съпротивлението.

4.8. Проучвания за усвояване на багрилаHK2 клетки и hPTECs се посяват върху флуородиди (диаметър 22 mm) и се култивират в DMEM/F12 с ниско съдържание на глюкоза (5 mmol/L) в продължение на 48 часа. След серумно гладуване за една нощ, клетките се инкубират с TGF 1 (10 ng/mL) ± данегаптид (50–100 nM) за 48 часа. За следващите етапи, балансиран солев разтвор (BSS, pH 7,0), състоящ се от NaCl (137 mM), KCl (5,4 mM), MgSO4 (0,8 mM), Na2HPO4 (0,3 mM), KH2PO4 (0,4 mM), NaHCO3 (4,2 mM ), използвани са HEPES (10 mM) и глюкоза (5 mM). За да се индуцира поглъщането на багрилото, клетките бяха изложени на свободен от Ca2 плюс BSS (нула CaCl2 плюс EGTA (1 mM)) плюс карбоксифлуоресцеин (200 µM) за 10 минути, последван от 5 минути период в Ca2 плюс -съдържащ BSS (1,3 mM) плюс карбоксифлуоресцеин (200 цМ). След това съдовете се измиват с Ca2+-съдържащ BSS (12 mL). Изображенията са получени с Cool Snap HQ CCD камера (Roper Scientific, Gottingen, Германия) и софтуер Metamorph (Universal Imaging Corp., Marlow, Bucks, UK). ImageJ беше използван за количествено определяне на усвояването на багрилото, където област на интерес (ROI) беше начертана около всяка клетка (приблизително 10–15 клетки/блюдо) и беше измерен средният интензитет на пикселите. Стойността на фоновата флуоресценция беше извадена от всяка ROI.

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА ДИАЛИЗА

4.9. ATP биосензиранеATP биосензори (Sarissa Biomedical, Coventry, UK) бяха използвани в амперометрична настройка с едновременен двоен запис, както е описано по-рано [12]. Беше използван нулев биосензор за отчитане на неспецифични електроактивни артефакти и изваден от ATP следата. Глицерол (2 mM) беше включен във всички разтвори за запис, за да се даде възможност за откриване на ATP. HK2 клетките се посяват върху стъклени покривни стъкла (диаметър 10 mm) в DMEM/F12 с ниско съдържание на глюкоза (5 mmol/L) за 48 часа преди серумно гладуване за една нощ. След това клетките се инкубират с TGF 1 (10 ng/mL) ± данегаптид (100 nM) в продължение на 48 часа. Покривните стъкла се прехвърлят в камера, съдържаща Ca2 плюс BSS, перфузиран при 6 mL/min (37 °C) и се оставят за 10 минути, за да се аклиматизират. ATP и нулевите биосензори бяха огънати и спуснати, така че електродът да лежи успореден на клетъчния монослой. След като настъпи стабилна базова линия, перфузията на BSS без Са2 плюс стимулира отварянето на хемиканала. След освобождаване на АТФ, Ca2+-съдържащ BSS се използва за затваряне на хемиканали, последвано от калибровъчен разтвор на АТФ (10 тМ). Записите бяха получени при 4 Hz с интерфейс Micro CED (Mark2), използвайки софтуер Spike (v8.03).

4.10. Масив от антитела срещу възпаление,Масив от антитела срещу възпаление (RnD Systems) оценява индуцираната от TGF 1-регулация на 31 възпалителни маркера. Решетката беше изпълнена, като се следваха инструкциите на производителя. Накратко, hPTECs се култивират в DMEM/F12 с ниско съдържание на глюкоза (5 mM) в продължение на 48 часа, преди серумно гладуване през нощта, и след това впоследствие се стимулират в продължение на 48 часа с TGF 1 (10 ng/mL) ± данегаптид (100 nM). Клетъчните лизати и супернатантата бяха събрани и инкубирани за една нощ с предварително блокирани мембрани, забелязани в два екземпляра с улавящи антитела. 800 CW FL флуоресцентна стрептавидин/биотинилиран коктейлна смес се използва за визуализиране на експресионни протеинови/антитяло комплекси с помощта на Odyssey FC и полу-количествено с помощта на ImageStudio (v5.2, LI-COR).

4.11. Количествен PCR в реално времеРНК се екстрахира с помощта на мини комплект RNeasy (QIAGEN) и се транскрибира обратно (Invitrogen). PCR в реално време (SYBR GreenER, Invitrogen) се извършва с помощта на инструмент StepOne Plus (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, USA). cDNA експресия се получава чрез сравняване със стандартна крива на серийно разредена cDNA. The following primers were used: p16 (forward: CTCGTGCTGATGCTACTGAGGA, reverse: GGTCG GCGCAGTTGGGCTCC), p21 (forward: AGGTGGACCTGGAGACTCTCAG, reverse: TCCTCTTGGAGAAGATCAGCCG), cyclin D1 (forward: TCTACACCGACAACTCCATCCG, reverse: TCTGGCATTTTGGAGAGGAAGTG), Klotho (forward: CCTCCTTTACCTGAAAATCAGCC, reverse CAGGTCGGTAAACTGAGACAGAG) и GAPDH (напред: GTCTC CTCTGACTTCAACAGCG, назад: ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA). Анализът на кривата на топене потвърди специфичността на праймера и се провери за потенциално замърсяване.

4.12. АнализЗа всички експерименти контролата с ниска глюкоза (5 mM) беше нормализирана до 100 процента и всички други условия бяха сравнени със съответните им контроли. Статистическият анализ беше извършен с помощта на еднопосочен ANOVA тест с последващ тест за множество сравнения на Tukey. Данните са изразени като средна стойност ± SEM, като n означава номера на пробата. P-стойност по-малка или равна на 0,05 означава статистическа значимост.